CH681081A5 - - Google Patents

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CH681081A5
CH681081A5 CH1114/89A CH111489A CH681081A5 CH 681081 A5 CH681081 A5 CH 681081A5 CH 1114/89 A CH1114/89 A CH 1114/89A CH 111489 A CH111489 A CH 111489A CH 681081 A5 CH681081 A5 CH 681081A5
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egf
amino acids
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CH1114/89A
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Daniel R Twardzik
Hans Marquardt
George J Todaro
A Gregory Bruce
Timothy M Rose
Anthony F Purchio
Shiu-Lok Hu
Wen Chang
Suo Win Liu
Thomas J Franceschini
Mohammed Shoyab
Greg Plowman
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Oncogen
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Description

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Beschreibung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Polypeptide mit Wachstumsfaktoraktivität, einschliesslich chimärer Polypeptide sowie Verfahren zu ihrer Herstellung unter Verwendung von DNA-Techniken.
Es wurde gefunden, dass eine signifikante Anzahl von Polypeptiden, die von Säugetierzellen ausgeschieden werden, eine Wachstumsfaktoraktivität aufweisen. Die Sequenz dieser Polypeptide ist im wesentlichen in einem weiten Bereich von Säugetieren konserviert. Das grösste Interesse stellt der Zusammenhang dieser Verbindung mit der Geschwulstbildung dar. Ebenfalls interessant ist die Frage, wie die Herstellung der Wachstumsfaktoren gesteuert wird und wie diese die zelluläre Aktivität steuern.
Es wurde ebenfalls festgestellt, dass die Infektion von Säugetierzellen durch Viren zur Proliferation des Wachstums der infiszierten Zellen führt. Deshalb sind im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Mitglieder der Pocken-Viren, wie Variola, Vaccinium und Viren, welche im Zusammenhang mit besonderen Krankheiten stehen, wie das Shope-Fibroma-Virus, das Yaba-Tumorvirus und das Molluscum contagiosum-Virus (MCV) von besonderem Interesse.
Es ist ebenfalls von Interesse zu bestimmen, ob Viren, welche eine zelluläre Proliferation bei der Infektion verursachen, Polypeptide produzieren, welche mit den Wachstumsfaktoren im Zusammenhang stehen, entweder selber Wachstumsfaktoren oder Wachstumsfaktor-Rezeptoren darstellen. Diese Verbindungen könnten dann für Studien von viralen Wirkungen, in Tests für die Gegenwart der Viren, in Nährmedien, als Mitogene und bei der Entwicklung bei therapeutischen Mitteln für die Behandlung von viralen Infektionen verwendet werden. Es ist ebenfalls von Interesse, Verbindungen zu entwickeln, welche Agonisten oder Antagonisten von Wachstumsfaktoren sind, für ihre Verwendung in vitro bei der Züchtung von Zellkulturen und bei der Erforschung von mitotischen Verfahren und in der Therapie nützlich sind.
Relevante Literatur
Venkatesan et al., J. Viral. (1982) 44:637-646 beschreiben die DNA-Sequenierung eines strukturierten, gencodierenden Vaccinia-Virusproteins, dabei war jedoch keine Erkenntnis, dass Proteine davon, Wachstumsfaktoraktivität aufwiesen. Cooper et al., ibid (1981) 37:284-294, berichten über die Translation von mRNA, die innerhalb der invertierten, terminalischen Wiederholung des Vaccinium-Virusgenoms codiert wurden. Proliferative Krankheiten durch Mitglieder der Pockenvirus-Familie sind für das Shope-Fibromvirus beschrieben worden (Shope, J. Exp. Med. (1932) 56:793-822; Yaba-Tumorvirus (Niven et al., J. Path. Bacteriol. (1961) 81:1-14) und Molluscum contagiosum-Virus (MCV) (Postlethwaite, Arch. Environ. Health (1970) 21:432-452). Die Beschreibungen von epidemischen Wachstumsfaktor (EGF) können bei Scott et al., Science (1983) 221:236-240 und bei Gray et al., Nature (1983) 303:722-725 gefunden werden. Die Gegenwart von drei Disulfidbrücken in EGF und der transformierende Wachstumsfaktor (TGF) werden durch Savage et al., J. Biol. Chem. (1973) 248:7669-7692 beschrieben. Vergleiche ebenfalls Doolittle et al., Nature (1984) 307: 558-560 und die australische Patentanmeldung Nr. 85 006 288. Es wurde vorgeschlagen, dass die Rezeptorbindungsregion des EGF-Moleküls in der Schlaufe zwischen dem dritten und vierten Cysteinrest liegt (Komoriya et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA (1983) 81:1351-1355).
Neue Beschreibungen von Vaccinia-Virus-Wachstumsfaktor (VGF) können bei Brown et al., Nature (1985) 313:491-492; Reisner, Nature (1985) 313:801-803 und Blomquist et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA (1984) 81:7263-7367 gefunden werden. Der natürliche Shope-Fibromvirus-Wachstumsfaktor (SFGF) wurde durch Chang, W.C. et at., in Molecular and Cellular Biol. (1987) 7:535-540 beschrieben. Shope, J. Exp. Med. (1932) 56:793-802 schildern, dass die Infektion von erwachsenen Kaninchen durch das Shope-Fibromavirus eine schnelle Proliferation von Fibroblasten verursacht, was zu einem gutartigen Fibrom führt. Die Infektion von neugeborenen oder immuno-suppresiven, erwachsenen Kaninchen verursacht eine schnelle Proliferation von Fibroblasten, was zu einem invasiven, atypischen Fibrosar-com führt. Allison, A.C., J. Nati. Cancer Inst. (1966) 36:869-876; Smith, et al., J. nati. Cancer Inst. (1973) 50:1529-1539; Allison, A.C. J. nati. Cancer Inst. (1966) 35:859-868.
Der natürliche Myxomvirus-Wachstumsfaktor (MGF) wird durch Upton et al., J. Viral. (1987) 61:1271-1275 beschrieben. Die Infektion von erwachsenen Kaninchen durch das Myxomvirus verursacht einen schnellen invasiven myxosarcomatischen Tumor. Strayer, D.S. and Seil, S., J. nati. Cancer Inst. (1983) 71:105-116.
Eine DNA-Sequenz, die fähig ist, einen konservierten Wachstumsfaktor zu codieren (natürlicher Molluscum contagiosum-Virus-Wachstumsfaktor (MCGF)) ist entdeckt worden. Porter, C. D. and Archard, L. C., J. Gen. Viral. (1987) 68:673-682. Infektionen von Menschen durch das Molluscum con-tagiosum-Virus indiziert gutartige Hauttumore, welche durch schnell-proliferative Zellen gekennzeichnet sind. Brown et al., Sec. Transm. Dis. (1981) 8:227-234. Das Yaba-Tumorvirus verursacht subkutane Histocytome bei Affen und Menschen, Bearcroft et al., nature (London) (1958) 182:195-196, und wegen seiner Beziehung zum Shope-Fibromvirus wird vorausgesagt, dass das Myxomvirus und das Molluscum contagiosum-Virus einen ähnlichen Wachstumsfaktor aufweisen.
Mäuse EGF (mEGF) Scott et al., 1983, supra; Gray et al., 1983, supra) und humaner EGF (hEGF)
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(Gregory et al., Int. J. Pept. Protein Res. (1977) 9:107-118) sind bekannt, dass sie homolog zum humanen Mäuse- und Ratten-TGF sind (Marquardt et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA (1983) 80:4684-4688) und die Reste 45 bis 85 eines 140-Rest-Polypeptides, Vaccinia-Wachstumsfaktor (VGF) werden durch das Vaccinia-Virusgenom codiert (Venkatesan et al., 1982, supra).
Die Expression von fremden Peptiden unter Verwendung eines Baculovirus-Vektors in Insektenzellen wird durch Maeda et al., Nature (1985) 315:592-594 und Carbonell et al., J. of vorlogy (1985) 56:153-160 beschrieben.
Es wird ausdrücklich auf diese Artikel verwiesen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die im Patentanspruch 1 definierten neuen Poypeptide. Sie können Analogien in Fragmenten von viralen Proteinen finden, welche Zusammensetzungen als Mitogene wirken und als Nährmedien, als Reagenzien für den Nachweis von Wachstumsfaktorrezeptoren oder der Gegenwart von Wachstumsfaktoren und als Kompetitoren für transformierende Wachstumsfaktoren und epidermale Wachstumsfaktoren verwendet werden. Zusammensetzungen, welche solche Peptide enthalten, finden therapeutische Verwendung beispielsweise zur Förderung der Epithelisierung und der Heilung von Verbrennungen und Wunden. Die neuen Peptide können synthetisiert werden. Die Hauptpeptide können als Oligopeptide oder als fusionierte Proteine gebildet sein, wobei rekombinante Techniken in einer grossen Vielzahl von Wirten verwendet werden können. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls die DNA-Sequenzen, welche die neuen Polypeptide codieren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Fig. 1 ist der Vergleich einer Aminosäuresequenz eines Vaccinaia-Virusproteins mit einem bekannten Wachstumsfaktor, worin die Initial-Aminosäure des VGF Asparaginsäure (D) in Position 20 von Methio-nin ist, welche Position aa~24 der offenbarten Peptide entspricht;
Fig. 1 zeigt die vorgeschlagene Struktur von reifem VGF mit Asparagin (N)-Ersetzungen. Die potentiellen Glykosilierungsstellen im MGF und SFGF sind durch Sterne angegeben.
Neue Zusammensetzungen, die als Agonisten oder Antagonisten von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) oder transformierendem Wachstumsfaktor (TGF) dienen können, werden zur Verfügung gestellt und sind für eine grosse Vielzahl von Applikationen bei der Zellkultur, Diagnose, in vivo-Therapie und in Kombination mit anderen Peptiden bei der Bildung von hybriden Polypeptiden als Immunogene für die Herstellung von Antikörpern nützlich. Es können Polynukleotidsequenzen isoliert oder hergestellt werden, welche in einen Expressionsvektor eingeführt werden können, um die Hauptzusammensetzungen zu ex-primieren.
Die Zusammensetzungen finden Analogien in Fragmenten von viralen Proteinen, insbesondere bei Pockenvirus-Proteinen. Der VGF besitzt ungeladene und hydrophobe Reste in der Nähe des N-Termi-nus zwischen den Resten 5 und 15 und in der Nähe des C-Terminus zwischen den Resten 100 und 124. Durch ihre Analogie zu integralen Membran-Glykoproteinen kann geschlossen werden, dass sie eine N-terminale hydrophobe Signalsequenz aufweisen, welche proteolytisch während oder unmittelbar nach der Translation entfernt wird, und eine C-terminale transmembrane Sequenz, die als Anker für das reife Protein in der Membrane dient, aufweisen. Die Spaltung des viralen Polypeptides bei arg-43 und arg-90 des reifen Peptides würde zu einer Freisetzung eines löslichen Polypeptides führen. Es wird angenommen, dass das 140-Rest-VV-Polypeptid zuerst ein membran-vereinigtes Protein nach der Entfernung der 1 g Aminosäuresequenz freisetzt. Nach dem intrazellulären Verfahren wird ein lösliches Wachs-tumsfaktor-Peptid mit etwa 57 Resten erhalten. Cell (1985), 42:383-393. Der Vergleich des Myxom-Wachstumsfaktors (MGF) und des Shope-Fibrom-Wachstumsfaktors (SFGF) mit anderen Mitgliedern der Wachstumsfaktorenfamilie (vgl. Fig. 1) zeigt verschiedene bemerkenswerte Unterschiede. MGF und SFGF, welche als Vorläufermoleküle synthetisiert werden, besitzen eine Signalsequenz am N-Termi-nus, im Unterschied zu den anderen Wachstumsfaktor-Mitgliedern besitzen sie jedoch keinen Transmembran-Bereich am C-Terminus, was darauf hindeutet, dass sie sekretierte Moleküle darstellen. Die Sequenzanalyse zeigt einen signifikanten Gebrauch der Aminosäure Asparagin sowohl im MGF als auch in SGF. In den 6 Stellungen besitzen sowohl MGF und SFGF konservierte Asparagine, während die anderen Mitglieder kein Asparagin aufweisen. An diesen Stellen sind die Asparagine durch 1 hochkonservierte Glycinreste an den Stellen 8 und 31 ersetzt, wobei das erste Cystein in Position 2 ist. Beide dieser Glycinreste kommen in Kombination mit hochkonservierten Tyrosinresten in den Positionen 9 und 32 vor. Wegen der hochkonservierten Natur der Aminosäuren an dieser Seite des Moleküls wird angenommen, dass die Cysteinschlaufen, die an diesem Teil vorhanden sind, in die Rezeptorbindung und die Funktion der Wachstumsfaktoren in dieser Familie involviert sind.
Für die Aminosäuren Glycin und Asparagin wird vorausgesagt, dass sie höchste Beta-Wendepotentiale aufweisen (Chou und Fassman, Ann. Rev. Biochem. (1978) 47:251-276). Demzufolge scheint die Konservierung dieses Wendepotentials ausserordentlich wichtig für die Aktivität eines Wachstumsfaktors. Die Wachstumsfaktoren, die verschieden sind vom Myxom und Shope verwenden nahezu ausschliesslich Glycin in wichtigen Wenderegionen des Moleküls. Im MGF und im SFGF sind diese Glycine nahezu alle in Asparagine umgewandelt (vgl. Fig. 2). Dies gibt die wichtige biologische Funktion an, welche auf dem Ersatz des hochkonservierten Glycins mit dem Asparagin beruht. Es existiert die Möglichkeit, dass der Ersatz von Glycin in den konservierten Wenderegionen in der Wachstumsfaktorstruktur
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durch Asparagin zu einer erhöhten Funktionalität des Wachstumsfaktor führt, entweder durch Erhöhung der Bindung an den EGF-Rezeptor oder an einen verwandten Rezeptor, der Verbesserung des direkten Effektes des Wachstumsfaktors in geschädigten Zellen oder durch Erhöhung der Stabilität des Moleküls.
Zwei neu vorkommende Asparagine im MGF und in SFGF führen zu potentiellen N-verbundenen Gly-kosiiierungsstellen. Im weiteren sind diese Stellen in zwei Cysteinschlaufen vorhanden, was eine variable Anzahl Aminosäuren erlaubt. Demzufolge kann das neue Vorkommen von Asparaginen zu mehreren Vorteilen des Wachstumsfaktors in der verbesserten Funktionalität führen. Einer davon könnte die Stabilisierung des Proteins in vivo durch den Schutz vor Abbau oder der immunogenen Stellen durch Glykosilierung sein.
Die Hauptpolypeptide sind dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine Schlaufe oder einen Kreis aufweisen, normalerweise drei Schlaufen oder Kreise, als Resultat von Cysteinen, welche Brücken bilden, wobei der physiologisch aktive Teil des Moleküls, welcher die Wachstumsfaktoraktivität beisteuert, etwa 12 bis 65 Aminosäuren, normalerweise 15 bis 60 Aminosäuren aufweist. Von diesen drei Schlaufen besitzen zwei der Schlaufen 12 bis 15 Aminosäuren (14 bis 17 ringförmige Aminosäuren) exklusive der Cysteinbrücke, insbesondere besitzt eine davon 12 oder 13 Aminosäuren (14 oder 15 ringförmige Aminosäuren) und die andere 15 Aminosäuren (17 ringförmige Aminosäuren), wobei die N-termi-nale, proximale Schlaufe normalerweise 12 bis 13 Aminosäuren aufweist, insbesondere 12 Aminosäuren und die mittlere Schlaufe 15 Aminosäuren besitzt.
Die dritte Schlaufe oder C-proximale Schlaufe weist 8 Aminosäuren (10 ringförmige Aminosäuren) auf und umfasst flankierende Aminosäuren und besitzt folgende Formel:
PP3- (aa25-C-aa27)m - C-aa29-aa30-G-Y
PP4-(aa40-aa39-aa38)n-C- R- aa35- G-aa33
worin die Ein-Buchstaben-Symbole für die Aminosäuren die konventionelle Bedeutung besitzen, worin C Cy-stein, G Glycin, N Asparagin, Y Tyrosin und R Arginin ist;
aa25 ist eine neutrale Aminosäure, welche aliphatisch sein kann, insbesondere mit 3 bis 4 Kohlenstoffatomen oder aromatisch, insbesondere 9 Kohlenstoffatome aufweist und 0 bis 1 Hydroxylgruppe besitzt, z.B. Alanin, Serin, Threonin, Tyrosin oder Phenylalanin;
aa27 ist eine neutrale oder basische Aminosäure, welche insbesondere 3 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist und wenn sie neutral ist, 0 bis 1 Carboxamidgruppe aufweist, beispielsweise Arginin, Alanin, Valin, Leucin, Isoieucin, Asparagin oder Glutamin;
aa£9 ist eine neutrale oder basische Aminosäure, welche aliphatisch oder aromatisch ist, wobei die aromatische beispielsweise Histidin ist und die aliphatische 2 bis 6, normalerweise 3 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist und 0 oder 1 Hydroxylgruppe aufweist, und beispielsweise Serin, Threonin, Leucin, Valin, Isoieucin oder Arginin ist;
aa30 eine neutrale Aminosäure ist, die aliphatisch oder aromatisch ist, wobei die aromatische z.B. Histidin ist und die aliphatische 3 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist und 0 oder 1 Hydroxylgruppe besitzt und insbesondere Serin, Isoieucin und Valin ist;
aa33 stellt eine neutrale, aliphatische Aminosäure von 2 bis 6, normalerweise 3 bis 6 Kohlenstoffatome mit 0 oder 1 Hydroxylgruppe dar, insbesondere wird sie durch Serin, Threonin, Valin, Leucin oder Isoieucin verkörpert oder sie kann eine saure Aminosäure, wie beispielsweise Glutaminsäure oder Aspara-ginsäure sein;
aa35 ist eine neutrale oder saure Aminosäure mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, worin die neutrale beispielsweise Alanin, Valin, Leucin, Isoieucin und Serin ist und die saure beispielsweise Asparagin- oder Glutaminsäure ist;
aa38 ist eine aliphatische, neutrale, substituierte Aminosäure, worin der Substituent Carboxamid ist und 4 bis 5 Kohlenstoffatome aufweist oder eine saure Aminosäure, wie beispielsweise Asparagin, Glutamin, Asparaginsäure oder Glutaminsäure ist;
aa39 ist eine aromatische Aminosäure oder eine neutrale, aliphatische Aminosäure mit 3 bis 4 Kohlenstoffatomen, normalerweise mit einem Hydroxylsubstituenten, vorzugsweise ist sie aromatisch und umfasst Phenylalanin, Histidin, Tyrosin, Serin oder Threonin;
aa40 ist eine neutrale, substituierte oder unsubstituierte, aliphatische Aminosäure von 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine basische Aminosäure, wie beispielsweise Alanin, Valin, Isoieucin, Glutamin oder Arginin;
m und n sind 0 oder 1 ;
pp3 kann eine Polypeptidkette von nicht mehr als insgesamt 1000 Aminosäuren darstellen und pp4 kann Wasserstoff sein und den Schluss des Polypeptides bilden.
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pp3 und pp4 können aber auch gleiche oder verschiedene Polypeptidketten von nicht mehr als insgesamt 1000 Aminosäuren darstellen. Die Polypeptidketten weisen normalerweise nicht mehr als etwa 500 Aminosäuren auf, vorzugsweise sind dabei mindestens 90% der Aminosäuren, insbesondere mindestens etwa 95% der vorhandenen Aminosäuren in einer der zwei Polypeptidketten vorhanden; in einigen Fällen kann die Kette nur aus einer Aminosäure bestehen und nicht mehr als 100 Aminosäuren umfassen, häufig nicht mehr als etwa 50 Aminosäuren, je nach der Verwendung des Polypeptides und der Rolle der verlängerten Kette; die Polypeptidketten können mit natürlich vorkommenden Polypeptiden, welche mit natürlich vorkommenden Wachstumsfaktoren und Pockenviren-Proteinen verbunden sind, verwandt sein oder können verschieden sein von natürlich vorkommenden Ketten oder Fragmenten davon, welche mit der Polypeptidkette, welche spezifisch in der Formel dargestellt ist, verschieden sein, normalerweise in keiner Beziehung, wobei m, n und pp4 so ausgewählt sind, dass der dritte Bereich mindestens 14 Amino-C-terminale Aminosäuren besitzt, die bei Aminosäure aa25 bis aa29 beginnen und bei aa4" bis aa53 enden.
Die Definitionen der Aminosäuren sind nachstehend dargelegt.
Neutral (Ne)
aliphatisch (AI)
unsubstituiert G, A, V, L, l, P substituiert oxy S,T
thio C, M
amido N, Q aromatisch (Ar)
unsubstituiert F
substituiert Y
heterocyclisch H, W
Geladen (bei pH 6,0)
basisch (Ba) K, R
sauer (Ac) D, E
Die Abkürzungen in Klammern beziehen sich auf besondere Aminosäuregruppen. Bei den unsubstitu-ierten sollen keine andere Heterosubstituenten vorhanden sein, als die im Glycin vorhandenen Carboxy-und Aminogruppen. Die Aminosäuren sind natürlich vorkommende L-Aminosäuren.
Die neutralen Aminosäuren können ebenfalls beschrieben werden als solche mit nicht-polaren oder polaren (aber ungeladenen) R-Gruppen. Die Aminosäuren, welche unter diese Definitionen fallen, sind folgende:
nicht-polare Aminosäuren A, V, L, I, P, M, F, W polare Aminosäuren G, S, T, C, Y, N, Q
Die Schlaufe zwischen den Cysteinen bei den Positionen 28 und 37 in der obigen Formel weist 0 oder 1 saure Aminosäure (S) auf. Die Aminosäuren, die unmittelbar die Cysteine flankieren (d.h. Aminosäuren 27 und 38) ausserhalb der Schlaufe können mindestens eine geladene Aminosäure umfassen und mindestens eine substituierte, aliphatische Aminosäure. Von den Aminosäuren der Schlaufe (28 bis 37) sind 4 bis 6, normalerweise 5 Amiosäuren neutrale, aliphatische Aminosäuren und nicht mehr als zwei, normalerweise eine, sind aromatische Aminosäuren.
Von besonderem Interesse sind Verbindungen, worin die Polypeptide weniger als 130 Aminosäuren, insbesondere weniger als 55 Aminosäuren und mindestens 44 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens etwa 53 Aminosäuren aufweisen. Von besonderem Interesse sind Polypeptide, welche die Aminosäuren 44 bis 88 und Fragmente davon von VGF (aa1 bis aa47, vgl. Fig. 1) enthalten.
Vorzugsweise aa29 eine substituierte oder unsubstituierte, aliphatische Aminosäure mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen mit 0 bis 1 Hydroxygruppe, insbesondere Serin oder Valin oder eine aromatische Aminosäure, insbesondere Histidin.
aa30 ist vorzugsweise Histidin, Serin oder eine unsubstituierte Aminosäure von 5 bis 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere Isoieucin;
aa33 ist vorzugsweise eine substituierte oder unsubstituierte, aliphatische Aminosäure mit 0 bis 1 Hy-droxygruppen und mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen;
aa35 ist vorzugsweise eine aliphatische Aminosäure mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen;
aa38 ist vorzugsweise Glutamin oder Glutaminsäure;
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aa39 ist vorzugsweise aromatisch, insbesondere Histidin oder Phenylalanin;
aa40 ist vorzugsweise eine neutrale oder basische Aminosäure.
Von besonderem Interesse ist die Gegenwart von zwei Schlingen, wobei die C-proximale Schlinge mit der zweiten Schlinge verbunden ist, wobei die Aminosäuren der zweiten Schlinge stark variieren können. Die zweite Schlinge weist vorzugsweise 14 bis 16 Aminosäuren auf, exklusive der Cysteinbrücke, insbesondere etwa 15 Aminosäuren. Von den Aminosäuren sind 6 bis 9, vorzugsweise 7 bis 9, insbesondere etwa 8, aliphatische Aminosäuren, die substituiert oder unsubstituiert sein können, vorzugsweise sind nicht mehr als etwa drei der Aminosäuren substituiert, insbesondere sind 1 bis 2 Aminosäuren substituiert; es sind 2 bis 4 aromatische Aminosäuren vorhanden, insbesondere drei aromatische Aminosäuren, erwünscht sind Histidin und Tyrosin; es sind 2 bis 4 saure Aminosäuren vorhanden, vorzugsweise 3 saure Aminosäuren, insbesondere Asparaginsäure und es sind 0 bis 2, normalerweise 1 basische Aminosäure, insbesondere Arginin vorhanden. Wünschenswert wird das Cystein, welches die Hauptschleife, die am nächsten des Cystein der anderen Schlaufe liegt, durch 0 bis 2, normalerweise durch 0 bis 1 Aminosäure, insbesondere durch Arginin getrennt.
Von besonderem Interesse sind für einige Applikationen Verbindungen der folgenden Formel:
Y L
ppl-aa1-C-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-F-C-F
N
H-(aa12a)p-G-aa14-C-aa16-Ar1-(aa17a)p-(aa17b)p aa18_aa19_aa20-.aa21_aa22_ (aa22a) (aa22b)p_aa23
N
aa24-(aa25-C-aa27-C-aa29-aa3 °-G-Y-aa3 3-G-aa35 Q
R-C-E-aa39-aa4 0)-aa4 i-L-aa43-aa44-pp2
worin die Symbole aa25 bis aa4° die obige Bedeutung besitzen; pp1 und pp2 sind gleich oder verschieden und können Wasserstoffe darstellen, welche den terminalen Teil des angegebenen Polypeptides darstellen oder können Polypeptide sein mit insgesamt bis zu 1000 Aminosäuren, normalerweise bis zu etwa 500 Aminosäuren und können insgesamt nur eine Aminosäure besitzen oder können individuelle oder getrennte Polypeptide mit 1 bis 100 Aminosäuren sein, normalerweise von 1 bis 75 Aminosäuren, insbesondere etwa 5 bis 50 Aminosäuren; diese Polypeptide besitzen spezifische Applikationen für die Änderung der spezifisch beschriebenen Sequenz für einen vorbestimmten Zweck; pp1 und pp2 können gleich oder verschiedenen von natürlichen Pockenviren-Polypeptid sein, normalerweise verschieden;
aa1 kann irgendeine Aminosäure sein, insbesondere eine aliphatische Aminosäure, eine basische Aminosäure oder eine saure Aminosäure, vorzugsweise eine unsubstituierte, aliphatische Aminosäure mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, einschliesslich Glycin, Leucin, Valin, Lysin, Glutaminsäure und Asparaginsäure;
aa3 ist eine neutrale Aminosäure, insbesondere mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, insbesondere Asparagin, Glycin und Prolin;
aa4 kann irgendeine Aminosäure sein, aliphatische oder aromatische, insbesondere 2 bis 6 Kohlenstoffatome, welche neutral oder sauer sein kann, insbesondere 3 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist, einschliesslich Prolin, Asparagin, Asparaginsäure, Histidin, Serin und Leucin;
aas ist eine saure oder neutrale, substituierte, aliphatische Aminosäure, insbesondere Glutaminsäure oder Asparaginsäure oder eine hydroxy-substituierte Aminosäure mit 3 bis 4 Kohlenstoffatomen, insbesondere Serin;
aa6 ist eine unsubstituierte, aliphatische Aminosäure mit 2 bis 6, normalerweise 2 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine aromatische Aminosäure, insbesondere Glycin, Histidin oder Tyrosin;
aa7 ist eine saure, basische oder neutrale Aminosäure, insbesondere mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Glutaminsäure, Asparaginsäure, Lysin und Threonin;
aa8 ist eine neutrale, unsubstituierte, aliphatische Aminosäure mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine mit Carboxamid substituierte Aminosäure mit 4 bis 5 Kohienstoffatomen, z.B. Asparagin, Glutamin oder Glycin;
aa11 ist eine neutrale Aminosäure, entweder eine aliphatische oder aromatische Aminosäure, insbesondere eine aliphatische, vorzugsweise mit 5 bis 6 Kohienstoffatomen und besonders bevorzugt Leucin oder Phenylalanin;
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aa12 ist eine aromatische Aminosäure oder eine carboxamid-substituierte, aliphatische Aminosäure mit 4 bis 5 Kohienstoffatomen, insbesondere Histidin oder Asparagin;
aa12 ist eine neutrale, aliphatische Aminosäure oder eine saure Aminosäure, insbesondere Glycin, Asparagin oder Asparaginsäure aa14 ist eine saure Aminosäure oder eine neutrale, aliphatische Aminosäure, die substituiert oder unsubstituiert ist mit 4 bis 5 Kohienstoffatomen mit 0 oder 1 Hydroxylgruppe, insbesondere Asparaginsäure, Threonin oder Vaiin;
aa16 ist eine Bindung oder eine neutrale oder basische, aliphatische Aminosäure, entweder substituiert oder unsubstituiert mit 4 bis 6 Kohienstoffatomen, insbesondere Isoieucin, Arginin oder Methionin;
Ar1 stellt eine aromatische Aminosäure dar, welche einen carbocyclischen oder heterocyclischen Ring aufweisen kann und Histidin, Phenylalanin oder Tyrosin umfasst;
aai7a jst eine neutrale, aliphatische Aminosäure, entweder substituiert oder unsubstituiert mit 3 bis 6, normalenweise 3 bis 5 Kohienstoffatomen mit 0 bis 1 Hydroxygruppen und umfasst Vaiin, Leucin, Isoieucin und Threonin;
aa17b ist eine neutrale, unsubstituierte Aminosäure mit 5 bis 6 Kohienstoffatomen oder eine saure Aminosäure, insbesondere Valin, Isoieucin oder Glutaminsäure;
aa18 ist eine neutrale, aliphatische Aminosäure, substituiert oder unsubstituiert mit 2 bis 6, vorzugsweise 3 bis 6 Kohienstoffatomen mit 0 bis 1 Hydroxysubstituenten, insbesondere Alanin, Serin oder Glutamin;
aa19 kann irgendeine Aminosäure sein, insbesondere eine aliphatische oder basische Aminosäure, vorzugsweise mit 4 bis 6 Kohienstoffatomen und besonders bevorzugt mit 5 bis 6 Kohienstoffatomen, beispielsweise Arginin, Leucin, Vaiin und Glutaminsäure;
aa20 ist eine saure Aminosäure oder eine aliphatische carboxamid-substituierte Aminosäure und umfasst Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure oder Glutamin;
aa21 ist eine neutrale, unsubstituierte, aliphatische Aminosäure oder eine basische Aminosäure von 3 bis 6 Kohienstoffatomen und weist 0 oder 1 Hydroxyl- oder Carboxamidgruppe auf und umfasst Isoieucin, Leucin, Asparagin, Serin, Threonin, Lysin und Arginin;
aa22 ist eine Bindung oder eine saure Aminosäure, welche Asparaginsäure oder Glutaminsäure ist oder eine neutrale, aliphatische Aminosäure, insbesondere Valin;
aa223 ist eine neutrale, aliphatische Aminosäure mit 0 oder 1 Hydroxylgruppe, insbesondere einer Hydroxylgruppe und vorzugsweise Serin;
aa22b igt eine neutrale, aliphatische Aminosäure mit 4 bis 6 Kohienstoffatomen, insbesondere Leucin oder Isoieucin;
aa23 ist eine Bindung oder eine neutrale, aliphatische Aminosäure, die substituiert oder unsubstituiert ist und 2 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist und 0 bis 1 Hydroxylsubstituent aufweist, beispielsweise Glycin, Serin, Threonin und Asparagin;
aa24 ist eine aliphatische Aminosäure, insbesondere eine thio-substituierte, aliphatische Aminosäure, vorzugsweise Methionin, Prolin oder eine aromatische Aminosäure, insbesondere Tyrosin;
aa41 ist eine neutrale, substituierte oder unsubstituierte, aliphatische oder saure Aminosäure mit 4 bis 6 Kohienstoffatomen, insbesondere Valin, Asparagin oder Asparaginsäure;
aa43 ist eine neutrale, aliphatische, saure oder basische Aminosäure, welche substituiert oder unsubstituiert sein kann mit 4 bis 6 Kohienstoffatomen und umfasst Valin, Leucin, Isoieucin, Arginin, Lysin und Asparaginsäure;
aa44 kann irgendeine Aminosäure sein, insbesondere eine andere als eine basische Aminosäure und kann eine saure, neutrale oder aromatische Aminosäure sein und wenn sie nicht aromatisch ist, 3 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen und insbesondere Asparaginsäure, Alanin, Leucin, Tryptophan oder Threonin sein: und p 0 oder 1 ist.
Es ist von besonderem Interesse, wenn pp1 die folgende Sequenz hat:
pp1'-aa-24-aa-23-aa-22-aa-21-aa-20-aa-'|9-aa-'18
-aa-17-aa-16-aa-15-aa-i4-aa-13-aa-12-aa-11
aa-10-aa-9-aa-8-aa-7-aa-s-aa-5-aa-4-aa_3-aa-2-aa_1
worin pp1' in Kombination mit den in dieser Sequenz folgenden Aminosäurezeichen äquivalent mit pp1 ist. Die obige Sequenz fällt in die Definition von pp1; pp1' kann Wasserstoff oder eine Aminosäuresequenz sein. Eine oder mehrere Aminosäuren, welche durch aa-" dargestellt sind (x ist irgendeine Nummer) kann eine Bindung sein, so dass sie dazu dient, die Anzahl der Aminosäuren in der N-terminalen Kette zu reduzieren. Demzufolge kann der gesamte oder nur ein Teil der angegebenen Aminosäuresequenz vorhanden sein. Wenn ein Teil der Sequenz vorhanden ist, werden ebenfalls die angrenzenden Aminosäuren von der Sequenz involviert, d.h. die Aminosäuren in ihrer numerischen Ordnung ohne Deletionen. Normalerweise ist mindestens eine Aminosäure vorhanden und in der Regel mindestens 3 und vorzugsweise mindestens 6, wenn die verbleibenden, stromaufwärts liegenden Aminosäuren abwesend sind, so dass pp1' mit aa-1, aa-6 oder dergleichen, verbunden ist;
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aa-1 kann irgendeine Aminosäure sein, insbesondere eine aliphatische mit 3 bis 6 Kohienstoffatomen, vorzugsweise eine neutrale oder basische, insbesondere Lysin, Arginin, Prolin, Asparagin oder Serin;
aa-2 kann irgendeine Aminosäure sein, entweder eine aliphatische oder aromatische, insbesondere eine aliphatische, vorzugsweise mit 3 bis 6 Kohienstoffatomen;
aa-3 kann eine aliphatische oder aromatische sein, insbesondere eine aliphatische, entweder polare oder nicht-polare mit 2 bis 6, normalerweise 2 bis 5 Kohienstoffatomen und weist im allgemeinen 0 oder 1 Hydroxylsubstituenten auf;
aa-4 kann irgendeine aliphatische Aminosäure sein, neutral oder basisch, im allgemeinen mit 3 bis 6 Kohienstoffatomen, vorzugsweise mit 5 bis 6 Kohienstoffatomen und z.B. Asparagin, Prolin oder Lysin;
aa-5 kann irgendeine aliphatische Aminosäure sein, insbesondere eine neutrale, im allgemeinen von 3 bis 6 Kohienstoffatomen, insbesondere Valin oder Isoieucin;
aa-6 ist eine neutrale oder saure Aminosäure, wenn sie aliphatisch ist, mit 3 bis 6, normalerweise mit 4 bis 6 Kohienstoffatomen, beispielsweise Isoieucin, Valin oder Asparaginsäure;
aa-7, aa-8, aa-9, aa-12, aa-14, aa-15, aa-16, aa-17, aa-19, aa-20, aa-21 und aa-23 sind aliphatische Aminosäuren mit 3 bis 6 Kohienstoffatomen, entweder polar oder unpolar, insbesondere polar mit 0 oder 1 Hydroxylsubstituenten oder aromatisch;
aa-10 und aa~25 sind nicht-poiare, aliphatische Aminosäuren oder saure Aminosäuren mit 2 bis 6, normalerweise 2 bis 3 Kohienstoffatomen;
aa-13, aa-22 und aa-24 sind polare, aliphatische Aminosäuren oder saure Aminosäuren mit 4 bis 5 Kohienstoffatomen, insbesondere mit einem Carboxamidsubstituenten;
aa-11 und aa-18 sind aliphatische Aminosäuren, entweder polar oder unpolar oder saure Aminosäuren. Von besonderem Interesse ist ein N-terminales Fragment mit aa-1 bis aa-24 oder aa-1 bis aa-7, insbesondere aa-1 bis aa-6. pp1' kann bequemerweise irgendeine Aminosäuresequenz sein, welche als Fusionsprotein dienen kann, insbesondere, um ein immunogenes Peptid für die Herstellung von Antikörpern gegen die Verbindung zu liefern.
Der primäre Aspekt der erfindungsgemässen Zusammensetzungen sind die Sequenz aa25 bis aa40, insbesondere die Sequenz vom Cystein in Stellung 28 bis zum Cystein in Stellung 37 und die Schlaufen, welche durch die Cysteine in Stellung 2 und 10 und die Cysteine in den Stellungen 15 bis 26 gebildet werden. Vorzugsweise haben die erfindungsgemässen Zusammensetzungen eine Schlaufe, welche durch die Cysteine in den Stellungen 28 und 37 geschaffen wird in Konjunktion mit der Schlaufe, welche durch die Cysteine in den Stellungen 15 bis 26 gebildet wird.
Es können chimäre Polypeptidsequenzen hergestellt werden, indem Fragmente von verschiedenen Polypeptiden, welche eine Sequenz im wesentlichen ähnlich den natürlich vorkommenden Polypeptidketten aufweisen, welche mit natürlich vorkommenden Wachstumsfaktoren verbunden sind und Pockenvi-renproteinen kombiniert werden. Die resultierenden chimären Polypeptide besitzen etwa 40 bis 65 Aminosäuren, üblicherweise etwa 45 bis 60 Aminosäuren und insbesondere 49 bis 53 Aminosäuren. In jedem Fall wird die Rahmenstruktur durch die Cysteine beibehalten mittels der Cysteinbrücken, welche die Schlaufen der obendefinierten Grössen definieren. Demzufolge kann irgendein Fragment eines Wachstumsfaktors verwendet werden, welches im wesentlichen mit VGF (vgl. beispielsweise Fig. 1) oder einem anderen Wachstumsfaktor, welcher die gleiche Rahmenstruktur wie die erfindungsgemässen Zusammensetzungen besitzt und eine ähnliche physiologische Aktivität aufweist, homolog ist. Dies ungeachtet der Säugetierquelle, beispielsweise von Primaten, wie Menschen, Nagetieren, wie Ratten und Mäuse, Rinder, Vögel, Schweine usw.
Es können bis drei Verbindungen erforderlich sein, je nach der Quelle der Fragmente und der Länge der gewünschten Polypeptide. Es ist wünschenswert, dass die Verbindungen an einem Punkt zwischen aa-6 und aa1; aa11 und aa1^; aa25 und aa29 und aa42 und aa53 gemacht werden. Die Sequenzen zwischen etwa aa-6 und etwa aa15 werden als N-terminale Sequenzen bezeichnet; diejenigen zwischen etwa aa14 und etwa aa29 werden als zentrales Fragment bezeichnet; und diejenigen zwischen etwa aa25 und dem Ende des Peptides (im allgemeinen aa44 bis aa47) werden als C-terminaler Bereich bezeichnet. Der exakte Verbindungspunkt variiert je nach dem Ort der Restriktionsstellen usw. Zusätzlich kann eine extrem N-terminale Sequenz, die etwa aa-24 bis aa-7, insbesondere aa-23 bis aa-7 enthält, ebenfalls zu einem chimären Polypeptid verbunden werden.
Die Fragmente enthalten im allgemeinen 15 bis 50, normalerweise 15 bis 45 Aminosäuren, da aa20 nicht die zwanzigste Aminosäure der Verbindung darstellt, sondern nur die spezifische Sequenz, die spezifisch definiert wurde (vgl. Fig. 1).
Es wurden verschiedene zweckmässige Restriktionsstellen in die synthetischen Gene, welche zur Konstruktion des chimären Polypeptides verwendet wurden, eingebaut. Wenn möglich, lassen die Restriktionsstellen die Aminosäuresequenz des Wachstumsfaktorgens unverändert. In einigen Fällen jedoch, führt die Einverleibung der neuen Restriktionsstelle zu einer geänderten Aminosäuresequenz. Von besonderem Interesse ist es, wenn die codierende Sequenz für VGF zur Einführung einer Kpnl-Re-striktionsstelle durch Änderung der Aminosäuresequenz aa13 bis aa15 von GDC bis GTC und für die Einführung einer Sphl-Stelle in aa23 bis aa28 geändert wird, indem die Sequenz GMYCRC in GYACVC umgewandelt wird. Diese Änderungen führen zu bequemen Stellen für die Verbindung mit Fragmenten des VGF-Gens mit Fragmenten von anderen Wachstumsfaktoren. Beispielsweise kann das Gen-Fragment
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aa26 bis aa47 bequem mit einem Gen-Fragment von aipha-TGF, welches Aminosäuren codiert, welche den Resten aa~6 bis aa2^ entsprechen, verbunden werden, um ein TGF/VGF-Hybridpolypeptid zu erhalten. Demzufolge enthält die Sequenz des chimären Peptides aa-6 bis aa13 tN-terminal) und aa14 bis aa2s (zentrales Fragment), welches von alpha-TGF abgeleitet ist und aa26 bis aa47 (C-terminal) abgeleitet von VGF, wie oben modifiziert.
Die Herstellung eines Plasmides, welches fähig ist, chimäre Proteine zu exprimieren, weiche Aminosäuresequenzen aufweisen, die von Fragmenten von mehr als einem Wachstumsfaktor oder einem Pockenviruspolypeptid mit Sequenzänderungen, die nötig sind zur Einführung von bequemen Restriktionsstellen abgeleitet sind, sind im einzelnen im experimentellen Teil beschrieben.
Fusionsproteine können ebenfalls hergestellt werden, wenn ein Wachstumsfaktor oder ein chimäres Polypeptid expriminiert wird, welches an die N-terminalen Aminosäuren einer Signalsequenz oder mit N-terminalen Aminosäuren von hochexprimierten, bakteriellen Bakteriophagen oder eukaryontischen Genen verbunden ist. Zusätzlich kann eine enzymatisch oder chemisch faltbare Stelle nach der Leadersequenz vorgesehen werden, um das reife Polypeptid von der Leadersequenz abzuspalten. Die Herstellung von Plasmiden, welche zur Expression dieser Fusionspolypeptide fähig sind und Verfahren für die Spaltung und Isolierung des gewünschten Polypeptids sind im einzelnen im experimentellen Teil beschrieben.
Herstellung von Wachstumsfaktoren
Die Hauptzusammensetzungen können auf verschiedene Weise hergestellt werden, je nach der Grösse der Zusammensetzung. Insbesondere unterhalb etwa 80, in der Regel unterhalb 60 Aminosäuren, kann die Zusammensetzung mittels üblichen Synthesen hergestellt werden. Vergleiche beispielsweise Merrifield, Festphasen-Peptidsynthese «The Peptides Analysis, Synthesis Biology», Special Methods in Peptide Synthesis, Part A, Vol. 2, Gross und Meinhofer, Hrg. Academic Press, NY, 1980, Seiten 1-284. Vergleiche ebenfalls US-A 4 127 526.
Alternativ kann die Verwendung der Hybrid-DNA-Technologie eingesetzt werden, wenn DNA-Sequenzen verwendet werden können, welche das gewünschte Polypeptid oder einen Vorläufer davon codieren. Die DNA-Sequenzen, welche den Wachstumsfaktor von Interesse codieren, können synthetisiert werden, indem übliche Techniken verwendet werden, beispielsweise als Überlappung einzelner Stränge, welche zusammen verbunden werden können, um die gewünschte Codierungssequenz zu bilden. Die Termini können bezeichnet werden, um Restriktionsstellen vorzusehen oder ein oder beide Termini können für die Verbindung mit komplementären Enden eines Expressionsvektors stumpfendig sein. Für die Expression der Sequenz ist ein Initial-Methionin erforderlich. Die Expressionsvektoren sind im allgemeinen erhältlich und in der Literatur umfangreich beschrieben.
Anstelle der Synthese eines interessierenden Gens kann der Wachstumsfaktor durch verschiedene Techniken isoliert werden. Wenn beispielsweise der Wachstumsfaktor ein viraler Wachstumsfaktor ist, kann die mRNA aus dem Virus, welches das Polypeptid einschliesslich des Wachstumsfaktors codiert, isoliert werden, die mRNA umgekehrt transkribiert werden, die erhaltende einsträngige (ss) DNA als Schablone verwendet werden, um eine doppelsträngige (ds) DNA herzustellen und das ds-DNA isoliert werden. Eine andere Technik besteht darin, ein Stück der viralen DNA zu isolieren und unter Verwendung einer Probe, welche eine Region der am meisten konservierten Sequenzen in einem Wachstumsfaktorgen enthält, zweckmässig zu isolieren, die Sequenzen zu identifizieren, welche einen Faktor im viralen Genom codieren. Die Probe kann kürzer sein, als die gesamte Sequenz, sollte jedoch eine Länge von mindestens 10, vorzugsweise 14 und am bevorzugtesten 20 Nukleotide aufweisen. Längere Oligonukleo-tide sind ebenfalls nützlich, bis zu der vollen Länge des Wachstumsfaktorgens. Sowohl DNA- und RNA-Proben können verwendet werden.
Bei ihrer Verwendung werden die Proben typischerweise auf eine nachvollziehbare Art markiert (beispielsweise mit 32p oder Biotin-markierten Nukleotiden) und werden mit einer einsträngigen DNA oder RNA aus dem Organismus, in welchem das Gen gesucht wird, inkubiert. Die Hybridisierung wird nachgewiesen, indem typischerweise, unter Verwendung von Nitrozellulosepapier mittels der Markierung, nachdem die einsträngigen und zweisträngigen (hybridisierten) DNA (oder DNA/RNA) aufgetrennt worden sind. Hybridisierungstechniken, welche für die Verwendung mit Oiigonukleotiden zweckmässig sind, sind dem Fachmann bekannt.
Obschon Proben normalerweise mit einer nachweisbaren Markierung, welche eine leichte Identifikation erlaubt, verwendet werden, sind unmarkierte Oligonukleotide ebenfalls nützlich, beide als Vorläufer von markierten Proben oder für die Verwendung in Verfahren, welche dem direkten Nachweis von zweisträngigen DNA (oder DNA/RNA) nützlich sind. Demzufolge bezieht sich der Ausdruck «Oligonukleotide» sowohl auf die markierten als auch die unmarkierten Formen.
Ist einmal eine gewünschte DNA-Sequenz erhalten worden, kann sie auf vielfältige Weise manipuliert werden, um eine Expression zu erreichen; beispielsweise können chimäre Polypeptide hergestellt werden, indem Gen-Fragmente von mindestens zwei Polypeptiden, die Sequenzen aufweisen, die mindestens oberhalb 30% homolog zu natürlich vorkommenden Wachstumsfaktoren sind, die den EGF-Rezep-tor («natürliche Liganden») binden, kombiniert werden. Es ist erwünscht, dass die dreidimensionale Struktur, insbesondere die Schlaufenstruktur des Polypeptides erhalten bleibt, insbesondere derjenige
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Teil oder diejenigen Teile der Struktur, welche für die Bindung zum EGF-Rezeptor und für die biologische Aktivität der natürlich vorkommenden Wachstumsfaktoren, welche sich an den EGF-Rezeptorbinden, verantwortlich sind.
Je nach der Quelle der Fragmente und der Länge des gewünschten Polypeptides können gewünschte Restriktionsstellen in die verwendeten synthetischen Gene eingebaut werden, um die obenbeschriebenen chimären Polypeptide zu konstruieren. Wenn immer möglich, lassen die Restriktionsstellen die Aminosäuresequenz des Polypeptides unverändert, in einigen Fällen jedoch kann der Einbau von neuen Restriktionsstellen eine geänderte Aminosäuresequenz bewirken, ohne die Aktivität des Proteins zu verändern.
Wenn das Gen in einem Wirt exprimiert wird, welcher die transkriptionalen und translationalen, regulatorischen Gebiete des Wildtypes des Wachstumsfaktors erkennt, können seine gesamten Gene mit seinen 5' - und 3' -regulatorischen Gebieten des Wildtypes in einen zweckmässigen Expressionsvektor eingebaut werden. Es existieren zahlreiche Expressionsvektoren, welche Replikationssysteme von Säugetierviren, wie Simian-Virus 40, Adenovirus, der bovine Papilloma-Virus, Vaccinia-Virus, Insekten-Baculovirus usw. verwenden. Diese Replikationssysteme sind entwickelt worden, um Markierungen zur Verfügung zu stellen, welche die Auswahl von Transvektionsmitteln erlauben, ebenso um geeignete Restriktionsstellen zur Verfügung zu stellen, welche in das Gen eingebaut werden können.
Wenn ein Gen in einem Wirt exprimiert werden muss, welcher die natürlichen, transkriptionalen und translationalen, regulatorischen Gebiete des Wildtypes nicht erkennt, sind weitere Manipulationen erforderlich. Es ist eine Anzahl von zweckmässigen 3'-transkriptionalen, regionalen Regionen bekannt, welche stromabwärts vom Stopcodon eingebaut werden können. Die nicht-codierenden 5'-Regionen, die stromabwärts vom interessierenden Gen liegen, können durch eine Endonukleasen-Restriktion, Bal31 Resektion oder dergleichen entfernt werden.
Wenn andererseits eine zweckmässige Restriktionsstelle in der Nähe des 5'-Terminus des interessierenden Gens vorhanden ist, kann das interessierende Gen einer Restriktion unterworfen werden und es kann ein Adapter für die Verbindung des interessierenden Gens mit der Promotorregion verwendet werden, wenn der Adapter für die verlorenen Nukleotide des interessierenden Gens erforderlich ist. Es können zahlreiche Strategien verwendet werden, um eine Expressionskassette zu erhalten, welche in der 5'-3'-Richtung der Transkription eine transkriptionale, regulierende Region und eine translationale Startregion aufweist, welche regulierende Sequenzen für die Einleitung der Regulierung umfassen kann; interessierende Gene unter transkriptionaler und translationaler Steuerung der Startregion; und eine transkriptionale und translationale Abschlussregion.
Für die zweckmässige Auswahl von regulierenden Sequenzen müssen folgende Faktoren, welche die Expression beeinflussen können, in Betracht gezogen werden. Für die transkriptionale Regulierung sind die Menge und die Stabilität der Messenger-RNA wichtige Faktoren, welche die Expression des Genproduktes beeinflussen. Die Menge der mRNA wird durch die Anzahl Kopien des besonderen Gens, durch die relative Effizienz seines Promotors und den Faktoren, welche den Promotor regulieren, wie Verbesserer oder Repressoren, bestimmt. Es wird angenommen, dass der Start in der Region stattfindet, welche unmittelbar stromaufwärts vom Beginn der Codierungssequenz liegt.
Der Promotor in prokaryontischen Zellen enthält Nukleotidsequenzen, welche die Effizienz der Transkription beeinträchtigen können. Die Sequenzen umfassen die regulierenden Regionen bei etwa -35 und -10 Nukleotiden vom Start der DNA-Kette. Effiziente Promotoren umfassen solche, worin die Nukleotidsequenz der-35 und -10-regulierenden Regionen im wesentlichen die gleiche ist, wie entsprechende Sequenzen für diese Regionen in bakteriellen Promotoren von hoch-effizienten Genen. Im allgemeinen weisen diese Regionen eine Länge von etwa 5 Nukleotiden bzw. 6 Nukleotiden auf und jede Sequenz kann um ungefähr ein Nukleotid in der Länge oder in der Sequenz variieren. Eine bevorzugte Sequenz der -35 Übereinstimmungs-Regulierungssequenz stammt vom trp-Promotor, nämlich TGACA und für die -10-Übereinstimmungs-Regulierungssequenz vom lac-Promotor, nämlich TATAAT.
Nicht nur die Nukleotidsequenzen, jedoch auch der Zwischenraum von Übereinstimmungssequen-zen -35- und -10-regulierenden Regionen aufeinander bezogen wichtig für die Erhaltung der optimalen Transkription des interessierenden Gens. Im allgemeinen sind die Übereinstimmungssequenzen der -35 und -10-regulierenden Regionen durch etwa 16 bis 18 Nukleotide, vorzugsweise durch etwa 17 Nukleotide, getrennt. Jede Sequenz kann um etwa 1 Nukleotid variieren.
Illustrative, transkriptionale Regulationsregionen oder Promotoren umfassen für Bakterien den ß-gal-Promotor, der linke und rechte lambda-Promotor, trp- und lac-Promotor, trp-lac-Fusionspromotor usw.; synthetische Promotoren, deren Sequenzen im wesentlichen ähnlich zu diesen Sequenzen sind, können ebenfalls verwendet werden. Ein bevorzugter Promotor für Bakterien ist ein Fusionspromotor, welcher die -35-regulierende Region des trp-Promotors und die -10-regulierende Region des lac-Promotors aufweist. Besonders bevorzugt ist der Promotor ein solcher, worin die -35-trp-Übereinstimmungssequenz ungefähr 17 Nukleotide stromaufwärts von der -10-lac-Übereinstimmungssequenz liegt. Für Hese, gly-kolytische Enzym-Promotoren, wie ADH-I und -II-Promotoren, GPK-Promotor und PGI-Promotor, trp-Promotor usw.; für Säugetierzellen SV40, früher und später Promotor, der späte Adenovirus-Haupt-promotor, 15-Promotor oder Verstärkersequenzen und dergleichen.
Die transkriptionale, regulierende Region kann zusätzliche regulierende Sequenzen umfassen, welche die Mässigung der Expressionszeit des Gens von Interesse erlaubt, z.B. durch Gegenwart oder
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Abwesenheit von Nährstoffen oder Expressionsprodukten im Wachstumsmedium, Temperatur usw. Beispielsweise kann die Expression des interessierenden Gens durch die Temperatur des Wirtszellen-Wachstumsmediums durch Zufügen einer regulierenden Sequenz, einschliesslich des Bakteriophagen lambda PL-Promotors, des Bakteriophagen lambda-OL-Operators und des Gens CI857, welches den temperaturempfindlichen Ci-Rezeptor im Expressionsvektor codiert, reguliert werden. Dies erlaubt eine Regulierung des Promotors durch Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor und dem Operator bei niederen Temperaturen, beispielsweise bei etwa 30°C. Eine Erhöhung der Temperatur auf etwa 42°C würde den Rezeptor inaktivieren und das interessierende Gen könnte exprimiert werden.
Ein Beispiel einer Mässigung unter Verwendung von Wachstumsmediums-Nährstoffen, Regulierung des iac- oder trp-lac-Hybridpromotor kann durchgeführt werden, indem das Gen für den Lacl-Rezeptor verwendet wird, welche sich an den lac-Promotor im Gebiet stromabwärts von der -10-regulierenden Region bindet. Das Lacl-Rezeptorgen kann auf einem Episom vorhanden sein, vorzugsweise dem Lacl-verbesserten Mutanten oder kann in der Expressionskassette selbst enthalten sein. Die Gegenwart einer signifikanten Konzentration des Repressormoleküls im Wachstumsmedium hemmt die Promotorfunktion in Abwesenheit eines Induktors. Demzufolge verbessert die Zugabe von IPTG oder Lactose zum Wirtszellen-Wachstumsmedium die Promotorfunktion. Wenn der bakterielle Stamm Lac+ ist, kann Lactose als Induktor anstelle von IPTG verwendet werden. Sowohl in eukaryontischen wie auch in prokaryon-tischen Systemen können die Terminierungsregionen ebenfalls Sequenzen oder Strukturen enthalten, welche die Stabilität von mRNA-Arten erhöhen und eine höhere Expression bewirken. Demzufolge kann die transkriptionale, regulierende Region zusätzlich regulierende Sequenzen enthalten, welche die Transkription terminieren und welche Sequenzen oder Strukturen aufweisen, welche den Abbau der mRNA hemmen und demzufolge die Stabilität der mRNA-Arten erhöhen und somit eine höhere Expression bewirken. Es sind verschiedene Beispiele von prokaryontischen Sequenzen bekannt, beispielsweise der Trp-Terminator, den Gen 32(T4)-Terminator oder synthetische Terminatoren, welche eine ähnliche Sequenz wie das Gen 32 aufweisen.
In eukaryontischen Systemen bewirken die transkriptionale Terminierung, die RNA-Spaltung und die Polyadenylierungsregionen eine Eigenreifung für die mRNA-Transkripts und sind somit nötig für eine effiziente Expression. Die native 3'-untranslatierte Region kann genügend sein, das Polyadenylierungssi-gnal von beispielsweise SV40, das insbesondere eine Spieissstelle aufweist, welches eine effizientere Expression bewirkt, könnte jedoch ebenfalls verwendet werden. Alternativ könnte die 3'-untranslatierte Region, die von einem besonderen Zelltypus (beispielsweise Ig in Myelomzellen) exprimiert wird, mit dem interessierenden Gen fusioniert werden. Solche 3'-Sequenzen könnten ebenfalls mit 5'-regu!ierenden Sequenzen von den gleichen hochexprimierten Genen gepaart werden und könnten sogar Codierungsregionen im Leserahmen umfassen, um Fusionsproteine, wie oben beschrieben, zu bilden.
Für die translationale Regulierung, welche durch die Gegenwart von mRNA gegeben ist, kann die Ex-primierung durch Beeinflussung des Einleitungsgrades (Ribosomen-Bindung an die mRNA) den Grad der Verlängerung (Transport des Ribosoms durch mRNA), Grad der posttranslationalen Änderungen und der Stabilität des Genproduktes beeinflusst werden. Der Verlängerungsgrad wird wahrscheinlich durch Codongebrauch beeinflusst; die Verwendung des Codons für seitende tRNA kann den Translationsgrad reduzieren. Es wird demzufolge bevorzugt, Codons zu verwenden, welche häufiger erscheinen in Genen, welche normalerweise durch Wirtszellen zur Verbesserung des Translationsgrades exprimiert werden.
in Prokaryonten befinden sich stromabwärts von den -35- und -10-regulierenden Regionen eine Übereinstimmungssequenz, im allgemeinen AGGA, welche als Shine-Daigarno-Sequenz bezeichnet wird, von welcher angenommen wird, dass sie in die ribosomale Bindung involviert ist. Es kann eine optimale Bindung und Einleitung der Translation erreicht werden, indem eine Ribosomen-Bindungstelle verwendet wird, welche in Wirtszellen von hochexprimierten Genen funktionell ist. Der Beweis deutet ebenfalls auf die Gegenwart von Nukleotidsequenzen hin, welche um die Shine-Daigarno-Sequenz liegen und auf Sequenzen innerhalb der Codierungsregion, welche die Ribosomen-Bindung beeinflussen kann, möglicherweise durch Bildung von strukturellen Motiven, durch welche das Ribosom die Einleitungsstelle erkennt. Die Änderung von Nukleotidsequenzen der codierenden Region kann demzufolge für die Erzielung einer optimalen Bindung und Einleitung der Translation verwendet werden. Die Sequenz der ersten ungefähr 7 bis 30 Codons nach dem Einleitungscodon ATG kann ebenfalls die Bindung und die Expression beeinträchtigen. Vorzugsweise werden die Leadersequenz und die Shine-Daigarno-Sequenz vom gleichen Gen gewonnen oder wenn sie von verschiedenen Genen erhalten werden, können die Codons der Leadersequenz durch Codon-Degenierung bis zur Näherung einer Nukleotidsequenz des natürlichen Gens, welches der Leadersequenz folgt, verändert werden, wie dies in der parallelen U.S. Patentanmeldung Serial Number 264 098 vom 28. Oktober 1988 beschrieben, auf welche ausdrücklich Bezug genommen wird.
Die Stellung der AGGA-Sequenz bezüglich dem Einleitungs-ATG-Codon kann die Expression beeinflussen. Im allgemeinen befindet sich die Shine-Daigarno-Sequenz ungefähr 5 bis 9 Nukleotide vom Einleitungscodon entfernt, obschon unerwarteterweise ein hoher Grad der Expression erzielt werden kann, wenn Expressionskassetten verwendet werden,-worin die Shine-Daigarno-Sequenz ungefähr 10 bis 13 Nukleotide, vorzugsweise 11 bis 12 Nukleotide, vom Einleitungscodon entfernt ist.
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Die Stabilität der mRNA ist abhängig von der Empfindlichkeit der mRNA gegen Ribonuklease-Enzyme. Im allgemeinen wird die Exonuklease-Verdauung gehemmt durch die Gegenwart durch strukturellen Motiven am Ende der mRNA, Rückfallstrukturen, geänderten Nukleotiden oder spezifischen Nukleotiden. Es wird angenommen, dass die Endonuklease-Verdauung an spezifischen Kennungsstellen innerhalb der mRNA vorkommt und stabile mRNA keine solchen Steilen aufweisen. Es besteht ebenfalls ein gewisser Beweis, dass mRNA, welche einen hohen Translationsgrad aufweisen, ebenfalls gegen Abbau durch die Gegenwart von Ribosomen an der mRNA geschützt sind.
Die Stabilität des Expressionsprodukts kann erzielt werden, indem eine Synthese eines Fusionsproteins vorgesehen wird, worin das gewünschte Polypeptid in Konjunktion mit einem zweiten Polypeptid oder einem Fragment davon exprimiert wird. Vorzugsweise wird die Stabilität des Expressionsproduktes erreicht, indem eine Synthese eines Fusionsproduktes vorgesehen wird, in weichem das interessierende Polypeptid verbunden mit einer Niedersequenz exprimiert wird. Eine DNA-Sequenz, welche eine N-terminale Aminosäuresequenz von beispielsweise einem hochexprimierenden bakteriellen oder bakterio-phagen Gen, wie dem bakteriophagen lambda-N-Proteingen, cro-Gen und ss-Galactosidase oder einem eukaryontischen Gen, wird stromaufwärts von und im Leserahmen mit dem interessierenden Gen verbunden. Die Leadersequenz enthält normalerweise 8 bis etwa 50, vorzugsweise 50 bis 45 und besonders bevorzugt 18 bis 25 N-terminale Aminosäuren.
Die Expression des interessierenden Polypeptids als fusioniertes Protein mit einer Leadersequenz von einem andern Gen besitzt verschiedene Vorteile, zusätzlich zur verleihten Stabilität. Beispielsweise verleiht die Gegenwart der N-terminaien Aminosäuren ein Mittel für die Verwendung von allgemeinen Reinigungstechniken für die Reinigung einer Anzahl von Polypeptiden. Beispielsweise sind die N-termi-nalen Aminosäuren des N-Proteins besonders antigenisch und demzufolge spezifische Antikörper, welche gegen die N-terminalen Aminosäuren des N-Proteins als Mittel für die Reinigung von Fusionsproteinen, welche den N-Terminus des N-Proteins enthalten, verwendet werden können. Im weiteren besitzt der N-Terminus des N-Proteins eine hohe positive Ladung, welche die Reinigung des gewünschten Proteins durch lonenaustausch-Chromatographie und dergleichen erleichtert.
Die Leadersequenz kann ebenfalls eine hydrophobe Aminosäuresequenz sein, welche zusätzlich als Signalsequenz für die Sekretion dient. Eine DNA-Sequenz, welche die Signalsequenz codiert, wird stromaufwärts vom und im Leserahmen mit dem interessierenden Gen verbunden. Typischerweise umfasst die Signalsequenz eine Spaltstelle, welche durch eine Signalsequenz-Peptisdase erkannt wird. Demzufolge erlaubt die Positionierung des interessierenden Polypeptides direkt nach der Signalsequenz-Spaltstelle, dass das interessierende Polypeptid spezifisch von der Signalsequenz abgespalten und als reifes Polypeptid ausgeschieden wird. Beispiele von hydrophoben Aminosäuresequenzen umfassen die bakterielle alkalische Phosphatase-Signalsequenz;- die OMP-A-B-C-D-E — oder F-Signalse-quenzen; die LPP-Signalsequenz, ß-Lactamase-Signalsequenz; und Toxin-Signalsequenzen und Mutanten davon. Für eukaryontische Zellen können Signaisequenzen die Signalsequenzen des Affen-TGF-ß, P97-Gen (humanes Melanom-Antigen), K. lactis-Killertoxin-Seauenz. Faktor des alpha-Paarungstyps und andere Kiilertoxin-Signalsequenzen oder die normale Signalsequenz in Verbindung mit dem interessierenden Gen, zusammen mit Mutanten von Signalsequenzen umfassen.
Andere Leadersequenzen, die verwendet werden können, umfassen hydrophile Sequenzen, beispielsweise die N-terminalen 41 Aminosäurereste vom Amphiregulin, welches die Änderung der Funktion des interessierenden Polypeptides verursachen kann. Zusätzlich kann ein cytotoxisches Mittel, wie ein Toxin-A-Kettenfragment, die Ricin-A-Kette, das wachstumsverhindernde Peptid des Schlangengiftes oder ein zielgerichtetes Molekül, wie ein Hormon oder ein Antikörper, kovalent mit der Leadersequenz gekuppelt werden, wobei in den meisten Fällen ein minimaler Effekt auf die biologische Aktivität auf das interessierende Genprodukt ausgeübt wird. Wie für andere Leadersequenzen beschrieben, ist eine DNA-Sequenz, welche die Leadersequenz codiert, stromaufwärts von und im Leserahmen mit dem interessierenden Gen verbunden.
Wenn die Leadersequenz keine Signalsequenz ist oder keine bequeme natürliche Spaltstelle aufweist, können zusätzliche Aminosäuren eingefügt werden, um eine enzymatisch oder chemisch spaltbare Steile für die Abspaltung des Leaderpeptides nach der Reinigung des Fusionsproteins einzufügen, um eine anschliessende Reinigung des reifen. Polypeptids zu ermöglichen. Beispielsweise erleichtert die Einführung von säurelabilen Aspartyl-Prolin-Bindungen zwischen zwei Segmenten des Fusionsproteins ihre Trennung bei niederen pH. Dieses Verfahren ist für das gewünschte Polypeptid nicht zweckmässig, wenn es säurelabil ist. In einem weiteren Beispiel kann das Fusionsprotein mit beispielsweise Cyanbromid gespalten werden, weiches spezifisch für die Carboxyseite des Methioninrestes ist. Die Einfügung eines Methionins zwischen der Leadersequenz und dem gewünschten Polypeptid ermöglicht die Freisetzung des gewünschten Polypeptides. Dieses Verfahren ist nicht zweckmässig, wenn das gewünschte Polypeptid Methioninreste enthält.
Wenn die Leadersequenz eine Signalsequenz enthält, können die interessierenden Gene mit den sekretorischen Leadersequenzen mit oder ohne Leadersequenz exprimiert werden, unter der Voraussetzung, dass die Sequenz zurückgehalten oder abgespalten werden kann. Zusätzlich ist es wünschenswert, um einen hohen Anteil des gewünschten Polypeptides als reifes abgespaltenes und wiedergefaltetes Peptid, welches im Medium ausgeschieden wird, zu erhalten, einen Promotor zu verwenden, wie der tac-Promotor, welcher bei niederen Temperaturen, beispielsweise bei etwa 30°C, wirken kann. Unerwar-
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teterweise konnten hohe Anteile des Sekretes bei niederen Temperaturen erhalten werden. Extrem hohe Expressionsgrade können die gesamten translationalen Änderungen des Proteines verhindern, was zur Aggregation und Akkumulation von ungespaltenen Vorläufern führt (d.h. Strukturprotein und sekretorischer Leader). In ähnlicher Weise kann das Wachstums bei erhöhten Temperaturen, beispielsweise bei 42°C ebenfalls zu Aggregation und Akkumulation von ungespaitenem Vorläufer führen. Die Herstellung von fusionierten Proteinen, einschliesslich der Verfahren für die Spaltung und das Wiederfalten der interessierenden Polypeptide sind im weiteren in der parallellen U.S. Patentanmeldung Serial Number 264 098, beschrieben.
Nach jeder Manipulation an DNA in der Entwicklung der Kassette wird das Plasmid geklont und nach Bedarf isoliert, die besondere Kassettenkomponente auf ihre Sequenz analysiert, um sicherzustellen, dass die Eigensequenz erhalten wurde. Je nach der Natur der Manipulation kann die gewünschte Sequenz vom Plasmid abgetrennt und in einen anderen Vektor eingeführt werden oder das Plasmid kann einer Restriktion unterworfen werden und die Expressionskassetten-Komponente kann zweckmässig manipuliert werden. In einigen Fällen kann ein Shuttle-Vektor verwendet werden, welcher fähig ist, die Replikation in verschiedenen Wirten, welche verschiedene Replikationssysteme erfordern, durchzuführen. Dies kann gegebenenfalls zusätzliche Markierungsmittel erfordern, welche in beiden Wirten funktionieren. Wenn solche Markierungsmittel erforderlich sind, können diese in den Vektor einverleibt werden. Das Plasmid, weiches die Kassette enthält, zwei Replikationssysteme und Markierungsmittel können erforderlichenfalls von einem Wirt in einen anderen übertragen werden. Für die Auswahl ist jedes nützliche Markierungsmittel verwendbar. Es ist wünschenswert, dass es gegen Neomycin oder Tetracyclin resistent ist. Obschon ein Markierungsmittel für die Auswahl aus Bequemlichkeitsgründen stark erwünscht ist, sind ebenfalls andere Auswahlverfahren für transformierte Zellen beschrieben worden. Vergleiche beispielsweise G. Reipin, et al., Current Genetics, 1982, 189-193. Die transformierten Zellen können ebenfalls durch spezifische Produkte einem Screeningverfahren unterworfen werden, beispielsweise kann die Synthese einen gewünschten Produktes durch immunologische und enzymatische Methoden bestimmt werden.
Die Expressionskassette in ein Replikationssystem einverleibt werden für die episomale Aufrechterhaltung in einem zweckmässigen zellulären Wirt oder kann ohne Replikationssystem verwendet werden, wenn sie in das Wirtsgenom integriert wird. Die DNA kann auf übliche Weise in den Wirt eingeführt werden, wie beispielsweise durch Transformation unter Verwendung von Kalziumphosphat-ausgefällter DNA, Transvektion durch In-Kontakt-Bringen der Zellen mit dem Virus, Mikroinjektion der DNA in Zellen oder dergleichen. Wenn einmal das Gen von Interesse in einen zweckmässigen Wirt einverleibt worden ist, kann der Wirt wachsen, um das interessierende Gen zu exprimieren.
Es kann eine Vielzahl von Wirtszellen verwendet werden. Beispiele von prokaryontischen Zellen umfassen gram-negative Organismen, wie E. coli, beispielsweise JM109, JM101 und JM107; HB101, DH1 oder DH5. Besonders zweckmässig sind grampositive Organismen, wie B. subtilis. welche keinen peripheren Zwischenraum besitzen und direkt Polypeptide in das Wachstumsmedium ausscheiden können. Eukaryontische Wirtszellen können beispielsweise Hefezellen, Insektenzellen und Säugetierzellen sein, beispielsweise COS-Zellen, CHO-Zellen, Affennierenzellen und Seidenraupenzellen (sf9).
Die Konstruktion, welche das Gen von Interesse und flankierende Regionen, welche für die Regulierung der Expression verantwortlich sind, kann durch jedes übliche Mittel in den Expressionswirt eingeführt werden, beispielsweise durch Transformation, beispielsweise mit Kalziumphosphat-ausgefällter DNA, durch Transfektion, Transduktion, Konjugation, Mikroinjektion usw. Der Wirt kann dann in hoher Dichte in einem zweckmässigen Nährmedium gezüchtet werden. Wenn der Promotor einführbar ist, werden erlaubte Bedingungen verwendet, beispielsweise Änderung der Temperatur, Erschöpfung oder Überfluss eines metabolischen Produktes oder eines Nährstoffes oder dergleichen.
Wenn beispielsweise die regulatorische Sequenz den bakteriophagen lambda-PL-Promotor, dem bak-teriophagen lambda-OL-Operator und den temperaturempfindlichen CI857-Repressor enthält, können die Wirtszellen ungehindert durch die Nachfrage der Synthese des fremden Genproduktes wachsen, was zusätzlich für den Wirtsorganismus toxisch sein kann. Wenn die Wirtszellen eine optimale Dichte erreicht haben, kann die Temperatur auf eine nicht erlaubte Temperatur, beispielsweise auf etwa 42°C erhöht werden, wobei in diesem Moment der Cl-Repressor inaktiv wird, was eine Transkription vom PL-Promotor erlaubt. Die maximale Sekretion kann erhalten werden, indem der lac-Promotor oder ein trp-lac-Promotor verwendet wird und die Induktion mit einem metabolischen Induktor, wie Lactose für einen lac+-Wirtsstamm erfolgt und zu lac Ii auf dem Vektor führt. Beispiele von Wirtszellen, welche in einem solchen System verwendet werden können, umfassen DH1, DH5 oder HB101.
Wenn das Produkt in der Wirtszelle zurückgehalten wird, werden die Zellen geerntet, lysiert und das Produkt isoliert und gereinigt, z.B. durch Extraktion, Ausfällung, Chromatographie oder Elektrophorese. Wenn das Produkt ausgeschieden wird, kann das Nährmedium gesammelt werden und das Produkt auf übliche Weise beispielsweise durch Affinitätschromatographie isoliert werden. Zur Herstellung eines aktiven Proteins kann es nötig sein, dass das Protein wiedergefaltet wird. Wenn das Protein als Fusionsprotein exprimiert wird, mit einer Niedersequenz, kann die Niedersequenz durch Behandlung mit beispielsweise Ameisensäure oder Cyanbromid entfernt werden. Die Leadersequenz wird vorzugsweise nach der Wiederfaltung des Proteins entfernt.
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Die rekombinanten Produkte können gegebenenfalls glykosyliert werden mit der Wildtypglykosylie-rung oder einer anderen Giykosylierung. Im allgemeinen unterscheidet sich die Glykosylierung durch nicht mehr als 50% und üblicherweise durch nicht mehr als 20% von der Wildtypglykosylierung. Der Anteil der Glykosylierung ist teilweise von der Sequenz des besonderen Peptides und ebenso vom produzierenden Organismus abhängig. Demzufolge führt die Expression des Produktes in E. coli-Zellen zu einem unglykosylierten Produkt und die Expression des Produktes in Insektenzellen normalerweise in ein weniger glykosyliertes Produkt als die Expression des Produktes in Säugetierzellen.
Verwendung von Wachstumsfaktoren
Die erfindungsgemässen Zusammensetzungen finden eine grosse Anzahl von Anwendungen in vitro und in vivo als Agonisten oder Antagonisten für Wachstumsfaktoren, wie epidermale Wachstumsfaktoren (EGF) und transformierende Wachstumsfaktoren, insbesondere alpha-TGF. Eine Diskussion von Wachstumsfaktoren, welche selbst oder in Kombination mit anderen Zusammensetzungen, insbesondere Polypeptidzusammensetzungen für die Regulierung des Wachstums von Zeilen und andere Aktivitäten verwendet werden, können beispielsweise gefunden werden im Handbook of Expérimentai Pharmacolo-gy, Tissue Growth Factors, Hrg. Baseraga, Band 57, Springer-Verlag, Berlin, 1981, Kapitel 3, insbesondere Seiten 98-109; und Carpenter, Ann. Rev. Biochem. (1979) 48:193-216.
Der humane EGF scheint identisch zum humanen Urogastron zu sein und übt eine Vielzahl von Effekten auf das prenatale und neonatale Gewebewachstum. Solche Effekte sind das frühreife Augenöffnen, die Wundheilung,' das Hervorbrechen von Vorderzähnen und eine beschleunigte Reifung der Lunge. EGF-Rezeptoren können in einer Vielzahl von erwachsenen Geweben gefunden werden. EGF kann ebenfalls die Phosphorylierung des eigenen Rezeptors stimulieren. EGF steht ebenfalls in einer Beziehung zur verbesserten Knochenresorption.
Der transformierende Wachstumsfaktor, insbesondere alpha-TGF, besitzt viele analoge Aktivitäten, wie diejenigen von EGF. TGF bindet sich an den EGF-Rezeptor, was zur Phosphorylierung des Rezeptors, der Verbesserung seiner Tyrosin-spezifischen Kinase-Aktivität und zur Stimulierung des Zellwachstum führt. Cohen, in Biological Response Mediators and Modulators (Hrg. August, J.T.), Acade-mic, New York, 1983, Seiten 7-12; Tarn et al., nature (1984), 309:376-378; Ibbotson et al., Science (1983) 221:1292-1294.
Die Myxom- und Shope-Fibrom-Viren induzieren eine signifikante Erhöhung des proliferativen Potentials von Zellen innerhalb des befallenen Bereichs. Während Vaccinia ein kleineres proliferatives Ereignis an der Infektionsstelle induziert, induziert das Shope-Fibrom-Virus das proliferative Hauptereignis, was zu einer Tumorbildung führt, welche bei erwachsenen Kaninchen gutartig ist, jedoch bei immuno-suppressierten Erwachsenen oder in Neugeborenen proliferativ und invasiv ist. Das Myxomvirus induziert einen schnell verbreiteten Myxosarkomtumor. Obschon diese proliferativen Ereignisse aufgrund von anderen viralen Faktoren verursacht werden könnten, scheint der virale Wachstumsfaktor stark in die induzierte zelluläre Proliferation verwickelt zu sein, welche durch die virale Infektion bewirkt wird.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können insbesondere als Medikamente, als Agonisten für EGF und für die Wundheilung, wie für die Epithelisierung von Wunden, wie für Verbrennungen, Augenwunden, chirurgischen Schnitten und dergleichen verwendet werden. Der Wirkstoff kann in üblichen Trägersubstanzen, beispielsweise Silvaden, in einem genügenden Anteil um die Epithelisierung und/oder Wundheilung, normalerweise in Anteilen von 0,01 bis 10,0 ng/ml, üblicherweise von 0,075 bis 5,0 ng/ml EFG-Äquivalenten, vorzugsweise 0,5 bis 5 p.g/ml verwendet werden. Die Formulierung wird über die Wunde ausgebreitet, damit eine vollständige Beschichtung der Wunde mit der Formulierung erhalten wird. Die Behandlungen können bis zu viermal pro Tag durchgeführt werden oder nur jeden zweiten Tag oder weniger, je nach der Natur der Wunde und der Reaktion auf die Behandlung, der Konzentration des Wirkstoffes und dergleichen.
Die erfindungsgemässen Zusammensetzungen können als Wirkstoffe in diagnostischen Tests oder für die Herstellung von Reagenzien verwendet werden, beispielsweise für polyklonale oder monoklonale Antikörper. Als Wirkstoffe können sie für den Nachweis von analogen Wachstumsfaktoren oder für den Nachweis von Antikörpern auf die Wachstumsfaktoren in physiologischen Flüssigkeiten, wie Blut, verwendet werden.
Je nach den besonderen Umständen und dem Zweck des Reagens, kann das Polypeptid markiert oder unmarkiert sein. Es wurde eine grosse Vielzahl von Markiersubstanzen verwendet, welche direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal erzeugen. Diese Markiersubstanzen umfassen Radionuklide, Enzyme, fluoreszierende Substanzen, Partikel, chemiluminiszierende Substanzen, Enzymsubstrate oder Cofaktoren, Enzyminhibitoren, magnetische Partikel usw. Vergleiche beispielsweise US-A 3 654 090, 3 817 837, 3 935 074, 3 996 345,4 277 437, 4 374 925 und 4 366 241.
Es besteht eine grosse Anzahl von Methoden für die Verbindung der Markiersubstanzen mit Polypeptiden, welche die Verwendung von N-terminalen -Aminogruppen für die Funktionalisierung eines Py-razolons umfassen können, während andere freie Aminogruppen geschützt sind, wobei das Pyrazolon dann mit verschiedenen Reagenzien in Kontakt gebracht wird, beispielsweise mit Aminogruppen, um den das nachweisbare Signal verursachenden Rest zu binden. Durch Schutz der Arginin-Aminosäuren, welche an der dritten Schlaufe beteiligt sind oder sich nahe davon befinden, können andere Argine funktio-
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nalisiert werden, beispielsweise für die Konjugation mit Aminogruppen oder Thiogruppen auf übliche Weise funktionalisiert werden. Alternativ können die Polypeptide mit dem Wirkstoff in Kontakt gebracht werden, beispielsweise einer aktivierten Carbonsäure, welche zufällig substituiert ist, wobei das biologisch aktive Material vom biologisch inaktiven Material als Resultat der zufälligen Substitution abgetrennt wird. Schliesslich kann in Abhängigkeit der Synthesemethode das Polypeptid geändert werden, um die gewünschte Funktionalität als Teil des Syntheseverfahrens zu erhalten.
Die erfindungsgemässen Zusammensetzungen können ebenfalls für die den Nachweis von EGF-Re-zeptoren verwendet werden. Die erfindungsgemässen Zusammensetzungen können ebenfalls für den Nachweis der zellulären Antwort auf EGF und/oder TGF verwendet werden, indem für die Konkurrenz zwischen diesen natürlich vorkommenden Materialien und einer Zusammensetzung gemäss der vorliegenden Erfindung gesorgt wird. Auf diese Weise können Änderungen in der Rezeptorkonformation nachgewiesen werden.
Die Hauptzusammensetzungen können ebenfalls für verschiedene therapeutische Zwecke, einschliesslich der Stimulation des Wachstums oder der Steuerung der Knochenbildung verwendet werden. Diese Verbindungen können in zweckmässigen physiologischen Trägern intraperitoneal, subkutan, intravenös, intraarteriell verabreicht werden oder direkt auf der betroffenen Stelle aufgetragen werden. Zusätzlich können die erfindungsgemässen Zusammensetzungen in Liposome einverleibt werden, wobei gegebenenfalls die Verwendung von Antikörpern für die Zielrichtung in Betracht gezogen werden kann. Zahlreiche Träger umfassen phosphat-gepufferte Salzlösung, Kochsalzlösung, Wasser oder dergleichen. Die Konzentration der Zusatzstoffe kann in einem weiten Rahmen variieren, je nach der letzten Verwendung und der Aktivität.
Es können ebenfalls andere Additive in den Formulierungen vorhanden sein, wie EGf, TGF oder andere Faktoren, Bakteriozide, wie beispielsweise Antibiotika, Bakteriostatika, Puffer usw.
Für die Herstellung von Antikörpern können die erfindungsgemässen Polypeptide, worin pp1-4 Wasserstoff ist oder kurze Oligopeptidketten (mit weniger als fünf Aminosäuren) mit antigenischen Polypeptiden oder Proteinen verbunden werden, um in Säugetierwirte zu injizieren. Das antigenische Protein besitzt etwa 60 Aminosäuren und hat normalerweise ein Molekulargewicht von nicht mehr ais 100 ku (kilodalton). Es existieren Techniken für die Verbindung von Polypeptiden, entweder an einer spezifischen Stelle oder zufällig, unter Venwendung von bifunktionellen Reagenzien, beispielsweise von p-Maieimidobenzoesäure, Glutaraldehyd, p,p'-Benzidin usw. Gewöhnliche antigenische Proteine umfassen bovines Serumalbumin, Schlüssellochschnecken-Hämocyanin, Tetanustoxoid usw. Die erfindungsgemässen Polypeptide sind an das antigenische Protein in genügender Anzahl verbunden, um die gewünschte immunogene Antwort zu erzielen. Üblicherweise sind zwei oder mehr Verstärkungseinspritzungen nach der ursprünglichen Einspritzung erforderlich. Für Antiseren wird dem immunisierten Wirt das Blut entnommen und die immunoglobulinfraktion isoliert. Für monoklonale Antikörper wird die Milz isoliert und Splenozyten werden mit einem zweckmässigen Fusionspartner in üblicher Weise fusioniert. Die resultierenden Hybridome werden dann einem Screening auf die Antikörperbindung an die epitopi-schen Stellen des erfindungsgemässen Polypeptides unterworfen. Diese Antikörper können für eine Vielzahl von Zwecken, wie beispielsweise als diagnostische Reagenzien, für die Therapie usw. verwendet werden. Die Antikörper können, wenn sie als Reagenzien eingesetzt werden, gegebenenfalls markiert werden, wie dies für die Polypeptide beschrieben wurde.
Aufgrund der folgenden Beispiele wird die Erfindung ohne Einschränkung erläutert.
EXPERIMENTELLER TEIL Biologische Hinterlegungen
Die folgenden Expressionsplasmide, welche sämtliche in E. coli HB101 transformiert wurden, wurden am angegebenen Datum bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, U.S.A. hinterlegt und besitzen die folgenden Identifikationen und ATCC-Hinterlegungsnummern:
Identifikation
ATCC-Hinterlegungsnr. Hinterlegungsdaium
PBM11 PBM14
67366
67367
PBM11/PA/VGF PBM11/DP/VGFa PBM11/PA/EGF PBM11/M5
67417
67418
67419
67436
67437 67547
3. Juni 1987 3. Juni 1989 3. Juni 1989
PBM11/C2 PBM11/NDP/EGF
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Verfahren
Die allgemeinen verwendeten Kionierungstechniken sind in Maniatis et ai., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, New York beschrieben. Alle DNA-modifizie-renden Enzyme wurden von kommerziellen Herstellern geliefert. Sie wurden gemäss den Herstellervorschriften verwendet. Die Materialien und Apparaturen für die DNA-Reinigung und Trennungen wurden in Obereinstimmung mit den Instruktionen der Lieferfirmen gebraucht.
Beispiel I
Herstellung von synthetischen Genen von Interesse
Es wurden synthetische Wachstumsfaktorgene entworfen, deren Wirtszellencodons für die hochgradige Expression optimiert waren. Zusätzlich wurden verschiedene zweckmässige Restriktionsstellen in den synthetischen Genen entworfen. Wenn möglich, wurde durch die neuen Restriktionsstellen die Aminosäuresequenz des Wachstumsfaktorgens unverändert gelassen, in einigen Fällen führte jedoch die Einverleibung von neuen Restriktionsstellen zu einer geänderten Aminosäuresequenz. Diese Stellen teilen die synthetischen Gene in Drittel und ergaben einen N-terminalen, einen mittleren und einen C-ter-minalen Bereich.
Das natürliche VGF-Genprodukt enthält einen extrem N-terminalen Bereich, welcher kein Gegenstück im reifen TGF aufweist. Die VGF-Fragmente, welchen dieser Bereich fehlt, werden als verstümmelt bezeichnet. Die Restriktionsstellen wurden für die Anfangskonstruktion des finalen Genes aus partiellen, synthetischen Oligonukleotidfragmenten verwendet, welche sich von einer Restriktionsstelle zur anderen ausdehnen. Die Oligonukleotide wurden auf einem Applied Biosystems Oligonukleotid-Synthesi-zer synthetisiert und wurden auf einem Acryiamidgel gereinigt. Die Oligonukleotide wurden am 5'-Ende unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert und jedes Oligonukleotid wurde dann mit seinem Komplement gehärtet.
A. Synthetische TGF-Oligonukleotide
1. Humaner N-terminaler TGF-Bereich
TGF ->
Bs-sHIINcoI
MVVSHFNDCPDSHTQFC 5' CGCGCCATGGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGC 3 ' GGTACCAACAAAGAGTGAAATTGCTGACGGGCCTGAGAGTATGAGTCAAAACG
Kpnl F H G T
TTTCATGGTAC 3' TGF104 AAAGTAC 5' TGF1Û3
2. Modifizierter humaner mittlerer TGF-Bereich. wobei die humane Seouenz QEDK in QEEK geändert wurde, der Seouenz. weiche in Ratten-TGF gefunden wurde
Kpnl Sohl
CRFLVQEEKPAC 5' CTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATG 31 TGF101
3' CATGGACGGCAAAAGACCAAGTCCTTCTTTTTGGCC 5' TGF102
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3. Humaner C-terminaler TGF-Bereich vchsgyvgarcehadll c . cgtttgccattctggctacgttggcgcacgttgcgaacacgctgacctgctg
3 • gtacgScggtaagaccgatgcaaccgcgtgcaacgcttgtgcgactggacgac
BamHI
A Ter
GCTTAAG 3' TGF205
CGAATTCCTAG 5' TGF206
B. Synthetische VGF-OIigonukleotide 1. Extremer N-terminaler VGF-Bereich
HindiII
EDSGNAIETTSPEITNATT 5 * AGCTGACTCTGGTAACGCTATCGAAACTACTTCTCCGGAAATCACTAACGCTACTACT 3' V 3' CTGAGACCATTGCGATAGCTTTGATGAAGAGGCCTTTAGTGATTGCGATGATGA 5' V
2. Modifizierter N-terminaler VGF-Bereich. einschliesslich der Aso-Pro-Spaltstelle. mit der Sequenz HGT. welche die natürliche Sequenz HGD ersetzt
BamHI
IDPM'DIPAIRLCGPEGDGY 5 ' GATCGATCCCATGGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTAC 3 ' CTAGGGTACCTGTAGGGCCGATAGGCAGACACGCCGGGCCTTCCGCTGCCGATG
Kpnl
C L H G T TGCCTGCATGGTAC 3' VGF104a ACGGACGTAC 5' VGF103a
3. Modifizierter mittlerer VGF-Bereich. worin die Seouenz GYAC die natürliche Sequenz GMYC ersetzt
Kpnl SphI
TCIHARDIDGYAC 5' CTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATG 3' VGFlOla 3' CATGGACGTAGGTACGTGCACTGTAGCTGCCGATGC 5' VGF102a
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4. C-terminaler VGF-Bereich am 5' -Ende
SphI EcoRI
CRCSHGYTG 51 CCGTTGCTCTCATGGCTACACTGG 3' VGF1A
3! GTACGGCAACGAGAGTACCGATGTGACCTTAA 5' VGF2A
5. Modifizierter C-terminaler VGF-Bereich. 5'-Ende. wobei die Sequenz VCS die natürliche Seouenz RCS ersetzt
SphI EcoRI
VCSHGYTG 5' CGTTTGCTCTCATGGCTACACTGG 3' VGF1
3' GTACGCAAACGAGAGTACCGATGTGACCTTAA 5' VGF2
6. C-terminaler VGF-Bereich. 3'-Fraament. mit der Endung YQR anstelle von PNT dem abgeleiteten C-Terminus von natürlich ausgeschiedenem VGF
EcoRI BamHI
IRCQHVVLVDYQR Ter 5' AATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCG-TTAAGGATC 3' VGF3 3' GCAACGGTCGTACAACAAGACCAGGTGATGGTCGCAATTC 5' VGF 4
C. Synthetische EGF-Oligonukleotide
Drei Sätze von überlappenden synthetischen Oligonukleotiden 1(A,B), 2(A,B) und 3(A,B), welche humanen EGF codieren, wurden auf einem Applied Biosystems Oligonukleotid-Synthesizer sequeniert und auf einem Acrylamidgel gereinigt. Die Oiitonukleotide wurden am 5'-Ende unter Verwendung von T4-Po-lynukleotodkinase phosphoryliert. Jedes Oiigonukleotid wurde mit seinem Komplement gehärtet.
1.
NcoIEcoRI
MNSDSECPLSHDGY
5' CATGAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCATGACGGCTAC 3' EG FIA
3' TTAAGACTGAGACTTACGGGCGACAGAGTACTGCCGATGACGGAC 5' EGF2A
2j_
Nsil SphI
CLHDGVCHYIEALDKYAC
5' TGCCTGCATGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGACAAGTACGCATG 3 ' EGF1B 3' GTACTGCCGCA.TACGTACATGTAGCTTCGAGACCTGTTCATGC 5' EGF2B
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3.
Sohl
NCVVGYIGERCQYRDLK 5 ' CAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGTGACCTGAAA
3 ' GTACGTTGACGCAACAACCGATGTAGCCGCTTGCAACGGTCATGGCACTGGACTTT
BamHI
W W E L R *'
TGGTGGGAACTGCGTTAAG 3' EGF3
ACCACCCTTGACGCAATTCCTAG 5' EGF4
Beispiel il
Beschreibung der Klonieruna und Expression von Plasmiden
A. Das Plasmid pLEBam wurde verwendet, um synthetische Oligonukleotidfragmente zu klonieren, da es die praktischen BssHIl und BamHI-Restriktionsstellen aufweist. Ein Plasmid mit Ncol und BamHl-Re-striktionsstellen, wie pBM11 oder pBM11/NDP (nachstehend beschrieben) kann für die Klonierung der synthetischen Nukleotidfragmente oder anderer DNA-Sequenzen von Interesse verwendet werden.
B. Plasmid oBM11. beschrieben in der parallelen U.S. Patentanmeldung, Serial Number 264 098 vom 28. Oktober 1988, erlaubt die Klonierung eines interessierenden Gens stromabwärts der DNA-Sequen-zen, welche die 33 N-terminalen Aminosäuren des bakteriophagen lambda-N-Gens codieren, bei der Restriktionsstelle BamHI. Nach der Induktion des lambda-PL-Promotors durch Inaktivierung des temperaturempfindlichen C1857 Repressors bei 42°C wird das fremde Genprodukt als C-terminaler Teil eines Fusionsproteins exprimiert, dessen N-terminale Sequenz diejenige des N-Gens ist.
C. Plasmid PBM11M4. beschrieben in der parallelen U.S. Patentanmeldung, Serial Number 264 098 vom 28. Oktober 1988, ist von pBM11 abgeleitet und erlaubt, dass ein Gen von Interesse bei der BamHI-Restriktionsstelie direkt nach dem initiierenden Methionins des Gens kloniert werden kann. Das Plasmid pBM11/M4 enthält ebenfalls die Ncol-Stelle des Neomycingens.
D. Plasmid PBM11M5. beschrieben in der parallelen U.S. Patentanmeldung, Serial Number 264 098 vom 28. Oktober 1988, ist von pBM11 abgeleitet, worin eine Ncol-Stelle. die im Neomycin-Widerstands-gen vorhanden ist, durch stellengerechte Mutagenese entfernt worden. Die Klonierung eines Genes von Interesse in pBM11/M5 erfordert demzufolge keine partielle Verdauung des Vektors mit Nçol.
E. Plasmid pBM11/NDP. beschrieben in der parallelen U.S. Patentanmeldung, Serial Number 264 098 vom 28. Oktober 1988, ist von pBM11 abgeleitet und hat DNA-Sequenzen, welche ein säurelabiles Aspa-ragin-Prolin-Dipeptid codiert, welches zwischen den Sequenzen, welche das N-Gen und ein interessierendes Gen codieren, insertiert ist. Das Plasmid enthält eine Ncol-Stelle und eine Çlal-Stelle für die Klonierung eines interessierenden Gens stromabwärts des pl-Promotors.
F. Plasmid PBM11/PAD. beschrieben in der parallelen U.S. Patentanmeldung, Serial Number 264 098 vom 28. Oktober 1988, ist vom Plasmid PBM11M4 abgeleitet und ermöglicht, dass ein interessierendes Gen bei Hindill. Smal oder BamHI stromabwärts einer modifizierten, alkalischen Phosphatase-Signalse-quenz geklont werden kann.
G. Plasmid pBM11/PAK. beschrieben in der parallelen U.S. Patentanmeldung, Serial Number 264 098 vom 28. Oktober 1988, ist vom Plasmid pBM11M4 abgeleitet und erlaubt, dass ein interessierendes Gen bei Hindlll. Smal oder BamHI stromabwärts einer alkalischen Phosphatase-Signalsequenz kloniert werden kann.
H. Plasmid oTCPt wurde so entworfen, dass es die tac-Promotorelemente enthält und als Cro-SD verwendet werden kann, um das interessierende Gen nach der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz ex-primieren zu können. Ein Beispiel der Konstruktion dieses Plasmides ist nachstehend in der Konstruktion von pTCPt/EGF angegeben.
Konstruktion von pTNPt ([trp-35]217bp[lac-10][nSD]8bp[ATG]/alkalines Phosphatasesignal/Linker/ trans.term.-NEO)
Dieses Plasmid wurde so entworfen, dass es tac-Promotorelemente aufweist und das N-Gen SD zur Expression eines gegebenen Gens hinter der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz verwendet. Es besitzt einen pBR322-Hintergrund mit einem Neomycin-Widerstandsgen. Das Plasmid pTNPt wurde fol-gendermassen konstruiert:
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(a) Herstellung des 2.8kb EcoRI-BamHI-Fraament von pBM16t/VGFa. welchem die Hindlll-Stelle fehlt
Das Plasmid pBM16t/VGFa wurde mit EcoRI und BamHI verdauut und das 2,8kb-Fragment wurde isoliert. Das 2,8kb-Fragment wurde mit einem EcoRl-BamHI-Linker verbunden und die korrekte Konstruktion wurde durch Restriktionsanalyse isoliert und als Zwischenprodukt I bezeichnet.
Die einzige Hindlll-Stelle in der Nähe des Neomycin-Widerstandsgens wurde vom Zwischenprodukt I-Plasmid durch Verdauung mit Hindlll entfernt, wobei unter Verwendung eines Klenow-Fragmentes stumpfe Enden erhalten wurden und diese wiederum verbunden wurden. Daraus resultierte das Zwischenprodukt Il-Plasmid, dem die Hindlll-Stelle fehlte.
Das 2,8kb EcoRl-BamHl-Fraoment von pBM16t/VGFa, welchem die Hindlll-Stelle fehlte, wurde isoliert, indem das Zwischenprodukt Ii mit EcoRI und BamHI verdauut wurde. Das resultierende Fragment wurde durch Agarosegel-Elektrophorese isoliert.
(b) Herstellung des 150bp BamHl-Bsml-Fraomentes von dBM1 1/PAK
Das Plasmid pBM11/PAK ist identisch mit pBM11/PAK/ EGF, mit der Ausnahme, dass es eine Verbindungsregion mit den Hindlll. Smal und BamHI-Stellen stromabwärts der alkalischen Phosphatase-Si-gnalsequenz anstelle des EGF-Gens enthält. pBM11/PAK wurde mit Bsml und BamHI verdauut und ein 150bp-Fragment, welches das N-Gen SD, die alkalische Phosphatase-Signalsequenz und die Verbindungsregion enthielt, wurde isoliert.
(c) Herstellung der Oligonukleotide TacA+ und TacA-
Die Oligonukleotide TacA+ und TacA- wurden auf einem Applied Biosystems Oiigonukleotid-Synthesi-zer synthetisiert und wurden so entworfen, dass sie einen EcoRI-Überhano am 5'-Ende mit der trp-35-Übereinstimmungssequenz, die von lac-10-Übereinstimungssequenz durch 17 Nukleotide abgetrennt ist, innerhalb welcher eine Sstl-Stelle vorhanden war, aufwies. Die Sequenz enthielt ebenfalls das 5'-Ende der lac-mRNA, die lac-Rezeptorbindungsstelle und einen Bsml-Überhano.
TacA+ 51AATTACTCCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGAGCTC
GTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAG 31
TacA- 51GTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATA
CGAGCTCGATGATTAATTGTCAACAGGGGGATGGGGAGT 3'
(d) Verbindung und Isolierung von pTNPt
Das 2,8kb EcoRI-BamHI-Fraament. das 150bp Bsml-BamHI-Fraament und die Oligonukleotide TacA+ und TacA- wurden miteinander unter Verwendung von DNA-Ligase verbunden und die DNA wurde zur Transformierung von ausreichendem JM109(lacIq) verwendet. Es wurde eine korrekte Konstruktion durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenierung isoliert.
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(EcoRI-Stelle von pBMll)
I
GAATTACTCCCCATCC
SstI
trp-35 (17bp) lac-10
CCCTG [TTGACA] ATTAATCATCGAGCTCG (TATAATG)
Bsml
51 lac mRNA-> n mRNA->
TGTGG/AATTGTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGCATTCAAAGCAGAAGGCT
TTGGGGTGTGTGATACGAAACGAAGCATTGGCCGTAAGTGCGATTCCGGATTAGC
TGCCAATGTGCCAATCGCGGGGGGTTTTCGTTCAGGACTACAACTGCCACACACC
-Pvul mSD (8bp) Signal Sequenee- -> ACCAAAGCTAACTGAC {ACCA} GAATCCAG ATGAAACAATCTACGATCGCCC
MKQSTIAL
Smal
Hindlll BamEI
TCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTTCCCGGGATCCGTG ALLPLLFTPVTK
(BamHI-Stelle von pBMll)
Trans. Term. j
ACTAATTGGGGACCCTAGAGGTCCCCTTTTTTATTTTAAAACGATCC
I. Das Plasmid plac/cro-B aal besteht aus dem Operator-Promotor-Gebiet des E. coli-Lactose (lacV Operon, ebenso wie die ribosomalen Bindungsstellen von lag und ero. Das Plasmid wurde konstruiert, wie in der parallelen U.S. Patentanmeldung, Serial Number 264 098 beschrieben. Die Fusionsproteine, welche durch diesen Vektor exprimiert wurden, entstehen aus dem N-Terminus des bakteriophagen lamb-da-Cro-Proteins, der Aminosäuresequenz, weiche durch die insertierte DNA codiert wurde und den C-Terminus von ß-Galactosidase. Die kontrollierenden Elemente dieses Vektors bestehen aus der Opera-tor-PromotorRegion des E. coli-Lactose (Jaç)-Operons, ebenso wie die ribosomalen Bindungsstellen von lac und ero.
J. Plasmid ptac/cro-ß-oal erlaubt, dass ein Gen von Interesse stromabwärts der N-terminalen 21 Aminosäuren des bakteriellen Cro-Proteins kloniert werden kann. Das Plasmid wurde, wie in der paralle-
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Ieri U.S. Patentanmeldung 264 098 konstruiert. Der Expressionsvektor ptac/cro-ß-gal ist ähnlich dem plac/cro-ß-gal, mit der Ausnahme, dass der Promotor des ptac/cro-ß-gal aus der -35-Region des Promotors des Tryptophan-Operons und dem Pribnow-Kasten des lac-Operons besteht. Dieser hybride Promotor erlaubt einen höheren Expressionsgrad als plac/cro-ß-gal.
K. Das Plasmid pRSV erlaubt die Expression eines interessierenden Gens in eukaryontischen Zellen mit dem RSV LTR-Promotor, Gorman et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA (1982) 79:6777-6781.
L. Plasmid pAc610. Smith et al., Molec. Cell. Biol. (1983) 12:2156-2165, erlaubt die Expression eines fremden Gens in Insektenzellen.
M. Plasmide pToxl und dTqx2 erlauben die Expression eines interessierenden Gens in Hefezellen unter Verwendung der X. lactis-Killtoxin-Sianalseauenz (EMBO 6, 229-234 (1987); Biochem., Biophys. Res. Comm. 144: 613-619 (1987)). Diese Konstruktion besitzt das URA3-Gen für die Selektion in Hefe und das AMP-Gen für die Selektion in Bakterien. Die Transkription wird mit dem CYCI-Promotor und GAL stromaufwärts der Aktivierungssequenz eingeleitet (Methods Enzymol., 101, 181-191 (1983) und ändert innerhalb dem 3'-Ende des FLP-Gens (Mol. Cell. Biol., 5, 2770-2780 (1985). Die Konstruktion besitzt sowohl den 2-Mikronursprung und den pBR322-Ursprung für die Replikation in Hefe bzw. E. coli. Die Killertoxin-N-terminale Region mit der Signalsequenz und der Kex2-Spaltungsstelle wurde auf Ligo-nukleotiden eingeführt und enthielt die A-T-reiche Region unmittelbar vor dem Initiatorcodon, wobei eine optimale Translationseinleitung und Verlängerungssignale aufrechterhalten wurden. Es wurden verschiedene Restriktionsstellen eingebaut, um die Insertion von interessierenden Genen sowohl von der Signalspaltungsstelle als auch von der Kex2-Spaltungsstelle zu ermöglichen.
1. Herstellung des 3kb EcoRI-Espl-Fraamentes von PBR322.
welches den Ursprung und das AMP-Widerstandsgen enthält
Das Plasmid pLGSD5(-ATG), ein Hefe-Expressionsvektor (Methods Enzymol. 101:181-191 (1983)) wurde mit EcoRI und Espi verdauut und es wurde das 3, Okb-Fragment isoliert.
2. Herstellung des 2.1 kb EcoRI-Espl-Fraomentes des 2 Mikronolasmides.
welches das 3'-Ende des FLP-Gens und den Ursprung enthält
Das Plasmid pLGSD5(-ATG) wurde mit EcoRI und Espi verdauut und es wurde das 2,1kb-Fragment isoliert.
3. Verbindung und Isolierung des Zwischenprodukt I-Plasmides
Die 2,1 kb und 3kb-EcoRI und Espl-Fraqmente wurden miteinander verbunden, wobei DNA-Ligase verwendet wurde und die DNA wurde verwendet, um ausreichend HB101 zu transformieren. Es wurde eine korrekte Konstruktion durch Restriktionsanalyse isoliert.
4. Herstellung des 1.8kb EcoRl-BamHl-Fraamentes von pLGSD5 (-ATGÌ.
welches das URA3-Gen. GAL UAS und den CYCI-Promotor enthielt
Das Plasmid pLGSD5(-ATG) wurde mit EcoRI und BamHI verdauut und das 1,8kb-Fragment wurde isoliert. Die BamHI-Stelle ist innerhalb eines Linkers, welcher 4bp stromabwärts des CYCl-Initiators inser-tiert wurde, vorhanden.
5. Herstellung der Oligonukleotide pToxl A+. 2A-. 1B+. 2B-
Die Oligonukleotide wurden so entworfen, dass sie die Codons für die Signalsequenz von K. lactis-Kil-lertoxin mit der BamHI-Stelle stromabwärts des CYCl-Initiators verbinden. Zur Konservierung der optimalen Translationseinleitung wurden 13bp einer A-T-reichen Sequenz stromaufwärts des Killertoxin-In-itiatorcodons einverleibt. Dieses Sequenz stimmt mit der Übereinstimmungssequenz überein, welche für die Hefe-Einleitungscodons bestimmt wurde, eine Bglll-Steile wurde direkt stromaufwärts der A-T-Regi-on plaziert, um eine Mutagenese der Einleitungsregion der Signalsequenz zu ermöglichen. Eine Hindlll-Stelle wurde 10 Nukleotide stromaufwärts von der Signalspaltungsstelle angeordnet, um die Mutagenese für stromaufwärts liegende Sequenzen und die Verbindung von Genen von Interesse zu ermöglichen. An den pToxl war eine Aval. Xhol-Stelle direkt stromabwärts der Signalspaltstelle vorhanden, während in pTox2 eine Nael-Stelle an der Signalspaltstelle für die Stumpfende-Klonierung direkt über der Signalspaltstelle vorhanden, welche von Gly-Leu in Ala-Glys geändert wurde.
Die Auflösung des Heteroduplex an der Spaltstelle sollte zur Bildung von Klonen führen, welche die pToxi-Sequenz enthalten, welche ihrerseits die pTox2-Sequenz enthalten. In beiden Konstruktionen codieren die nachfolgenden Sequenzen den Rest der Killertoxin-Vorläufersequenz abwärts von der Kex2 Lys-Arg-Spaltstelie, an welchem Punkt verschiedene Restriktionsstellen (StuI, Sa[l, Acci. Hincll und BamHI) vorhanden, um die Klonierung des interessierenden Gens zu erleichtern. Die Stul-Stelle erlaubt die Stumpfend-Klonierung direkt nach dem Arg-Codon der Kex2-Spaltungstelle. Die Oligonukleotide be22
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sitzen einen BamHI-Überhana am 5'-Ende und einen Hindlll-Überhana am 3'-Ende und ermöglichen die Klonierung eines Zwischenvektors. Die resultierende Sequenz weist keine der beiden Stellen mehr auf.
(BamHI) Bglll Hindlll
MNIFYIFLFLLS 1A+ 5 ' GATCAGATCTAATAATTATAAAATGAATATATTTÎACATATTTTTGTTTTTGCTAAGC 2A- 3 ' TCTAGATTATTAATATTTTACTTATATAAAATGTATAAAAACAAAAACGATTCGAAG
Signal-Spaltungsstelle Kex2-Spaltungsstelle
(pToxl) / Aval/Xhol / StuI SalI,Acci BamH
FVQGLEHÏHRRGSLVKRPLSTDP 1B+ 5 ' TTCGTTCAGGGCCTCGAGCATACTCATAGAAGAGGCTCCTTAGTCAAAAGGCCTTTGTCGACGGATCC 2B- 3 1 AAGTCCGGCCGCTCGTATGAGTATCTTCTCCGAGGAATCAGTTTTCCGGAAACAGCTGCCTAGGTCG A G (pTox2) Nael
Diese Oligonukleotide wurden auf einem Applied Biosystems Synthesizer synthetisiert und wurden durch Gelelektrophorese gereinigt. Anschliessend wurden sie unter Verwendung von T4-Kinase phos-phoryliert und die komplementären Paare wurden zusammengeschmolzen, verbunden und gelgereinigt.
6. Herstellung des EcoRI-Hindlll-Zwischenprodukt I-Vektors
Der Zwischenprodukt I-Vektor wurde mit EcoRI und Hindlll verdauut und dann mit alkalischer Phosphatase behandelt. Diese Behandlung entfernte ein kleines EçoRI-Hindl Il-Fragment und liess eine Hindlll-Stelle stromabwärts der FLP 3'-Sequenz zurück.
7. Verbindung und Isolierung von pToxl und dTqx2
Das 1,8kb EcoRI-BamHI-Fraoment wurde mit dem Oligonukieotid-Fragment unter Verwendung von DNA-Ligase verbunden und das resultierende Fragment wurde gelgereinigt und anschliessend mit dem EcoRI-HindlII-Zwischenprodukt I-Vektor verbunden und die DNA wurde zur Transformation von genügendem HB101 verwendet. Die korrekten Konstruktionen wurden identifiziert unter Verwendung der Restriktionsanalyse und der DNA-Sequenierung und es wurde ein Klon mit der Sequenz pToxl und eines mit der Sequenz pTox2 isoliert. Beiden Klonen fehlte die BamHI-Stelle an der Verbindung der Oligonukleotide und des Zwischenprodukt I-Vektors.
Beispiel III
Zusammensetzungen von Wachstumsfaktorgenen für die Expression in prokaryontischen Zellen
A. Herstellung des Plasmides pLEBam/TTV
Der synthetische chimäre Wachstumsfaktor, welcher als TTV oder (TGF/TGF/VGF) bezeichnet wurde, wurde im Klonierungsvektor pLEBam zusammengesetzt. Dieser hybride Wachstumsfaktor enthielt die Aminosäuresequenz des humanen TGF in den aminoterminalen 2/3 des Gens, mit der Ausnahme der Sequenz QEEK, welche von der natürlichen Sequenz QEDK geändert wurde. Der Carboxyterminus wurde von der Aminosäuresequenz von VGF abgeleitet und mit der Sequenz YQR stromaufwärts von der natürlichen Sequenz PNT terminiert. Das Plasmid pLEBam wurde mit BssHIl und BamHI verdaut. BssHII-BamHI pLEBam wurde dann zu den Oligonukleotiden TGF101,102,103 und 104 und VGFI, 2,3, und 4 unter Verwendung von DNA-Ligase verbunden und die resultierenden Plasmide wurden zur Transformierung von genügendem HB101 verwendet. Die Transformanten wurden auf Ampicillin ausgewählt und durch Restriktionsanalyse unter Verwendung von EcoRI. Ncol und BamHI und durch Nukleotidsequenierung nach Maxa-Gilbert einer Restriktionsanalyse unterworfen. Es wurde eine korrekte Konstruktion isoliert und mit pLEBam/TTV bezeichnet.
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TGF -Ncol ccatggttgtttctcactttaacgactgcccggactctcatactcagttttgctt mvvshfndcpdshtqfcf
VGF -
Kpnl SphI
tcatggtacctgccgttttctggttcaggaagaaaaaccggcatgcgtttgctct hgtcrflvqeekpacvcs
EcoRI
catggctacactggaattcgttgccagcatgttgttctggtcgactaccagcgt egïtgirc-qhvvlvdyqr
BamHI TAAGGATCC
ter
B. Herstellung des Plasmides pLEBam/TW
Der synthetische chimäre Wachstumsfaktor, welcher als TW oder (TGF/VGF/VGF) bezeichnet wurde, wurde im Klonierungsvektor pLEBam zusammengesetzt. Dieser hybride Wachstumsfaktor enthielt die Aminosäuresequenz von humanem TGF im N-terminalen Bereich des Gens. Der mittlere und der C-terminale Bereich wurden von der verstümmelten VGF-Sequenz abgeleitet und das Ende von der Sequenz YQR stromaufwärts der natürlichen Sequenz PNT. Zusätzlich besitzt das synthetische Gen die Modifikation GYACVC für GMYCRC.
(a) Herstellung von 4,3kb Kpnl-Sphl-Fraament von pLEBam/TTV
Das Plasmid pLEBam/TTV wurde mit Kpnl und Sohl verdauut und das 4,3kb Kpnl-Sphl-Fraament wurde gelgereinigt. Diese Verdauung entfernt den mittleren TGF-Bereich vom synthetischen Gen TTV im Klonierungsplasmid pLEBam.
(b) Verbindung und Isolierung von pLEBam/TW
Die Oligonukleotide VGF101a und 102a wurden mit dem 4,3kb Kpnl-Sphl-Fraament von pLEBam/TTV unter Venwendung von DNA-Ligase verbunden und die resultierende Mischung wurde verwendet, um HB101 genügend zu transformieren. Die Transformanten wurden auf Ampicillin ausgewählt und einem Screening durch Nukleotidsequenierung unter Verwendung der Sanger-Didesoxy-Methode einem Screening unterworfen. Es wurde eine korrekte Konstruktion isoliert und mit pLEBam/TW bezeichnet.
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TGF *
Ncol ccatggttgtttctcactttaacgactgcccggactctcatactcagttttgctt mvvshfndcpdshtqfcf
VGF *
Künl SjdIiI
tcatggtacctgcatccatgcacgtgacatcgacggctacgcatgcgtttgctct hgtcihardidgyacvcs
EcoRI
catggctacactggaattcgttgccagcatgttgttctgctcgactaccagcgt hgytgircqhvvlvdy qr
BamHI
taaggatcc
Ter
Beispiel IV
Expression des interessierenden Polypeptides als Fusionsprotein mit dem N-Protein
A. Modifizierter synthetischer TGF
1. Herstellung von pBM11/N/TGF
Der modifizierte humane TGF wurde in diesem System als Teil einer Fusion mit 33 N-terminalen Aminosäuren des N-Gens exprimiert und hat die Sequenz QEEK, welche die humane Sequenz QEDK ersetzt.
(a) Herstellung eines 780 bp SohI-PvuI-Fraamentes von pBM11/N/TTV
Das Plasmid pBM11/N/TTV wurde mit Sohl und Pvul verdauut und das 780 bp SphI-PvuI-Fraqment wurde gelgereinigt. Dieses Fragment enthielt Teile des pBM11-Plasmides am Pvul-Ende und am Sehl-Ende, das N-Gen und die N-terminalen 2/3 des humanen TGF-Gens.
(b) Herstellung des 5 kb BamHI-Pvul-Fragmentes von pBM11/N/TTV
Das Plasmid pBM11/N/TTV wurde mit BamHI und Pvul verdauut und das 5 kb BamHI-PvuI-Fraament wurde gelgereinigt.
(c) Verbindung und Isolierung von pBM11/N/TGF
Die Oligonukleotide TGF205 und 206, das 780 bp Sohl-Pvul-Fraament und das 5 kb BamHI- Pvul-Fragment von pBM11/N/TTV wurden zusammen verbunden und zur Transformation von genügendem HB101 verwendet. Die Transformanten wurden auf Neomycin ausgewählt und durch Restriktionsanalyse unter Verwendung von EcoRI und der Nukleotidsequenierung nach der Sanger-Didesoxy-Methode einer Restriktionsanalyse unterworfen. Die korrekte Konstruktion wurde isoliert und mit pBM11/N/TGF bezeichnet.
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atggat.gcacaaacacgccgccgcgaacgtcgcgcagagaaacaggctcaatgga mdaqtrrrerraekqaqvîk
BamHI
aagcagcaaatcccctgttggttggggtaagcgcaaaaccagttcggatccgcat aanpllvgvsakpvrirm tgf -
ggttgtttctcactttaacgactgcccggactctcatactcagttttgctttcat vvshfndcpdshtqfcfh
Kpnl SphI
GGTACCTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATGCGTTTGCCATTCTG GTCRFLVQEEKPACVCHSG
BamHI
GCTAGGTTGGCGCACGTTGCGAACACGCTGACCTGCTGGCTTAAGGATCC YVGARCEHADLLA Ter
B. Modifiziertes synthetisches TGF-VGF-Hvbrid
1. Herstellung von pBM11/N/TTV
In dieser Konstruktion wurde ein synthetisches modifiziertes TTV-chimäres Gen als C-terminaler Teil eines Fusionsproteine mit den ersten 33 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus exprimiert. Dieser hybride Wachstumsfaktor enthielt die Aminosäuresequenz von humanem TGF in den aminoterminalen 2/3 des Gens mit der Ausnahme, dass die Sequenz QEEK anstelle der natürlichen, humanen Sequenz QEDK vorhanden war. Der Carboxyterminus wurde von der Aminosäuresequenz von VGF abgeleitet und mit der Sequenz YQR stromaufwärts der natürlichen Sequenz PNT terminiert.
(a) Herstellung des synthetischen NcoKstumpfì-BamHl TTV-Gens
Das Plasmid pLEBam/TTV wurde mit Ncol verdauut und die Enden wurden stumpf gemacht, indem die Überhänge unter Verwendung des Klenow-Fragmentes von DNA-Polymerase gefüllt wurden. Die DNA wurde dann mit BamHI verdauut und das 170 bp NcoKstumpfi-BamHI TTV-Fragment wurde einer Gelreinigung unterworfen.
(b) Herstellung des BamHI-verdauuten pBM11 Das Plasmid pBM11 wurde mit BamHI verdauut.
(c) Verbindung und Isolierung von pBM11/N/TTV
BamHl-verdauutes pBM11, das Ncolfstumpfl-BamHl TTV-Fragment und die BamHI-Linker (5'GATCCG3') wurden unter Verwendung von DNA-Ligase miteinander verbunden und die resultierende Mischung wurde verwendet, um HB101 genügend zu transformieren. Die Transformanten wurden auf Neomycin ausgewählt und einem Screening unterworfen, wobei eine Restriktionsanalyse und eine Nukleotidsequenierung nach der S'anger-Didesoxy-Methode verwendet wurden. Es wurde eine korrekte Konstruktion isoliert und mit pBM11/N/TTV bezeichnet.
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BamHI
aagcagcaaatcccctgttggttggggtaagcgcaaaaccagttcggatccgcat aanpllvgvsakpvrirm tgp -
GGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTTTCAT VVSHFNDCPDSHTQFCFH
Kpnl SphI VGF ■*
GGTACCTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATGCGTTTGCTCTCATG GTCRFLVQEEKPACVCSHG
EcoRI
GCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGTTAAG YTGIRCQHVVLVDYQR Ter
BamHI GATCC
Beispiel V
Herstellung des Polypeptides von Interesse als Fusionsprotein mit dem N-Protein und einer Spaltungsstelle
A. Modifizierter synthetischer VGF
1. Herstellung von pBM11/NDP/VGFA
Die N-terminale Sequenz des synthetischen VGFA-Gens ist eine verstümmelte Version der natürlichen VGF-Sequenz und beginnt mit der Sequenz DIPAIR. In diesem Plasmid befindet sich das VGFA-Fragment 32 Aminosäuren des lambda-N-Proteins und des Dipeptides Asparaginsäure-Proiin stromabwärts. Um die Konl-Klonierunasstelle zu bewahren, wurde die synthetische Sequenz zum Code CLHCGTC geändert, anstelle der natürlichen VGF-Sequenz CLHGDC und endet mit der Sequenz YQR stromaufwärts der natürlichen Sequenz PNT. Zusätzlich codiert das VGFA-Gen die Sequenz GYACVC, welche die natürliche Sequenz GMYCRC ersetzt.
(a) Herstellung des Kpnl-BamHI 89bp C-terminale Fragment des synthetischen VGF-Gens
Das Plasmid pLEBam/TVV wurde mit Kpnl und BamHI verdauut und das 80bp KonI-BamHI-Fraament wurde gelgereinigt. Das Fragment enthält die C-terminalen 2/3 des synthetischen VGF-Gens, mit der Kpnl-Stelle am 5'-Ende.
(b) Herstellung von BamHI-verdauuten dephosphoryliertem pBM11
Das Plasmid pBM11/N/TTV wurde mit BamHI verdauut und die 5'-Phosphate wurden durch Behandlung mit intestinaler alkalischer Kalbsphosphatase entfernt. Das 5,6kp BamHI-Plasmidfraament wurde gelgereinigt.
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(c) Verbindung und Isolierung von pBM11/NDP/VGFA
Die Oligonukleotide VGF103a, 104a, das 5,6kb BamHI-Fragment von pBM11 und das 80bp Kpnl-Bam-Hl-Fragment von pLEBam/TW wurden zusammen unter Verwendung von DNA verbunden und dann für die ausreichende Transformierung von HB101 verwendet. Die Transformanten wurden auf Neomycin ausgewählt und wurden durch Restriktionsanalyse unter Verwendung von Clal und Nukleotidsequenie-rung gemäss der Sanger-Didesoxy-Technik einem Screening unterworfen. Es wurde eine korrekte Konstruktion isoliert und mit pBM11/NDP/VGFA bezeichnet. Diese Konstruktion hatte die Sequenzen GTC und GYACVC anstelle der authentischen VGF-Sequenzen GDC und GMYCRC.
N-qen -►
atggatgcacaaacacgccgccgcgaacgtcgcgcagagaaacaggctcaatgga mdaqtrrrerraekqaqwk
Clal
AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCGATC AANPLLVGVSAKPVRIDP
Ncol VGF -
CCÄTGGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTACTGCCT MDIPAIRLCGPEGDG.YCL
Kpnl SphI
GCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCGTTTGCTCT HGTCIHARDIDGYACVCS
EcoRI
CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGT HGYTGIRCQHVVLVDYQR
BamHI TAAGGATCC Ter
2. Herstellung von DBM11/NDPA/GFa
Die N-terminale Sequenz von VGFa ist eine verstümmelte Version der natürlichen VGF-Sequenz und beginnt mit der Sequenz DIPAIR. Zusätzlich enthält die VGFa-Sequenz die geänderten Sequenzen GTC und GYACRC, anstelle der natürlichen VGF-Sequenzen GDC und GMYCRC. In diesem Plasmid befindet sich das VGFa-Gen stromabwärts der 32 Aminosäuren des lambda-N-Proteins und des Dipeptides Asparaginsäure-Prolin. Die Behandlung des gereinigten Fusionsproteins mit Ameisensäure führt zu einer Spaltung an der säurelabilen Asparaginsäure-Prolin-Peptidbindung, was die Trennung des VGFa-Proteins vom lambda-N-Protein-Aminoterminus erlaubt. Die Spaltung ist von solcher Natur, dass das VGFa-Protein mit dem Prolinrest am Aminoterminus zurückbleibt.
(a) Herstellung von Sphl-verdauuten. dephosphyrlierten pBM11/DP/VGFA
Das Plasmid pBM11/DP/VGFA (10 jig) wurde mit 30 Einheiten Sohl verdauut und die 5'-Phosphate wurden durch Behandlung mit intestinaler alkalischer Kälberphosphatase entfernt. Das 5kb-Plasmidfrag-ment wurde nach der Elektrophorese auf einem Agarosegel wieder gewonnen.
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(b) Herstellung eines EcoRI-Sphl 70bp-Fragmentes von pBM11/DP/VGFA
Das Plasmid pBM11/DPA/GFA (10 ng) wurde mit 30 Einheiten EcoRI und dann mit 30 Einheiten SphI verdauut. Das 70bp-Fragment wurde nach der Elektrophorese auf einem Agarosegel gewonnen.
3. Verbindung und Isolierung von dBM1 1/NDP/VGFa
Das 24bp-Fragment, welches die Oligonukleotide VGF 1A und 2A enthielt, das 5bk Sohl-Fraament und das 70bp EcoRI-Sohl-Fraoment von pBM11/DP/VGFA wurden zusammen verbunden und die Mischung wurde verwendet, um fähige E. coli HB101-Zelien zu transformieren. Die Transformanten wurden durch Nukleotidsequenierung unter Verwendung der Sanger-Didesoxynukleotid-Methode einem Screening unterworfen. Ein korrekter Klon wurde isoliert und mit pBM11/NDP/VGFa bezeichnet.
N—gen *
atggatgcacaaacacgccgccgcgaacgtcgcgcagagaaacaggctcaatgga mdaqtrrrerraekqaqwk
Clal aagcagcaaatcccctgttggttggggtaagcgcaaaaccagttcggatcgatcc aa npllvgvsakpvridp
Ncol vgp -
ccatggacatcccggctatccgtctgtgcggcccggaaggcgacggctactgcct mdipairlcgpegdgycl
Kpnl SphI
GCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCCGTTGCTCT HGTCIHARDIDGYACRCS
EcoRI
CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGT HGYTGIRCQHVVLVDYQR
BamHI" TAAGGATCC Ter
B. Modifizierte synthetische TGF-VGF-Hybride 1. Herstellung von pBM11/NDP/TTV
In dieser Konstruktion wird das synthetische modifizierte TTV-chimäre Gen als C-terminaler Teil eines Fusionsproteins mit 32 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus exprimiert. Ein säurempfindliches As-paraginsäure-Prolin-Dipeptid trennt die zwei Teile der Fusion. Der hybride Wachstumsfaktor enthält die Aminosäuresequenz von humanem TGF in den aminoterminalen 2/3 des Genes mit der Ausnahme der Sequenz QEEK, welcher aus der natürlichen humanen TMR-Sequenz QEDK geändert wurde. Der Carboxy-terminus wurde von der Aminosäuresequenz des VGF abgeleitet und mit der Sequenz YQR stromaufwärts der natürlichen Sequenz PNT terminiert.
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(a) Herstellung des 5bk Ncol pBM11-Plasmidfragmentes
Das Plasmid pBM11/NDP/VGFA wurde mit Ncol verdauut und das 5bk Ncol-Plasmidfraament wurde gelgereinigt. Dieses Fragment hatte einen Ncol-Uberhana an der Asparaginsäure-Prolin-Spaltungsstel-le stromabwärts der Sequenzen, welche die ersten 32 Aminosäuren des N-Gens codieren. Die andere Ncol-Stelle befindet sich im Neomycin-Widerstandsgen.
(b) Herstellung des 0.6kb Ncol-BamHI pBM 11 -Fragmentes
Das Plasmid pBM11/N/TTV wurde mit Ncol und BamHI verdauut und das 0,6kb Ncol-BamHI-Plasmid-fragment wurde gelgereinigt. Dieses Fragment hatte den Ncol-Überhana im Neomycin-Widerstandsgen.
(c) Herstellung des 170bp synthetischen TGF/TGF/VGF-Fragmentes
Das Plasmid pLEBam/TTV wurde mit Ncol und BamHI verdauut und das Ncol-BamHI-170bp-Fragment, welches das synthetische TGF/TGF/VGF-Gen enthielt, wurde gelgereinigt. Dieses Fragment hatte den Ncol-Überhana am 5'-Ende des Gens und der BamHI-Überhana am 3'-Ende des Gens.
(d) Verbindung und Isolierung von pBM11/NDP/TTV
Das 5bk Ncol und die 0,6kb Ncol-BamHI-Plasmidfraamente wurden mit dem 170bp Ncol-BamHI TTV-Gen unter Verwendung von DNA-Ligase verbunden und die resultierende Mischung wurde verwendet, um das fähige HB101 zu transformieren. Die Transformanten wurden auf Neomycin in solcher Weise ausgewählt, dass nur Kolonien mit korrekt rekonstruierten Neomycin-Widerstandsgenen überleben würden. Die Transformanten wurden einem Screening unterworfen, wobei die Restriktionsanalyse mit Ncol und Nukleotidsequenierung nach der Sanger-Didesoxy-Technik verwendet wurde. Eine korrekte Konstruktion wurde isoliert und mit pBM11/NDP/TTV bezeichnet.
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atggatgcacaaacacgccgccgcgaacgtcgcgcagagaaacaggctcaatgga mdaqtrrrerraekqaqwk
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2. Herstellung von pBM11/NDP/VTV
In dieser Konstruktion wurde das synthetische modifizierte VTV-chimäre Gen als C-terminaler Teil eines Fusionsproteins mit den ersten 32 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus exprimiert. Ein säurelabiles Asparaginsäure-Prolin-Dipeptid trennt die zwei Teile der Fusion. Der hybride Wachstumsfaktor enthielt die Aminosäuresequenz des humanen TGF im mittleren Bereich mit der Aminosäuresequenz QEEK, welche die natürliche Sequenz QEDK ersetzt. Der N-terminale und der C-terminale Bereich wurden von der verstümmelten VGF-Sequenz abgeleitet und beginnen mit der Sequenz DIPAIR und enden mit der Sequenz YQR, weiche stromaufwärts der natürlichen Sequenz PNT liegt.
(a) Herstellung eines 5bk BamHI-Ncol-Fraamentes des pBM11
Das Plasmid pBM11/N/TTV wurde mit BamHI und Ncol verdauut und das Sbk BamHl-NcoI-Fraament wurde gelgereinigt. Dieses Fragment enthält einen BamHI-Überhano am 3'-Ende der Sequenzen, welche die ersten 32 Aminosäuren des N-Gens codieren und eine Ncol-Stelle im Neomycin-Widerstandsgen.
(b) Herstellung eines 700bp Kon l-Ncol-Fraqmentes von pBM11/N/TTV
Das Plasmid pBM11/N/TTV wurde mit Kpnl und Ncol verdauut und das 700bp Kpnl-Ncol-Fragment wurde gelgereinigt. Dieses Fragment setzt sich zusammen aus einem Teil des Plasmides pBM11, das einen Teil des Neomycin-Widerstandsgens am Ncol-Überhana enthält und aus dem C-terminalen VGF-Bereich des synthetischen TTV-Gens am Koni-Überhang.
(c) Verbindung und Isolierung von pBM11/NDP/VTV
Die Oligonukleotide VGF103a und 104a, das 5kb BamHI-Ncol-Fraament von pBM11 und das 700bp Konl-Ncol-Fraament von pBM11/N/TTV wurden untereinander unter Verwendung von DNA-Ligase verbunden und dann zur Transformierung von fähigem HB101 verwendet. Die Transformanten wurden auf Neomycin ausgewählt und wurden durch Restriktionsanalyse unter Verwendung von Clal und der Nukleotidsequenierung nach dem Sanger-Didesoxy-Verfahren einem Screening unterworfen.
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3. Herstellung von pBM1 6/NDP/TVV
In dieser Konstruktion wurde das synthetische modifizierte TVV-chimäre Gen als C-terminaler Teil eines Fusionsproteins mit den ersten 32 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus exprimiert. Ein säurelabiles Asparaginsäure-Prolin-Dipeptid trennt die zwei Teile der Fusion. Der hybride Wachstumsfaktor enthielt die Aminosäuresequenz von humanem TGF im N-terminalen Bereich. Der mittlere und der C-ter-minale Bereich waren von der verstümmelten VGF-Sequenz abgeleitet und enden mit der Sequenz YQR. Zusätzlich hat das synthetische Gen die Modifikation GYACVC anstelle von GMYCRC.
(a) Herstellung des 4,3kb Ncol-Bglll-Fragmentes von pBM11/NDP/VGFa
Das Plasmid pBM11/NDP/VGFa wurde mit Ncol und Balli verdauut und das 4,3kb-Fragment wurde gelgereinigt. Der Ncol-Überhana befindet sich an der Asparaginsäure-Prolin-Spaltungsstelle, unmittelbar stromabwärts der ersten 32 Aminosäuren des N-Gens.
(b) Herstellung des 1.2kb BamHI-Bolll-Fragmentes von pBM11M5
Das Plasmid pBM11M5 wurde mit BamHI und Bglll verdauut und das 1,2kb-Fragment wurde gelgereinigt. Dieses Fragment unterscheidet sich vom normalen pBM11-Fragment in solcher Weise, dass die Ncol-Stelle im Neomycin-Widerstandsgen entfernt worden ist und allen daraus folgenden Vektoren, welchen diese Ncol-Stelle fehlt, als pBM16 bezeichnet werden.
(c) Herstellung des 170bp Ncol-BamHI TW-synthetischen Gens
Das Plasmid pLEBam/TW wurde mit Ncol und BamHI verdauut und das 170bp Ncol-BamHl-Fraoment wurde gelgereinigt. Dieses synthetische Genfragment hatte die Ncol-Stelle am 5'-Ende und die BamHI-Stelle am 3'-Ende.
(d) Verbindung und Isolierung von pBM16/NDP/TW
Das 4,3kb Ncol-Bolll-Fraament von pBM11/NDP/VGFa und das 1,2kb BamHl-Balll-Fraament von pBM11M5 und das 170bp Ncol-BamHI TW-synthetische Genfragment wurden zusammen unter Venwendung von DNA-Ligase verbunden und die resultierende Mischung wurde zur Transformierung von fähigem HB101 verwendet. Die Transformanten wurden auf Neomycin ausgewählt und einem Screening unterworfen, indem eine Restriktionsanalyse und Nukleotidsequenierung nach der Sanger-Didesoxy-Tech-nik durchgeführt wurde. Das Plasmid pBM16 bezeichnet, um den Verlust der Ncol-Restriktionsstelle im Neomycin-Widerstandsgen anzugeben.
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ccatggttgtttctcactttaacgactgcccggactctcatactcagttttgctt mvvshfndcpdshtqfcf
Kpnl vgf - SphI
tcatggtacctgcatccatgcacgtgacatcgacggctacgcatgcgtttgctct hgtcihardidgyacvcs
EcoRI
catggctacactggaattcgttgccagcatgttgttctggtcgactaccagcgt hgytgircqhvvlvdyqr
BamHI
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Ter
C. Synthetischer EGF
1. Herstellung von dBM1 1/NDP/EGF
In dieser Konstruktion wird der humane EGF als Teil einer Fusion mit 32 N-terminalen Aminosäuren des N-Gens, welche stromabwärts der Asp-Pro-Spaltungsstelle liegen, exprimiert.
(a) Herstellung des 5kb Ncol-Fraamentes von pBM11
Das Plasmid pBM11/DPA/GFA wurde mit Ncol verdauut und die 5'-Phosphate wurden durch Behandlung mit alkalischer intestinaler Kälberphosphatase entfernt. Das 5kb Plasmidfragment wurde gelgereinigt. Dieses Fragment hatte einen Ncol-Überhano an der Asp-Pro-Spaltstelle stromabwärts der Sequenzen, welche die ersten 32 Aminosäuren des N-Gens codieren. Die andere Ncol-Stelle ist das Neomycin-Widerstandsgen.
(b) Herstellung eines 0,6kb Ncol-BamHI-Fragmentes von pBM11
Das Plasmid pBM11/n/TTV wurde mit Ncol und BamHI verdauut und das 0,6kb Ncol-BamHI-Plasmid-fragment wurde gelgereinigt. Dieses Fragment hatte den Ncol-Überhang im Neomycin-Widerstandsgen.
(c) Verbindung und Isolierung von pBM11/DP/EGF
Die drei Sätze von verschmolzenen EGF-Oligonukleotiden mit einem Ncol-Überhang am 5'-Ende und einem BamHI-Überhana am 3'-Ende, das Skb Ncol-Fraoment von pBM11 und das 0,6kb NçoI-BamHI-Fragment von pBM11 wurden zusammen unter Verwendung von T4-DNA-Ligase verbunden und die resultierende Mischung wurde verwendet zur Transformierung von fähigem E. coli HB101. Die Transfor-
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manten wurden auf Neomycin in solcher Weise ausgewählt, dass nur Kolonien mit einem korrekt rekonstruierten Neomycin-Widerstandsgen überleben würden. Die Transformanten wurden durch Restriktionsanalyse unter Verwendung von EcoRI und BamHI und durch eine DNA-Sequenierung, wie oben beschrieben, einem Screening unterworfen.
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GCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGCGTTA YIGERCQYRDLKWWELR*
BamHI AGGATCC
Beispiel VI
Herstellung des Polypeptides von Interesse als Fusionsprotein mit einer modifizierten alkalischen Phosphatase-Signalsequenz
A. Herstellung von oBM11/PAD/EGF
Die synthetischen Oligonukleotide wurden entworfen, damit die Insertion eine DNA, die ein modifiziertes Phosphatase-Signalpeptid codieren und eine Verbindungsregion mit drei Klonierungsstellen (Hindll, Smal und BamHI) im pBM11-Expressionsvektor stromabwärts des PL-Promotors und der ribosomalen Bindungsstelle des N-Gens möglich ist. Die Nukleotidsequenz wurde so optimiert, dass die so ähnlich wie möglich der Nukleotidsequenz des Aminoterminus des lambda-N-Gens war, da die lambda-N-Gense-quenz aufgrund ihrer ribosomalen Bindungstelle für eine effiziente Ribosomen-Einleitung und Translation entwickelt war. Zusätzlich wurde die zweite Aminosäure der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz, die basische Aminosäure Lysin durch die saure Aminosäure Asparaginsäure ausgewechselt.
1. Herstelluno des 0.17kb EcoRI-BamHI-Fragmentes von EGF
Das Plasmid pBM11/NDP/EGF (30 j*g) wurde mit 30 Einheiten EcoRI verdauut und dann mit 4 Einheiten Klenow-Fragment von DNA-Polymerase behandelt, um stumpfe Enden zu schaffen. Die DNA wurde schliesslich mit 30 Einheiten BamHI verdauut und das 0,17kb-Fragment des EGF-Gens wurde nach der Elektrophorese auf einem Agarosegel wiedergewonnen. Die so gereinigte DNA besass eine stumpfe EcoRI-Stelle am 5-Ende und einen BamHi-Überhano am 3'-Ende.
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2. Herstellung des 0.5kb Pvul-Hindlll-Fraomentes von PBM11/PAD
Das Plasmid pBM11/PAD (18 ng) wurde mit 30 Einheiten Hindlll verdauut und dann mit Klenow-Frag-ment zur Abstumpfung der Enden behandelt. Die DNA wurde dann mit Pvul verdauut und das 0,5kb Pvul-Hindlll (stumpfe) Fragment wurde nach Elektrophorese auf einem Agarosegel wiedergewonnen.
3. Herstelluno des 5.2kb Pvul-BamHI-Fragmentes von pBM1 1/ PAP
Das Plasmid pBM11/PAD (18 (xg) wurde mit 30 Einheiten Pvul und anschliessend mit 30 Einheiten Bam-Hl verdauut. Das 5,2 kb-Fragment wurde nach der Elektrophorese auf einem Agarosegel gewonnen.
4. Verbindung und Isolierung von pBM1 1/PAD/EGF
Das 0,17kb EcoRI (stumpfe) BamHI-Fraoment. das 0,5kb Pvul-Hindlll (stumpfe) Fragment und das 5,2kb Pvul-BamHI-Fraoment wurden zusammen verbunden und die resultierende Mischung wurde zur Transformierung von fähigem E. coli HB101 verwendet. Die Transformanten wurden unter Verwendung einer DNA-Sequenierung, wie oben beschrieben, einem Screening unterworfen. Die gewünschte Signalsequenz/EG F-Region besass folgende Sequenz:
Signal Sequenz atggatcaatctacaatcgccctcgcacttctcccactgctgttcact mdqstialallpllft egf ccagtgacaaaagctaattctgactctgaatgcccgctgtctcatgac pvtkansdsecplshd
Nsil ggctactgcctgcatgacggcgtatgcatgtacatcgaagctctg gyclhdgvcmyieal
Sohl gacaagtacgcatgcaactgcgttgttggctacatcggcgaacgt dkyacncvvgyiger
BamHI
tgccagtaccgtgacctgaaatggtgggaactgcgttaaggatcc cqyrdlkwwelr*
Die Wirksamkeit der Herstellung von fremden Protein im pBM11/PAD-Expressionssystem und die Fähigkeit der Reinigung von funktionell aktiven fremden Proteinen aus dem Fusionsprodukt wurde gezeigt unter Verwendung von pBM11/PAD/ EGF als Beispiel. Nach der Grössen-Ausschlusschromatographie (TSK-250) wurden 10,3 mg Äquivalente des aktiven EGF-Fusionspolypeptides aus 23 g (8 I) des E. coli. welche in der Lage waren, das EGF-Gen zu exprimieren, gewonnen. 40% der EGF-Aktivität wurde vom EDF abgeleitet, welcher durch die Signaisequenz gespalten war.
B. Herstelluno von oBM11/PAD/nVGFa
Die synthetischen Oligonukleotide wurden entworfen, um das synthetische VGFa-Gen mit einer modifizierten alkalischen Phosphatase-Signalsequenz zu verbinden, um eine optimale Signalsequenz-Spaltungsstelle durch Codierung der zusätzlichen N-terminalen Reste, welche unmittelbar stromabwärts der Signalsequenz-Spaltungsstelle in natürlichen VGF vorkommen und oben als extremer N-Terminus bezeichnet werden. Die nVGFa-Sequenz enthält die geänderten Sequenzen GTC und GYACRC anstelle der natürlichen VGF-Sequenzen GDC und GMYCRC und besitzt als Ende die Sequenz YQR stromaufwärts der natürlichen Sequenz PNT. In diesem Expressionsystem bleibt die Signalsequenz für die Mehr-
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heit der Moleküle am nVGFa gefunden, wobei ein Fusionsprotein mit nVGFa am C-Terminus gebildet wird.
1. Herstellung des 0.5kb Hindlll-Pvul-verdauuten pBM11/PAD
Das Plasmid pBM11/PAD wurde mit Hindlll und Pvul verdauut und das 0,5kb-Fragment wurde gelgereinigt. Die Hindlll-Stelle befindet sich am C-Terminus der modifizierten alkalischen Phosphatase-Si-gnalsequenz.
2. Herstellung des 5.2kb-pvul-BamHI dBM1 1-Plasmidfraoment
Das Plasmid pBM11/NDP/VGFa wurde mit Pvul und BamHI verdauut und das 5,2kb Plasmidfragment wurde gelgereinigt.
3. Herstellung des synthetischen 170bp Ncolfetumpfeni- BamHI synthetischen VGFa-Gen
Das Plasmid pBM11/NDP/VGFa wurde mit Ncol verdauut und die 5'-Überhänge wurden durch Behandlung mit Sl-Nuklease entfernt. Dies führte zu einem stumpfen Ende am ersten Codon des verstümmelten, synthetischen VGFa-Gens. Die DNA wurde dann mit BamHI verdauut und das 170bp Ncol(stumpfei-BamH [-Fragment wurde gelgereinigt.
4. Verbindung und Isolierung von pBM11/PAD/nVGFa
Die Oligonukleotide VGF105 und 106, das 0,5kb Hindlll-Pvul-Fraoment von pBM11/PAD, das 5,2kb Pvul-BamHl-pBM11 Fragment und das 170bp Ncol(stumpfe)-BamHI synthetische VGFa-Gen wurden zusammen unter Verwendung von DNA-Ligase verbunden und die resultierende Mischung wurde zur Transformierung eines fähigen HB101 verwendet. Die Transformanten wurden auf Neomycin ausgewählt und durch Restriktionsanalyse und Nukleotidsequenierung unter Verwendung der Sanger-Didesoxy-Technik einem Screening unterworfen. Es wurde eine korrekte Konstruktion, welche die modifizierte alkalische Phosphatase-Signalsequenz im Rahmen mit dem nVGFa-Gen enthielt, isoliert.
Signal Sequenz . -
ATGGATCAATCTACAATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGA MDQSTIALALLPLLFTPVT
nVGF -
CAAAAGCTGACTCTGGTAACGCTATCGAAACTACTTCTCCGGAAATCACTAACGC KADSGNAIETTSPEITNA
TACTACTGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTACTGC TTDIPAIRLCGPEGDGYC
Koni SphI
CTGCATGGTÄCCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCCGTTGCT LHGTCIHARDIDGYACRC-S
ctcatggctacactggÜItcgttgccagcatgttgttctggtcgactaccagcg hgytgircqhvvlvdyqr
BamHI ttaaggatcc Ter
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Beispiel VII
Expression des interessierenden Polypeptides als Fusionsprotein mit einer alkalischen Phosphatase-Signalsequenz
A. Herstellung von pBM11/PAK/nVGFa ^Alkalische Phosphatase- Sianalseauenz/nVGFa mit natürlichen VGF-Terminus und den Sequenzen GTC und GYACRCÌ
Das PlasmidpBM11/PAD/nVGF wurde in vitro mutagenisiert (Morinaga et al., Biotechnology (1984) 2:636-643), um die Codons zu ändern, welche die zweite Aminosäure in der Signalsequenz ändern, nämlich den Asp (D)-Codon zurück in denjenigen für Lys (K), dem Rest, welcher in der natürlichen Sequenz gefunden wird. Diese Mutagenese führte ebenfalls eine Pvul-Stelle in die Signalsequenz ein.
atggatcaatctacaatcgccctcgcacttctcccactgctgttcactccagtgacaaaa mdqstialallpllftpvtk gctgactctggtaacgctatcgaaactacttctccggaaatcactaacgctactact adsgnaiettspeitnatt
Kpnl gacatcccggctatccgtctgtgcggcccggaaggcgacggctactgcctgcatggt dipairlcgpegdgyclhg
SphI
acctgcatccatgcacgtgacatcgacggctacgcatgccgttgctctcatggctacact tcihardidgyacrcshgyt
EcoRI BamHI
ggaattcgttgccagcatgttgttctggtcgactaccagcgttaaggatcc gircqhvvlvdyqr Ter
B. Herstellung von pBM11/PAK/EGF
In dieser Expressionskassette ist das EGF-Gen ein Teil einer Fusion mit der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz.
Das Plasmid pBM11/PAD/EGF wurde in vitro mutagenisiert, um die Codone zu ändern, welche die zweite Aminosäure in der Signalsequenz codieren, um den Asp (D)-Codon in denjenigen für Lys (K) umzuwandeln, dem Rest, welcher in der natürlichen Sequenz gefunden wird. In diese Mutagenese führt ebenfalls eine Pvul-Stelle in die Signalsequenz ein.
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Pvul
Signal Sequenz -*
atgaaacaatctàcgatcgccctcgcacttctcccactgctgttcactccagtga mkqstialallpllftpvt
EGF -
caaaagctaattctgactctgaatgcccgctgtctcatgacggctactgcctgca kansdsecplshdgyclh
Nsil SphI
tgacggcgtatgcatgtacatcgaagctctggacaagtacgcatgcaactgcgtt dgvcmyiealdkyacncv gttggctacatcggcgaacgttgccagtaccgtgacctgaaatggtgggaactgc vgyigercqyrdlkwwelr
BamHI gttaaggatcc if
C. Herstellung von TacPak/EGF (alkalische Phosphatase-Sianalseauenz/humaner EGF
1. Herstellung von Plasmidfraomenten
Das Plasmid p135-1 wurde vom Plasmid pDR540 (Pharmacia) abgeleitet und enthielt das Cro-Gen SD und eine Bglll-Stelle stromabwärts des lac-SD. pDR540 ist ein Expressionsvektor, welcher den trp-lac-Hybridpromotor enthält. pl35-1 wurde mit Bglll und BamHI verdauut und mit bakterieller, alkalischer Phosphatase behandelt.
Das Plasmid pBM11/PAK/EGF wurde mit Pvull und BamHI verdaut und das 230bp-Fragment, welches einen Teil der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz codiert und der humane EGF wurden isoliert.
2. Herstellung derTacPakl und TacPak2-Qligonukleotide
Die synthetischen Oligonukleotide TacPakl und TacPak2 wurden mit einem Überhang entworfen, welcher mit der Bloll-Stelle von pl35-1 und einem Pvull-Überhang verträglich war, verträglich mit der Pvull-Stelle im alkalischen Phosphatase/EGF PvuIl/BamHI-Fraoment. Die Oligonukleotide wurden auf einem Applied Biosystems Oligonukleotid-Synthesizer synthetisiert.
Belli Pvul
Bql
TacPakl 5' GATCTATGAAACAATCTACGAT 3' TacPak2 3' ATACTTTGTTAGATGC 5'
3. Verbinduno und Isolieruno des TacPak/EGF-Klons
Das Balll-BamHI verdauute pl35-1, das 230bp PAK/EGF-Fragment und die Oligonukleotide TacPakl und TacPak2 wurden unter Venwendung von DNA-Ligase verbunden, in einem fähigen HB101 transformiert und eine korrekte Konstruktion wurde durch "die DNA-Sequenierung isoliert.
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(Hindlll-Stelle von pDR540)
i
AAGCTTACTCCC
trp-35 (I6bp) lac-10
CATCCCCCTG [TTGACA] ATTAATCAÎCGGCTCG (TATAATG)
mRNA 5' lacl binding site lacSD TGTGG/AATTGTG AGCGGATAACAATTTCACAC {AGGA} AACAGGATCACTA
Pvul croSD (llbp)BglII {AGGA} GGTTCAGATCT
Signalsequenz
ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGA MKQSTIALALLPLLFTPVT
EGF ->
CAAAAGCTAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCATGACGGCTACTGCCTGCA •KANSDSECPLSHDGYCLH
Ns i I SphI
TGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGACAAGTACGCATGCAACTGCGTT DGVCMYIEALDKYACNCV
GTTGGCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGC VGYIGERCQYRDLKWWELR
BamHI
GTTAAGGATCC *
Beispiel VII
Expression eines Polypeptides von Interesse als Fusionsprotein mit einer alkalischen Phosphatase-Signalsequenz unter Verwendung einer Expressionskassette, welche eine transkriptionale Terminie-rungsregion enthält
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A. Herstellung von pTCPt/EGF iïtrp-35116bDHac-1 OïïlacSDH 1 bp lATGI/alkalische Phosphatase-Sio-na/humaner EGF/trans. term.-NEO)
Dieses Plasmid ist so entworfen, dass es tac-Promotorelemente aufweist und den cro-SD für die Expression des humanen EGF hinter der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz verwendet. Es hat einen pBR322-Hintergrund mit einem Neomycin-Widerstandsgen.
1. Herstelluno des 420bp Hindlllfstumpfenl-BamHI-Fragmentes von TacPak/EGF
TacPak/EGF wurde mit Hindlll verdauut und dann mit Klenow-Fragment von DNA-Polymerase verdauut, um stumpfe Enden zu schaffen. Die DNA wurde dann mit BamHI verdauut und das 420bp-Frag-ment, welches die tac-Promotorelemente und die codierende Region für die alkalische Phosphatase-Signalsequenz enthielt, verdauut und der humane EGF wurde durch Agarosegel-Elektrophorese isoliert.
2. Herstellung des 2.8kb EcoRlfetumpfenl-BamHI-Fraamentes von pBM1 6t/NDP/VGFa pBM16t/NDP/VGFa wurde mit EcoRI verdauut und dann mit Klenow behandelt, um stumpfe Enden zu schaffen. Die DNA wurde dann mit BamHI verdauut und das 2,8kb-Fragment wurde isoliert. Dieses DNA-Fragment enthielt den pBR322-Ursprung, das Neomycin-Widerstandsgen ohne seine Ncol-Stelle und den Gen32-artigen Transkriptionsterminator stromabwärts der BamHI-Stelle.
3. Verbinduno und Isolierung von pTCPt/EGF
Das 2,8kb EcoRI(stumpfe)-BamHl-Fragment von pBM16t/NDP/VGFa wurde mit dem 420bp HindIII(stumpfen)-BamHl-Fragment von TacPak/EGF verbunden und die resultierende DNA wurde zur Transformierung von fähigem JM109(lacIq) verwendet. Es wurde eine korrekte Konstruktion isoliert, durch seine Beständigkeit gegen Neomycin und durch DNA-Sequenierung.
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CHindiII-Stelle von pDR540)
I
AAGCTTACTCCC
trp-35 (16bp) lac-10
CATCCCCCTG [TTGACA] ATTAATCATCGGCTCG {TATAATG}
mRNA 51 lacl Bindungsstelle lacSD TGTGG/AATTGTG AGCGGATAACAATTTCACAC {AGGA} AACAGGATCACTA
Pvul croSD (llbp)BglII Signal Sequen2: ->
{AGGA} GGTTCAGATCT ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTCC
MKQSTIALALLP
EGF ->
CACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTC LLFTPVTKANSDSECPLS
Nsil
TCATGACGGCTACTGCCTGCATGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGAC HDGYCLHDGVCMYIEALD
SphI
AAGTACGCATGCAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGC KYACNCVVGYIG
BamHI
GAACGTTGCCAGTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGCGTTAAGGATCCGTGA ERCQYRDLKWWELR*
Trans. Term. CTAATTGGGGACCCTAGAGGTCCCCTTTTTTATTTTAAAACGATC
B. Herstellung von nTCPt/nVGFa iïtm-35l16bpriac-10ïïlacSD1 rcroSDlHhorATGl/alkalisches Phospha-tase-Sianal/N-terminaler VGFa mit der Sequenz GTC und GYACRCVtrans. term. -NEO
Dieses Plasmid besitzt die tac-Prcmotorelemente und verwendet cro-SD zur Expression des modifizierten VGF-Gens mit der N-terminalen Verlängerung stromabwärts der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz. Das Plasmid besitzt einen pBR322-Hintergrund mit einem Neomycin-Widerstandsgen.
1. Herstellung des 350hn-Pvul-BamHI-Fragmentes von pBM1 1/ PAK/nVGFa
Das Plasmid pBM11/PAK/nVGFa wurde mit Pvul und BamHI verdauut und das 350bp-Fragment wurde durch Geielektrophorese isoliert. Dieses Fragment enthält den grössten Teil der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz und des nVGFa-Gens.
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2. Herstellung des 2.8kb-Pvul-BamHI-Fraamentes von pTCPt/ EGF
Das Plasmid pTCPt/EGF wurde mit Pvul und BamHI verdauut und das 2,8kb-Fragment wurde durch Gelelektrophorese isoliert.
Verbindung und Isolierung von pTCPt/nVGFa
Das 2,8kb-Fragment und das 350bp-Fragment wurden unter Verwendung von DNA-Ligase verbunden und die DNA wurde zur Transformierung von fähigem JMI09(laclq) verwendet. Es wurde unter Verwendung der Restriktionsanalyse eine korrekte Konstruktion isoliert.
3. Verbindung und Isolierung von pTCPt/nVGFa
Das 2,8kb-Fragment und das 350bp-Fragment wurden unter Verwendung von DNA-Ligase verbunden und die DNA wurde zur Transformierung von fähigem JM109(laclq) verwendet. Es wurde unter Verwendung der Restriktionsanalyse eine korrekte Konstruktion isoliert.
(Hindlll-Stelle von pDR540)
AAGCTTACTCCC
trp-35 (16bp) lac-10
CATCCCCCTG [TTGACA] ATTAATCATCGGCTCG (TATAATG)
mRNA 51 lacl Bindungsstelle lacSD TGTGG/AATTGTG AGCGGATAACAATTTCACAC {AGGA} AACAGGATCACTA
Pvul croSD (llbp)Bgll.I Signal SequenS ->
{AGGA} GGTTCAGATCT ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTCCC
MKQSTIALALLP
nVGF ->
ACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTGACTCTGGTAACGCTATCGAAACTACT LLFTPVTKADSGNAIETT
TCTCCGGAAATCACTAACGCTACTACTGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCC SPEITNATTDIPAIRLCGP
Kpnl
CGGAAGGCGACGGCTACTGCCTGCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGA EGDGYCLHGTCIHARDID
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SphI EcoRI
CGGCTACGCATGCCGTTGCTCTCATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTT GYACRCSHGYTGIRCQHV
BamHI Trans.
GTTCTGGTCGACTACCAGCGTTAAGGATCCGTGACTAATTGGGGACCCTAGAGGT
VLVDYQR*
Term.
CCCCTTTTTTATTTTAAAACGATC
C. Herstellung von pTNPt/EGF trtrp-35H7bpnac-10ïïnSD18bp TATGI/alkalisches Phosphatase-Si-anal/humaner EGF/trans. term.-NEO
Dieses Plasmid wurde so entworfen, dass es tac-Promotorelemente aufwies und das N-Gen SD zur Exprimierung von humanem EGF hinter der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz aufwies. Es hat einen pBR322-Hintergrund mit dem Neomycin-Widerstandsgen.
1. Herstellung von 2.8kb Pvul-BamHI-pTNPt
Das Plasmid pTNPt wurde mit Pvul und BamHI verdauut und das 1,8kb-Fragment wurde durch Gelelektrophorese isoliert.
2. Herstelluno des 300bo Pvul-BamHI-Fraomentes von oBMU/PAK/EGF
Das Plasmid pBM11/PAK/EGF wurde mit Pvul und BamHI verdauut und das 300bp-Fragment wurde isoliert.
3. Verbindung und Isolierung von pTNPt/EGF
Das 2,8kb-Fragment und das 300bp-Fragment wurden unter Verwendung von DNA-Ligase verbunden und die DNA wurde in fähige JM109(lacIq) umgewandelt. Es wurde eine korrekte Konstruktion durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenierung isoliert.
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CEcoRI-Stelle von pBMll)
l
GAATTACTCCCCATCC
SstI
trp-35 (17bp) lac-10 5'lac
CCCTG [TTGACA] ATTAATCATCGAGCTCG (TATAATG) TGTGG/AATTG
Bsml mRNA-> n mRNA->
TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGCATTCAAAGCAGAAGGCTTTGGGGTGTGT
GATACGAAACGAAGCATTGGCCGTAAGTGCGATTCCGGATTAGCTGCCAATGTGC CAATCGCGGGGGGTTTTCGTTCAGGACTACAACTGCCACACACCACCAAAGCTAA
Pvul nSD (8bp) Signal Sequenz ->
CTGAC {AGGA} GAATCCAG ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTC
MKQSTIALALL
EGF ->
CCACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGT PLLFTPVTKANSDSECPLS
Nsil
CTCATGACGGCTACTGCCTGCATGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGA HDGYCLHDGVCMYIEALD
SphI
CAAGTACGCATGCAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGT KYACNCVVGYIGERCQYR
BamHI BamHI
GACCTGAAATGGTGGGAACTGCGTTAAGGATCCGTGACTAATTGGGGA
DLKWWELR*
(BamHI site of pBMll) Trans. Term. 1
CCCTAGAGGTCCCCTTTTTTATTTTAAAACGATCC
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Beispiel IX
Zusammensetzung des Wachstumsfaktorgens für die Expression in eukaryontischen Zellen
A. Herstellung des Plasmides pRSV/VGF
Die Transfection dieses Plasmides in Ovarzeilen eines chinesischen Hamsters führte zur Herstellung des natürlichen VGF.
fai Herstellung von HindllKstumpfi-BolllKstumpfl-pRSV
Das Plasmid pRSV wurde mit Hindlll und Bglll verdauut und das 4kb-Fragment wurde gelgereinigt. Die herausragenden Enden wurden mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase stumpf gemacht und dann wurden die 5'-Phosphate mit alkalischer intestinaler Kälberphosphatase entfernt.
(b) Herstelluno des Ddel-Fragmentes. welches das VGF-Gen enthält
Ein subgeklontes genomisches Fragment von Vaccinia-DNA wurde mit Ddel verdauut und die herausragenden Enden wurden unter Verwendung des Klenow-Fragmentes stumpf gemacht und es wurde ein 550bp Ddel-Fraoment gelgereinigt.
(ci Verbindung und Isolierung von pRSV/VGF
Das 4 kb Hindllltstumpfì-BglIKstumpfì-Fraament von pRSV und das 550 bp Ddel(stumpf)-Fragment von Vaccinia-DNA wurden zusammen unter Verwendung von DNA-Ligase verbunden und die Transformanten wurden mit Ampicillin ausgewählt und durch Restriktionsanalyse einem Screening unterworfen. Es wurde eine korrekte Konstruktion isoliert und mit pRSV/VGF bezeichnet.
(d) Transfektion von CHO-Zellen durch pRSV/VGF
Das Plasmid pRSV/VGF wurde mit einem Plasmid pRSV mit Kalziumphosphat-Ausfällung in Zellen eines chinesischen Hamsters cotransfektiert. Die Transfektanten wurden durch Southern-Dot-Blot-Hybridisierung einem Screening unterworfen und ein positives Klon mit der Bezeichnung pRSV/VGF52 wurde isoliert.
B. Herstellung des Plasmides pAcA/GF
Ein zusätzliches Expressionssystem, welches zur Exprimierung des rekombinanten VGF-Proteins verwendet wurde, ist ein Insektensystem. Vergleiche Maeda et ai. und Carboneil et al., supra. In einem solchen System wird das Autographa Californica-Kernpolyhedrosisvirus (AcNPV) als Vektor zur Exprimierung fremder Gene verwendet. Das Virus wächst in Soodoptera fruoiperda-Zellen. Das Hüllgen kann in nicht wesentlichen Regionen (z.B. das Polyhedrin-Gen) des Virus geklont werden und wird unter Steuerung durch einen AcNPV-Promotor plaziert (z.B. durch den Polyhedrin-Promotor). Die erfolgreiche Insertion der VGF-Genkonstruktion führt zu einer Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und zur Produktion eines nicht abgeschlossenen rekombinanten Virus (d.h. dem Virus fehlt die Proteinhülle, welche durch das Polyhedrin-Gen codiert wird). Diese rekombinanten Viren werden dann zur Infektion von Soodoptera fruoiperda-Zellen. in welchen das insertierte Gen exprimiert wird, verwendet.
Das VGF-Gen von Interesse wurden unter der Steuerung eines zweckmässigen Promotors für ein In-sektenzellensystem plaziert. Das Plasmid pAc610 enthält das Polyhedrin-Gen, welches ein ampiciliin-wi-derstandsfähiges Markierungsmittel aufweist. Es werden Polylinker in dieses Gen 50 Basen stromabwärts von der Transkriptionsstartstelle des Polyhedrin-Gens und 7 Basen vor dem ersten ATG inser-tiert. Das VGF-Gen wird an einer geeigneten Polylinkerstelle kloniert, so dass es unter der Steuerung des Polyhedrin-Promotors steht. Der ATG-Methion-Startcodon und die translationalen Terminierungs-codons sind diejenigen des VGF-Gens. Die transkriptionalen Startstellen und die Polyadenylierungssi-gnale sind diejenigen des Polyhedrin-Gens.
(ai Herstelluno von Smal-BamHl-pAc610
Das Plasmid pAc610 wurde mit Smal und BamHI verdauut.
(b) Herstelluno des HindllKstumpfi-Bolll-Fraamentes des VGF- Gens
Das Plasmid pRSVA/GF wurde mit Hindlll verdauut und die hervorstehenden Enden wurden unter Verwendung des Klenow-Fragmentes stumpf gemacht. Die DNA wurde dann mit Bglll verdauut und das 560 bp-Fragment wurde gelgereinigt.
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(c) Reinigung und Isolierung von dAc/VGF
Das Smal-BamHl-Fraoment von pAc610 und das 560 bp-Fragment von pRSV/VGF, welche das VGF-Gen enthalten, wurden unter Verwendung von DNA-Ligase verbunden und die Transformanten wurden durch Restriktionsanalyse einem Screening unterworfen. Es wurde eine korrekte Konstruktion isoliert und mit pAc/VGF bezeichnet.
(dì Transfektion von Sf9-Zellen mit pAcA/GF
Das Plasmid pAcA/GF wurde mit Wild-Typ von AcNPV-Baculovirus DNA in Sf9-lnsektenzellen (Spodoptera fruoiperdai cotransfektiert. Die Transfektanten wurden auf Einschluss von negativen Phenotypen in Plaque-Tests einem Screening unterworfen. Ein negativer Plaque-Einschluss wurde isoliert und nach 5 Runden von aufeinanderfolgender Piaquereinigung wurde ein höherer Titer des Vorrates des rekombinanten Virus hergestellt.
C. Herstellung von pAc/SFGF
Baculovirus-Expression von natürlichen Shope-Fibromvirus-Wachstumsfaktor.
(a) Herstellung von BamHI-verdauuten pAc610
Das Plasmid pAc610 wurde mit BamHI und Smal verdauut. Die Smal-Stelle dieses Plasmides befindet sich stromabwärts des Baculovirus Polyhedrin-Promotors.
(b) Herstelluno eines 430bp-Hincll-Sau3a-Fraomentes einer genomischen Shope-Fribromvirus-DNA
Das 3,7kb Bglll-Fragment des 19kb BamHl-C-Fraqment der genomsichen Shope-Fibromvirus-DNA wurde in BamHI-verdautem SP64-Plasmid geklont und mit SP64/3.7. bezeichnet. Das Plasmid SP64/3.7. wurde mit Hincll verdauut und das Ikb-Hincll-Fraament wurde gelgereinigt. Das Ikb-Fragment wurde dann mit Sau3a verdauut und das 430bp Hincll-Sau3a-Fragment wurde gelgereinigt.
(c) Verbindung und Isolierung von pAc/SFGF
Das BamHI-Smal-verdauute pAc610 wurde zum 430bp-HincllSau3a-Fragment. welches das SFGF-Gen enthält, verbunden und die resultierende Mischung wurde in geeigneten E. coli HB101 transformiert. Die Transformanten wurden durch Restriktionsanalyse einem Screening unterworfen und die korrekte Konstruktion wurde isoliert und die pAc/SFGF bezeichnet.
Beispiel X
Herstellung von Polypeptiden A. Festohasen-Svnthese von VGF und TGF
1. Synthetisches VGF-Fraoment
Die Sequenz, welche dem verstümmelten VGF entspricht und mit der Sequenz DI PAIR beginnt und mit der Sequenz LVDY endet, wurde auf einem Applied Biosystems Model 430 A Peptide Synthesizer zusammengesetzt, wobei das Standard-Verfahren eingesetzt wurde. Die Behandlung des erhaltenen Peptides mit flüssiger HF unter üblichen «nieder-hoch»-Bedingungen ergab das rohe deblockierte Peptid. Das Peptid wurde einem Chromatofocusing on PBE94 (Pharmacia) unterworfen. Das partiell gereinigte Peptid wurde bei ph 6,5 eluiert. Die kurze Behandlung mit 0,2 N Natriumhydroxid entfernte die Cystein-Schutzgruppen (Ethylcarbamoyl) und das Peptid wurde in Gegenwart von oxidierendem und reduzierendem Glutathion oxidiert. Die Reinigung durch Gelfiltration und die HPLC ergaben hochgereinigten VGF mit der folgenden Sequenz:
DIPAIRLCGPEGDGYCLHGDCIHARDIDGMYCRCSHGYTGIRCQHWLVDY
2. Synthetischer humaner und Ratten-TGF-alpha
Humaner und Ratten-TGF-alpha wurden chemisch im wesentlichen wie oben für den VGF synthetisiert und wurden durch Penninsula Labs zur Verfügung gestellt.
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B. Isolierung von in prokarvontischen Zellen hergestellten rekombinanten Polypeptiden
1. Wachstumsfaktoren, die in Vektoren auf Basis von pBM hergestellt wurden, wobei der PL-Promotor und der ts-CI-Reoressor verwendet wurde
E. coli B (HB101), welcher die pBM11/NDP/Wachstumsfaktorplasmide enthielten, wurden in Luria-Brü-he bei 30°C gezüchtet. Die Kulturdichte wurde bei 550 nm gemessen und wenn die Dichte eine Absorb-tion von 0,7 bis 0,9 erreichte, wurde die Synthese des Wachstumsfaktor-Fusionsprotein durch Erhöhung der Temperatur auf 42°C eingeleitet. Die Kultur wurde bei dieser Temperatur während 5 bis 20 Std. inkubiert und dann wurden die Bakterien durch Zentrifugation isoliert und bis zu ihrer Verwendung auf -70°C abgekühlt.
Für die Isolierung des rekombinanten Proteins wurden die Zellen in Pufferlösung, welche 0,05 M NaHaPCU, pH 7,2, 0,5 M NaCI, 0,01 M EDTA enthielt, aufgetaut. 150 ml Puffer wurden für die Herstellung von 50 g Bakterien verwendet. Die Zellen wurden durch Beschallung auf Eis während 15 Min. unter Verwendung einer 1/4-Zoll-Sonde, mit 50% Pulsen bei 60 Watt Kraft aufgebrochen. Nach der Aufbrechung der Zellen wurde das unlösliche Protein durch Zentrifugation bei 12 000 Umdrehungen/Min. in einem GSA-Rotor während 90 Min. gesammelt. Die Kügelchen, welche das unlösliche Protein enthielten, wurden dann 50 ml 6 M Guanidin-hydrochlorid wieder suspendiert. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation während 2 Std. bei 25 000 Umdrehungen/Min. auf einem Ultrazentrifugenrotor vom Beck-man-Typ 30 gesammelt. Der Überstand wurde gesammelt und bei -20°C bis zum weiteren Gebrauch aufbewahrt.
Die Reinigung des Fusionsproteins wurde entweder auf Sephacryl S300 oder Fractogel HW-55-Säu-len, die mit 1 M Guanidin-hydrochlorid equilibriert waren, durchgeführt. Fraktionen, welche das Fusionsprotein enthielten, wurden als diejenigen Fraktionen identifiziert, welche ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht, das dem Molekulargewicht des durch das synthetische Gen codierten Polypeptid entsprach, durch Bestimmung auf einem 15% Polyacrylamid-Harnstoffgel bestimmt.
Zur Herstellung der aktiven Form des rekombinanten Wachstumsfaktors wurde das Protein wiedergefaltet, indem es in 50 mM Tris-HGI-Puffer, pH 8,7, welcher 1 M Guanidin-hydrochlorid, 1,24 mM reduziertes Glutathion und 0,25 mM oxidiertes Glutathion enthielt, bei 4°C während 3 bis 10 Tagen inkubiert. Die biologische Aktivität des Wachstumsfaktors wurde durch einen kompetitiven Rezeptor-Bindungstest, wie oben beschrieben (vgl. Beispiel I.C) kontrolliert. Nach Erhalt einer maximalen Aktivitätsstufe wurde das Protein gegen destilliertes Wasser und bis zur Trockenheit gefriergetrocknet.
Wenn die Leadersequenz entfernt werden sollte, wurde das Protein entweder durch Resuspension in 70% Ameisensäure und Inkubation bei 40°C während 3 Tagen oder durch Inkubation über Nacht bei Zimmertemperatur in einem 100fachen molaren Überschuss von Cyanbromid gespalten. Das gespaltene Produkt wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert und bis zur Trockenheit gefriergetrocknet.
Zur weiteren Reinigung wurde der rekombinante Wachstumsfaktor in 40% Acetonitril, 0,1% TFA resuspendiert und durch HPLC unter Verwendung einer BioRad TSK-250-Säule gereinigt. Die Fraktionen, welche den Wachstumsfaktor enthielten, wurden gepoolt und einer weiteren Reinigung unter Verwendung der Umkehrphasen-HPLC unterworfen, entweder Waters jiBondapk C-18 oder Rainin Dynamax C-8. Das Elutionsmittel bestand aus einem linearen Gradienten von 20 bis 40% Acetonitril, welches 0,1% TFA enthielt. Die Fraktionen, die die Rezeptorbindungsaktivität enthielten, wurden gepoolt, gefriergetrocknet und bis zu ihrer Venwendung bei -20°C aufbewahrt.
(a) TGF und modifizierter TGF (i) N/TGF
Der rekombinante, modifizierte, humane TGF wurde aus Plasmid pBM11/N/TGF hergesteilt und enthielt 33 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus und die Sequenzänderung QEEK anstelle der natürlichen humanen Sequenz QEDK.
(b) Modifizierter und verstümmelter VGF
(i) PAD/nVGFa
Rekombinanter modifizierter VGF wurde aus Plasmid pBM11/PAD/nVGFa, welcher die extrem-N-ter-minale Sequenz von VGF und die mofizierten Sequenzen GTC und GYACRC anstelle der natürlichen VGF-Sequenz GDC und GMYCRC enthielt, hergestellt. Das nVGFa-Fragment wurde als Fusionsprotein mit einer modifizierten alkalischen Phosphatase-Signalsequenz am N-Terminus exprimiert und wurde bei der Sequenz YQR am C-Terminus verstümmelt.
(ii) NDP/VGFa
Der rekombinante modifizierte VGF wurde aus dem Plasmid pBM11/NDP/VGFa, welches bei der
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DIPAIR-Sequenz beginnt und bei der YKQR-Sequenz im VGF endet, hergestellt. Er hat die modifizierten Sequenzen GTC und GYACRC anstelle der natürlichen VGF-Sequenzen GDC und GMYCRC. Das VGFa-Fragment wurde als Fusionsprotein mit 32 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus und dem säurelabilen Dipeptid Asparaginsäure-Prolin exprimiert.
(iii) VGFa
Das VGF-Fragment wurde hergestellt, wie in 2.b oben beschrieben und nach der Abspaltung vom Fusionsprotein durch Säurebehandlung wurde es weiter durch HPLC gereinigt.
(iv) NDP/VGFA
Der rekombinante modifizierte VGF wurde aus Plasmid pBM11/NDP/VGFA, welches mit der DIPAIR-Sequenz beginnt und mit der YKQR-Sequenz in VGF endet, hergestellt und besitzt die modifizierten Sequenzen GTC und GYACVC anstelle der natürlichen VGF-Sequenzen GDC und GMYCRC. Das VGFA-Fragment wurde als Fusionsprotein mit 32 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus und dem säurelabilen Dipeptid Asparaginsäure-Prolin exprimiert.
(c) Chimäre TGF/VGF-Hvbride
(i) N/TTV (TGF/TGF/VGF)
Rekombinantes modifiziertes TTV wurde aus pBM11/N/TTV hergestellt und enthielt die Aminosäuresequenz des humanen TGF in den aminoterminalen 2/3 des Gens mit der Ausnahme der Sequenz QEEK, welche von der natürlichen humanen Sequenz QEDK geändert wurde. Der Carboxy-Terminus wurde von der Aminosäuresequenz von VGF geändert und mit der Sequenz YQR stromaufwärts der natürlichen Sequenz PNT terminiert. Das TTV-Fragment wurde als Fusionsprotein mit 33 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus exprimiert.
(ii) NDP/TTV
Rekombinantes TTV wurde vom Plasmid pBM11/N/TTV hergestellt und wie in (a) beschrieben modifiziert, mit der Ausnahme, dass das TTV-Fragment als Fusionsprotein mit 32 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus und dem säurelabilen Dipeptid Asparaginsäure-Prolin exprimiert wurde.
(iii) NDP/VTV
Das rekombinante modifizierte VTV wurde aus Plasmid pBM11/NDP/VTV hergesteilt und enthielt die Aminosäuresequenz des humanen TGF, wobei der mittlere Bereich mit der Aminosäuresequenz QEEK die natürliche Sequenz QEDK ersetzt. Die N-terminalen und C-terminalen Bereiche wurden von der verstümmelten VGF-Sequenz abgeleitet und beginnen mit der Sequenz DIPAIR und enden mit der Sequenz YQR. Das VTV-Fragment wurde auf einem Fusionsprotein mit 32 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus und beim säurelabilen Dipeptid Asparaginsäure-Prolin exprimiert.
(iv) NDP/TVV
Rekombiniertes modifiziertes VTV wurde vom Plasmid pBM11/NDP/TVV hergestellt und enthielt die Aminosäuresequenz von humanem TGF im N-terminalen Bereich des Gens. Der mittlere und der C-termi-nale Bereich wurden von den verstümmelten VGF-Sequenzen abgeleitet und ändern mit der Sequenz YQR. Zusätzlich besitzt das synthetische Gen die Änderung GYACVC anstelle von GMYCRC. Das TW-Fragment wurde als Fusionsprotein mit 32 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus und dem säurelabilen Dipeptid Asparaginsäure-Prolin exprimiert.
2. Wachstumsfaktoren, welche in Vektoren hergestellt wurden, die den tac- oder lac-Promotor enthalten
Bakterielle Wirte, welche Expressionskassetten enthalten, welche den tac- oder lac-Promotor enthalten, wurden bei 30 bis 37°C bis zu einer optischen Dichte von A600 = 0,2 bis 0,8, entweder in LB-Brühe oder einem chemisch definierten Medium, wie M9-Medium, welches mit Thiamin und Glukose versehen war, gezüchtet. Es wurde ein zweckmässiges Antibiotikum in das Wachstumsmedium gegeben, um die Wirte für die Aufnahme der Expressionskassette auszuwählen. Die bakteriellen Kulturen wurden mit einer Konzentration von 100 bis 1000 mM IPTG induziert und bei 30°C während 16 bis 24 Std. gezüchtet. Für die Expressionskassetten, weichen das lacl-Gens des bakteriellen Wirtes fehlte, trugen die bakteriellen Wirte einen F-Faktor mit dem lacql-Gen, wie MJ109, XL1, JM103 usw. Für die Expressionskassetten, welche das lacl-Gen trugen, sind Beispiele von bakteriellen Wirten HB101, DH1, DH5 usw. Falls der bakterielle Wirt einen lac-Operon (lac+) enthält, kann die Expressionskassette mit 1% Lactose induziert
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werden. Nach der Induktionsperiode können die Wachstumsfaktoren entweder vom Medium oder aus Zellkügelchen isoliert werden.
(a) PAK/EGF
Humaner EGF, hergestellt aus den Expressionskassetten TAcPak/EGF und pTcCPt/EGF wurde aus dem Medium in einer aktiven Form isoliert, wobei die alkalische Signalsequenz entfernt wurde. Ungefähr 85% des aktiven EGF wurde im Medium gefunden, mit dem Rest, welcher mit den Zellkügelchen verbunden war. Diese Expressionskassette ergab 4 mg/l des aktiven EGF. Die Zellen wurden aus dem Medium durch Zentrifugation entfernt und das Medium wurde durch einen Amicon SY30, 30 000 Mr Ausschluss-Spiralfilter gefiltert und dann durch eine Q-Sepharose-Säule passieren gelassen und der hochreine humane EGF wurde in 20 mM NaPÜ4 pH 7 mit 0, bis 0,5 M NaCI-Gradient eluiert. Alternativ können die Wachstumsfaktoren aus den Zellkügelchen durch den osmotischen Schock oder durch Beschallung isoliert werden und im wesentlichen durch das gleiche wie das obenbeschriebene Verfahren gereinigt werden.
(b) PAK/nVGFa
Der rekombinante nVGFa wurde aus der Expressionskassette pTCPt/nVGFa hergestellt. Der nVGFa wurde aus den Zellkügelchen durch Beschallung isoliert und wies ungefähr 40% des gesamten bakteriellen Proteins auf.
C. Isolierung des VGF und des SFGF. hergestellt durch eukavontische Expression des natürlichen Gens
1. Herstelluno des VGF aus Affennierenzellen
Der natürliche VGF wurde durch Infektion von Affennierenzellen mit dem Vaccinia-Virus hergestellt. Ceropithecus-Affennieren (BSC-1) Zellen-Monoschichten wurden mit 15 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) pro Zelle von gereinigtem VV (Stamm WR, gezüchtet in Hela-Zellen und durch eine Saccharose-Dichte-Gradienten-Sedimentation (Moss, B., (1981) in Gene Amplification and Analysis, Hrg. Chirickjian, J.G. und Papis, T.S. (Elsevier/North-Holland, NY), Band 2, Seiten 253-266)) infisziert. Die infiszierten Zellen wurden bei 37°C mit ungefähr 1 ml Eagle-Basal-Medium mit 2% fötalem Kälberserum pro 2x106 Zellen inkubiert. Es wurden Mock-infiszierte Zellen in identischer Weise behandelt. Die Zellkultur-Über-stände wurden durch eine Zentrifugation und niederer Geschwindigkeit geklärt und gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde dann wiederum in 1M Essigsäure suspendiert und intensiv gegen 0,2M Essigsäure dialysiert. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation entfernt und der Überstand wurde gefriergetrocknet und in 1/100 des Ursprungvolumens von 1M Essigsäure wiedersuspendiert und bei 4°C gelagert.
2. Herstellung von VGF in CHO-Zellen
Der natürliche VGF wurde ebenfalls durch Transfektion des Plasmides pRSV/VGF, das das VGF-Genfragment in Ovarzeilen von chinesischen Hamstern enthielt, produziert. Die transferierten Zellen wurden expandiert und das Medium und die Zellkügelchen wurden auf Gegenwart von VGF durch Immunopräzipitation getestet, wobei ein Antiserum gegen ein N-terminales VGF-Peptid verwendet wurde.
3. Herstelluno von VGF in Seidenraupen unter Verwendung des Baculovirus-Promotors
(a) Transformation
Die Wirtszelle für AcNPV ist Spodoptera fruoiperda (sf9). Um einen rekombinanten Virusstock zu produzieren, wurde das VGF-enthaltende Plasmid mit AcNPVDNA gemischt und in sf9-Zellen transfek-tiert, wobei die Kalziumphosphat-Technik verwendet wurde. Die rekombinanten Viren wurden aus dem Medium isoliert und die Plaque wurde auf sf9-Zellen gereinigt. Die rekombinanten Plaquen wurden durch Hybridisierung unter Verwendung von radiomarkierten VGF-DNA als Probe identifiziert.
(b) Expression
Wenn einmal ein rekombinantes Virus identifiziert ist, wird es auf sf9-Zellen ausgebreitet. Der rekombinante Virusstock wird dann zur Infektion von sf-Zellen verwendet, die Zellen werden lysiert und die Überstände auf die Produktion des VGF-Proteins einem Screening unterworfen, wobei das Protein gereinigt wurde, wie oben beschrieben für die Vaccinia-Virus-infiszierten Säugetierzellen.
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Die vorausgesagte Sequenz des produzierten VGF in den Insektenzellen ist:
DSGNAIETTSPEITNATTDIPAIRLCGPEGDGYCLHGDCIHARDIDGMYCRCSHGYTGIR CQHVVLMYQRSENPNTTTSYIPSPGIMLVLVGIIIITCCLLSVYRFTRRTKLPIQDMWP
Eine potentielle Glykosylierungsstelle ist am Asparagin in Stellung 15 des N-terminalen Endes des Polypeptides vorhanden.
Diese 121-Restsequenz startet mit der N-terminalen Sequenz, welche direkt für den gereinigten VGF aus W-infiszierten Affenzellen bestimmt wurde (d.h. bei Rest 20 des offenen VGF-Leserahmens) und setzt sich bis zum letzten Rest des offenen Leserahmens fort. Es fehlt demzufolge das Signalpeptid (Reste 1 bis 19 des offenen Leserahmens) schliesst jedoch die Transmembranen-Sequenz (YIPSPGIMLVLVGIIIITCCLLSVY) ein.
Das vorausgesagte Molekulargewicht des 121-Restpeptides beträgt 13 304, ohne Kohlenhydrat. Das scheinbare Molekulargewicht des baculovirus-produzierten VGF beträgt 17 000, was signifikant kleiner ist, als dasjenige welches von VV-infiszierten Zellen erhalten wurde, was darauf hindeutet, dass die zwei Formen wahrscheinlich verschieden entwickelt werden. Dem baculovirus-produzierten VGF kann ein zusätzlicher Teil der N-terminalen Sequenz oder ein Teil der C-terminalen Sequenz oder beide fehlen oder er könnte sich im Typ und im Ausmass der Glykosylierung unterscheiden.
4. Herstellung von SFGF in Seidenraupen unter Verwendung des Baculovirus-Promotors
(a) Transfektion von sf9-Zellen mit pAc/SFGF
Das Plasmid pAc/SFGF wurde mit AcNPV-DNA des Baculovirus vom Wildtyp in sf9-lnsektenzellen (Soodoptera fruoioerdai cotransfektiert. Die Transfektanten wurden auf Auschluss des negativen Phe-notyps in Plaque-Tests einem Screening unterworfen. Eine ausschluss-negative Platte wurde isoliert und nach 5 Runden aufeinanderfolgender Plattenreinigung wurde ein hoher Titer eines rekombinanten Virusvorrates hergestellt. Das rekombinante Virus enthielt gemäss Southern-Analyse das SFGF-Gen.
D. Natürlicher EGF
1. Der natürliche EGF wurde aus Speicheldrüsen von Mäusen isoliert oder von Collaborative Research gekauft.
Beispiel XI
Aktivitätstests
A. Mitooen-Test
Die Mitogenese-Tests wurden folgendermassen durchgeführt: diploide, humane Fibroblasten aus Zellkulturen von neugeborener Vorhaut wurden auf eine Dichte von 3x104 Zellen/Loch (96-Loch-Plat-ten, Nunclon, Roskilde, Denmark) und wurden in geändertem Eagle-Medium nach Dulbecco (GIBCO)/10% neugeborenes Kälberserum gezüchtet. Die Kulturen wurden dann in Medium mit 0,2% neugeborenem Kälberserum gegeben und 2 Tage später wurde der EGF (10 ng/ml) oder der zu testende Wachstumsfaktor (10 ng Äquivalente von EGF/ml) zugegeben. Nach 8 Std. wurden die Kulturen mit 5-[125l]-lod-2'-desoxyuridin (Amersham, 10 p.Ci/mi, 5 Ci/mg; 1 Ci = 37 GBq) markiert und die Menge des in das unlösliche TCA Material einverleibte Isotops wurde wie beschrieben bestimmt (Twardzik et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA (1985) 182:5300-5304).
B. Soft-Aoar-Kolonienwachstums-Stimulationtest
Eine 0,5 ml Grundschicht von 0,5% Agar (Agar Noble; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) in Wachstumsmedium wurde auf 24-Loch-Costar-Gewebekulturplatten aufgetragen. 1/2 ml 0,3% Agar in Wachstumsmedium, welches 1 bis 1,5.104 Zellen/ml NRK-Zellen oder andere Zeiiinien von Interesse und verschiedene Konzentrationen des getesteten Faktors enthielt, wurden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO2 in Luft inkubiert und nach 7 Tagen wurde 0,5 ml 0,3% Agar in Wachstumsmedium mit dem gleichen Gehalt des zu bestimmenden Faktors zugegeben. Die Kolonien wurden numeriert, gelöst und entfernt. Die Anzahl der Kolonien mit mehr als 6 Zellen wurde gezählt.
C. EGF-Rezeptprbindunos-Hemmungstest
Der Radiorezeptor-Test wurde folgendermassen durchgeführt: die Bindung von 125I-markiertem EGF (1251-EGF) an seinen Rezeptor auf Monoschichten von A431-Zellen wurde in Abänderung des Verfahrens von Cohen und Carpenter, Proc. Nati. Acad. Sei. USA (1975) 71:1317-1321) durchgeführt. Die Zel-
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ien (1x103 pro Loch) wurden auf 24-Loch-Platten fixiert (Linbro, Flow Laboratories) mit 10% Formalin in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung vor dem Test. Die formalin-fixierten Zellen werden von den Platten nicht so leicht abgestreift, wie dies bei nicht-fixierten Zellen der Fall ist, die Replikatwerte waren demzufolge konstant. Unter diesen Testbedingungen sättigt 125|_eGF (1x1 010 cpm/nmoi) den Bindungstest bei 3nM; die Tests wurden bei 10% des Sättigungswertes durchgeführt. Die Wachstumsfaktorkonzentrationen wurden als ng-Äquivalente EGF/ml ausgedrückt, d.h. die erforderliche Menge, um eine Hemmung des 125l-EGF-Bindungsäquivalent zu demjenigen, welches durch eine bekannte Menge EGF produziert wird, zu erzeugen.
D. Radioimmunoassav
Jede 50 pJ-Reaktion enthielt folgendes: 20 mM Natriumphosphat bei pH 7,4, 200 mM NaCI, 40 mM Di-thiothreitol, 0,1% bovines Serumalbumin, 0,1% NaN3, 125sl-markiertes Peptid (2x10* cpm) entsprechend den 17 carboxy-terminalen Resten von alpha-TGF (Linsley et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA (1985) 82:356-369), Antiserum mit einer finalen Verdünnung 1:5000 und andere Zugaben wie angegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Antiserum eingeleitet und wurde bei 23°C während 90 Min. fortgesetzt. Ein gleiches Volumen von 10% formaiin-fixiertem S. aureus (Pansorbin, Calbiochem) wurde dann zugegeben und die Inkubation wurden während weiteren 30 Min. bei 23°C fortgesetzt. Das Immunoad-sorbens wurde durch Sedimentation entfernt und die Menge des gebundenen 125l-markierten Peptides wurde gemessen. Die Menge des gebundenen Peptides wurde in Abwesenheit des Antikörpers auf nicht-spezifische Bindung gemessen (weniger als 5% des gesamten) und als Prozentsatz der maximalen Bindung ausgedrückt.
E. Wundheiluna
1. Mitteldermale, thermische Verletzungen
Mitteldermale, thermische Verletzungen wurden am dorsalen Thoras von anästhesierten, weiblichen Yorkshire-Schweinchen (30 Pfund) gemacht, wobei der Rücken rasiert und die Haare mit kommerzieller Haarentfernungscreme entfernt wurden. Eine Messingschablone (3x3 cm, 147 gm) wurde in einem Wasserbad mit 70°C equilibriert und während exakt 10 Sek. in festen Kontakt mit der Haut gebracht. Die resultierende Blase wurde dann entfernt. 5 mitteldermale Verbrennungen wurden auf jeder Seite der Wirbelsäure angebracht, wobei jede ungefähr 2,5 cm voneinander entfernt war. Die Verbrennungen wurden zweimal täglich mit ungefähr 3 ml Trägercreme (Siivadene) allein oder mit Wachstumsfaktor behandelt oder die Wunden blieben unbehandelt. Nach 9 oder 10 Tagen Behandlung mit natürlichen VGF wurden die Schweine anästhesiert und der Brandschorf wurde von den Verbrennungen entfernt. Es wurden Biopsien von jeder Verbrennung in den re-epithelisierten Bereichen genommen.
2. Mittedermale Spender-Transplantationsverletzunoen
Ein 5 Monate altes, 20,5 kg schweres Kleinschwein wurde mit 20 mg/kg Ketamin und 2 mg/kg Rompum anästhesiert. Der dorsale Thorax wurde rasiert, mit Betadin eingerieben und sorgfältig mit Kochsalzlösung gewaschen. Eine Anzahl von sechs 5x5 Spenderstellen wurden an jeder Seite des dorsalen Thorax mit einem Padgett-Dermatom bei 60/1000 Zoll durchgeführt, indem zwei Streifen bei 30/1000 Zoll entnommen wurden. Die topische Therapie enthält 1 ml Kochsalzlösung in 20 g Siivadene, gleichmässig über sechs Wunden auf der linken Seite verteilt. Die rechte Seite wurde mit 1 ml des Test-Wachstumsfaktors in 20 g Silvaden gleichmässig zwischen den sechs Wunden verteilt, behandelt. Es wurden alle Wunden mit einem Verbrennungsverband, Chux, Ace-Wickel und Gerkin, versehen. Die Tiere wurden wie oben beschrieben an den Tagen nach der Operation 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10 und 11 anästhesiert. Die Verbände wurden entfernt und die Wunden wurden mit Betadin eingerieben und sorgfältig mit Kochsalzlösung gespült. Das zweckmässige Mittel wurde appliziert und die Wunden wurden wie oben beschrieben geheilt.
Beispiel XII
Biologische Aktivität von rekombinanten Wachstumsfaktoren, hergestellt in prokaryontischen Zellen A. EGF-Rezeptorbinduno
Dieser Test bestimmt die Fähigkeit eines Moleküls, den EGF-Rezeptor zu binden, wie dies durch seine Fähigkeit, die Bindung von EGF an seinen Rezeptor zu hemmen, gemessen wird. Alle Wachstumsfaktoren und chimären Wachstumsfaktoren, ob modifiziert, verstümmelt, isoliert, erwiesen sich als aktiv im EGF-Rezeptorbindungstest. Eine Zusammenfassung dieser Resultate ist nachstehend dargestellt:
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Tabelle
EGF-Rezeptorbindung von rekombinanten Wachstumsfaktoren
Peptid
Expressionskassette
Reinheit EGF
Bindung an Rezeptor
N/TGF-modifizierte, verstümmelte Fusion pBM11/N/TGF
95%
Ja
PAD/nVGFa-modifizierte, verstümmelte Fusion pBM11/PAD/nVGFa
95%
Ja
NDP/VGFa-modifizierte, verstümmelte Fusion pBM11/NDP/VGFa
95%
Ja
N/TTV-modifizierte, verstümmelte, chimäre Fusion pBMl 1/NDP/VGFa
95%
Ja
NDP/TTV-modifizierte, verstümmelte, chimäre Fusion pBM11/N/TTV '
95%
Ja
NDP/VTV-modifizierte, verstümmelte, chimäre Fusion pBM11/NDP/TTV
95%
Ja
NDP/TW-modifizierte, verstümmelte, chimäre Fusion pBM11/NDP/VTV
95%
Ja
PAK/EG F
pBM11/PAK/EGF
95%
Ja
EGF
pBM11/PAK/EGF
95%
Ja
PAD/EGF
pBM11/PAD/EGF
95%
Ja
EGF
pBM11/PAD/EGF
95%
Ja
PAK/EGF
TacPak/EGF ■
95%
Ja
EGF
TacPak/EGF
95%
Ja
PAK/EGF
pTCPt/EGF
95%
Ja
EGF
pTCPt/EGF
95%
Ja
Ein Vergleich der Bindungs-Hemmkurven für natürlichen Mäuse-EGF und bakteriell exprimierter, re-kombinanter, chimärisches Wachstumsfaktor N/TTV (Polypeptid-Fusion von 32 N-terminalen Aminosäuren des lambda-N-Gens und des modifizierten und verstümmelten TGF/VGF-Hybrids) führten zur Erkenntnis, dass keine Unterschiede in den Bindungsaktivitäten bestanden.
B. Mitogene Aktivität
Die Aktivität von verschiedenen gereinigten Wachstumsfaktoren wurde getestet und die Aktivität war in allen Fällen vergleichbar mit dem Effekt, welcher durch den EGF bewirkt wurde. Die getesteten Verbindungen sind unten angegeben:
Tabelle
Mitogene Aktivität von Wachstumsfaktoren
Peptide Mitogene Aktivität* •
TTV-modifiziert, verstümmelt, chimär Ja
N/TTV-modifizierte, verstümmelte, chimäre Fusion Ja
* wie durch 3H-Thymidin- oder durch 125l-ldU-Einverleibung gemessen.
C. Wundheilung 1. Middermale Verletzungen
Der Effekt von natürlichem oder synthetischem TGF, EGF und VGF und ebenso wie rekombinanten Wachstumsfaktoren auf mitteldermale Verletzungen wurde wie in Beispiel VEI beschrieben, getestet. Der Prozentsatz des ursprünglichen Verbrennungsgebietes, welches heilte, wurde durch computerunterstützte Telemetrie bestimmt und der Prozentsatz der Wunden-Re-Epithelisierung wurde bestimmt. Die unbehandelten Wunden wurden zu etwa 15% re-epithelisiert. Die Behandlung mit Silvaden allein oder Sil-vaden mit EGF führte ungefähr zu 50% Re-Epithelisierung, während die Behandlung mit synthetischem TGF oder natürlichem VGF ungefähr zu 90% zu Re-Epithelisierung führt. Die optimale Konzentration zur Förderung der Re-Epithelisierung des EGF betrug 1 bis 10 ng/ml, während der synthetische TGF und der natürliche VGF eine maximale Reaktion bei 0,1 ng/ml zeigte.
Ähnliche Experimente, wie die obenbeschriebenen, wurden durchgeführt, um den Effekt bei der Wundheilung von TGF, einer modifizierten, verstümmelten Form von VGF (VGFa) oder einer modifizierten, verstümmelten, chimären Fusion von TGF und VGF (TTV) zu bestimmen, welche alle durch die rekombinante Technologie in Bakterien hergestellt wurden. Diese rekombinanten Wachstumsfaktoren und
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hybride Wachstumsfaktoren beschleunigten die Wundheilung im gleichen Ausmass, wie der synthetische TGF oder der natürliche VGF mit einer optimalen Konzentration von 0,1 ng/ml.
2. Mitteldermale Donor-Transplantationsverletzunaen
Der modifizierte, verstümmelte VGFa wurde auf seine Fähigkeit, die Wundheilung im Donor-Translati-onsplationsmodell zu beschleunigen, getestet. Der Behandlungsplan war gleich wie oben beschrieben (vgl. Beispiel I) unter Verwendung von 1 ml VGFa, 5 ng/ml in 20 g Silvaden. Es wurden täglich Photographien gemacht. Eine Zusammenfassung ist nachstehend angegeben:
Tabelle
Wirkung von rekombinantem VGFa bei der Wundheilung
Behandlung* Wundzustand POD**7
POD 8
POD 9
POD 10
Kochsalzlösung sehr offen offen,
vorwiegend geheilt mit etw. Heilung geheilt
VGFa-modifiziert, offen;
vorwiegend geheilt geheilt geheilt verstümmelt offensichtl. Epithelisierung
* Silvaden als Träger ** POD = postoperativer Tag
Der modifizierte, verstümmelte VGFa beschleunigte die Heilung der Wunde im Vergleich mit der Kontrolle mit Trägermaterial. Die Photographien (hier nicht vorhanden) bei POD 8 zeigten wesentliche Unterschiede zwischen Kochsalzlösung und VGFa.
Beispiel XIII
Biologische Aktivität von VGF, hergestellt in eukaryontischen Zellen A. VGF. hergestellt in Affennierenzellen (BSC-1 Ì
1. Das Medium, welches von BSC-1-Zellen 24 Std. nach der Infektion mit VV abgeleitet wurde, wurde auf die Gegenwart von Material getestet, welches mit 125I-EGF für die Bindung an EGF-Rezeptor-rei-che humane epidermoide Karzinomzellen (A431) konkurrieren kann. Die VV-infiszierten Zellen setzten eine wirksame Aktivität frei, welche mit dem EGF in Konkurrenz trat, wobei die Aktivität als VGF bezeichnet wurde. Das Volumen des Kontrollmediums von Mock-infiszierten BSC-1-Kontrollkulturen enthielten eine minimale Aktivität in Konkurrenz mit dem EGF.
Der Nachweis der VGF-Produktion bei der am frühesten getesteten Zeit, 2 Std. nach der Infektion, zeigte erhöhte Mengen von VGF im Kulturmedium. Nach 12 Std. wurden maximale Mengen dieser Aktivität im Kulturüberstand gefunden, wobei nach 24 Std. nur eine schwache Zunahme verzeichnet wurde.
Das Ausmass der VGF-Produktion erwies sich als eine Funktion der Multiplizität der Virusinfektion, wie dies durch folgende Tabelle dargelegt wird:
Tabelle
Wirksamkeit der Multiplizität der Infektion auf die VGF-Freisetzung
Virus-Multipiizität pfu pro Zelle
Freigesetzter VGF ng Äq. von EGF pro ml
0
-
10
2,7
20
4,5
40
6,1
80
10,1
Die Kulturen der BSC-1-Zellen wurden im pfu-Prozell-Verhältnis wie angegeben infisziert und die Überstände (ungefähr 1 ml/2x106 Zellen) wurden 24 Std. nach der Infektion geerntet. Es wurden jeweils Proben angesäuert, lyophilisiert und durch doppelte Radiorezeptorassays für EGF, wie beschrieben, getestet (Delarco und Todaro, Proc. Nati. Acad. Sei. USA (1978) 75:401-405). nq Äo. = Nanoqramm-Aguivalente
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2. Partielle Reinigung des VGF
Die Aktivität, welche mit EGF in Konkurrenz tritt und in W-infiszierten BSC-1-Zellen gefunden wurde, wurde partiell aus den säureextrahierten Kulturüberständen 24 Std. nach der Infektion wie oben beschrieben, gereinigt. Die säuresolubilisierten Polypeptide (10,5 mg) aus den Überständen wurden auf eine Biogel P10-Säule, die mit 1M Essigsäure equilibriert war, aufgetragen und es wurden Proben von jeder Fraktion auf die Aktivität, welche mit EGF in Konkurrenz tritt, getestet. Der aktive Hauptpeak (Fraktion 42) wurde etwas nach dem Mr 29 000 Carbon-Anhydrasemarker mit einem scheinbaren Mr von 25 000 eluiert. Das Molekulargewicht wurde durch Verwendung von Tandem-verbundenem Bio-Sil TSK 250 HPLC-Grössensäulen bestätigt, wobei die gesamte Aktivität als Hauptpeak in der Region mit dem Proteinmarker von Mr 25 000 eluiert wurde. Ein Mikrogramm des partiell gereinigten VGF war mit 90ng EGF im Radiorezeptor Konkurrenztest äquivalent.
3. Weitere Reiniguno von VGF
Die gepoolten Fraktionen der Gelfiltrationsäule (25-35) wurden durch Vakuumzentrifugation konzentriert, wieder in 0,05% Trifiuoressigsäure (TFA) suspendiert, geklärt und in 3,9 mm x 20 cm jxBondapak Ci8-Säulen (Waters, Milford, MA) injiziert. Die Peptide wurden mit einem linearen 20 bis 60% Acetonitril-Gradient in 0,05% TFA mit einer Fliessgeschwindigkeit von 1,0 ml/Min. bei 22°C eluiert. Aliquote Anteile jeder Fraktion wurden durch einen Radiorezeptortest auf die EGF-konkurrenzierende Aktivität getestet. Die Peptide, welcher der Spitzenaktivität entsprachen, wurden gesammelt und mit 0,05% TFA verdünnt und wiederum in eine jiBondapak-Säuie injiziert und unter Verwendung von isokratischen Bedingungen isoliert. Die Acetonitril-Konzentration betrug etwa 22 bis 25%.
Ein Vergleich des Anteils des VGF, hergestellt durch BSC-1-Zellen, die mit 15pfuVV pro Zelle infis-ziert waren, mit derjenigen von alpha-TGF, hergestellt durch Retrovirus-transformierte Zellen ist in der folgenden Tabelle dargestellt:
Tabelle
Vergleich der biologischen Aktivität von VGF mit alpha-TGF und EGF
Wachstumsfaktor1
EGF-Rezeptorbindung2 ng äq. zu EGF/ml/Medium
Einleitung d. DNA-Synthese [125l] IdU Einverleib. (cpm/Gefäss)
Stimulierung d. veranke-rungsunabhäng. Zellwachstum4
Softagar-Kolonien/Platte keiner
-
1,779
<20
VGF
2,3
3,760
108
TGF-alpha
0,2
NT
294
EGF
—
8,482
346
NT = nicht getestet
1VGF (90 ng Äquivalente (äq) zu EGF/ng Protein) wurden durch Gelfiltration nach der Elution aus einer Ci8 iiBondapak-Säule (Waters Associates) gereinigt. alpha-TGF wurden von Snyder-Theiien Felin-Sarkom-Virus-transformierten Fisher-Rattenembryo-Zellen gereinigt, gemäss Marquardt et ai., Proc. Nati. Acad. Sei. USA (1983) 80:4684-4688; der EGF wurde von submaximalen Drüsen von Mäusen gereinigt (Cohen et al., J. Biol. Chem. (1980) 255:41834—41842).
2Die Quantifizierung der EGF-Äquivalente beruhte auf einer Standard-Kurve für die 125l-EGF-Bin-dungskonkurrenz, wie beschrieben.
3Die Mitogenese-Tests wurden wie beschrieben durchgeführt; die ruhigen Kulturen von dipioiden, humanen Fibroblasten wurden mit 10 ng gereinigten EGF/ml oder mit der gleichen Anzahl EGF-Äquivalente VGF/ml behandelt. Die Werte für das [125l]-Iod-desoxyuridin ([125l]ldU) stellt einen Mittelwert von drei Bestimmungen dar.
4Die Anzahl der Softagar-Kolonien stellt eine mittlere Anzahl von Kolonien dar, welche ein Minimum von 20 NRK Zellen/sechs Zufalls-Niederenergiefelder 10 Tage nach dem Ansatz (1,5x 104 Zellen/ml) mit gereinigtem EGF (5 ng/ml) enthalten oder die gleiche Anzahl EGF-Äquivalente VGF/m I und 2,0 ng TGF-ß/ml aus humanen Blutplättchen gereinigt enthalten, gemäss Assoian et al., J. Biol. Chem. (1983) 258:7155-7160. Die Platten mit NRK-Zellen, die mit TGF-ß allein oben behandelt wurden, bildeten keine Kolonien.
B. VGF hergestellt in CHO-Zellen
Die biologische Aktivität von VGF hergestellt in CHO-Zellen wurde unter Verwendung des EGF-Bin-
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dungstests ausgewertet, wobei das Kulturmedium ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Der Wachs-tumsfaktor band sich an EGF-Rezeptor.
C. VGF hergestellt in Seidenraupen
Die biologische Aktivität von partiell gereinigtem (ungefähr 50%) VGF hergestellt in Seidenraupen, wurden unter Verwendung des EGF-Rezeptorbindungstests ausgewertet, wobei eine Bindung an den EGF-Rezeptor festgestellt wurde.
Tabelle
Prozent-Epithelisierung von Wunden nach Behandlung mit Wachstumsfaktor
Schwein 1 Natürlich. VGF ng/mi
(9 Tage n.d. Verbrennung)
Rechte Seite
Silvaden
Unbehandelt
0,1
0,1
15%
0%
70%
h-EGF (ig/ml
65%
Linke Seite
Silvaden
Unbehandelt
0,1
0,1
0,1
75%
55%
60%
70%
30%
Schwein 2
VGF* jig/ml
(10 Tage n.d. Verbrennung)
Rechte Seite
Silvaden
Unbehandelt
0,1
0,5
1.0
50%
0%
95%
95%
60%
Linke Seite
Silvaden
Unbehandelt
0,1
0,5
1,0
50%
0%
60%
75%
40%
Schwein 3
Ratten-TGF ng/ml
(9 Tage n.d. Verbrennung)
Rechte Seite
Silvaden
Unbehandelt
0,1
1,0
10
25%
5%
90%
85%
65%
* VGF: Natürlicher VGF hergestellt aus Vaecinia-Virus-infiszierten Zellen
D. Immunologischer Vergleich von VGF und TGF
Im oben beschriebenen Radioimmunoassay wurde eine 50% Verschiebung des Antigens vom Antikörper zu den carboxyterminalen 17 Aminosäuren des Ratten-TGF-alpha-Moleküls bei einer Antigenkon-zentration von ungefähr 0,2 bis 0,3 ng Äquivalenten EGF festgestellt, wobei der 125i-markierte alpha-TGF in Konkurrenz mit alpha-TGF tritt. Wenn VGF mit äquivalenten Konzentrationen getestet wurde, konnte keine Konkurrenz festgestellt werden. In einem kompetitiven Immunoassay auf native EGF, VGF-Präparate, wurde sogar beim Test mit 50 ng EGF Äquivalenten/ml eine minimale Verschiebung (weniger als 10%) des 125|-EGF von einem polyklonalen Antikörper zum nativen EGF festgestellt.
Es ist aus den obigen Resultaten offensichtlich, dass der VGF ein potentes Epithelisierungsmittel ist, welches in befriedigender Weise einen Vergleich mit anderen Wachstumsfaktoren, welche vorher getestet wurden und eine mitogenische Aktivität aufwiesen, standhält. Die erfindungsgemässen Polypeptide können mit verschiedenen Wirtsorganismen für die Induktion einer immunogenen Antwort, einer verbesserten cellulären Proliferation, für die Wundheilung oder dergleichen verwendet werden. Bei Wunden wurde eine Epithelisierung und Vaskularisierung beobachtet, ebenso wie eine schnelle Wiederherstellung der Festigkeit der Wunde, d.h. ein Widerstand gegen Trennen oder Reissen. Die Wirtsorganismen umfassen Säugetiere, wie Nagetiere, Haustiere, Primaten oder Menschen.
Erfindungsgemäss besitzen die neuen Verbindungen eine grosse Anwendung in verschiedenen Gebieten, beispielsweise als Diagnostika, für in vivo- und in vitro-Effekte auf Zellen, als Mitogene, Additive in Nährmedien, als Agonisten und Antagonisten gegen EGF und TGF, als Immunogene, als Therapeutika, für die Verbesserung der Wundheilung und dergleichen.
Im weiteren kann durch die Zurverfügungstellung von kleinen Oligopeptiden mit Bindungsaktivität, das Oligopeptid allein oder in Kombination mit anderen Polypeptiden verwendet werden, mit anderen Polypeptiden zur Änderung der Eigenschaften der anderen Polypeptide verschmolzen werden, wobei eine Bindung des Polypeptides an Zellen mit Wachstumsfaktor-Rezeptoren erzielt wird. Demzufolge können reversibel zahlreiche Polypeptide an Zellen gebunden werden, welche Wachstumsfaktor-Rezeptoren aufweisen, wobei die Eigenschaften der Zellen auf vorbestimmte Weise beeinflusst werden.
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Claims (33)

Patentansprüche
1. Polypeptid, gekennzeichnet durch a) seine Fähigkeit der Bindung an einen EGF-Rezeptor,
b) seine im wesentlichen gleiche Schlaufenstruktur, wie natürlich vorkommender Wachstumsfaktor, der zur Bindung an den EGF-Rezeptor als natürlicher Ligand fähig ist und c) mindestens 30% Homologie mit dem natürlichen EGF-Rezeptorbinder, wobei das Polypeptid drei Bereiche aufweist, jeder davon eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens 30% homolog mit den Fragmenten der gleichen oder verschiedenen natürlichen Liganden ist und die gleiche relative Stellung, wie diese Fragmente des natürlichen Liganden aufweist, wobei die Bereiche, wie nachstehend angegeben, definiert sind:
erster Bereich von mindestens 11 N-terminalen Aminosäuren, die bei Aminosäure aa-6 bis aa1 beginnen und bei Aminosäure aa11 bis aa15 enden;
zweiter Bereich von mindestens 11 zentralen Fragment-Aminosäuren, die bei Aminosäure aa11 bis aais beginnen und bei Aminosäuren aa25 bis aa£9 enden;
dritter Bereich von mindestens 14 Amino-C-terminalen Aminosäuren, die bei Aminosäure aa2® bis aa29 beginnen und bei aa40 bis aa53 enden,
mit der Massgabe, dass falls das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch zum natürlichen Liganden ist, ein vierter Bereich von mindestens 6 extrem- N-terminalen Aminosäuren, die bei aa-7 bis aa-i beginnen und bei Aminosäure aa-« bis aa-7 enden, vorhanden ist und eine Sequenz hat, die verschieden von den extrem-N-terminalen Aminosäuren des natürlichen Liganden ist.
2. Polypeptid gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es einen vierten Bereich von mindestens 6 extrem-N-terminalen Aminosäuren aufweist, die bei aa-7 bis aa-1 beginnen und bei aa-45 bis aa-7 enden.
3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Aminosäuresequenz oder ein Fragment davon von mindestens 37 Aminosäuren, das mindestens die Aminosäuren 1 bis 37 enthält, umfasst:
aa -24 -20 -15 -10 -5 -1
dsgnaiettspeitnattdipair 1 5 10 15 20
lcgpegdgyclhxìgdcihxSard
25 30 35 40
idgx3mycrcshgytgircqhvv 45 50 53
lvdyqrsenpnt worin X1 eine Bindung oder eine Aminosäure ist; X2 eine Bindung oder 1-2 Aminosäuren darstellt; X3 eine Bindung oder 1-4 Aminosäuren darstellt; Xi, X2 und X3 gleich oder verschieden sein können.
4. Polypeptid gemäss Anspruch 3, worin mindestens eine Aminosäure der genannten aa14 Threonin ist, aa24 Tyrosin ist, aa25 Alanin und aa27 Valin ist.
5. Polypeptid gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz aa-6 bis aa47 enthält.
6. Polypeptid gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass aa14 Threonin ist, aa24 Tyrosin und aa25 Alanin ist.
7. Polypeptid gemäss Anspruch 6, worin aa-6 bis aa13 der Aminosäuresequenz durch folgende Sequenz ersetzt ist:
aa -6 -11 5 10 13
vv-shfndcpdshtqfcfhg.
8. Polypeptid gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass aa14 bis aa27 der Aminosäuresequenz durch folgende Sequenz ersetzt ist:
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aa 14 20 25 27
TCRFLVQEDKPACV.
9. Polypeptid gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass aa22 durch Glutaminsäure ersetzt ist.
10. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2 codiert.
11. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der EGF-Ligand VGF, TGF-a, MGF, EGF, SFGF oder Amphiregulin ist.
12. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz eine Lea-der-Sequenz codiert, wobei gegebenenfalls eine Aminosäuresequenz, die selektiv gespalten werden kann, im Carboxyterminus dieser Leader-Sequenz eingefügt ist, die mit dem Aminoterminus des ersten Bereichs oder wenn der vierte Bereich vorhanden ist, mit dem Aminoterminus des vierten Bereichs verbunden ist.
13. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Leadersequenz ein N-ter-minales Fragment eines Lambda-N-Proteins eines Lambda-Cro-Proteins oder von Amphiregulin ist.
14. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Leader-Sequenz eine Signalsequenz ist.
15. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Signalsequenz eine alkalische Phosphatase-Signalsequenz, eine Affen-TGF-p-Signalsequenz oder eine K-Lactis-Killertoxin-Si-gnalsequenz ist.
16. DNA-Sequenz gemäss einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der genannten Bereiche mindestens 30% Homologie zu einem Fragment von VGF, TGF-a, EGF oder SFGF aufweist.
17. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine Änderung von der Sequenz aufweist, die einen natürlichen Liganden codiert und zu folgenden Änderungen in der Aminosäuresequenz führt: HGD zu HGT; GMYC zu GYAC; RCS zu VCS; CLHGDC zu CLHGTC; und GMYCRC zu GYACVC.
18. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Polypeptid und eine Leadersequenz mit 8 bis 45 N-terminalen Aminosäuren von einem Bakteriophagen Lambda-N-Protein oder Cro-Protein, Amphiregulin, TR-Gen32 oder einer bakteriellen, alkalischen Phosphatase-Signalse-quenz, die mit dem Aminoterminus des Polypeptides verbunden ist, gegebenenfalls über eine Aminosäuresequenz, die selektiv gespalten werden kann, codiert.
19. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Polypeptid mit einer Leadersequenz von 32 der 33 N-terminalen Aminosäuren codiert.
20. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das codierte Polypeptid TGF-a, VGF, VGFA, VGFa oder EGF ist.
21. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Polypeptid codiert, worin die Leader-Sequenz eine alkalische Phosphatase-Signalsequenz ist.
22. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das codierte Polypeptid VGFa, NVGFa oder EGF ist.
23. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Polypeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz codiert:
MVVSHFNDCPDSHTQFCFHG
TCRFLVQEEKPACVCSHGYT
GIRCQHVVLVDYQR.
24. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Polypeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz codiert:
MDIPAIRLCGPEGDGYCLHG
TCRFLVQEEKPACVCSHGYT
GIRCQHVVLVDYQR.
25. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Polypeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz codiert:
MVVSHFNDCPDSHTQFCFHGT
CIHARDIDGYACVCSHGYTGI
RCQHVVLVDYQR.
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26. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Polypeptid mit einer Leader-Sequenz codiert, die etwa 21 N-terminale-Aminosäuren von Cro-Protein umfasst.
27. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Polypeptid mit einer Leader-Sequenz codiert, die etwa 8 terminale Aminosäuren des T4-Gens 32 umfasst.
28. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das codierte Polypeptid folgende Aminosäuresequenz aufweist:
VVSHFNDCPDSHTQFCFHGT
CRFLVQEEKPACVCSHGYTG
IRCQHVVLVDYQR.
29. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 3-9 codiert.
30. Expressionskassette, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Richtung der Transkription einen in einer Wirtszelle funktionellen, transkriptionalen und translationalen Initiationsregelbereich, und eine DNA-Sequenz gemäss Anspruch 10 enthält.
31. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Expressionskassette gemäss Anspruch 30 enthält.
32. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Wirtszelle gemäss Anspruch 31 in einem zweckmässigen Kulturmedium gezüchtet wird, wobei das Polypeptid exprimiert und isoliert wird.
33. Plasmid zur Herstellung einer Wirtszelle gemäss Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dasâ das Plasmid die funktionellen Bereiche von pBM11/NDP/EGF; pBM11/PAD/EGF; pBM11/PAK/EGF; pBM11/N/TGF; pBM11/NDP/VGFA; pBM11/NDP/VGFa; pBM11/PAD/nVGFa; pBM11/PAK/nVGFa; pRSV/VGF; pAc/SFGF; pAc/VGF; Tac/Pak/EGF; pTCPt/EGF; pTCPt/nVGFa; pBM11/N/TTV; pBM11/NDP/TTV; pBM11/NDP/VTV oder pBM16/NDP/TVV enthält.
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