DE69020335T2

DE69020335T2 - B-ketten-analoge des von blutplättchen abstammenden wachstumsfaktors und verfahren zu deren homogener herstellung.

Info

Publication number: DE69020335T2
Application number: DE69020335T
Authority: DE
Inventors: Arlen Thomason
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1989-12-19
Filing date: 1990-12-17
Publication date: 1995-11-02
Anticipated expiration: 2010-12-18
Also published as: ATE123949T1; CA2032675A1; AU646014B2; AU7153491A; IE904608A1; JPH04504064A; EP0458959B1; DE69020335D1; GR3017317T3; NZ236549A; FI913892A0; US5272064A; EP0458959A1; NO913232D0; NO913232L; IL96723A0; EP0458959A4; DK0458959T3; WO1991008761A1; PT96272A

Description

Von dem von humanen Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor wird angenommen, dab er der wichtigste mitogene Wachstumsfaktor für Bindegewebszellen im Serum ist. Die mitogene Aktivität von PDGF ist in zahlreichen Studien dokumentiert worden, in denen gezeigt wurde, daß PDGF die Mitose in arteriellen glatten Muskelzellen, in Fibroblasten-Zellinien und Gliazellen positiv beeinflußt; vgl. Deuel et al., J. Biol. Chem 256 (17), 8896-8899 (1981); Heldin et al., J. Cell. Physiol., 105, 235 (1980) Gehirngliazellen; Raines und Ross, J. Biol. Chem., 257, 5154 (1982) (arterielle glatte Muskelzellen von Affen). Ferner wird angenommen, dab PDGF chemotaktisch anziehend auf Fibroblasten, glatte Muskelzellen, Monocyten und Granulocyten wirkt. Aufgrund der offensichtlichen Fähigkeiten, sowohl die Mitose an Stellen von Bindegewebsverletzungen zu induzieren als auch die Fibroblasten an Stellen solcher Verletzungen zusammenzuziehen, wird vermutet, daß PDGF ein besonderes Potential für den therapeutischen Einsatz bei der Reparatur von verletztem oder traumatischem Bindegewebe hat.
PDGF wurde von Ross et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 1207-1210 (1974) erstmalig als ein Faktor beschrieben, der im vollständigen Blutserum (aber nicht im Blutplättchen-armen Serum) gefunden wird und welcher in der Lage ist, das Wachstum von Fibroblasten in Kultur zu fördern. PDGF wurde im weiteren aus Blutplättchen und aus Serum isoliert, wobei das native unreduzierte PDGF als ein dimeres Protein mit einem Molekulargewicht von 27-35 kd identifiziert wurde. Es zeigte sich, daß die Reduktion von PDGF zwei oder mehrere kleine Banden in dem molekularen Großenbereich von 10-18 kd im Gel erzeugt. Es wurde angenommen, daß diese kleineren Banden zwei verschiedene kleinere monomere Untereinheiten von ungefähr 18 kd und 16 kd Molekulargewicht, bezeichnet jeweils als "A" und "B" Untereinheit oder alternativ PDGF A Kette und PDGF B Kette, repräsentieren. Die Aminosäuresequenz der zwei Untereinheiten von PDGF ist seitdem bestimmt worden, wobei sich zeigte, daß die PDGF B Kette zu mehr als 90 % homolog zum vorhergesagten Produkt des v-sis Gens ist, einem Onkogen des onkogenen "simian sarcome virus" (SSV); vgl. Doolittle et al., Science, 221 275-276 (1983) und Waterfield et al., Nature, 304, 2810-2814 (1983). Ferner zeigte sich, daß die A-Kette ungefähr 60 % homolog zur B Kette ist.
Das PDGF aus humanen Blutplättchen ist ferner als 109 Aminosäuren umfassendes Spaltungsprodukt eines 241 Aminosäuren großen Vorläuferpolypeptids identifiziert worden, welches vom c-sis Gen kodiert wird, dem menschlichen Gegenstück zum v- sis Gen; vgl. Johnson et al., EMBO Journal, 3 (5), 921-928 (1984). Die Sequenzdaten von Johnson et al. bestätigten ferner den hohen Grad an Homologie der vorhergesagten Aminosäuresequenz des v-sis Genproduktes, p28sis, mit der aktuellen Aminosäuresequenz der B Kette von PDGF. Die Homologie der PDGF B Kette zum v-sis Genprodukt beginnt bei Aminosäure 67 von p28sis, einem Serin-Rest, und setzt sich über 109 Aminosäuren bis zu einem Threonin-Rest an Aminosäureposition 175 fort, vgl. Johnson et al. ibid. Diese über 109 Aminosäuren homologe Sequenz stimmt ferner mit dem Spaltungsprodukt von 109 Aminosäuren des vom c-sis Gen codierten Vorläuferproteins überein, von dem angenommen wird, daß es die reife Form von PDGF im Menschen ist. Die Homologie mit dem vom c-sis Gen codierten Vorläuferprotein beginnt bei Aminosäure 82 des 241 Aminosäuren umfassenden Vorläuferproteins und setzt sich über 109 Aminosäuren fort.
Es wird angenommen, daß PDGF nur in Dimer-Form biologisch aktiv ist. Dieses biologisch aktive PDGF Dimer kann die Form eines PDGF AB Heterodimers, eines PDGF BB Homodimers oder eines PDGF AA Homodimers haben; vgl. Hannink et al., Mol. Cell. Biol., 6, 1304-1314 (1986). Jede monomere Untereinheit des biologisch aktiven Dimers, ungeachtet dessen, ob es sich um ein A-Ketten-Monomer oder ein B Ketten-Monomer handelt, beinhaltet acht Cystein-Reste. Einige dieser Cystein-Reste bilden Disulfidbrücken zwischen den Ketten, welche das Dimer zusammenhalten.
Die 109 Aminosäuren der zum v-sis Genprodukt homologen Sequenz (PDGF B&sub1;&sub0;&sub9;) sind von Johnson et al. als reife Form des PDGF B identifiziert worden und sind unter Verwendung rekombinanter Technik mit Hefe und anderen eukaryontischen Wirtszellsystemen verwendet worden, um aktives rekombinantes PDGF (rPDGF) zu erzeugen; vgl. U.S. Patent Nr. 4,766,073 ("Murray et al. I), Hefewirtszellen. Die Verwendung der für PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; kodierenden Sequenz liefert zwei Vorteile im Vergleich zur Verwendung der vollständigen von c-sis kodierten Sequenz: (1) die kodierende Sequenz für 109 Aminosäuren erleichtert die rekombinante Herstellung eines Proteins wie PDGF B, weil sie leichter zu manipulieren ist als die längere durch das c-sis Gen kodierte Sequenz, und (2) die kodierende Sequenz für 109 Aminosäuren resultiert in einem rekombinanten Produkt, welches von der Struktur dem reifen Protein von PDGF B näherkommt und somit vom Organismus, der mit rPDGF B behandelt wird, weniger Prozessierung erfordert. Es wurde vermutet daß weitergehende Deletionen der carboxy- oder aminoterminalen Aminosäuren zu noch kleineren, potentiell biologisch aktiven PDGF B Analoga führen, die eine breitere therapeutische Verwendung haben könnten; vgl. U.S. Patent Nr. 4,845,075 ("Murray et al. II"), wobei die therapeutische Wirkung dieser gekürzten Formen allerdings noch nicht gezeigt worden ist.
PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; kann durch rekombinante Technologie unter Verwendung irgendeines einer ganzen Reihe von Ausgangsmaterialien hergestellt werden, um die notwendige kodierende Sequenz bereitzustellen. Zum Beispiel kann das allgemein erhältliche v-sis Gen modifiziert werden, um das menschliche Gegenstück, das c-sis Gen, zu erhalten, und es kann im Anschluß an die Insertion eines Stopkodons an Aminosäureposition 110 zur Transfektion der gewünschten Wirtszellen eingesetzt werden. Alternativ kann entweder das c-sis Gen als Ausgangsmaterial eingesetzt oder die kodierende Sequenz für 109 Aminosäuren synthetisiert werden. Es ist darüberhinaus möglich, eine Kombination dieser Methoden zu verwenden, wie zum Beispiel bei Murray et al. beschrieben. In jedem Fall muß noch ein Stopkodon an Aminosäureposition 110 der kodierenden Sequenz positioniert werden. Andernfalls würde das Translationssystem der Wirtszelle über die 109 Aminosäurekodons hinaus translatieren, bis ein natürlich vorkommendes Stopkodon ereicht ist, und würde somit ein Protein produzieren, welches die Aminosäuresequenz des restlichen vom c-sis Gen kodierten Proteins enthält (falls ein Vektor mit inseriertem c-sis Gen verwendet wird) oder welches ein vom Vektor kodiertes Protein enthält (falls ein synthetisches Gen verwendet wird).
Die Verwendung von höher entwickelten eukaryontischen Wirtszellsystemen und Hefewirtszellsystemen für die rekombinante Produktion von PDGF B resultiert typischerweise in der Sekretion von biologisch aktivem rPDGF B in relativ geringen Mengen. Das Prozessierungssystem erzeugt jedoch innerhalb dieser höher entwickelten Wirtszellen ein rekombinantes rPDGF B Homodimerprodukt, welches auf irgendeine Weise durch die natürlichen biologischen Prozesse in der Wirtszelle wie Glykosylierung und/oder proteolytische Spaltung prozessiert worden ist. Dies ist besonders im Fall von Säuger-Wirtszellen zutreffend. Infolgedessen kann die genaue Zusammensetzung des rekombinanten Produktes nicht genau vorhergesagt oder in vielen Fällen nicht genau gesteuert werden.
Andererseits produzieren prokaryontische Wirtszellsysteme wie E. coli ein leichter zu kontrollierendes und definiertes Produkt aufgrund des auf der niedrigen Evolutionsstufe, die von diesen Wirtszellen besetzt wird, noch nicht vorhandenen Prozessierungssystems. Prokaryontische Wirtszellsysteme produzieren ferner sehr viel größere Mengen des gewünschten rekombinanten Produktes. Der Nachteil bei stärkeren Expressionssystemen ist, daß im Gegenzug zum Erlangen einer höheren Ausbeute des rekombinanten Produktes dieses rekombinante Protein aus Einschlußkörpern isoliert werden muß. Dieses erfordert typischerweise die Zurückfaltung des denaturierten Proteins, um ein biologisch aktives Produkt zu erzeugen. Allerdings haben kürzlich entwickelte Rückfaltungsmethoden den Wunsch verstärkt, rPDGF B in hoch exprimierenden Wirtszellsystemen zu exprimieren. Zum Beispiel wird in WO 91/08762 ein Verfahren beschrieben, um denaturiertes rPDGF zurückzufalten, wobei unter Verwendung eines Blocking-Reagenz ein geschütztes monomeres Intermediat gebildet wird. Auf der anderen Seite beschreibt die WO 90/04035 die PDGF Expression in E. coli als ein Fusionsprotein (d.h. mit Leadersequenz), welches vor der Abspaltung der Leadersequenz zurückgefaltet wird.
Dennoch zeigte sich überraschenderweise bei der Produktion von PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; in E. coli zumindest in einigen Fällen das Problem des "Überlesens" des Stopkodons. Mit anderen Worten, das Expressionssystem der Wirtszellen kann in einigen Fällen über das Stopkodon an Position 110 hinweglesen und ein längeres Produkt als das gewunschte PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; Endprodukt exprimieren. Wenn beispielsweise das Stopkodon UGA an Position 110 des c-sis Gens plaziert wurde, ist gefunden worden, daß die Aminosaure Selenocystein an dieser Position beim "Überlesen" positioniert wird. Die Insertion von Selenocystein wahrend des "Überlesens" bei naturlich vorkommenden UGA Kodons ist auch bei mehreren anderen Proteinen beschrieben worden; vgl. Zinoni et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3156-3160 (1987); Chambers et al., EMBO J., 5, 1221-1227 (1986), Sukenaga et al., Nucleic Acids Res., 15, 7178 (1987). Partielles "Überlesen" ist in geringem Umfang auch beobachtet worden, wenn UAG oder UAA Stopkodons an Position 110 des c-sis Gens plaziert wurden. Das "Überlesen"-Problem bewirkt in E. coli Wirtszellen die Produktion eines heterogenen Gemisches von PDGF B&sub1;&sub0;&sub9;, verbunden mit einer längeren Form von PDGF B. Dieses erfordert andererseits einen oder mehrere zusätzliche Trennungsschritte, die ausgeführt werden müssen, um ein homogenes produkt zu erhalten.
Für therapeutische und kommerzielle Zwecke ware es wünschenswert, auf ökonomische Art signifikante Mengen einer biologisch aktiven zuverlässig homogenen Form von PDGF B zu erhalten. Die Unfähigkeit von hoch exprimierenden prokaryontischen Wirtszellsystemen, rPDGF B in homogener Form zu produzieren, erhöht signifikant die Kosten der Erzeugung eines homogenen Produktes durch die zusätzlichen Kosten der(des) erforderlichen Trennungsschritte(s).
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, stark exprimierte homogene rPDGF B Analoga bereitzustellen, welche biologisch aktiv und dem natürlich vorkommenden PDGF B sehr ähnlich sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue rPDGF B Analoga bereitgestellt. Ferner wird ein Verfahren für die Produktion von signifikanten Mengen dieser neuen homogenen Analoga zur Verfügung gestellt. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet eine neue kodierende Sequenz, in der ein Stopkodon in dem c- sis Gen oder in eine andere Sequenz, die für ein Vorläuferprotein von PDGF B kodiert oder Analoga davon, entsprechend an einer Stelle von dem Kodon für die Aminosäure 111 bis zum Kodon für die Aminosäure 160 positioniert ist. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt die Produktion von relativ großen Mengen homogener rPDGF B Analoga durch hoch exprimierende Wirtszellen wie E. coli. Die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung produzierten rPDGF Analoga zeigen biologische Aktivität, die mit der Aktivität des natürlich vorkommenden PDGF B vergleichbar ist.

Beschreibung der Zeichnungen

Abb. 1 ist eine graphische Darstellung der Aminosäuresequenz-Daten, die aus der Analyse von Säuger rPDGF B abgeleitet wurde.
Abb. 2 ist ein Coomassie-Brilliant-Blau gefarbtes Elektrophoresegel, welches die relative Mobilität von Säuger rPDGF B im Vergleich zu E. coli rPDGF B&sub1;&sub0;&sub9; und rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; zeigt.
Abb. 3 zeigt die spezielle kodierende Sequenz, welche benutzt wurde, um PDGF B&sub1;&sub1;&sub9; wie in Beispiel 1 beschrieben zu exprimieren.
Abb. 4 ist ein Coomassie-Brilliant-Blau gefärbtes Elektrophoresegel, welches die Mobilität von E. coli rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; zeigt, das aus verschiedenen Ansätzen stammt, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden.
Abb. 5 ist die graphische Darstellung der mitogenen Aktivität von in E. coli produziertem rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9;, welches gemaß der vorliegenden Erfindung zurückgefaltet worden ist.
Abb. 6 ist die graphische Darstellung der chemotaktischen Aktivität auf Fibroblasten von in E. coli produziertem rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9;, welches gemäß der vorliegenden Erfindung zurückgefaltet worden ist.
Abb. 7 ist die graphische Darstellung der chemotaktischen Aktivität auf Monocyten von in E. coli produziertem rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9;, welches gemäß der vorliegenden Erfindung zurückgefaltet worden ist.
Abb. 8 zeigt die Aktivität eines PDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Monomeren im Vergleich zum PDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Homodimeren.
Die vorliegende Erfindung liefert neue rPDGF B Analoga. Diese Analoga sind 110- 159 Aminosäuren lang und haben die gleiche Aminosäuresequenz wie ein Teil des PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; Vorläuferproteins oder des PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; Vorläuferprotein-Analogons. Die Analoga können in Form von Monomeren und/oder Dimeren vorliegen.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von kommerziell verwendbaren Mengen dieser homogenen rPDGF B Analoga aus hoch exprimierenden Wirtszellsystemen wie E. coli bereit. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird durch eine Transfektion oder Transformation von ausgewählten Wirtszellen mit einer neuen kodierenden Sequenz durchgeführt. Die neue kodierende Sequenz basiert auf dem c-sis Gen oder einer für das PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; Vorläuferprotein kodierenden Sequenz oder entsprechenden Analoga, in denen an einer Stelle entsprechend dem Kodon für die Aminosäure 111 bis zum Kodon für die Aminosäure 160 ein Stopkodon positioniert ist.
Um das Verständnis der vorliegenden Erfindung zu fördern, werden die folgenden Begriffe gemäß der nachstehenden Definition verwendet.
Sofern nicht anders angegeben, ist PDGF B eine beliebige Kombination von PDGF B Monomeren und/oder Dimeren, einschließlich entsprechender Analoga, die reduziert oder nicht reduziert, biologisch aktiv oder inaktiv, rekombinant oder anders gewonnen vorliegen können. Die Bezeichnung "PDGF B" soll spezifisch auch PDGF B Analoga einschließen, die eine oder mehrere Modifikationen der Anzahl und/oder Identität der Aminosäuren des natürlich vorkommenden PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; haben. PDGF B Analoga sind biologisch aktiv oder können durch Rückfaltungs-Technik oder andere ähnliche Manipulationen biologisch aktiv gemacht werden.
Die Bezeichnungen "PDGF Monomer" und "monomeres PDGF" bedeuten ein einzelnes monomeres PDGF Molekül, welches keine Disulfidbrücken zu einem anderen PDGF Molekül aufweist. Der Begriff "reduziertes PDGF" bedeutet notwendigerweise monomeres PDGF.
Die Bezeichnungen "PDGF Dimer" oder "dimeres PDGF" bezeichnen ein PDGF Molekül, welches zwei monomere Untereinheiten umfaßt, welche über Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind.
Die Bezeichnung "biologisch aktives PDGF Dimer" bezeichnet dimeres PDGF, welches im wesentlichen die gleiche mitogene Aktivität und/oder chemotaktische Aktivität wie natürlich vorkommendes PDGF hat.
Die Bezeichnung "biologisch aktives PDGF Monomer" bezeichnet monomeres PDGF, welches eine spezifische mitogene Aktivität von mindestens etwa ein Tausendstel der spezifischen mitogenen Aktivität des natürlich vorkommenden dimeren PDGF hat.
Die Bezeichnung "biologisch aktive Konformation", wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf die Konformation von biologisch aktivem PDGF Dimer oder biologisch aktivem PDGF Monomer.
Die Bezeichnung "Vorläuferprotein" bezieht sich auf das 241 Aminosäuren umfassende, vom c-sis Gen kodierte Vorläuferprotein von PDGF B&sub1;&sub0;&sub9;.
Die Bezeichnung "Vorläuferprotein-Analogon" bezieht sich auf ein Vorläuferprotein, welches eine oder mehrere Modifikationen an Anzahl und/oder Identität der Aminosäuren im Vergleich zur vom c-sis Gen kodierten 241 Aminosäuren umfassenden Aminosäuresequenz aufweist. Ebenso wie die Vorläuferproteine werden auch Vorläuferprotein-Analoga durch die für ein Vorläuferprotein kodierende Sequenz kodiert.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "für ein Vorläuferprotein kodierende Sequenz" das c-sis Gen oder irgendeine kodierende Sequenz, welche für das 241 Aminosäuren lange, vom c-sis Gen kodierte Vorläuferprotein PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; oder entsprechende Analoga kodiert. Obwohl die für ein Vorläuferprotein kodierende Sequenz eine oder mehrere Modifikationen an Anzahl und/oder Identität der Kodons des natürlich vorkommenden c-sis Gens aufweisen kann, ist die für ein Vorläuferprotein kodierende Sequenz: (1) in der Lage gegen das c-sis Gen zu hybridisieren oder (2) würde zum c-sis Gen (und/oder (1)) hybridisieren, wenn der genetische Kode nicht degeneriert wäre. Üblicherweise wird eine für ein Vorläuferprotein kodierende Sequenz bevorzugte Kodons für die Expression in dem ausgewählten Wirtszellsystem beinhalten.
In dem hier verwendeten Nummerierungssystem bezeichnet Aminosäure-Nummer 1 das aminoterminale Serin des reifen Blutplättchen PDGF B, wie von Johnson et al., ibid. bestimmt. Diese Position entspricht dem Aminosäurerest 82 des 241 Aminosäuren umfassenden Vorläuferproteins. Aminosäuren, die dem Serin-Rest Nummer 1 in dem vom c-sis Gen kodierten Vorläuferprotein vorangehen, werden mit negativen Ziffern bezeichnet. Aminosäuren, die dem Serin an Position 1 folgen, werden sequentiell nummeriert, so daß die 2415te Aminosäure des Vorläuferproteins als Aminosäure 160 bezeichnet wird.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemaße PDGF B Produkt, das dem in Säugern vorkommenden PDGF B am nächsten kommt, in homogener Form von hochexprimierenden prokaryontischen Wirtszellen erzeugt. Um andere bevorzugte potentielle Stellen für das Einfügen des Stopkodons in der Vorläuferprotein kodierenden Sequenz zu identifizieren (für spätere Transformation oder Transfektion einer prokaryontischen Wirtszelle), wurde zuerst das vollständige, für 241 Aminosäuren kodierende c-sis Gen in einen Expressionsvektor inseriert und zur Transfektion von CHO-Zellen (chinese hamster ovary cells) eingesetzt. Das resultierende Proteinprodukt wurde dann gereinigt und chromatographisch getrennt, um die Carboxytermini der Proteine zu bestimmen, die bei der Prozessierung durch CHO-Zellen entstehen. Es zeigte sich, wie ausführlich in den folgenden Beispielen beschrieben wird, daß die zwei vorherrschenden PDGF B Proteinprodukte, die von den CHO-Zellen exprimiert wurden, nach Aminosäure 109 und nach Aminosäure 119 terminiert waren. Zusätzlich wurden mindestens zwei andere PDGF B Analoga durch proteolytische Spaltung in einem Bereich nach etwa Aminosäure 126 bis etwa nach Aminosäure 136 prozessiert. Basierend auf mdglichen proteolytischen Spaltstellen wurde angenommen, daß die Carboxytermini dieser beiden zusätzlichen PDGF Analoga nach den Arginin-Resten enden, nämlich nach den Aminosäuren 126, 130, 133, 135 und 136.
Vorzugsweise wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung durch Transfektion oder Transformation von Wirtszellen mit einer für ein Vorläuferprotein kodierenden Sequenz durchgeführt, in der ein Stopkodon an einer Stelle der kodierenden Sequenz von dem Kodon für die Aminosäure 111 bis zum Kodon für die Aminosäure 137 positioniert wurde. Besonders bevorzugt ist das Stopkodon an einer Stelle von dem Kodon für die Aminosäure 120 bis zum Kodon für die Aminosäure 137 positioniert. Insbesondere bevorzugt ist die Positionierung des Stopkodon an einer Stelle, die dem Kodon für die Aminosäure 120, 127, 131, 134, 136 oder 137 entspricht. Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung einer kodierenden Sequenz, bei der ein Stopkodon beim Kodon für die Aminosäure 120 positioniert ist, um das Verfahren der vorliegenden Erfindung durchzuführen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung liefert neue Analoga von PDGF B, welche eine Lange von 110 bis 159 Aminosauren haben. Die besonders bevorzugte Positionierung des Stopkodons resultiert in der Produktion von PDGF B&sub1;&sub1;&sub9;
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann allgemein unter Verwendung einer Modifikation einer der zahlreichen an sich bekannten Methoden für die rekombinante Produktion von PDGF B durchgeführt werden. Zum Beispiel kann zunächst das v-sis Gen modifiziert werden, um das menschliche Gegenstück, das c-sis Gen, zu erhalten, oder man benutzt das c-sis Gen als Ausgangsmaterial und transformiert oder transfiziert, im Anschluß an die Plazierung eines Stopkodons an irgendeiner der Aminosäurepositionen von 111 bis 160, die gewünschten Wirtszellen. Das Stopkodon wird vorzugsweise in das c-sis Gen oder in die für ein Vorläuferprotein kodierende modifizierte v-sis Sequenz durch ortsspezifische Mutagenese eines zuvor existierenden Kodons eingefügt.
Alternativ kann entweder die für ein Vorläuferprotein kodierende Sequenz synthetisiert oder zuerst das c-sis Gen oder das modifizierte v-sis Gen an einer passenden Restriktionsschnittstelle nahe dem Carboxyterminus gekürzt und dann der Carboxyterminus der für ein Vorläuferprotein kodierenden Sequenz zur gewünschten Endposition (111 bis 160) unter Verwendung bevorzugter Kodons für den Vektor und für das verwendete Wirtszellsystem wiederhergestellt werden. Das c-sis Gen oder das modifizierte v-sis Gen kann ferner an einer passenden Restriktionsschnittstelle nahe dem Aminoterminus gekürzt werden, und der Aminoterminus kann bis zur gewünschten Startposition (vorzugsweise Aminosäure 1), wiederum unter Verwendung von Kodons für den ausgewählten Vektor und das Wirtszellsystem, zurückgebildet werden. Ungeachtet dessen, ob natürlich vorkommendes oder synthetisches Ausgangsmaterial oder eine Kombination davon verwendet wird, muß ein Stopkodon nach dem gewünschten Carboxyterminus der für ein Vorläuferprotein kodierenden Sequenz positioniert werden; d.h. an einer Aminosäureposition von 111 bis 160.
Im bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung wird das v-sis Gen modifiziert, um das c-sis Gen zu erhalten, wobei im Anschluß daran oder gleichzeitig ein Stopkodon an der gewünschten Stelle des modifizierten Gens, entsprechend der vorliegenden Erfindung, positioniert wird. Die c-sis Vorläuferprotein kodierende Sequenz, die das Stopkodon enthält, wird dann in einen Vektor inseriert, der zur Transformation oder Transfektion der gewunschten prokaryontischen Wirtszellen verwendet wird.
Im Verfahren der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise eine für ein Vorläuferprotein kodierende Sequenz verwendet, die ein Analogon des c-sis Gens darstellt. Das Analogon des c-sis Gens, das für ein Vorläuferprotein kodiert, kann so konstruiert werden, daß es bevorzugte Kodons für die Expression in E. coli Wirtszellen enthält. Das Analogon des c-sis Gens kann durch ein Verfahren erhalten werden, das sowohl die Mutation individueller Basen in der DNA als auch die Substitution synthetischer kodierender Sequenzen für die Carboxy- und Aminotermini nach Spaltung der existierenden kodierenden Sequenzen mit Restriktionsenzymen an geeigneten Stellen, um die Ligation mit den synthetischen Termini zu ermöglichen beeinhaltet.
Das v-sis Gen stellt ein exzellentes Ausgangsmaterial dar, um die für ein Vorläuferprotein kodierende Sequenz für die Verwendung in einem erfindungsgemäben Verfahren zu erhalten. Zum Beispiel sind in der Region von Aminosäure 1-119 nur fünf Aminosäuren zwischen dem v-sis kodierten Protein und dem c-sis kodierten PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; Vorläuferprotein unterschiedlich. Zwei dieser fünf Kodons, die im v-sis Gen für Aminosäuren kodieren, können durch in vitro Mutagenese-Techniken verändert werden, um eine DNA-Sequenz zu erzeugen, die für ein Protein kodiert, in dem die zwei Aminosäuren die gleichen sind wie die entsprechenden Reste in dem PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; Vorläuferprotein. Für den gewünschten Austausch in den Kodons 101 und 107 kann eine Anzahl von Methoden für die in vitro Mutagenese von DNA benutzt werden. Solche Methoden sind an sich bekannt. Zum Beispiel sind die Methoden von Eckstein und Mitarbeitern (Taylor et al., Nucl. Acids Res., 13 8764-8785 (1985); Nakamaye und Eckstein, Nucl. Acids Res 14, 9679-9698 (1986)) wie sie in der Anleitung von Amersham (Arlington Heights, Illinois) für das "Oligonucleotide-Directed In Vitro Mutagenesis System" Kit beschrieben werden, von besonderem Nutzen zur Umwandlung des Isoleucin-Restes an Aminosäureposition 101 zu einem Threonin-Rest und des Alanin-Restes an Aminosäureposition 107 zu einem Prolin-Rest.
Im Anschluß an die in vitro Mutagenese der Kodons entsprechend den Aminosäuren 101 und 107 kann die veränderte v-sis DNA dann am Aminoterminus mit dem Restriktionsenzym BglII, welches an einer Position entsprechend dem Kodon fur die Aminosäure 24 schneidet, gekürzt werden. Der stromaufwärts liegende Bereich des Gens, inklusive der Kodons fur die ersten 24 Aminosauren, kann wiederhergestellt werden durch Ligation der stromabwarts gelegenen, BGlII gespaltenen, mutagenisierten v-sis DNA mit einem synthetischen DNA-Fragment, welches kodiert für: (1) ein ATG Translationsinitiationskodon; (2) einen Serin-Rest an Aminosäureposition 1; und (3) den Rest der ersten 24 Aminosäuren des von c-sis kodierten Vorläuferprnteins. Auf diese Art werden zwei der anderen drei verschiedenen Aminosäuren, d.h. der Serin-Rest an Aminosäureposition 6 und der Valin-Rest an Aminosäureposition 7 zur humanen PDGF B Form (bzw. Threonin und Isoleucin) konvertiert, wobei die stromaufwärts liegenden durch das v-sis Gen kodierten Aminosäuren des Vorläuferproteins entfernt werden.
Die Verkürzung des Carboxyterminus ermöglicht in ähnlicher Art den Ersatz des Carboxyterminus durch ein synthetisches Fragment, das gleichzeitig das Kodon für die Aminosäure 114 verändert und das Kodon für die Aminosäure 120 durch ein Stopkodon austauscht. Vorzugsweise wird die mutagenisierte v-sis DNA mit dem Restriktionsenzym SmaI geschnitten, welches an einer Stelle spaltet, die dem Kodon für die Aminosäure 112 entspricht. Ein synthetisches DNA Fragment, welches für die Aminosäuren 112-119 des PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; Vorläuferproteins kodiert und ein Translationsstopkodon an Position 120 hat, kann dann mit der SmaI gepaltenen, mutagenisierten v-sis DNA ligiert werden. Diese synthetische DNA kodiert ferner für einen Glycin-Rest anstelle eines Threonin-Restes an der Stelle des Kodons für Aminosäure 114 und ermöglicht die Konvertierung der fünften Aminosäure, die sich von der entsprechenden Aminosäure im PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; Vorläuferprotein unterscheidet.
Das endgültige DNA-Konstrukt dieser für ein Vorläuferprotein kodierenden Sequenz kodiert für die Aminosäuren 1-119 des PDGF B und für einen zusätzlichen Methionin-Rest am Aminoterminus. Dieses PDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Gen kann dann mit einem geeigneten Expressionsvektor wie pCFM 1156 ligiert und dann in ein geeignetes Wirtszellsystem transformiert oder transfiziert werden, vorzugsweise ein Prokaryont wie eine E. coli Wirtszelle, wobei das aminoterminale Methionin in vivo nach der Synthese in der Wirtszelle entfernt wird. (Es ist möglich, daß einige E. coli Stamme das aminoterminale Methionin nicht entfernen und daher ein rekombinantes Produkt mit einer zusatzlichen Aminosaure am Aminosaureterminus synthetisieren).
Das bevorzugte Expressionsystem fur die Produktion von homogenen rPDGF B Analoga der vorliegenden Erfindung umfaßt prokaryontische Zellkultursysteme, vorzugsweise E. coli. In Erganzung zu den beschriebenen, speziellen Expressionssystemen beinhaltet die vorliegende Erfindung auch andere Systeme und schließt als nicht limitierendes Beispiel die Modifikation der Proteasespaltungsstellen und/oder die Benutzung alternativer Leadersequenzen mit ein, um in den Wirtszellen die Produktionsmenge an rPDGF Analoga der vorliegenden Erfindung zu erhöhen.
Die neuen rPDGF B Analoga der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung irgendeiner der zahlreichen, bekannten Verfahren aus der Wirtszelle isoliert, zurückgefaltet und gereinigt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Rückfaltung ist in WO 91/08762 beschrieben.
In Übereinstimmung mit dem bevorzugten Rückfaltungsverfahren wird ein Disulfid- Blocking-Reagenz verwendet, um ein Monomergemisch von Disulfid-Intermediaten zu erzeugen, bei denen die freien Sulfhydrylgruppen der reduzierten, ungefalteten rPDGF Monomere geschützt sind. Dieses bewahrt die Sulfhydrylgruppen des reduzierten rPDGF vor vorzeitiger Bildung von Disulfidbrücken während der Isolierung und Reinigung. Gleichzeitig macht diese Modifikation das rPDGF Intermediat in wässrigen Lösungen löslich. Als Konsequenz ist es möglich, daß das geschützte monomere Intermediat die biologisch aktive Konformation in einem wässrigen Medium annimmt, wonach die Aufhebung der Blockierung erfolgen kann. Typischerweise resultiert die Aufhebung der Blockierung in der Bildung einer dimeren Form von PDGF, in der die dimere Struktur durch Ausbildung von den gewünschten Intraketten- und Interketten-Disulfidbrücken nun mehr korrekt fixiert sind.
Überraschenderweise stellte sich heraus, daß das geschützte, monomere rPDGF B Analogon der vorliegenden Erfindung biologische Aktivität zeigt, obwohl eine signifikant größere Menge des Monomers benötigt wird, um die maximale Aktivität, welche für das entsprechende PDGF Dimer beobachtet wurde, zu erzielen (d.h. die spezifische Aktivität des Monomers ist niedriger als die des Dimers). Es wird nicht angenommen, daß PDGF natürlicherweise in monomerer Form existiert, und entsprechend ist es so noch nicht aus natürlichem Ausgangsmaterial isoliert worden. Auf der Basis der gegenwärtigen Modelle des Wirkungsmechanismus, bei denen davon ausgegangen wird, daß PDGF ein Signal via Interaktion mit PDGF Zelloberflächenrezeptoren übermittelt, wird angenommen, daß die dimere Form für die biologische Aktivität notwendig ist.
Das vorherrschende Model 1 für die erforderliche Interaktion mit den Zelloberflächenrezeptoren legt die Vermutung nahe, dab zwei PDGF Rezeptoren miteinander interagieren müssen, um das Signal zu übermitteln. Dies führt zu einer wechselseitigen Reaktion, die Kreuz-Phosphorylierung genannt wird, d.h. jeder Rezeptor katalysiert das Anhängen einer Phosphatgruppe an den jeweils anderen. Es wird angenommen, daß jede monomere Untereinheit des PDGF-Dimers an ein einzelnes Rezeptormolekül bindet, so daß zwei Rezeptoren zusammengebracht werden und die Kreuz-Phosphorylierung ermöglicht wird, was gelegentlich auch als Rezeptor- Dimerisierung bezeichnet wird; vgl. Williams, Science, 243 1564-1570 (1989); Hammacher et al., EMBO, 8, 2489-2495 (1989). Obgleich es nachfolgend postuliert wurde, daß die monomere Form von PDGF in einigen Fällen biologische Aktivität haben mag (WO 89/04460), konnte die Existenz solch einer Aktivität eines PDGF Monomers bisher noch nicht gezeigt werden. Ferner gibt es keine Erklärung, wie ein Monomer die erforderliche Rezeptor-Dimerisierung induzieren könnte.
Obgleich beobachtet wurde, daß wesentlich größere Mengen der erfindungsgemäßen monomeren rPDGF B Analoga ben6tigt wurden, um die beobachtete maximale biologische Aktivität zu zeigen, die mit der entsprechenden Dimer-Form erreichbar ist, zeigte sich auch, daß diese Monomere in der Tat imstande sind, ein Niveau von "Superaktivität" zu erreichen, d.h. die Aktivität ist mindestens etwa 3 bis 3,5 mal höher als die, die mit irgendeiner Menge des Dimers erreicht wird.
Das pharmazeutische Potential von biologisch aktiven dimeren rPDGF Analoga und/oder biologisch aktiven monomeren rPDGF B Analoga der vorliegenden Erfindung kann für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, die zur Behandlung von vielen Wundtypen von Säugerarten durch Arzte und/oder Tierärzte dient. Die Menge von biologisch aktivem PDGF, das in den pharmazeutischen Zusammensetzungen für solche Behandlungen eingesetzt wird, wird natürlich von der Stärke der Wunde, die behandelt wird, vom Weg der gewählten Verabreichung und der spezifischen Aktivität oder Reinheit von PDGF abhängig sein, und wird durch den behandelnden Arzt oder Tierarzt bestimmt werden. Die Bezeichnung "therapeutisch wirksame" PDGF Menge bezieht sich auf die Menge von PDGF, die in Abwesenheit von anderen verabreichten Wachstumsfaktoren zur Erzeugung einer therapeutischen Reaktion in einem Säuger bestimmt wurde. Solche therapeutisch wirksamen Mengen konnen ohne weiteres ermittelt werden.
Das erfindungsgemäß hergestellte PDGF kann auf irgendeinem Weg angewendet werden, der sich für die zu behandelnden Wunden oder Krankheitszustände eignet.
Krankheitszustände, die durch therapeutische Verabreichung von PDGF erfolgreich behandelt werden können, schließen die zuvorgenannten offenen Hautwunden, Schnittwunden der Haut und gastrointestinale Schnittwunden mit ein. PDGF kann auch zur Heilung von Knochen, Knorpel, Sehnen, Bändern und des Epithels (z.B. Darmauskleidung, Magenauskleidung) und zur Gliazellen-vermittelten Reparatur verwendet werden.
PDGF wird bevorzugt äußerlich auf die Wunde angewendet. Die äußerliche Verabreichung kann durch eine einmalige Verabreichung oder Dosis oder durch wiederholte Dosen in festgelegten Intervallen erfolgen. Die Zusammensetzungen für die äußerliche Verabreichung von PDGF der vorliegenden Erfindung lassen sich ohne weiteres ermitteln. Die bevorzugte Behandlungsmethode hängt von der Wunde oder dem Krankheitszustand ab. Obgleich für PDGF die Mdglichkeit besteht, es als reine oder im wesentlichen reine Verbindung anzuwenden, wird die Verabreichung als pharmazeutische Zubereitung oder Präparation bevorzugt.
Die Zubereitungen der vorliegenden Erfindung sowohl für die Verwendung in der Tiermedizin als auch für die Verwendung beim Menschen umfaßt eine therapeutisch wirksame Menge von PDGF, wie vorstehend beschrieben, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern und gegebenenfalls anderen therapeutischen Inhaltsstoffen. Der (die) Träger muß "verträglich" sein, was bedeutet, daß er mit den anderen Inhaltsstoffen der Zubereitung verträglich und für den Empfänger nicht schädlich ist. Vorzugsweise sollte die Zubereitung weder oxidierende noch reduzierende Agentien und andere Substanzen enthalten, die dafür bekannt sind, dab sie mit Peptiden unverträglich sind. Die Zubereitungen kdnnen in Form von Einheitsdosen verabreicht werden und nach an sich gut bekannten Methoden hergestellt werden. Alle Methoden beinhalten den Schritt, den Wirkstoff mit dem Träger, der aus einem oder mehreren zusätzlichen Inhaltsstoffen bestehen kann, zusammenzubringen. Im allgemeinen werden die Zubereitungen durch gleichmaßiges und grundliches Durchmischen von PDGF mit flussigen oder feinverteilten festen Trägern oder beidem hergestellt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Reinigung und Trennung von in CHO-Zellen hergestelltem rPDGF B

Das c-sis Gen, das ein natürlich vorkommendes Stopkodon beim Kodon für Aminosäure 161 besitzt, wurde kloniert und in CHO-Zellen exprimiert, wie dies im Detail in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/U588/0070 beschrieben ist. Das resultierende rPDGF B wurde wie nachfolgend dargestellt aufgereinigt und aufgetrennt.
Das rPDGF B aus dem konditionierten Medium von CHO-pDSVE/c-sis-Zellen wurde in vier Schritten gereinigt, dann aufkonzentriert und diafiltriert. Im ersten Schritt wurde ein starkes Kationenaustauscher-Harz, Biocryl BPA-2100, zu dem filtrierten konditionierten Medium in einem Verhältnis von 0,125 % (Volumen 10%ige Suspension/Volumen Medium) hinzugefügt. Zur Bindung des rPDGF B Proteinproduktes an das Austauscherharz wurde das Gemisch gerührt. Danach wurde das Produkt-Harz-Gemisch durch Durchfluß-Zentrifugation (flow centrifugation) wiedergewonnen. Der Niederschlag wurde dann mit annähernd 8 Volumen (bezogen auf das Naßgewicht des Niederschlages) eines Puffers (10% Ethanol/10 mM Tris/HCl, pH 7,7) gewaschen und durch Zentrifugation wiedergewonnen. Der Niederschlag wurde in zwei Volumen des gleichen Puffers resuspendiert, und anschließend wurde ein äquivalentes Volumen von 95 % igem Ethanol hinzugefügt. Diese Harz-Suspension wurde vor der weiteren Verarbeitung bei -20ºC ± 10ºC aufbewahrt.
Die Harz-Suspension wurde zentrifugiert und der Niederschlag wurde in 0,1 M NaCl/20 mM Tris/HCl, pH 7,7 bei kontrollierter Raumtemperatur resuspendiert. Die erhaltene Suspension wurde mit 10% (w/v) Natrium-N-laurylsarkosin bis zu einer Endkonzentration von 1 % (w/v) versetzt. Die Harz-Suspension wurde dann für mindestens 30 Minuten gemischt, anschließend wurde sie zentrifugiert, um das Harz (Niederschlag) von dem Produkt (nun im Oberstand) zu trennen. Das Harz wurde wie zuvor beschrieben unter Verwendung von einem Drittel Volumen des Natrium-N- laurylsarkosin-Extraktions-Gemisches reextrahiert, um restliches Produkt, das noch im Niederschlag nach der ersten Extraktion eingeschlossen sein könnte, zu erhalten.
Die vereinigten Uberstände aus den Harz-Extraktionsschritten wurden mit Salzsäure auf ph 2,7 ± 0 1 eingestellt. 1,05 Volumen 95 %iges Ethanol wurden hinzugefügt und ein geringer Niederschlag wurde durch Zentrifugation entfernt.
Der Überstand des vorangegangenen Schrittes wurde auf eine Sulfoxyethyl (SE)- Cellulosesäule aufgetragen, die zuvor mit 50% Ethanol/5 mM HCl äquilibriert wurde. Bei saurem pH lag Natrium-N-laurylsarkosin ungeladen vor und lief deshalb durch die Säule, während das Produkt rPDGF B, das kationisch vorlag, an die Säulenmatrix gebunden wurde. Um das restliche Natrium-N-laurylsarkosin zu entfernen, wurde die Säule mit 50% Ethanol/5 mM HCl, dann mit 20 mM NaPO&sub4;, pH 7,5 (um sie auf neutralen ph zu bringen) und schließlich mit 10 mM Tris/HCl, pH 7,7 gewaschen. Das rPDGF B Produkt wurde mit 0,5 M NaCl/10mM Tris/HCl, pH 7,7 eluiert.
Zweieinhalb Volumen Wasser wurden zu der rPDGF B Lösung hinzugefügt, gefolgt von 2,5 Volumen 3,0 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;. Das Produkt wurde dann auf eine Phenylsepharose -Säule aufgetragen (Pharmacia, Uppsala, Schweden), die zuvor mit 5% Ethanol/1,25 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;/50 mM NaPO&sub4; pH 7,5 äquilibriert wurde. Nach der Beladung mit dem Produkt wurde die Säule mit dem zuletzt genannten Puffer gewaschen. Das rPDGF Produkt wurde von der Säule unter Verwendung eines im Ammoniumsulfatgehalt linear abfallenden und im Ethanolgehalt steigenden Gradienten eluiert. Der Startpuffer war gleich dem Waschpuffer, und der Endpuffer war 30% Ethanol/50 mM NaPO&sub4;, pH 7,5. Fraktionen aus dieser Säule wurden durch SDS- PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen untersucht. Die Fraktionen, die das Produkt frei von anderen Proteinkontaminationen enthielten, wurden vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen des vorangegangenen Schrittes wurden mit 1 N HCl auf ph 4,0 ± 0, 1 gebracht und dann uber eine Amicon YM 10 (Amicon Inc., Danvers, Massachusetts) Ultrafiltrations-Membran bis zu einer Absorption (1 cm Lichtweg) von annähernd 0,6, gemessen bei 280 nm, aufkonzentriert. Das Produkt wurde dann mit mindestens vier Volumen 10 mM Ammoniumacetat/0,15 M NaCl, pH 4,0 diafiltriert. Die Produktlosung wurde dann mit dieser Losung auf einen Absorptionswert (1 cm Lichtweg) von 0,24 ± 0,04, gemessen bei 280 nm, verdunnt, was einer Menge von 0,5 mg rPDGF B/ml entspricht.

Beispiel 2

Bestimmung der Primärstruktur des von CHO-Zellen sezernierten rPDGF B

Um die Positionen zu bestimmen, an der Säugerzellen das von c-sis-kodierte 241 Aminosäuren lange Vorläuferprotein zu PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; prozessieren können, wurde die Struktur des sezernierten, prozessierten, rekombinanten Proteinproduktes durch analytische Gel-Elektrophorese und Proteinsequenzierung untersucht.

Aminosäuresequenz-Analyse und Ergebnisse

Die Aminosäure-Sequenz von aus dem konditionierten Medium von CHO-pDSVE/c- sis-Zellen gereinigten rPDGF B wurde über eine Kombination aus Sequenzanalyse des intakten rPDGF B und Sequenzanalyse aus Trypsin- und SVB-Protease gespaltenen Peptiden bestimmt, die durch Spaltung von reduziertem rPDGF B erhalten wurden, das mit 4-Vinylpyridin derivatisiert wurde. Die Sequenzbestimmungen wurden unter Verwendung von 470A und 477A Sequenziergeräten durchgeführt (Applied Biosystems, Inc., Foster City, California). Die Ergebnisse sind nachfolgend und in Fig. 1 zusammengefaßt.
Intaktes rPDGF B wurde über 26 Zyklen sequenziert. Die Hauptsequenz, die in dieser Analyse identifiziert wurde, beginnt mit rPDGF B Aminosäure 1 und wird in Fig. 1 durch die oberen Linien, bezeichnet mit "vollständiges PDGF", angegeben. Diese Sequenz entspricht der aus der DNA-Sequenz für rPDGF B erwarteten Sequenz. Die Präparation, die man für diesen Sequenzierlauf verwendete, wurde nicht alkyliert, so daß die Cysteine bei Zyklus 16 nicht detektiert werden konnten. Nichtalkyliertes Cystein wird über die Sequenzanalyse nicht ohne weiteres identifiziert. Nebensequenzen wurden beobachtet, die Fragmenten entsprechen, die bei Aminosäure 33 und 80 der rPDGF B Sequenz beginnen. Diese Neben-Aminotermini sind solchen ähnlich, die bei menschlichen Blutplättchen (Johnson et al., ibid) beobachtet wurden. Sie werden durch interne Spaltungen während der Prozessierung des Proteins verursacht.
Nach einer getrennten Trypsin- und SV-8 Protease-Spaltung von rPDGF B, das reduziert und mit 4-Vinylpyridin alkyliert worden war, wurden die Peptidfragmente isoliert. Die Reduktion war notwendig, da nichtreduziertes rPDGF B nicht mit Trypsin oder SV-8-Protease gespalten wird. Die Alkylierung mit 4-Vinylpyridin erlaubt den Nachweis von Cysteinen durch das Sequenziergerät.
Die Kombination von aminoterminaler Sequenzanalyse von vollständigem rPDGF B und von aminoterminaler Sequenzanalyse von Trypsin oder SV-8 Protease gespaltenen Peptiden bestätigte die Proteinsequenz bis zum Rest 118. Eine carboxyterminale Sequenzanalyse mit Carboxypeptidase P wurde verwendet um die Reste 117 bis 119 zu bestimmen. Die Daten zeigen, daß die Hauptform der rPDGF B Proteinpraparation aus CHO-Zellen mit den 119 Aminosäureresten, die in Fig. 1 gezeigt werden identisch ist.

Analytische Gel-Elektrophorese und Ergebnisse

Das gemäß Beispiel 1 aus dem konditionierten Medium von CHO-pDSVE/c-sis-Zellen gereinigte rPDGF B Produkt wurde elektrophoretisch auf einem 12 % SDS- Polyacrylamidgel aufgetrennt. Diese Technik erlaubt die Abschätzung der Lange von Polypeptiden unbekannter Größe, wenn sie mit geeigneten Proteinstandards bekannter Größe verglichen werden. Das rPDGF B Protein (10 ug), hergestellt aus CHO- pDSVE/c-sis Zellen, wurde sowohl vor als auch nach der Reduktion elektrophoretisch aufgetrennt und das Gel wurde dann mit Comassie-Brilliant-Blau gefarbt. Wie man in Fig. 2, Spur 1 und 2 sehen kann, wandert dieses Protein nach der Reduktion bedeutend schneller. Die Analyse der reduzierten Probe zeigte auch die Anwesenheit von vier Hauptbanden. Dieses Muster stimmt mit einer Struktur für nichtreduzienes rPDGF B überein, in der rPDGF B Monomere von vier unterschiedlichen Längen zu Disulfid-Dimeren gepaart sind.
Um eine genaue Bestimmung der Größe der vier rPDGF B Monomere zu erhalten, die von CHO-pDSVE/c-sis Zellen sezerniert wurden, wurden die elektrophoretischen Wanderungseigenschaften dieser Polypeptide mit denen von zwei rPDGF B Proteinen bekannter Größe verglichen, nämlich rPDGF B&sub1;&sub0;&sub9; und rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9;, die unter Verwendung eines bakteriellen Expressionssystems hergestellt wurden. Diese bakteriell hergestellten rPDGF B Proteine wurden gemaß Beispiel 3 erhalten, mit der Ausnahme, daß in einem Fall eine kodierende Sequenz für die Transfektion der bakteriellen Wirtszelle verwendet wurde, die ein Stopkodon bei dem Kodon fur die Aminosaure 110 enthalt. Bedingt durch das Auftreten eines Stopkodon "Überlesungs- Problems" im letzten Fall mußten die resultierenden rekombinanten Proteine (PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; und PDGF B&sub1;&sub6;&sub0;) aus dem konditionierten Medium aufgetrennt werden. Die zwei bakteriell hergestellten rPDGF B Proteine, die für die Verwendung als Standard gegenüber dem rekombinanten Produkt aus Säugerzellen ausgewählt wurden, wurden besonders konstruiert, damit sie am Carboxyterminus mit Aminosäure 109 und 119 terminieren, basierend auf der Sequenzanalyse von PDGF B aus menschlichen Blutplättchen (Johnson et al., ibid) und rPDGF B aus CHO-PDSVE/c-sis-Zellen (vorstehend beschrieben).
Die Aminosäuresequenzanalyse wurde gemäß Beispiel 2 durchgeführt. Sie bestätigte. daß diese zwei bakteriell hergestellten Proteine aus den Resten 1-109 bzw. 1-119 der PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; Vorläuferprotein-Aminosäuresequenz bestehen. Wie in Fig. 2, Spuren 2-4 gezeigt, wanderte das am schnellsten wandernde Polypeptid der reduzierten Säuger- (CHO-pDSVE/c-sis) rPDGF-Probe auf gleicher Höhe, wie der E. coli rPDGF B&sub1;&sub0;&sub9; Standard, während das Polypeptid der Säuger-Probe, das am zweitschnellsten wanderte, auf gleicher Höhe wie der E. coli rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Standard lief. Die beiden am langsamsten wandernden Polypeptide aus der Säuger-Probe wanderten bei Positionen, die mit Längen übereinstimmten, die 5-20 Aminosäuren länger waren, als die 119 Aminosäuren umfassende Form. Basische Aminosäurereste sind oft die Stellen von proteolytischen Spaltungen. Die Überprüfung der Aminosäuresequenz des 241 Aminosäuren langen rPDGF B&sub1;&sub0;&sub9; Vorläuferproteins zeigte basische Aminosäurereste an den Positionen 126, 130, 133, 135 und 136. Bei diesen Aminosäuren handelt es sich insbesondere um Arginine. Spaltung an irgendeiner dieser Positionen würde zu PDGF B Analoga führen, die um 7-17 Aminosäuren länger sind, als die 119 Aminosäuren umfassende Form.
Die Aminosäuresequenzierung und gelelektrophoretische Analyse zeigen zusammen, daß es sich bei dem von Sauger-Wirtszellen (CHO-pDSVE/c-sis) sezernierten rPDGF B um eine Mischung aus Dimeren handelt, die von vier Monomeren abstammen, wobei jedes von diesen einen Aminoterminus besitzt, der Serin Nummer 1 der PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; Proteinsequenz umfaßt. Das Polypeptid, das von den vier Polypeptiden am häufigsten vorkommt, besitzt einen Carboxyterminus, der am Arginin 119 endet. Ein anderes dieser Polypeptide besitzt einen Carboxyterminus, der aus dem Threonin 109 besteht. Die restlichen zwei Polypeptide sind 5-20 Aminosauren langer als die 119 Aminosauren umfassende Form und terminieren am Carboxyterminus mit einer Aminosäure, die höchstwahrscheinlich bei Arginin 126, Arginin 130, Arginin 133, Arginin 135 oder Arginin 136 liegt.

Beispiel 3

Herstellung von rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9;

Eine in Fig. 3 gezeigte für ein PDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Vorläuferprotein kodierende Sequenz wurde unter Verwendung des v-sis Gens als Ausgangsmaterial konstruiert.

Die Umwandlung der Aminosäuren 101 und 107

Ein ug des Plasmids pC60, ein Klon aus dem retroviralen Genom des Simian Sarcoma Virus (Wong-Staal et al., Science 213 226-228 (1981)), wurde mit den Restriktionsendonukleasen SalI und XbaI gespalten; das resultierende 1183 Basenpaar- Fragment wurde dann durch elektrophoretische Trennung in einem bei niedriger Temperatur schmelzendem Agarosegel gereinigt, nach dem bei Maniatis et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory (1982) beschriebenen Verfahren gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde dann aus dem Gel ausgeschnitten. Zur gleichen Zeit wurden 0,2 ug von M13mp19-DNA ebenso mit SalI und XbaI gespalten, wobei die große 7245 Basenpaar-Bande auf gleiche Weise aus einem bei niedriger Temperatur schmelzenden Agarosegel isoliert wurde. Die beiden ausgeschnittenen Gel-Stückchen wurden bei 65ºC geschmolzen und dann auf 37ºC abgekühlt. Die gesamte Gel-Menge, die das 7245 bp M13mp19-Fragment enthielt und ein Viertel der Gel-Menge, die das 1183 bp v-sis Fragment enthielt, wurden gemischt und gemäß Struhl, Biotechniques 3, 452-453 (1985) ligiert. Die ligierte DNA wurde in einen E. coli K12 Stamm TG1 eingeschleust und ein klarer Plaque wurde ausgewählt und in Flüssigkultur vermehrt. Das Vorhandensein des 1183 bp v-sis Fragmentes in dem M13mp19-Vektor wurde durch die Präparation der replikativen Form (RF) der Phagen-DNA und Restriktionskarten-Analyse bestätigt; vgl. Messing et al., Nucl. Acids Res 9 309-321(1981).
Der M13mp19/v-sis Phage, der auf diese Weise erhalten wurde, wurde in Flüssigkultur vermehrt, und die Einzelstrang-DNA isoliert; vgl. Messing et al., ibid. Diese DNA wurde als Matrize für die Oligonukleotid-spezifische in vitro Mutagenese verwendet, um die Kodons für die Aminosäuren an den Positionen 101 und 107 in die entsprechenden Kodons für die Aminosäuren von PDGF B umzuwandeln. Somit wurde das ATA-Kodon, das für Isoleucin 101 kodiert, in ACA (das für Threonin kodiert) umgewandelt, und das GCT Kodon, dab für Alanin 107 kodiert, in CCT (das für Prolin kodiert) umgewandelt.
10 ug der M13mp19/v-sis Einzelstrang-DNA wurden gegen 8 pmol eines phosphorylierten Oligonukleotids mit folgender Sequenz hybridisiert:
5'- GGTCACAGGCCGTGCAGCTGCCACTGTCTCACAC- 3'
Diese Sequenz ist homolog zu den Nukleotiden 4283 bis 4316 des v-sis Gens (Nummerierungssystem von Devare et al., ibid). Die unterstrichenen Basen des Oligonukleotids bezeichnen die Anderungen der v-sis zur menschlichen PDGF B Sequenz. Die DNA-Synthese wurde an dem mutierten Oligonukleotid initiiert, wobei der gesamte mutierte Strang mit dem Klenow-Fragment der E. coli DNA Polymerase I unter Verwendung von Thionukleotidtriphosphaten synthetisiert wurde, gefolgt von einer Ligation mit T4 DNA Ligase. Jegliche verbleibende Einzelstrang M13 mp19/v- sis DNA-Matrize wurde durch Filtration durch Nitrozellulosefilter entfernt. In den nichtmutierten Strang wurden durch Inkubation mit Restriktionsendonuklease III willkürlich Einzelstrangbrüche eingeführt. Der einzelsträng ig geöffnete, nichtmutierte Strang wurde dann mit Desoxynuleotidtriphosphaten unter Verwendung des mutierten Stranges als Matrize wieder aufgefüllt. Dies hat zur Folge, daß beide DNA-Stränge in dem Endprodukt die gewünschte Mutation enthalten. Die DNA wurde in den E. coli K12 Stamm TG1 eingeschleust. Plaques wurden ausgewählt, in Flüssigkultur vermehrt, und die Einzelstrang-DNA isoliert. Die DNA wurde nach der Methode von Sanger et al., PNAS, USA. 74, 5463-5467 (1977) sequenziert, um zu bestatigen, daß die gewünschte Mutante erhalten worden war.

Umwandlung der Aminosäuren 6 und 7

Im nächsten Schritt wurde der 5'- Teil des mutierten v-sis Gens gegen ein synthetisches DNA-Fragment ausgetauscht, das die Kodons für die Aminosäuren 6 und 7 des v-sis Gens gegen die in menschlicher PDGF Form vorkommenden Kodons austauscht. Dieses synthetische Fragment lieferte auch ein Translationsinitiationskodon, ATG, das unmittelbar dem Kodon für Serin 1 des menschlichen PDGF B vorangeht, und es lieferte auch Sequenzen für die Bindung an E. coli Ribosomen und eine Restriktionsstelle für die Ligation in den gewünschten E. coli Expressionsvektor (nachstehend beschrieben). Das synthetische DNA-Fragment wurde an die BglII-Stelle ligiert, die beim Nukleotid 4061 des v-sis Gens lokalisiert ist (Nummerierungssystem von Devare et al., ibid). Da eine BglII-Stelle, die im M13mp19-Vektor vorhanden ist, diesen Schritt verkomplizieren und mit ihm interferieren würde, wurde das mutierte v-sis Gen zuerst in den bekannten Plasmidvektor pUC18 überführt, der keine BGlII-Stelle enthält. Die M13mp19/v-sis mutierte RF-DNA wurde mit Sall und BamHI gespalten und das resulierende 1193 bp Fragment durch Elektrophorese unter Verwendung von bei niedriger Temperatur schmelzender Agarose isoliert. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pUC18 ligiert, das mit SalI und BamHI gespalten wurde. Die ligierte DNA wurde in den bekannten E. coli K12 Stamm DH5 eingeschleust und die Transformanten wurden im Hinblick auf ihre Fähigkeit, sich in Anwesenheit von Ampicillin zu vermehren, selektiert. Kolonien wurden ausgewählt, in Flüssigkultur vermehrt und die isolierte Plasmid- DNA wurde durch Restriktionskartierung auf Anwesenheit des v-sis Inserts untersucht.
Die pUC18/v-sis mutierte DNA wurde mit HindIII gespalten, das im Polylinker von pUC18 genau stromaufwärts vom mutierten v-sis Insert schneidet und mit BglII, das innerhalb der v-sis DNA beim Nukleotid 4061 schneidet (Nummerierungssystem von Devare et al., ibid), das dem Kodon der Aminosäure 24 des reifen Proteinproduktes entspricht. Das grobe 3565 bp Fragment, das aus dieser Reaktion hervorgeht, wurde durch Elektrophorese in einem bei niedriger Temperatur schmelzenden Agarosegel isoliert. Dieses Fragment wurde an ein synthetisches Doppelstrang-DNA-Fragment mit folgender Sequenz ligiert:
5'- AGCTTCTAGAAGGAGGAATAACATATGTCTCTGGGTTCGTTAACCATTGCG -
3' - AGATCTTCCTCCTTATTGTATACAGAGACCCAAGCAATTGGTAACGC -
- GAACCGGCTATGATTGCCGAGTGCAAGACACGAACCGAGGTGTTCGA -3'
- CTTGGCCGATACTAACGGCTCACGTTCTGTGCTTGGCTCCACAAGCTCTAG -5'
Dieses synthetische DNA-Fragment enthält ein HindIII "überhängendes" Ende an seinem stromaufwärts gelegenen Ende (links) und ein BglII "überhängendes" Ende an seinem stromabwärts gelegenen Ende (rechts). Außerdem ist eine XbaI Stelle (TCTAGA) innerhalb der synthetischen DNA vorhanden, direkt stromabwärts des HINDIII "überhängenden" Endes, das eine nachfolgende Spaltung mit XbaI für die Ligation in die XbaI Stelle des nachstehend beschriebenen Expressionsvektors erlaubt. Die ligierte DNA wurde in den E. coli K12 Stamm DH5 eingeschleust und die Transformanten wurden über ihr Wachstum auf Ampicillin enthaltendem Medium selektiert. Die Plasmid-DNAs der resultierenden Kolonien wurden durch Restriktionskartierung auf die Anwesenheit des synthetischen DNA-Fragmentes untersucht. An dieser Stelle enthielt die pUC18/v-sis Konstruktion ein mutiertes v-sis Gen, in dem die Kodons für die Aminosäuren 6, 7, 101 und 107 gegen die in der menschlichen PDGF B Form vorkommenden Kodons ausgetauscht waren, und sein 5'-Ende so verändert war, daß die Translation mit einem ATG Kodon beginnt, das dem Serinrest 1 unmittelbar vorangeht.

Umwandlung des Kodons für die Aminosäure 114 und Plazierung eines Stopkodons beim Kodon für die Aminosäure 120

Im nächsten Schritt wurde das Kodon für die Aminosäure 114 von ACT in GGT geändert, was einen Austausch von Glycin gegen Threonin in dem endgültigen Proteinprodukt zur Folge hat. Außerdem wurde Kodon 120, in dem GCC für Alanin in v-sis kodiert, in das Translationsterminations-Kodon TAA geändert. Das resultierende Proteinprodukt dieser Konstruktion endet mit dem Arginin 119. Beide Anderungen wurden in einem Schritt durch die Insertion eines synthetischen DNA- Fragmentes nach der Smai Stelle, die innerhalb des Kodons 112 lokalisiert ist, durchgeführt.
Die voranstehend erzeugte pUC18/v-sis mutierte DNA wurde mit SmaI, das bei Nukleotid 4324 in der v-sis Sequenz schneidet (Nummerierungssystem von Devare et al., ibid) und mit EcoRI gespalten, das im Polylinker direkt stromabwärts des v-sis Inserts schneidet. Ein kleines Fragment (510 bp) zwischen der SmaI und der EcoRI Stelle, das für den C-terminalen Teil des v-sis Proteins kodiert und eine 3'- untranslatierte Sequenz des v-sis Gens mit umfaßt, wurde durch Elektrophorese in einem bei niedriger Temperatur schmelzenden Agarosegel entfernt. Das große Fragment (ungefähr 3530 bp) wurde an ein synthetisches DNA-Fragment folgender Sequenz ligiert:
5'- GGGGGGTTCCCAGGAGCAGCGATAAG-3'
3'- CCCCCCAAGGGTCCTCGTCGCTATTCTTAA -5'
Das GGT-Kodon, das für den neuen Glycinrest 114 kodiert und das TAA- Terminationskodon, das an Position 120 eingeführt wurde, sind voranstehend unterstrichen. Dieses synthetische DNA-Fragment enthält an seinem stromaufwärts gelegenen Ende (links) ein glattes Ende für die Ligation an das glatte Ende, das durch Spaltung der mutierten v-sis Sequenz mit Smal hergestellt wurde, und ein EcoRI "überhängendes" Ende an seinem stromabwärts gelegenen Ende (rechts), um es an das EcoRI Ende zu ligieren, das durch Spaltung des pUC18-Polylinkers mit EcoRI erstellt wurde. Die ligierte DNA wurde in den E. coli K12 Stamm DH5 eingeschleust, und die Transformanten wurden über ihr Wachstum auf Ampicillin enthaltendem Medium selektiert. Die Plasmid-DNAS der resultierenden Kolonien wurden auf Anwesenheit des synthetischen DNA-Fragmentes durch Restriktionskartierung untersucht.

Expression von PDGF B&sub1;&sub1;&sub9;

Im letzten Schritt wurde die vollständige Form des mutierten v-sis Gens aus pUC18 ausgeschnitten und in den E. coli Expressionsvektor pCFM1156 ligiert. Das Plasmid pCFM1156PL wird aus dem bekannten Plasmid pCFMB36 hergestellt. Die Herstellung des Plasmids pCFMB36 ist in den Beispielen 1 bis 7 der US-PS 4,710,473 beschrieben. Zur Herstellung von pCFM1156 aus pCFM836 werden die zwei endogenen NdeI Restriktionsstellen gespalten, die exponierten Enden mit T4- Polymerase aufgefüllt und die aufgefüllten Enden ligiert.
Das resultierende Plasmid wird dann mit ClaI und KpnI gespalten und das ausgeschnittene DNA-Fragment durch ein DNA-Oligonukleotid mit folgender Sequenz ersetzt:
Der pCFMI 156-Vektor enthält eine Region für die Insertion von fremden Genen zwischen einer stromaufwärts gelegenen XbaI Stelle und mehreren stromabwärts gelegenen Restriktionsstellen. In diesem Fall wurde die stromabwärts gelegene EcoRI Stelle verwendet. Die vorstehend erzeugte pUC18/v-sis mutierte-DNA wurde mit XbaI und EcoRI gespalten, und das kleine 383 bp Fragment wurde mittels Elektrophorese in einem bei niedriger Temperatur schmelzenden Agarosegel isoliert. Dieses Fragment wurde mit der pCFMI 156 DNA ligiert, die ebenfalls mit Xbai und EcoRI gespalten worden war. Die ligierte DNA wurde in den E. coli K12 Stamm FMS (ATCC Nr. 67545) eingeschleust, und Transformanten wurden durch Wachstum auf Kanamycin enthaltendem Medium selektiert. Die Plasmid-DNA der resultierenden Kolonien wurde durch Restriktionskartierung auf Anwesenheit des inserierten DNA- Fragmentes untersucht.
Das endgültige Expressionsplasmid enthielt eine inserierte DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, das mit einem Methionin beginnt, gefolgt von den Aminosäuren 1 bis 119 der Sequenz der menschlichen PDGF B Kette. Die prokaryontischen E. coli Wirtszellen entfernten das aminoterminale Methionin nach der Synthese, so daß das endgültige Proteinprodukt den Aminosäuren 1-119 des menschlichen PDGF B entsprach.
Die Expression des 119 Aminosäure langen PDGF B Proteins wurde bestätigt, indem man Bakterienzellen, die das Expressionsplasmid enthalten, bei 28-30ºC vermehrte, bis die gewünschte optische Dichte der Kultur erreicht war. Sodann wurde die Wachstumstemperatur der Kultur für einige Stunden auf 42ºC erhöht. Proben der kultivierten Zellen wurden vor der Temperaturerhöhung auf 42ºC und zu einigen Zeitpunkten danach entnommen. Nach SDS-Polyacrylamid-gelelektrophoretischer- Analyse der bakteriellen Proteine wurde beobachtet, daß eine hervortretende Bande mit dem scheinbaren Molekulargewicht von 14,6 kDa in Temperatur-induzierten, nicht aber in Bakterienzellen vor der Induktion vorhanden war. Dieses Protein lag in einer ungefähren Menge von etwa 25-40 mg pro Liter Bakterienkultur vor, die bis zu einer Optischen Dichte von 1,0, gemessen bei 600 nm, vermehrt worden war.

Beispiel 4

Bestätigung der Primärstruktur von E. coli rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9;

Zur Bestätigung der erwarteten Aminosäuresequenz und der Homogenität des in E. coli hergestellten PDGF B&sub1;&sub1;&sub9; wurden die rekombinanten Produkte aus drei verschiedenen Ansätzen aus den Einschlußkörperchen (Inclusion Bodies) nach an sich bekannten, in Beispiel 5 näher beschriebenen Methoden gereinigt und dann durch analytische Gelelektrophorese und Proteinsequenzierung untersucht.

Aminosäuresequenz-Analyse: Ergebnisse

Die Aminosäuresequenzanalyse wurde gemäß Beispiel 2 durchgeführt. Diese Analyse bestätigt, daß das PDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Produkt aus E. coli Wirtszellen die erwartete, in Fig. 1 dargestellte, Sequenz hat.

Analytische Gelelektrophorese: Ergebnisse

Das gereinigte E. coli rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; aus Beispiel 3 wurde der SDS-PAGE-Analyse sowohl unter reduzierenden (5% 2-Mercaptoethanol, Erhitzen), als auch unter nichtreduzierenden Bedingungen (ohne Erhitzen) unterworfen. Die elektrophoretische Analyse wurde gemäß Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man die Proben neben einem Molekulargewichtsstandard von Bio Rad Laboratories (Richmond, California) in einem 3 bis 27 %igen Polyacrylamidgel laufen läßt.
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse für die Ansätze 1, 2 und 3 nach dem Anfärben mit Comassie-Brilliant-Blau. Bei Probenbeladungen von 3 bis 24 ug waren die einzigen nachweisbaren Banden solche, die dem E. coli rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; zuzuordnen sind. Unter nichtreduzierenden Bedingungen wurde eine Bande bei einem MW von etwa 30,000 MW beobachtet. Nach der Reduktion wurde eine Bande mit einem scheinbaren MW von etwa 15,000 beobachtet.

Beispiel 5

Zurückfaltung des rPDGF B Ketten Homodimers aus E. coli Einschlußkörperchen unter Verwendung von Glutathion als Blockierungsagens

Ungefähr 1,5 bis 1,6 kg von geernteter (d. h. aufkonzentrierter) E. coli Paste aus Beispiel 3, die rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; enthielt, wurden für die Zurückfaltungsreaktion verwendet. Die E. coli Paste wurde in 9 Volumen (v/w) 20 mM Ethylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz (EDTA) suspendiert, wobei die Temperatur auf 4ºC gehalten wurde. Die suspendierte Zellpaste wurde mittels eines Menton-Gaulin Homogenisiergerätes bei einem Druck von 984 kg/cm² (14.000 psi) und einer Temperatur von 12ºC lysiert. Das Lysat wurde sofort mit 3.600 g für 60 Minuten bei 4ºC zentrifugiert und der Überstand verworfen. Der Niederschlag mit den rPDGF enthaltenden Einschlußkörperchen wurde aufbewahrt.
Der Niederschlag wurde in 14 Volumen (v/w) 8,5 M Harnstoff, 0,1 M Glycin, pH 3,0 suspendiert und 30 Minuten gerührt. Inzwischen ließ man SE Sepharose (Pharmacia) Chromatographie-Harz ablaufen, indem man das kommerziell erhältliche Harz in einen gesinterten Glastrichter füllte und das Harz "der Schwerkraft folgend" ablaufen ließ. Man wäscht das Harz mit vollentsalztem Wasser und läßt dann das Harz wieder ablaufen. Unter fortwährendem Rühren des resuspendierten Niederschlages wurden 2,4 kg des abgelaufenen Harzes zu der Niederschlagssuspension hinzugefügt. Nach 30 Minuten wurde das Rühren beendet. Man ließ das Harz absetzen und verwarf den Überstand. Fünf Liter 8,5 M Harnstoff, 0,1 M Glycin, pH 3,5, wurden zu dem abgesetzten Harz hinzugefügt. Die Mischung wurde weitere 5 Minuten gerührt. Danach ließ man das Harz wieder absetzen und verwarf den Überstand.
Funf Liter 8,5 M Harnstoff, 20 mM Phosphorsaure, pH 3,0 wurden dann dem abgesetzten Harz hinzugefugt. Das erhaltene Gemisch wurde wieder 5 Minuten gerührt. Danach ließ man das Harz wiederum absetzen und verwarf den Überstand. Ein zweites Mal wurden 5 Liter 8,5 M Harnstoff, 20 mM Phosphorsaure, pH 3,0 dem abgesetzten Harz hinzugefugt. Diese Mischung wurde 30 Minuten bei einem Druck von 625 mm Hg (25 inches) geruhrt. Danach wurde das Vakuum aufgehoben und das Gemisch wurde auf 5 mM Dithiothreit gebracht und mit 10 M Natriumhydroxid (NaOH) auf einen pH-Wert von 7,7 eingestellt. Das Vakuum wurde wiederhergestellt und das Gemisch 30 Minuten gerührt. Noch unter Vakuum ließ man das Harz absetzen, indem man mit dem Rühren aufhörte, und verwarf 90% des Überstandes. Das Harz wird sofort mit der restlichen Flüssigkeit aufgeschlämmt und in eine Säule mit 25 cm Durchmesser gefüllt (Batch-Säule). Es wurde ein Fluß- Adapter aufgesetzt und das Harz wurde innerhalb von 10 Minuten mit einer Flußrate von 100 cm/Stunde mit einer 8,5 M Harnstoff, 20 mM Natriumphosphat (Na&sub2;HPO&sub4;). pH 7,7 Lösung, die mit Stickstoff gespült wurde (Puffer A), in die Säule gepackt. Der Flußadapter wurde bis auf die Harzoberfläche abgesenkt und die Säule wurde mit weiterem Puffer A bei einer Flußrate von 25 cm/Stunde gewaschen bis die bei 280 nm gemesse Absorption des Durchflusses konstant war.
Der Durchfluß der Batch-Säule wurde dann mit dem Zufluß einer zweiten 25 cm x 20 cm Säule (auflösende Säule) verbunden, die mit frischer SE Sepharose (Pharmacia) gepackt und mit Puffer A äquilibriert wurde. Die Batch- und die auflösende Säule wurden dann mit einer Flußrate von 25 cm/Stunde mit einem 80 Liter Gradienten von 100 % Puffer A zu 100 % Puffer B (8,5 M Harnstoff, 20 mM Na&sub2;HP0&sub4;, 0,4 M NaCl, pH 7,7) eluiert, der mit Stickstoff gespült wurde. Die geeigneten Fraktionen wurden sofort von der Säule kommend vereinigt und unter Vakuum gehalten. Die Ausbeute betrug zwischen 0,45 und 0,90 Gramm pro Liter Fermentationsbrühe.
Die denaturierte rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; enthaltende Lösung wurde falls erforderlich auf einen Absorptionswert verdünnt, der zwischen einer OD von 0,4 und 0,5 lag. Die Monomer-Proteinlösung wurde dann auf eine Endkonzentration von 0,1 M oxidiertes Glutathion gebracht und der ph wurde mit 10 M NaOH auf 8,0 eingestellt. Die Lösung wurde wieder unter Vakuum gestellt und 18 bis 24 Stunden gerührt. Danach wurde das Vakuum aufgehoben und der pH-Wert des nun derivatisierten, gemischten Disulfidzwischenprodukts von monomeren rPDGF wurde mit HCl auf 3,0 erniedrigt. Die resultierende Lösung wurde auf die Hälfte des anlfänglichen Volumens aufkonzentriert und dann zuerst gegen vier Volumen 8,5 M Harnstoff, 0,1 M Essigsaure und dann gefolgt von vier Volumen 0,1 M Essigsaure unter Verwendung einer Amicon YM 10 (Amicon Inc., Danvers, Massachusetts) Ultrafiltrationsmembran diafiltriert. Die Endproteinkonzentration lag zwischen 1,5 - 2,0 mg/ml
(&epsi; 1%280nm = 0,46)
mit einer Reinheit des rPDGF-S-S-G von oberhalb 85 % und einer Ausbeute zwischen 0,45 und 0,90 g pro Liter Fermentationsbrühe.
Die Zurückfaltung wurde durch Verdünnen der rPDGF-S-S-G-Lösung auf 0,1 mg/ml mit 20 mM Tris erreicht. Nachfolgend wurde 1 M Cystein in 0,1 M Essigsäure zu dieser Lösung bis zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt und der pH-Wert wurde mit NAOH auf 8,0 eingestellt. Die Lösung wurde 16 Stunden gerührt, um das derivatisierte, monomere rPDGF-S-S-G-Zwischenprodukt zu deblockieren und die Bildung von Disulfidbindungen innerhalb und zwischen den Ketten des gewünschten dimeren Endprodukts zu initiieren, und dann auf 0,1 M Essigsäure eingestellt. Die Ausbeute betrug 0,32 bis 0,63 g pro Liter Fermentationsbrühe.
Die Lösung von zurückgefaltetem dimeren rPDGF wurde bei einer Flußrate von 100 cm/Stunde auf eine 11,3 x 5 cm Säule, die mit Glas kontrollierter Porengröße (CPG, pg-350-400, 96 m²/g, 382 Å mittlerer Porendurchmesser, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri) gefüllt war und die entweder mit 0,05 M Glycin, pH 3,5 (Puffer C) oder mit 0,05 Glycin, 0,4 M NaCl, pH 3,5 (Puffer D) äquilibriert worden war. geladen. Nach dem Beladen der rPDGF-Postoxidationslösung auf die Säule, wurde die Säule mit dem Aquilibrierungspuffer bei einer Flußrate von 40 cm/Stunde gewaschen. Das gereinigte rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Homodimer wurde dann von der Säule eluiert, wiederum mit einer Flußrate von 40 cm/Stunde, durch Anlegen eines 5 Liter- Gradienten, der entweder mit Puffer C oder D begann und entweder mit 2 M Guanidin/HCl in Puffer C oder 8 M Harnstoff in Puffer D endete.
Die geeigneten Fraktionen von reinem rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Homodimer wurden vereinigt.
Die Ausbeute lag zwischen 0,25 und 0,5 g pro Liter Fermentationsbrühe.

Beispiel 6

Die mitogene Aktivität von zurückgefaltetem rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Homodimer

Das zurückgefaltete rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Homodimer aus Beispiel 5 wurde mittels eines Thymidin-Aufnahmetests auf mitogene Aktivität getestet. Es wurden normale Rattennierenzellen, Clone 49F, ATCC Nr. CRL-1570 (NRK) verwendet. Die Versuchsmethodik war eine Modifikation des Verfahrens von Pierce et al., J. Exp. Med. 176, 974-987 (1988) unter Verwendung von rPDGF B aus CHO-Zellen als Standard. Die NRK Zellen wurden in einem Wachstumsmedium (FBS-DMEM) vermehrt, das umfaßt: (1) Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), das 1g/l Glukose, 1% (w/v) Penicillin-Streptomycin-Lösung (100 x, 10,00 Einheiten Penicillin, 10 mg Streptomycin/ml), und 1 % (v/v) einer 100 x L-Glutamin-Lösung, 200 mm, enthält; und (2) 7,5% fötales Rinderserum (FBS) (Whitaker MA Bioproducts, Walkersville, Maryland).
Die Zellen wurden in 24-Näpfchen Mikrotiter-Platten mit einer Dichte von 2 x 10&sup4; Zellen/Näpfchen in FBS-DMEM ausplattiert. Nach fünf Tagen wurde das FBS- DMEM abgesaugt und durch 1 ml DMEM ohne FBS ersetzt, um die Zellen "auszuhungern", so daß sie, wenn sie PDGF ausgesetzt werden, aussagekräftiger reagieren können. Die Zellen wurden in diesem Medium für 24 Stunden inkubiert. Nach dieser Zeit wurden zu jedem Näpfchen je 50 ul einer Probe hinzugefügt, die PDGF enthielt. Nach weiteren 18 Stunden Inkubationszeit wurde die Probe, die PDGF enthielt, abgesaugt und durch 1 ml Markierungsmedium ersetzt, das DMEM, 5 % FBS und 2 uCi/ml ³H-Thymidin enthält. Die Platten wurden für eine weitere Stunde bei 37ºC inkubiert. Zellen aus je drei Näpfchen wurden mit einer Saccharose/EDTA-Lösung abgelöst und mit einem automatischen Microernter auf Glasfaser-Filtermatten geerntet. Die Zellen wurden mit Ethanol auf den Filtermatten fixiert und nach dem Trocknen wurden die Filtermatten in einem Szintillationszähler gezählt.
Der durchschnittliche Wert der Kontroll-Näpfchen, die kein PDGF erhalten hatten, wurde von dem für jede experimentelle Probe aus drei Werten gemittelten Zählwert abgezogen. Der Logarithmus der PDGF-Konzentration in ng/ml wurde gegen eingebaute cpm für jede Probe aufgetragen. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, daß das zuruckgefaltete rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; aus Beispiel 5 im wesentlichen die gleiche mitogene Aktivitat besitzt wie das rPDGF B aus den CHO- Wirtszellen.

Beispiel 7

Chemotaktische Aktivität von zurückgefaltetem rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Homodimer

Das zurückgefaltete rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Homodimer aus Beispiel 5 wurde auch auf seine chemotaktische Aktivität bei Fibroblasten und Monozyten nach der Methode von Senior et al., J. Cell. Biol. 96 382-385 (1983) und Deuel et al., J. Clin. Invest. 69, 1046-1049 (1982) getestet. Das rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; aus Beispiel 4 wurde in Boyden- Kammern getestet, wie in den angegebenen Artikeln beschrieben, unter Verwendung von Säuger rPDGF B aus CHO-Zellen als Standard. In diesem Test wandern die zellen durch einen Filter von einer Kammer ohne chemotaktisches Agens zu einer anderen Kammer mit einem chemotaktischen Agens. Nach einer vorgegebenen Zeitperiode wird die Anzahl der Zellen in einem mikroskopischen Feld auf der Seite mit der chemotaktisch wirksamen Verbindung gezählt.
Fibroblasten wurden aus Explantaten von chirurgischen Proben von normaler Erwachsenenhaut erhalten. Die Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) kultiviert, dem 2 mM L-Glutamin, nichtessentielle Aminosäuren und 10 % fötales Rinderserum (KC Biological, Inc., Lenexa, Kansas) zugesetzt wurden. Nach sechs Passagen wurden die Zellen für die Tests verwendet. Menschliche mononukleäre Zellen (Monozyten) wurden unter Verwendung von Ficoll/Hypaque Gradienten erhalten und in DMEM, ergänzt mit 2% Humanalbumin, zu Dichten von 2,5 x 10&sup6; Zellen/ml suspendiert.
Die Chemotaxis wurde in einem Multi-Blind-Well-Apparat bestimmt, der 30 Näpfchen (Wells) enthält. Eine Doppel-Membran-Technik, unter Verwendung einer Polykarbonat-Membran (Nucleopore Corporation, Pleasanton, California) mit 8 um Poren (Fibroblasten) oder 5 um Poren (Monozyten) aufgelegt auf eine Cellulosenitrat- Membran (Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts) mit 0,45 um Poren, wurde verwendet, um jedes Näpfchen in ein oberes und ein unteres Kompartiment zu trennen. Das untere Kompartiment wurde entweder mit einer zu testenden PDGF Lösung oder mit Kontrollmedium gefüllt und dann mit den Membranen in der geeigneten Anordnung bedeckt. Sodann wurde eine Zellsuspension, die Fibroblasten oder Monozyten enthält, in das obere Kompartiment gegeben. Nachdem beide Kompartimente in den Näpfchen gefüllt waren, wurde der Chemotaxis-Apparat 6 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC in eine Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid/95 % Luft gestellt. Der Multi-Blind-Well-Apparat wurde dann entnommen und jedes Membranpaar wurde entfernt und gefärbt.
Die Zellwanderung wurde bestimmt, indem man unter hochauflosender Vergroßerung (400 x) die Zellen auszahlt, die sich auf den Zwischenraum zwischen den beiden Membranen und solche, die sich auf die untere Membran hin bewegt haben. Funf stark vergrößerte Felder (high-power fields, hpf) wurden pro Membranpaar gezählt. Die Zellwanderung wird ausgedrückt durch die Nettoanzahl von Zellen die pro hpf gewandert sind, d. h. die Anzahl von Zellen pro hpf abzüglich der Anzahl von Zellen pro hpf, die in Reaktion auf das Kontrollmedium wandern. Die Ergebnisse aus den chemotaktischen Tests bei Fibroblasten sind in Fig. 6 und bei Monozyten in Fig. 7 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, daß das zurückgefaltete rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; aus Beispiel 5 im wesentlichen die gleiche chemotaktische Aktivität besitzt, wie das rPDGF B aus CHO-Wirtszellen.

Beispiel 8

Vergleich der mitogenen Aktivität von zurückgefaltetem rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Homodimer und rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Monomer

Das blockierte, monomere rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Zwischenprodukt aus Beispiel 5 wurde auf mitogene Aktivität gemäß Beispiel 6 getestet, wobei das rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Homodimer (ebenso aus Beispiel 5) als Standard verwendet wurde. Überraschenderweise zeigte die monomere Form des rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Analogons der vorliegenden Erfindung mitogene Aktivität. Es mußte aber weit mehr Monomer als Dimer eingesetzt werden (500 bis 1000 mal mehr), um die gleiche maximale Aktivität, die mit dem rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Homodimer erzielt wird, zu erreichen. Es ist noch überraschender, daß die maximale Aktivität, die mit der monomeren Form erzielt werden konnte, 3 bis 3,5 mal höher war, als die, die mit irgendeiner Menge des korrespondierenden rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Homodimers erreicht werden konnte.
Im besonderen wurde die mitogene Aktivität des rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9;-S-S-G Monomers ("mb-g") auf NRK-Zellen gemäß Beispiel 6 untersucht. Das rPDGF B&sub1;&sub1;&sub9; Homodimer ("BB") wurde als Standard verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt. Während die maximal erreichbare Aktivität des Dimers ihren Höchstwert bei ungefähr 30 cpm x 10&supmin;³ zeigt (nachdem eine Konzentration von ungefähr 4 ng/ml erreicht ist), benötigt die monomere Form 500-1000 ng/ml, um eine vergleichbare Aktivität zu erreichen. Bei noch höheren Konzentrationen jedoch übertrifft die Aktivität des Monomers bei weitem die maximale Aktivität, die für das Dimer beobachtet wird.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von B Ketten Analoga des von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors, umfassend die Transformation oder Transfektion einer Wirtszelle mit einer für ein Vorläuferprotein kodierenden Sequenz, in der ein Stopkodon an einer Stelle der kodierenden Sequenz von dem Kodon für die Aminosäure 111 bis zum Kodon für die Aminosäure 160 positioniert ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Wirtszelle eine prokaryontische Wirtszelle ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Stopkodon an einer Stelle von dem Kodon für die Aminosäure 111 bis zum Kodon für die Aminosäure 137 positioniert ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Stopkodon an einer Stelle von dem Kodon für die Aminosäure 120 bis zum Kodon für die Aminosäure 137 positioniert ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei daß das Stopkodon an einer Stelle positioniert ist, die unmittelbar einem Kodon für einen Argininrest folgt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Stopkodon an einer Stelle positioniert ist, die dem Kodon für die Aminosäure 120, Aminosäure 127, Aminosäure 131, Aminosäure 134, Aminosäure 136 oder Aminosäure 137 entspricht.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Stopkodon beim Kodon für Aminosäure 120 positioniert ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die für das Vorläuferprotein kodierende Sequenz das c-sis-Gen ist.

9. Ein rekombinantes Protein mit einer homogenen Aminosäuresequenz, die im wesentlichen zu einem Teil der Aminosäuresequenz des PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; Vorläuferpröteins identisch ist und das, wenn zurückgefaltet, im wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das natürlich vorkommende PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; besitzt, wobei das rekombinante protein an einer Position von Aminosäure 110 bis Aminosäure 159 endet.

10. Das rekombinante Protein nach Anspruch 9, wobei das rekombinante Protein an einer Position von Aminosäure 110 bis Aminosäure 136 endet.

11. Das rekombinante Protein nach Anspruch 10, wobei das rekombinante Protein an einer Position von Aminosäure 119 bis Aminosäure 136 endet.

12. Das rekombinante Protein nach Anspruch 11, wobei das rekombinante Protein an einer Position endet, die der Aminosäure 119, Aminosäure 126, Aminosäure 130, Aminosäure 133, Aminosäure 135 oder Aminosäure 136 entspricht.

13. Das rekombinante Protein nach Anspruch 12, wobei das rekombinante Protein bei der Aminosäure 119 endet.

14. Das rekombinante Protein nach Anspruch 13, mit der Sequenz:

15. Ein monomeres rekombinantes Protein, mit einer homogenen Aminosäuresequenz, die im wesentlichen zu einem Teil der Aminosäuresequenz des PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; Vorläuferproteins identisch ist und das, wenn zurückgefaltet, mindestens ungefähr eintausentstel der mitogenen spezifischen Aktivität des natürlich vorkommenden PDGF B&sub1;&sub0;&sub9; besitzt, wobei das rekombinante Protein an einer Position von Aminosäure 110 bis Aminosäure 159 endet.

16. Das monomere rekombinante Protein nach Anspruch 15, wobei das rekombinante Protein an einer Position von Aminosäure 110 bis Aminosäure 136 endet.

17. Das monomere rekombinante Protein nach Anspruch 16, wobei das rekombinante Protein an einer Position von Aminosäure 119 bis Aminosäure 136 endet.

18. Das monomere rekombinante Protein nach Anspruch 17, wobei das rekombinante Protein an einer Position endet, die der Aminosäure 119, Aminosäure 126, Aminosäure 130, Aminosäure 133, Aminosäure 135 oder Aminosäure 136 entspricht.

19. Das monomere rekombinante Protein nach Anspruch 18, wobei das rekombinante Protein bei der Aminosäure 119 endet.

20. Das monomere rekombinante Protein nach Anspruch 19 mit der Sequenz:

21. Eine für ein Vorläuferprotein kodierende Sequenz für die Verwendung bei der Expression eines rekombinanten von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor B Analogon in einer Wirtszelle, wobei ein Stopkodon an einer Stelle der kodierenden Sequenz von dem Kodon für die Aminosäure 111 bis zum Kodon für die Aminosäure 160 positioniert ist.

22. Die kodierende Sequenz nach Anspruch 21, wobei ein Stopkodon an einer Stelle der kodierenden Sequenz von dem Kodon für die Aminosäure 111 bis zum Kodon für die Aminosäure 137 positioniert ist.

23. Die kodierende Sequenz nach Anspruch 22, wobei ein Stopkodon an einer Stelle der kodierenden Sequenz von dem Kodon für die Aminosäure 120 bis zum Kodon für die Aminosäure 137 positioniert ist.

24. Die kodierende Sequenz nach Anspruch 23, wobei ein Stopkodon an einer Stelle der kodierenden Sequenz positioniert ist, die unmittelbar einem Kodon für einen Argininrest folgt.

25. Die kodierende Sequenz nach Anspruch 24, wobei das Stopkodon an einer Stelle der kodierenden Sequenz positioniert ist, die dem Kodon für die Aminosäure 120, Aminosäure 127, Aminosäure 131, Aminosäure 134, Aminosäure 136 oder Aminosäure 137 entspricht.

26. Die kodierende Sequenz nach Anspruch 25, wobei das Stopkodon beim Kodon für die Aminosäure 120 positioniert ist.

27. Eine Wirtszelle, die mit einer kodierenden Sequenz nach einem der Ansprüche 21 bis 26 in einer Weise transformiert oder transfiziert ist, daß die Wirtszelle ein Analogon des von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors B mit einer homogenen Aminosäuresequenz exprimiert.

28. Die Wirtszelle nach Anspruch 27, wobei die kodierende Sequenz der Aminosäuresequenz

entspricht.

29. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge an von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor B Analogon nach einem der Ansprüche 9 bis 20 und ein pharmazeutisch verträgliches Trägermaterial.

30. Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei das von Blutplättchen abstammende Wachstumsfaktor B Analogon das Analogon gemäß Anspruch 13 ist.

31. Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei das von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor B Analogon das Analogon gemäß Anspruch 14 ist.

32. Verwendung eines PDGF B Analogons nach einem der Ansprüche 9 bis 20, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Wunden.