DE69030539T2 - Wachstumsfaktor aus parenchymalen Lebenszellen, dafür kodierendes Gen, Verfahren zur Herstellung dieses Faktors und Transformanten - Google Patents
Wachstumsfaktor aus parenchymalen Lebenszellen, dafür kodierendes Gen, Verfahren zur Herstellung dieses Faktors und TransformantenInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft einen durch rekombinante DNA- Technologie erhaltenen hepatischen parenchymalen zellwachstumsfaktor; ein ihn kodierendes Gen; eine einen Expressionsvektor tragende Transformante, der mindestens eine Promotorsequenz, die für die Expression eines Proteins erforderlich ist, eine ein Signalpeptid kodierende Sequenz, eine DNA-Sequenz, die humanen hepatischen parenchymalen Zellwachstumsfaktor kodiert, und eine Terminatorsequenz umfaßt; und ein Verfahren zur Herstellung von humanem hepatischen parenchymalen Zellwachstumsfaktor durch Kultur der Transformante.
- Die Leber ist das am höchsten differenzierte und größte adenogene Organ im lebenden Körper. Es übt verschiedene wichtige Funktionen aus, wie Stoffwechsel (Metabolismus), Lagerung, Entgiftung, Abbau, Ausscheidung und ähnliches von verschiedenen Nährstoffen (Kohlenhydraten, Proteinen, Fetten, Vitaminen, Hormonen und ähnlichen), und sie spielt insbesondere ein wichtige Rolle beim Intermediatmetabolismus des lebenden Körpers.
- Diese Funktionen werden durch hepatische parenchymale Zellen aufrechterhalten, die im lebenden Körper durch verschiedene Hormone kontrolliert werden und die eine bemerkenswerte aktive Vermehrung in bestimmten Fällen zeigen können. Z. B. weiß man, daß in einer Ratte auch nach chirurgischer Entfernung von ca. 2/3 der Leber das zurückbleibende hepatische Gewebe prompt wächst und auf seine originale Größe in ca. 10 Tagen wieder hergestellt werden kann. Ferner wurden Patienten, die an hepatischem Karzinom leiden, mit partieller Hepatektomie behandelt, worauf Regeneration folgte.
- Eine Vielzahl von Forschungen und Untersuchungen waren darauf gerichtet, den Mechanismus der hepatischen Regeneration über die Proliferation der hepatischen parenchymalen Zellen aufzuklären, mit Berichten, die auf das Vorliegen eines hepatischen parenchymalen Zellwachstumsfaktor hinweisen. Insbesondere haben einige der jetzigen Erfinder gefunden, daß Plasma aus Patienten mit fulminanter Hepatitis eine bemerkenswert hohe Aktivität zur Vermehrung von hepatischen parenchymalen Zellen hatte (Biomed. Res., 6, 231 (1985) und Exp. Cell Res., 166, 139 (1986)) und sie waren zum ersten Mal in der Welt erfolgreich bei der Reinigung des Vermehrungsaktivierenden Faktors als Einzelprotein (japanische Patentanmeldung Kokai Nr. 22526/1988 und J. Clin. Invest., 81, 414 (1988)).
- Dieser humane hepatische parenchymale Zellwachstumsfaktor (humaner Hepatocyten-wachstumsfaktor; im folgenden als "hHGF" bezeichnet) hatte ein Molekulargewicht von ca. 76 000 bis 92 000, wie durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen bestimmt, jedoch lieferte SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen zwei Banden bei Molekulargewichten von 56 000 bis 65 000 und 32 000 bis 35 000. Nakamura et al. berichteten von Rattenplättchen-abgeleiteten Faktor mit ähnlicher Aktivität (Biochem. Biophys. Res. Commun., 122, 1450 (1984)) und schätzten sein Molekulargewicht auf ca. 27 000 durch SDS-PAGE (Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 83, 6489 (1986)). Anschließend reinigten sie den Faktor als homogenes Protein und berichteten, daß der gereinigte Faktor ein Protein mit einem Molekulargewicht von 82 000 war, welches aus zwei Polypeptiden mit Molekulargewichten von 69 000 und 34 000 bestand (FEBS Letters, 224, 311 (1987)).
- T. Nakamura et al. (Nature, 342, S. 440-443, 1989) haben die molekulare Klonierung und Expression eines humanen Hepatocyten-Wachstumsfaktors beschrieben, der vom Erfindungsgemäßen verschieden ist.
- Mit Ausnahme des oben erwähnten hHGFs und Ratten-HGFs existiert kein Bericht über irgendeinen Hepatocyten- Wachstumsfaktor, der als homogenes Protein gereinigt wurde. Auch im Hinblick auf den hHGF und Ratten-HGF kennen wir keinen Bericht über ihre Primärstrukturen und entsprechenden cDNA-Basensequenzen.
- Es wird eine große Menge an hHGF erforderlich sein, wenn eine Untersuchung durchgeführt werden soll, um die Funktion von hHGF im lebenden Körper in Einzelheiten und/oder seine wirkungen bei der hepatischen Regeneration in einem Patienten mit Hepatopathie aufzuklären. Jedoch sind Isolierung und Reinigung großer Mengen von hHGF aus Plasma vom Patienten mit fulminanter Hepatitis nicht so einfach im Hinblick auf die Arbeit, Zeit und Wirtschaftlichkeit, und eine stabile Isolierung von nur hHGF aus Seren, bei den verschiedene infektiöse Agenzien vorkommen, ist äußerst schwierig durchzuführen. Aus diesen Gründen wurde keine stabile und großmaßstäbliche Isolierung und Reinigung von hHGF aus Plasma von Patienten mit fulminanter Hepatitis versucht.
- Die Erfinder haben intensive Untersuchungen mit dem Zweck durchgeführt, eine große Menge von hHGF durch rekombinante DNA-Technologie zu erhalten, und es gelang ihnen zum ersten Mal ein Gen, das für hHGF kodiert, zu klonieren, welches für einen solchen Zweck geeignet ist. Ferner haben die Erfinder einen neuen, das Gen tragenden Expressionensvektor konstruiert, der die Expression von hHGF ermöglicht. Hierauf beruht die vorliegende Erfindung.
- Es ist demnach eine Aufgabe der Erfindung, einen hepatischen parenchymalen Zellwachtumsfaktor, erhalten durch Gentechnik, zur Verfügung zu stellen.
- Es ist eine weitere Aufgabe, ein für einen solchen hepatischen parenchymalen Zellwachstumsfaktor kodierendes Gen zur Verfügung zu stellen.
- Es ist eine weitere Aufgabe einen das Gen enthaltenden Expressionsvektor zur Verfügung zu stellen.
- Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung einer Transformante, z. B. einer tierischen Zelle, die den Expressionsvektor trägt, welche zur Produktion des hepatischen parenchymalen Zellwachstumsfaktor in der Lage ist.
- Es ist eine weitere Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung des hepatischen parenchymalen Zellwachstumsfaktors durch rekombinante DNA-Technologie zur Verfügung zu stellen.
- Die anderen erfindungsgemäßen Aufgabe gehen aus der folgenden Beschreibung hervor.
- Die Erfindung läßt sich besser durch die anschließende Beschreibung unter Bezugnahme auf die anliegenden Zeichnungen verstehen, bei denen:
- Fig. 1 a bis d zeigen die Aminosäuresequenz von erfindungsgemäßem hHGF;
- Fig. 2 a bis c zeigen die Basensequenz der im Beispiele 1 erhaltenen cDNA, welche ein für hHGF gemäß der Erfindung kodierendes Gen enthält. Die Erkennungsstellen der Hauptrestriktionsenzyme sind ebenfalls in dieser Abbildung gezeigt. Unterstreichungen in der Abbildung bedeuten Regionen, die den bereits bestimmten Aminosäuresequenzen entsprechen, und von diesen bedeuten doppelte Unterstreichungen die Sequenzen, die der bei der ersten erfindungsgemäßen Klonierung verwendeten Sonde entsprechen;
- Fig. 3 zeigt ein Schema zur Konstruktion eines Vektors, der zur Expression von humanem parenchymalem Zellwachstumsfaktor in der Lage ist;
- Fig. 4 zeigt die Struktur eines Expressionsvektors, der die für den erfindungsgemäßen humanen parenchymalen Zellwachstumsfaktor kodierende DNA enthält; und
- Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, welche die biologische Aktivität des den humanen parenchymalen Zellwachstumsfaktor enthaltenden Überstandes zeigt, der durch den Expressionsvektor, welcher die für den humanen parenchymalen Zellwachstumsfaktor gemäß der Erfindung kodierende DNA enthält, trägt, hergestellt wird.
- Erfindungsgemäß wird ein humaner Hepatocyten-Wachstumsfaktor (hHGF), dargestellt durch die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz, zur Verfügung gestellt, welcher eine Signalsequenz enthält; hHGF, dargestellt durch die Aminosäuresequenz im Bereich vom 30. Glutaminsäurerest (Glu) bis zum letzten Serinrest (Ser) in Fig. 1; und hHGF, dargestellt durch die Aminosäuresequenz im Bereich von dem 32. Glutaminsäurerest(Gln) zum letzten Serinrest (Ser) in Fig. 1. Die Erfindung umfaßt auch Modifikationen von hHGF, wie oben erwähnt, die mindestens eine zusätzliche, fehlende oder ausgetauschte Aminosäure umfassen, mit der Maßgabe, daß diese Modifikationen dem natürlich vorkommendem hHGF äquivalent sind.
- Ebenfalls zur Verfügung gestellt wird ein Gen, das für einen durch eine der Aminosäuresequenzen dargestellten hHGF kodiert; das Gen, das durch die in Fig. 2 gezeigte Basensequenz dargestellt wird, welches für einen für eine Signalsequenz enthaltenden hHGF kodiert;
- das Gen, dargestellt durch die Basensequenz von der 88. Base, Guanin (G), zur letzten Base (G) in Fig. 2; und das Gen, dargestellt durch die Basensequenz im Bereich von der 94. Base, Cytosin (C), zur letzten Base (G) in Fig. 2. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von hHGF, dargestellt durch die Aminosäuresequenz von Fig. 1, zur Verfügung, welches die Transformation einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein für hHGF kodierendes Gen enthält, und Kultur der erhaltenen Transformante umfaßt. Ferner wird eine Transformante zur Verfügung gestellt, die zur Produktion von hHGF gemäß der Erfindung in der Lage ist.
- Das für den erfindungsgemäßen hHGF kodierende Gen (cDNA) kann die in Fig. 2 gezeigte Basensequenz haben, in der jedoch nur die Basensequenz einer einzelstängigen DNA beschrieben wird, wobei die komplementären Basensequenz aus Gründen der Einfachheit weggelassen sind.
- Das Gen kann zur Expression von hHGF mit der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz durch rekombinante DNA- Technologie verwendet werden. In diesem Fall enthält ein von der für den hHGF kodierenden entsprechenden mRNA translatierte Protein eine Signalsequenz. Diese Signalsequenz wird abgespalten, wenn das Protein aus der Wirtszelle sekretiert wird, was auf diese Weise zur Produktion von hHGF mit einer Aminosäuresequenz führt, welche den Bereich von dem 30. Glutminsäurerest (Glu) oder dem 32. Glutaminsäurerest (Gln) bis zum letzten Aminosäurerest der in Fig. 1 dargestellten Sequenz aufweist. Anstelle dieser Signalsequenz können ebenfalls bestimmte Signalsequenzen anderer Proteine hier verwendet werden. Andererseits, wenn reifer hHGF ohne Signalsequenz in den Wirtszellen exprimiert wird, kann ein hHGF-kodierendes Gen mit der Basensequenz im Bereich vom 88. G oder 94. C bis zur letzten Base der in Fig. 2 dargestellten Sequenz nach Ligation des Gens mit einem ATG- Kodon einer Vektor-DNA verwendet werden.
- Erfindungsgemäß ist es beabsichtigt, alle Modifikationen wie Eliminierung, Veränderung und Zufügung von einer oder mehreren Aminosäuren oder Nukleinsäuren zu umfassen, unter der Voraussetzung, daß die Wachstums-verbessernde Aktivität der hepatischen parenchymalen Zellen nicht verändert wird.
- Ein DNA-Fragment eines für den erfindungsgemäßen hHGF kodierendes Gen kann nach den folgenden Verfahren erhalten werden:
- Nach der in J. Clin. Invest., 81, 414 (1988) beschriebenen Methode kann hHGF aus Plasma vom Patienten mit fulminanter Hepatitis gereinigt werden. Der gereinigte hHGF dissoziiert in zwei Polypeptide durch Aufbrechen der Disulfidbindungen unter reduzierenden Bedingungen. Das größere Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 56 000 bis 65 000 wird "H-Kette" genannt, und das kleiner mit einem Molekulargewicht von 32 000 bis 35 000 "L-Kette".
- Der gereinigte hHGF wird reduziert und die Thiolgruppen der gebildeten Cysteinreste werden carboxymethyliert, worauf Umkehrphasen-Hochdruckflüssigchromatographie zur Isolierung der H- und L-Ketten folgt. Alternativ kann hHGF unter reduzierenden Bedingungen auf einem Gel elektrophoretisiert werden, aus dem jeweils die H- und L-Ketten extrahiert werden. Die N-terminalen Aminosäuresequenzen beider Ketten können dann durch Analyse der Ketten mit einem Applied- Biosystems-Gasphasen-Proteinsequenzierer bestimmt werden.
- Andererseits kann hHGF selbst, oder nach Auftrennung in H- und L-Ketten, mit einem geeigneten proteolytischen Enzym, wie Achromobacter Protease I (Lysylendopeptidase) hydrolysiert werden. Die erhaltenen Peptidfragmente können durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigchromatographie isoliert werden. Jedes Peptid kann, wie oben beschreiben, unter Bestimmung der internen Aminosäuresequenz des Polypeptids analysiert werden.
- Aus diesen Aminosäuresequenzen können DNA-Basensequenzen zur Selektion einer Sequenz abgeleitet werden, die für die Präparation eines Oligonukleotids geeignet ist, z. B. dem wie in den Beispielen wie im folgenden beschreiben, gezeigt. Ein solches geeignetes Oligonukleotid wird synthetisiert und als eine Sonde verwendet.
- Eine cDNA-Bank zum Screenen nach einem für hHGF kodierenden Gen, kann eine beliebige sein, die aus der humanen Leber, Milz oder Plazenta abgeleitet ist, und ist handelsüblich von Clontech Laboratories, Inc. erhältlich. Eine Plazenta-cDNA- Bank ist besonders bevorzugt. Ferner kann die cDNA-Bank auch üblicherweise aus einer Zellinie oder Gewebematerial, in dem hHGF exprimiert ist, hergestellt werden.
- E. coli wird mit lambda-Phagen infiziert, der eine cDNA enthält, und kultiviert nach dem Verfahren von Maniatis (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, S. 56 bis 73, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982). Die so gebildeten Plaques werden dann einem Selektionsprozeß unter Verwendung eines Oligonukleotids unterzogen, das wie oben hergestellt wurde, und auf der Basensequenz beruht, die aus einem Teil der Aminosäuresequenz des hHGFS abgeleitet wurde, als Sonde nach dem Plaque-Hybridisierungsverfahren (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, S. 320 bis 328, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Daher können auf einfache Weise mehrere unterschiedliche lambda-Phagenklone erhalten werden, wobei jeder Klon sowohl die als Sonde verwendete Basensequenz als auch eine Basensequenz, die anderen Regionen der Aminosäuresequenz des erwünschten hHGFS entspricht, enthält.
- Die im Screeningprozeß positiven Plaques werden selektiert, und die Phagen läßt man nach dem Verfahren von Maniatis wachsen (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, S. 79, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Die DNA wird durch das Glycerin-Gradientenverfahren gereinigt und mit einem geeigneten Enzym, wie z. B. EcoRI, verdaut. Die erhaltene cDNA wird dann in einen Plasmidvektor, wie z. B. pUC18 und pUC19, oder in einem einzelsträngigen Phagen, wie z. B. M13mp18 und M13mp19, subkloniert. Die Basensequenz des erwünschten cDNA-Segments kann nach dem Dideoxyketten- Abbruchverfahren von Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)) bestimmt werden. Auf diese Weise kann die gesamte Basensequenz eines für die gesamte Aminosäuresequenz von hHGF, wie in Fig. 1 gezeigt, kodierenden Gens bestimmt werden.
- Industrielle Produktion von hHGF erfordert die Selektion eines Wirts-Vektorsystems, das eine stabile Expression bereitstellen kann. Ebenfalls muß das exprimierte hHGF die biologische Aktivität zur Proliferation von hepatischen parenchymalen Zellen besitzen. Insbesondere sollte berücksichtigt werden, daß natürlich vorkommendes hHGF ein Glycoprotein ist, daß hHGF eine Anzahl von Cysteinresten enthält, und daß die Positionen der zwischen den Thiolgruppen in den Cysteinresten gebildeten Disulfidbindungen und die Struktur höherer Ordnung eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der hHGF-Aktivität hat.
- Unter Berücksichtigung der obigen Punkte ist es wünschenswert tierische Zellen zu verwenden, z. B. CHO, COS und Maus L, C127- und FM3A-Zellen als Wirtszellen zur Expression des erfindungsgemäßen hHGF-Gens, obwohl Mikroorganismen wie z. B. Hefe, z. B. Saccaromyces cerevisiae und Escherichia coli, z. B. E. coli YA-21, verwendet werden können. Wenn ferner eine solche tierische Zelle als Wirtszelle verwendet wird, ist es vorteilhaft, daß ein Gen, das für den eine Signalsequenz enthaltenden unreifen hHGF kodiert, d. h. solch ein Gen, welches ebenfalls 1 bis 87 oder 1 bis 93 Nukleotide der in Fig. 2 gezeigten DNA-Sequenz enthält, verwendet wird und in die Zellen eingebaut wird, da man erwartet, daß das freie hHGF-Protein in das reife Kulturmedium sekretiert wird.
- Ein Expressionsvektor, der in der Erfindung verwendet werden kann, enthält ein DNA-Fragment, das für mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz des hHGF-Proteins stromabwärts vom Promotor des Vektors kodiert. Es kann hier die Verwendung verschiedener Promotoren in Betracht gezogen werden, einschließlich dem SV40-Promotor, den Protomotoren der Apolipoprotein-E- und -A1-Gene des Hitzeschock-Proteingens und des Metallothioneingens, den HSV-TK-Promotor, Adenoviruspromotor und Retrovirus-LTR. Erfindungsgemäß ist jedoch der SV40-Promotor oder der Promotor des Metallothioneingens bevorzugt.
- Ein für den unreifen hHGF, der eine Signalsequenz enthält, kodierendes DNA-Fragment wird in einen Vektor stromabwärts von seinem Promotor in Transkriptionsrichtung eingefügt. Es ist möglich, eine Kombination von zwei oder drei solcher hHGF-DNA-Fragmente einzufügen. Es ist auch möglich, eine solche Einheit herzustellen, die ein hHGF-DNA-Fragment, bei dem 5'-aufwärts ein Promotor verknüpft ist, enthält, und zwei oder drei solcher Einheiten in einen Vektor als Tandem entlang der Transkriptionsrichtung einzufügen.
- Ein Polydenylierungssignal sollte stromabwärts vom hHGF-Gen im Expressionsvektor vorhanden sein. Ein solches Polyadenylierungssignal kann aus SV40-DNA, beta-Globingen oder dem Metallothioneingen abgeleitet werden. Wenn zwei oder drei DNA-Fragmente, umfassend einen Promotor, der an das hHGF-Gen, wie oben beschreiben, geknüpft ist, in Tandemanordnung in einen Vektor eingefügt werden, ist es möglich, ein Polyadenylierungssignal an das 3' eines jeden hHGF-Gens anzufügen.
- Es ist erwünscht, einen selektiven Marker zu verwenden, wenn eine tierische Zelle, wie z. B: eine CHO-Zelle, mit dem Expressionsvektor transformiert wird. Ein solches selektives Markergen kann in den Expressionsvektor stromabwärts des Polyadenylierungssignals in oder gegen Transkriptionsrichtung eingefügt werden, sonst muß ein weiteres Plasmid, das ein selektives Markergen enthält, unter Erhalt einer Transformante co-transformiert werden. Solche selektive Marker können DHFR-Gen umfassen, welches Methotrexatresistenz verleiht (J. Mol. Biol., 159, 601 (1982)); das Neo-Gen, welches G-418-Antibiotikaresistenz verleiht, (J. Mol. Appl. Genet., 1, 327 (1982)), das E. coli abgeleitete Ecogpt-Gen, welches Mycophenolsäureresistenz verleiht (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2072 (1981)); und das hph-Gen, welches Hygromycinantibiotikaresistenz verleiht (Mol. Cell. Biol., 5, 410 (1985)). Das selektive Markergen hat als Promotor z. B. den SV40-Promotor 5' stromaufwärts davon, und ein Polyadenylierungssignal 3' stromabwärts davon.
- Wie bereits beschrieben, kann ein weiterer Vektor oder ein Plasmid, des einen Marker enthält, welcher die Selektion einer Transformante ermöglicht, in eine Wirtszelle zusammen mit dem Expressionsvektor, der das hHGF-Gen enthält, cotransformiert werden, wenn ein solches selektives Markergen nicht in den Expressionsvektor eingefügt ist. Solche Vektoren können z. B. pSV2neo (J. Mol. Appl. Genet., 1, 327 (1982)); pMBG (Nature, 294, 228 (1981)); pSV2gpt (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2072 (1981)) und pAd-D26-1 (J. Mol. Biol., 159, 601 (1982)) umfassen. In diesem Fall kann eine Transformante leicht auf Basis des Phenotyps des verwendeten selektiven Markers selektiert werden.
- Bei den oben erwähnten Verfahren können diese Zellen, welche das erwünschte hHGF-Proteingen enthalten, wiederholt einer Co-Transformation unter Verwendung verschiedener selektiver Marker, unterzogen werden. Dies kann vorzugsweise die Menge des exprimierten Proteins um ca. 20-fach erhöhen.
- Die Einführung des Expressionsvektors in tierische Zellen kann nach dem Kalziumphosphatverfahren (Virology, 52, 456 (1973)) oder im Elektroporationsverfahren (J. Membr. Biol., 10, 279 (1972)) durchgeführt werden. Das Kalziumphosphatverfahren wird allgemein eingesetzt.
- Die so transformierten tierischen Zellen können auf übliche Weise durch Suspension oder Adhäsionskultur transformiert werden. MEM oder RPMI1640 kann als Kulturmedium verwendet werden, und die Kultur kann in Abwesenheit oder Anwesenheit von 5 bis 10 % Serum und in Anwesenheit einer geeigneten Menge an Insulin, Dexamethason oder Transferrin erfolgen.
- Die tierischen Zellen, die das hHGF-Protein produzieren, scheiden das produzierte hHGF-Protein in das Kulturmedium aus. Das hHGF-Protein kann aus dem Kulturüberstand gereinigt und isoliert werden. In spezifischer Weise kann der Überstand einer Kombination verschiedener chromatographischer Schritte auf 5-Sepharose, Heparin-Sepharose, Hydroxylapatit und/oder sulfatiertem Cerulophain zur Reinigung und Isolierung des hHGF-Proteins unterzogen werden.
- Erfindungsgemäß wird hHGF (prehHGF) mit der von Met beginnenden Aminosäuresequenz, wie in Fig. 1 gezeigt, zunächst in Wirtszellen exprimiert. Der hHGF (prehHGF) wird dann zwischen dem 31. Gly und dem 32. Gln in den Wirtszellen hydrolysiert; auf diese Weise wird das Signalpeptid mit 31 Aminosäuren abgespalten. Das N-terminale Gln wird dann deaminiert unter Umwandlung in Pyroglutaminsäure. Auf diese Weise wird hHGF mit einem Pyroglutaminsäurerest an seinem N- Terminus ausgeschieden.
- Im hHGF gemäß der Erfindung bildet die Peptidkette von der N- termianlen Pyroglutaminsäure bis zum 494. Arg die schwere (H) Kette, während das übrige Peptid vom 495. Val bis zum letzten Ser die leichte (L) Kette bildet.
- Erfindungsgemäß kann das hHGF-Protein mit biologischen Aktivitäten im Überschuß stabil und einfach produziert werden, indem in eine Wirtszelle ein Expressionsvektor eingeschleust wird, in dem das erfindungsgemäße hHGF-Gen eingefügt wurde. Eine solche hHGF-Produktion wurde vor der Erfindung nicht erreicht. Auf diese Weise erhaltenes rekombinantes hHGF, hHGF-änliche Substanzen oder hHGF-haltige Fusionsproteine können bei der Behandlung von Lebererkrankungen unter Verstärkung der hepatischen Regeneration, zur Verbesserung der hepatischen Funktion, zur Hepatitisheilung, und als Mittel für hepatische Chirrhoseunterdrückung eingesetzt werden.
- Die folgenden Beispiele dienen nur zur Erläuterung. Die Erfindung ist nicht auf diese Beispiele beschränkt. Es ist selbstverständlich, daß der Fachmann Modifikationen durchführen kann, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung, wie in den anliegenden Ansprüchen definiert, abzuweichen.
- Die Reinigung von hHGF aus Plasma von Patienten mit fulminanter Hepatitis erfolgte nach dem in J. Clin. Invest., 81, 414 (1988) beschriebenem Verfahren. Auf diese Weise gereinigte hHGF-Präparation wurde eine SDS-PAGE unterzogen. Es wurde eine relativ breite Einzelbande bei Molekulargewichten von 76 000 bis 92 000 unter nicht- reduzierenden Bedingungen beobachtet. SDS-PAGE zeigte unter reduzierenden Bedingungen dagegen zwei Banden; eine relativ breite Bande bei Molekulargewichten von 56 000 bis 65 000 und eine andere Bande bei Molekulargewichten von 32 000 bis 35 000. Ein 50µg-Anteil der gereinigten hHGF-Präparation wurde in 100 µl 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9), enthaltend 5 M Harnstoff, gelöst, und die erhaltene Lösung wurde mit einer Menge von Achromobacter Protease 1 vermischt, was einem 1/200 des hHGFS im Molverhältis entsprach, worauf Inkubation bei 37ºC für 6 Stunden folgte. Die erhaltene Peptidmischung wurde einer Reduktion und einer Carboxymethylierung auf übliche Weise unterworfen. Jedes Peptid wurde dann abgetrennt und mittels Umkehrphasen-Hochdruchflüssigchromatographie unter Verwendung einer Bakerbond-WP-Octyl-Säule (J. T. Baker) isoliert. Analysen der vier Peptide unter Verwendung eines Gasphasen-Proteinsequenzierers (Applied Biosystems; Modell 470A) ergaben die Aminosäuresequenzen wie in der folgenden Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 AMINOSÄURESEQUENZEN DER PEPTIDE
- *XXX bedeutet eine nicht bestimmte Aminosäure
- Anschließend wurden synthetische Oligonukleotide auf Basis der Teilaminosäuresequenzen Asn-Met-Glu-Asp-Leu-His und His- Ile-Phe-Trp-Glu-Pro des in Tabelle 1 gezeigten Peptids Nr. 4 hergestellt. D. h. es wurden 64 Oligonukleotide TH23, bestehend aus 17 Basen (5'-T-G-T/C/A/G-A-A/G-A/G-T-C-T/C-T-C- C-A-T-A/G-T-T-3' und 24 Oligonukleotide TH24, bestehend aus 17 Basen (5'-G-G-T/C-T-C-C-C-C-A-A/G-A-A-A/G/T-A-T-A/G-T-G- 3') hergestellt. Das 5'-Ende eines jeden synthetischen Oligonukleotids wurde mit ³²P auf übliche Weise unter Verwendung von Polynukleotidkinase in einer Reaktionslösung (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Mercaptoethylalkohol, 100 µM [γ ³²P] ATP und Substrat-DNA) markiert. Unnötige Mononukleotide in diesen markierten Proben wurden durch konventionelle DEAE-Cellulose- Säulenchromatographie entfernt.
- Eine λ-Phagen-cDNA-Bank (Clontech Laboratories, Inc.), die aus einer 34 Wochen alten humanen Palcenta stammte, wurde nach den Herstellerangaben gescreent. E. coli Y-1090-Stamm wurde mit Phagen von 1 000 000 Klonen infiziert und bei 42ºC über Nacht auf einem NZY-Weich-Agarmedium unter Verwendung von fünf Petri-Schalen (24,5 cm x 24,5 cm) kultiviert, wobei jede Schale 200 000 Klone (NZY-Medium; 1 % NZ-Amin, 0,5 % Hefeextrakte und 0,5 % Natriumchlorid, eingestellt auf pH 7,5 und ergänzt mit 0,25 % Magnesiumchlorid und NZY-Weich- Agarmedium; NZY-Medium ergänzt mit Agarpulver auf seine Endkonzentration von 0,7 % und autokalviert) enthielt.
- Anschließend wurden die erhaltenen λ-Phagenklone, die auf dem Medium gewachsen waren, auf eine handelsübliche Nylonmembran (Gene Screening Plus, Du Pont Company) transferiert und einer Plaquehybridisierung wie folgt unterzogen.
- Auf einer Schale gewachsene Phagenpartikel wurden auf zwei Nylon-Membranen transferiert und jede Membran wurde auf mit 0,1 M Natriumhydroxid und 1,5 M Natriumchlorid imprägniertem Filterpapier transferiert. Nach Stehenlassen für 2 Minuten auf dem Filterpapier, wurde die Feuchtigkeit auf der Nylon- Membran unter Verwendung eines weiteren trockenen Filterpapiers entfernt. Die auf diese Weise getrocknete Membran wurde dann auf ein weiteres Filterpapier, das mit 2 x SSCP - 0,2 M Tris-HCl (pH 7,4) imprägniert war, aufgebracht, auf dem Filterpapier stehengelassen und dann an der Luft auf einem weiteren trockenen Filterpapier getrocknet. Diese Verfahrensschritte wurden noch einmal wiederholt. Der Begriff "2 x SSCP" bedeutet doppelte Konzentration von SSCP-Lösung und es werden ähnliche Ausdrücke im folgenden benutzt (10 x SSCP; 1,2 M Natriumchlorid, 150 mM Natriumcitrat, 130 mM Kaliumdihydrogenphosphat und 1 mM EDTA und pH 7,2).
- Die so behandelte Nylon-Membran wurde bei 60ºC 15 Minuten mit 3 x SSC - 0,1 % SDS (20 x SSC; 3 M Natriumchlorid und 0,3 M Natriumcitrat) gewaschen. Das Waschverfahren wurde noch einmal wiederholt. Jede der so gewaschenen Nylon-Membranen wurde dann bei 65ºC 3 Stunden in 5 ml einer Vorhybridisierungslösung [3 x SSC, 0,1 % SDS, 10 x Denhalt (40 x Denhalt-Lösung; 1 % RSA (Rinderserumalbumin), 1 % Polyvinylpyrrolidon und 1 % Ficol 400) und 20 µg/ml Lachssperma-DNA] inkubiert. Die vorstehenden Nylon-Membranen wurden 36 Stunden in einer Hybridisierungslösung, enthaltend ³²P-markierte synthetische Oligonukleotidsonde, hergestellt in [1] oben, [3 x SSC, 10 x Denhalt, 50 µg/ml Lachssperma- DNA, 1 M Natriumchlorid, 1 % SDS, 250 µg/ml Lachssperma-DNA und 100 000 cpm/ml ³²P-markierte Sonden-DNA pro synthetisierte Sonde] inkubiert. Die Inkubationstemperatur wurde durch Einsetzen von A oder T als 2ºC und G oder C als 4ºC berechnet und summieren diese Werte einer jeden Sonde (42ºC im Fall der TH23-Sonde und 46ºC im Fall der TH24- Sonde). Anschließend wurden die so inkubierten Nylon- Membranen aus der Hybridisierungslösung entfernt, zweimal in 4 x SSC (jeweils 30 Minuten) bei Raumtemperatur gewaschen, zweimal in 4 x SSC (30 Minuten für jede) bei der vorerwähnten Hybridisierungstemperatur gewaschen, wiederum zweimal in 2 x SSC (15 Minuten für jede) bei Raumtemperatur gewaschen und anschließend autoradiographiert.
- Es wurde eine Gesamtzahl von 6 autoradiographischen Signalen, die miteinander zwischen einem paar von Nylon-Membranen zusammenfielen, gefunden. Zur Isolierung der diesen Signalen entsprechenden Klone wurde jedes Plaque auf dem zuvor erwähnten Weich-Agarmedium, welches mit den positiven Signalen zusammenfiel, unter Verwendung eines Glasröhrchens entfernt. Phagenpartikel in den so entfernten Plaque wurden durch Inkubation der Plaque über Nacht in 1 ml TMG-Puffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 0,01 % Gelatine] extrahiert in Gegenwart von 50 µl Chloroform. E. coli Y-1090-Zellen wurde mit den so extrahierten Phagenpartikeln infiziert und eine geeignete Menge an infizierten Zellen wurden auf dem Weich-Agarmedium in einer Petri-Schale (9 cm im Durchmesser) kultiviert. Die Plaque-Hybridisierung erfolgte wie zuvor beschrieben. Durch Wiederholung einer Reihe dieser Verfahren wurde jedes Klon entsprechend einem positiven autradiographischen Signal isoliert.
- Im Ergebnis wurde eine Gesamtzahl von 6 unabhängigen Klonen erhalten. Von diesen wurden 2 Klone, bezeichnet als λ-hHGF21 und λ-hHGF502, auf ihre cDNA-Basensequenzen analysiert.
- Die DNA-Fragmente wurden aus den λ-Phagenklonen extrahiert und in Plasmidvektoren pUC18 und pUC19 und den einzelstängigen Phagenvektoren M13mp18 und M13mp19 wie folgt subkloniert.
- Infektion von 40 µl Suspension von 2 x 10&sup8;-Zellen von E. coli-Y-1090-Stamm mit 2 x 10&sup7;-pfu (plaque formation unit) von λ-Phagenklon, suspendiert in 200 µl TMG-Lösung, wo erfolgte durch Inkubieren davon bei 37ºC für 15 Minuten in 200 ml NZY- Medium in einem 500ml-Erlenmeyer-Kolben. Unmittelbar nach Inkubation wurden 1 ml von 1 M Kalziumchloridlösung zugegeben und die Kultur über Nacht inkubiert (ca. 14 Stunden).
- Zu Kultur wurden 2 ml Chloroform zugegeben. Nach Stehenlassen für ca. 10 Minuten wurden 15,8 g Natriumchlorid zugegeben und gelöst. Die Zentrifugation erfolgte bei 6 000 Upm für 20 Minuten bei 4ºC unter Verwendung einer gekühlten Zentrifuge (Modell SCR 2088; Rotor RPR 9-2; Hitachi Ltd.). Ein 209-Anteil von Polyethylenglycol 6 000 wurde zu der erhaltenen Überstandsflüssigkeit zugegeben und vollständig gelöst. Nach Stehenlassen für 1 Stunde in einem Eisbad, wurde die erhaltene Mischung bei 6 000 Upm 20 Minuten unter Verwendung der gekühlten Hitachi-Zentrifuge, Modell SCR 20BB, und dem Rotor RPR 9-2 zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde in 6 ml Puffer A [0,5 % NP40, 36 mM Kalziumchlorid, 30 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM Magnesiumchlorid, 125 mM Kaliumchlorid, 0,5 mM EDTA, 0,25 % Deoxycholsäure und 0,6 mM Mercaptoethanol] suspendiert. Die Suspension wurde dann mit 100 l von 10 mg/ml Deoxyribonuklease I und 10 µl von 10 mg/ml Rebonuklease A vermischt und bei 30ºC 30 Minuten zur Hydrolysierung von aus E. coli stammenden Nukleinsäuren hydrolysiert. Anschließend wurde die Reaktionsmischung mit einem gleichen Volumen an Chloroform vermischt und heftig gerührt, worauf Zentrifugation bei 3 000 Upm für 10 Minuten (Model LC-06; Rotor TS-7; Tomy Seiko Co., Ltd.) unter Erhalt einer Überstandsflüssigkeit folgte.
- Andererseits wurde eine Doppelschicht Glycerinlösung in einem Zentrifugenröhrchen für die Ultrazentrifugation (Rotor RPS40T; Hitachi Ltd.) hergestellt, in dem zunächst das Röhrchen mit 1 ml einer 40%igen Glycerinlösung [0,5 % NP40, 30 mM Tris-HCl (pH 7,5), 125 mM Kaliumchlorid, 0,5 mM EDTA, 0,6 InN Mercaptoethanol und 40 % Glycerin] beladen wurde, und dann hierauf 3 ml einer 10%igen Glycerinlösung [0,5 % NP40, 30 mM Tris-HCl (pH 7,5), 125 mM Kaliumchlorid, 0,5 mM EDTA, 0,6 mM Mercaptoethanol und 10 % Glycerin] aufgelegt wurden. Die Doppelschichtlösung wurde mit der Nuklease-behandelten Phagensuspension überschichtet. Nach Zentrifugation bei 35 000 Upm für 1 Stunde (Modell 70P72; Rotor RPS40T; Hitachi Ltd.) wurden die als Pellet gewonnenen Phagenpartikeln im Röhrchen, in 0,4 ml 40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA und 2 % SDS suspendiert, und die Suspension wurde 1 Stunde bei 55ºC in Gegenwart von 4 µl von 10 mg/ml Proteinase K inkubiert. Anschließend wurde die erhaltene Lösung in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und die Phagen-DNA wurde mit einem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform extrahiert und durch Ethanolpräzipitation gewonnen. Auf diese Weise wurden 200 µg Phagen-DNA erhalten.
- Die Phagen-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI auf übliche Weise verdaut, und die Verdaus wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Drei EcoRI-Fragmente zu 0,2 kb, 0,85 kb und 0,72 kb Größe wurden aus dem Klon λ- hHGF21 erhalten. Andererseits wurden cDNA-Fragmente durch Gewinnen der Insert-cDNA-Fragmente aus dem Agarosegel nach konventionellen Verfahren erhalten.
- Ein 100ng-Anteil von einer jeder dieser cDNA-Fragmente und ein 200ng-Anteil von jedem der Plasmidvektoren pUC18 und pUC19 und der einzelstrangigen Phagenvektoren M13mp18 und M13mp19, die zuvor mit dem Restriktionsenzym EcoRI auf übliche Weise verdaut worden waren, wurden in Gegenwart von T4-DNA-Ligase in 10 µl einer Reaktionslösung [66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Dithiothreitol, 66 µM ATP und Substrat-DNA] inkubiert. Jede dieser ligatisierten DNA-Proben wurde zur Transformation von einem E. coli-Wirt verwendet, der im Hinblick auf den verwendeten Vektor nach üblichen Verfahren selektiert wurde. Als Ergebnis wurden Subklone erhalten, die eine Teilbasensequenz des HGF- Gens in der EcoRI-Insertstelle enthielten.
- Die Bestimmung der Basensequenzen der cDNA-Subklone erfolgte nach dem Sanger et al. Dideoxyketten-Abbruchverfahren. Primer, die den handelsüblichen M13-Phagenvektoren entsprachen, wurden selektiert.
- Die Ableitung der Aminosäuresequenz aus der Basensequenz des Klons λ hHGF21, der die längste cDNA hatte, zeigte, daß die Aminosäuresequenz dieses Klons etwas von der bereits bestimmten Teilaminosäuresequenz enthielt, die von der für die Konstruktion der Sonde verwendeten Aminosäuresequenz unterschiedlich war, was zeigte, daß dieser Klon eine cDNA enthielt, die mindestens für einen Teil des hHGFS kodierte.
- Wenn ferner die cDNA-Basensequenz eines weiteren Klons λ- hHGF502, der ein verschiedenes cDNA-Fragment enthielt, das nicht im λ-hHGF21 vorkam, nach dem Sänger et al.-Verfahren analysiert wurde, wurde gefunden, daß der Phagenklon λ- hHGF502 eine gemeinsame 0,8kb-Basensequenz des Phagenklons λ- hHGF21 besaß, d. h. die Sequenz, die im Bereich lag, ausgehend von einer Base in der Nähe der Schnittstelle des Restriktionsenzyms NcoI bis zu einer Base in der Nähe der dritten EcoRI-Spaltstelle von 5' stromaufwärts, wie in Fig. 2 gezeigt, wie auch einer 0,7kb-Basensequenz an der 3'-Seite der allgemeinen Sequenz, die nicht in λ-hHGF21 gefunden wurde. Es wurde auch gefunden, daß die Basensequenz von hHGF502, die nicht in der Basensequenz von λ-hHGF21 enthalten war, eine Teilbasensequenz umfaßte, die einer der bereits bestimmten Teileraminosäuresequenz von hHGF entsprach. Es wurde ferner gefunden, daß die gesamte Aminosäuresequenz von hHGF durch Kombination der Basensequenzen dieser beiden Klone in einer solchen Weise abgedeckt wurde, daß die gemeinsamen Teile ihrer Basensequenzen überlappten.
- Fig. 3 zeigt das für die Herstellung eines hHGF- Expressionsplasmids verwendete Schema.
- Nach dem konventionellen Verfahren, beschrieben in "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laborators, S. 93 (1982), wurde Plasmid pUCHGF-1-DNA hergestellt, die ein BamHI-KpnI- Fragment, enthaltend hHGF-cDNA, umfaßte (Biochem. Biophys. Res. Commun., 163(2), 967-973 (1989)). Das BamHI-KpnI- Fragment von ca. 2,3 kb Größe erstreckte sich von der BamHI- Schnittstelle an der 27. Base stromaufwärts des in Startkodons ATG bis zur KpnI-Schnittstelle an der 8. Base stromaufwärts des Stopp-Kodons TAG.
- Die Plasmid-DNA (10 µg) wurde mit KpnI-Restriktionsenzym auf übliche Weise verdaut. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, durch Ethanolpräzipitation gereinigt und in 10 µl Wasser gelöst.
- In die KpnI-Spaltungsstelle des DNA-Fragments wurde ein synthetischer Linker von 32 Basen nach dem Maniatis et al.- Verfahren, beschrieben in "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 369-397 (1982)) eingeführt. Der Linker hatte eine KpnI-Schnittstelle an seinen beiden Enden und enthielt darin ein Stopp-Kodon TGA und eine BamHI- Spaltstelle, wie in Fig. 3 gezeigt.
- Das so modifizierte Plasmid wurde zur Transformation von E. coli auf übliche Weise verwendet. Aus den erhaltenen Transformaten wurde Plasmid-DNA nach dem üblichen Verfahren, wie in "Molekular Cloning", Cold String Harbor laboratory, S. 93 (1982) beschrieben, hergestellt.
- Die Plasmid-DNA (10 µg) wurde mit BamHI-Restriktionsenzym auf übliche Weise verdaut. Die erhaltene Reaktionsmischung wurde einer 1,0%igen Agarosegelelektrophorese unter Isolierung der hHGF-DNA-Fragmente unterworfen, die ATG-Start- und TGA-Stopp- Kodons aus begleitenden unerwünschten DNA-Fragmenten enthielten.
- Aus dem Agarosegel wurde das BamHI-BamHI-DNA-Fragment von ca. 2,3 kb, das für hHGF kodierte, nach dem Maniatis et al.- Verfahren, beschrieben in "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, S. 164 81982), hergestellt. Das DNA- Fragment wurde mit T4-DNA-Polymerase auf übliche Weise unter Formung glatter Enden an seinen beiden Termini behandelt. Das glattgemachte DNA-Fragment wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, durch Ethanolpräzipitation gereinigt und in 10 µl Wasser gelöst.
- Andererseits wurden 0,5 µg Expressionsvektor pKCR, wie in Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 1527 (1981) beschrieben, mit SmaI-Restriktionsenzym unter Bildung glatter Enden auf üblicher Weise verdaut, mit Phenol/Chloroform extrahiert und durch Ethanolpräzipitation gereinigt. Die Vektor-DNA wurde in 400 µl 50 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM Magnesiumchlorid und mit 1 Einheit bakterieller alkalischer Phosphatase (TOYOBO, BAP- 101) 30 Minuten bei 65ºC dephosphoryliert. Das DNA-Fragment wurde dann mit Phenol/Chloroform extrahiert, durch Ethanolpräzipitation gereinigt und in 10 µl Wasser gelöst.
- Das oben hergestellte Vektor-pKCR-DNA-Fragment (0,01 µg) wurde an das glatt endende BamHI-hHGF-cDNA-Fragment (0,1 µg) in Gegenwart von T4-DNA-Ligase (TOYOBO, LGA-101) in 20 µl 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Dithiothreitol, 66 µM ATP bei 14ºC 12 Stunden ligatisiert.
- Die erhaltene Reaktionsmischung (10 µl) wurde zur Transformation von E. coli-HB 101 (Takara Shuzo) gemäß der Beschreibung verwendet. Die Transformanten wurden auf einem Medium, enthaltend 50 µg/ml Ampicillin, kultiviert. Mehrere Dutzend an Ampicillin-resistenten Stämmen wurden erhalten.
- Plasmide aus diesen Stämmen wurden nach dem Maniatis et al.- Verfahren, beschrieben in "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 86-96 (1982), analysiert. Auf diese Weise wurde das Plasmid pKCRHGF-2 erhalten, in das zwei hHGF-Gene in Tandemanordnung in die Smai-Spaltstelle, die zwischen dem Promotor und dem Polyadenylierungssignal im Expressionsvektor pKCR vorlag, eingebaut waren.
- Die Struktur des Plasmids pKCRHGF-2 ist in Fig. 4 gezeigt.
- Nach dem in "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 86-96 (1982) beschriebenen Maniatis et al.- Verfahren wurde das in (1) oben hergestellte Plasmid pKCRHGF- 2, in das zwei hHGF-cDNA-Fragmente in die BamHI-Schnittstelle von pKCR eingefügt worden waren (Proc. Natl. Acad. Sci., 78(2), 1527 (1981)) aus dem rekombinanten E. coli gewonnen und unter Erhalt großer Mengen an HGF-Expressionsplasmid-DNA gereinigt.
- Andererseits wurde Plasmid-pSV2neo-DNA (J. Appl. Genet., 1, 327 (1982)) und Plasmid-pad-D26-1-DNA (J. Molec. Biol., 159, 601 (1982)), die jeweils für einen Marker zur Selektion der Transformanten kodierten, aus rekombinanten E. coli-Stämmen gewonnen, die das entsprechende Plasmid enthielten, und nach dem zuvor erwähnten Maniatis et al.-Verfahren gereinigt.
- Die drei so hergestellten Plasmide wurden zur Co- Transformation von CHO-Zellen nach Ausubel et al.-Verfahren, beschrieben in "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, Chapters 9.1.1 bis 9.1.4 (1987) verwendet.
- Zunächst wurden die CHO-Zellen halb-confluent auf ERDF-Medium (Kyokuto Seiyaku, Japan), das 10 % FCS (fetales Kalbsserum) in einer Petri-Schale mit 9 cm Durchmesser enthielt, kultiviert. Das Medium wurde aus der Schale entfernt und es wurde eine DNA-Lösung zugetropft, die zuvor auf die folgende Weise hergestellt worden war.
- In einem Eppendorf-Zentrifugenröhrchen wurden 300 ml 2x HEBS- Lösung (1,6 % Natriumchlorid, 0,074 % Kaliumchlorid, 0,05 % Dinatriumhydrogenphosphatdodecahydrat, 0,2 % Dextrose, 1 % HEPES (pH 7,05)), 10 µg Expressionsplasmid-DNA, 1 µg pSV2neo- Plasmid-DNA und 1 µg pad-D26-1-Plasmid-DNA zu jede Petri- Schale mit 9 cm Durchmesser zugegeben und es wurde sterilisiertes Wasser auf 570 µ1 Gesamtvolumen zugegeben. Zu der DNA-Lösung wurden 30 µl 2,5 M Kalziumchloridlösung zugetropft, wobei heftig auf einem Vortex-Mischer ein paar Sekunden vermischt wurde. Die erhaltene Mischung ließ man bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen, während mit dem Vortex- Mischer jeweils 10 Minuten gemischt wurde.
- Diese DNA-Lösung wurde zu den halb-zusammenfließenden Zellen in einer Petri-Schale gegeben und man ließ die Zellen bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen. Dann wurden 9 ml ERDF- Medium, enthaltende 10 % FCS, zu der Schale zugegeben, worauf Kultur in Gegenwart von 5 % CO&sub2; bei 37ºC für 4 bis 5 Stunden folgte.
- Die Medien wurden aus der Schale entfernt und die Zellen wurden mit 5 ml 1xTBS++-Lösung (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 140 mM Natriumchlorid, 5 mM Kaliumchlorid, 0,6 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 0,08 mM Kalziumchlorid, 0,08 mM Magensiumchlorid) gewaschen. Nach Entfernen der 1xTBS++- Lösung wurden 5 ml 1xTBS++-Lösung, enthaltend 20 % Glycerin, zu den Zellen zugegeben. Man ließ die Zellen bei Raumtemperatur 1 bis 2 Minuten stehen. nach Entfernen des Überstands wurden die Zellen noch einmal mit 5 ml 1xTBS++- Lösung gewaschen. Anschließend wurden 10 ml ERDF-Medium, enthaltend 10 % FCS, zu der Petri-Schale zugegeben, worauf Kultur in Gegenwart von 5 % CO&sub2; bei 37ºC folgte.
- Nach 48 Stunden wurde das Medium aus den Schalen entfernt und die Zellen wurden mit 5 ml 1xTBS++-Lösung gewaschen. Dann wurden 2 ml Trypsin-EDTA-Lösung (Sigma) zu den Zellen zugegeben und man ließ die Mischung bei Raumtemperatur 30 Sekunden stehen. Die Trypsin-EDTA-Lösung wurde dann aus den Schalen entfernt. Nach 5 Minuten wurden 10 ml ERDF- Medium, enthaltend 10 % FCS zu der Schale zugegeben, um die Zellen abzustreifen. Die kultivierten Zellen von einer Petri- Schale mit 9 cm Durchmesser wurden in 10 Teile geteilt und jeder Teil wurde auf eine Petri-Schale mit 9 cm Durchmesser gegeben. G418-Sulfat (GENETICIN, GIBCO) wurde zu jeder Schale bis 200 µg/ml zugegeben und die Zellen wurden weiter kultiviert.
- 10 Tage später wurden die überlegenden G418-resistenten Zellen isoliert und in Wells einer 24-Well-Kulturplatte verteilt, wobei jedes Well 3,1 M², enthaltend 1 ml ERDF- Medium + 10 % FCS, betrug, worauf weitere Kultur für ca. 7 Tage folgte.
- Das Medium wurde durch FCS-freies ERDF-Medium ersetzt und die Kultur wurde weitere 72 Stunden fortgesetzt. Dann wurden 2 ml Medium aus jedem Well entnommen und auf 50 µl durch Centricon (Millipore) konzentriert. Ca. 15 µl der Probe wurde einer Gelelektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgel unterzogen.
- Diese Proben wurden nach dem konventionellen Western- Blotting-Verfahren unter Bestätigung der Expression des hHGF- Proteins analysiert. Das Vorliegen biologischer Aktivität wurde ebenfalls durch Messen von hHGF-Aktivität nach dem Gohda et al.-Verfahren, beschrieben in Exp. Cell Res., 166, 139-150 (1986), bestätigt.
- Ferner wurden die erhaltenen Zellen aus jedem Well isoliert und es erfolgte quantitative Messung von hHGF-Protein durch einen Enzymimmuntest. Die Menge an exprimiertem hHGF wurde in B-1-, B-27- und B-102-Zellen bestimmt, welche eine signifikant große Menge an Protein lieferten.
- Plasmid-DNAS des oben in (1) hergestellten Expressionsvektors pKCRHGF-2 und pMBG, kodierend für Mycophenolsäureresistenz als Marker zur Selektion der Transformanten (Nature, 294, 228 (1981)) wurden aus rekombinanten E. coli-Stämmen, die das entsprechende Plasmid enthielten, nach dem zuvor erwähnten Maniatis et al.-Verfahren gewonnen und gereinigt.
- Die erhaltenen beiden Plasmide wurden wiederum zur Co- Transformation von jedem dieser Zellen B-1, B-27 und B-102 verwendet, die in Beispiel 2 (II) isoliert waren und zu einer stabilen Expression einer großen Menge von hHGF nach Passagen in der Lage waren, nach dem Ausubel et al.-Verfahren, beschreiben in "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, Chapters 9.1.1 bis 9.1.4 (1987).
- Zunächst wurden die hHFG-exprimierenden Zellen bis zur Halbkonfluenz in ERDF-Medium, enthaltend 10 % FCS in einer Petri-Schale von 9 cm Durchmesser kultiviert. Dann wurde das Medium aus der Schale entfernt und es wurde die DNA-Lösung zugetropft, die zuvor auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 (II) hergestellt worden war, mit Ausnahme, daß 10 µg pKCRHGF- 2-Plasmid-DNA und 1 µg pMBG-Plasmid-DNA verwendet wurden.
- Diese DNA-Lösung wurde zu den halbkonfluenten Zellen in der Petri-Schale zugegeben und man ließ die Zellen bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen. Dann wurden 9 ml ERDF- Medium, enthaltend 10 % FCS zu der Schale zugegeben, worauf Kultur in Gegenwart von 5 % CO&sub2; bei 37ºC für 4 bis 5 Stunden folgte.
- Das Medium wurde aus den Schalen entfernt und die Zellen wurden mit 5 ml 1xTBS++-Lösung gewaschen. Nach Entfernen der 1xTBS++-Lösung wurden 5 ml 1xTBS++-Lösung, enthaltend 20 % Glycerin, zu den Zellen zugegeben. Man ließ die Zellen bei Raumtemperatur 1 bis 2 Minuten stehen. Nach Entfernen des Überstands wurden die Zellen wiederum mit 5 ml 1xTBS++-Lösung gewaschen. Anschließend wurden 10 ml ERDF-Medium, enthaltend 10 % FCS, zu der Petri-Schale zugegeben, worauf Kultur in Gegenwart von 5 % CO&sub2; bei 37ºC folgte.
- Nach 48-stündiger Kultur wurde das Medium aus der Schale entfernt und die Zellen mit 5 ml 1xTBS++-Lösung gewaschen. Dann wurden 2 ml Trypsin-EDTA-Lösung (Sigma) zu den Zellen zugegeben und man ließ die Mischung bei Raumtemperatur 30 Sekunden stehen. Die Trypsin-EDTA-Lösung wurde dann von der Schale entfernt. Nach 5 Minuten wurden 10 ml alpha- MEM(-)-Medium, enthaltend 10 % FCS zu der Schale zugegeben, um die Zellen abzustreifen. Die kultivierten Zellen einer Petri-Schale mit 9 cm Durchmesser wurden in 10 Portionen geteilt und jede Portion wurde in eine Petri-Schale mit 9 cm Durchmesser gegeben. Es wurden Mycophenolsäure (Sigma) und Xanthin (Sigma) zu jeder Schale bis zu 1 µg/ml und 250 µg/ml zugegeben, und die Zellen wurden weiter kultiviert.
- 10 Tage später wurden die überlegenden Mycophenolsäureresistenten Zellen isoliert und in Wells einer 24-Well- Kulturplatte verteilt, jedes Well zu 3,1 cm², welches 1 ml ERDF-Medium + 10 % FCS enthielt, worauf weitere Kultur für ca. 7 Tage folgte.
- Das Medium wurde durch FCS-freies ERDF-Medium ersetzt und die Kultur weitere 72 Stunden fortgesetzt. Dann wurden 2 ml des Mediums aus jeden Well gewonnen und auf 50 µl durch Centricon (Millipore) konzentriert. Ca. 15 µl der Probe wurden einer Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgel unterzogen.
- Die Proben wurden durch konventionelles Western-Blotting- Verfahren zur Bestätigung der Expression des hHGF-Proteins analysiert. Das Vorliegen der biologischen Aktivität wurde ebenfalls durch Messen von hHGF-Aktivität nach dem Gohda et al.-Verfahren, beschrieben in Exp. Cell Res., 166, 139-150 (1986) bestätigt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt.
- Ferner wurden einige der erhaltenen Zellen isoliert und die Menge an exprimiertem hHGF-Protein durch Enzymimmuntest gemessen. Es wurden doppelt-transformierte BF-24-Zellen erhalten, die eine Menge an exprimierten hHGF zeigten, welche 20-fach von der zu einfach-transformierten B-102-Zellen war.
- Die hHGF-produzierende Zelle BD-24, hergestellt in Beispiel 3, wurde in ERDF-Medium, enthaltend 10 % FCS, kultiviert. Der Überstand (500 ml) wurde auf einer mit 10 ml 5-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) gefüllten Säule adsorbiert. Die Proteine wurden unter Verwendung von 10 mM Natriumphoshat-haltigen Puffer (pH 7,5) mit sich erhöhenden Konzentrationen von Natriumchlorid darin, eluiert. Rekombiniertes hHGF-Protein wurde mit ca. 0,7 M Natriumchlorid eluiert.
- Diese hHGF-Fraktion wurde durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese analysiert, welche eine breite Bande mit Molekulargewichten von ca. 76 000 bis 92 000 unter nicht- reduzierenden Bedingungen, und andererseits eine breite Bande von ca. 60 000 bis ca. 65 000 und eine schwache Bande von ca. 56 000 unter reduzierenden Bedingungen lieferte, welches der H-Kette des hHGF-Proteins entsprach, und ferner zwei Banden mit Molekulargewichten von ca. 32 000 bis 35 000 ergab, welche der L-Kette von hHGF-Protein entsprachen. Diese Bandenmultiplizität und -breite kann aus der Heterogenität der glycosylierten Zuckerketten auf dem hHGF-Protein herrühren.
- Der Puffer der gereinigten hHGF-Proteinlösung wurde durch 0,1 M wäßrige Ammoniumbicarbonatlösung ersetzt. Diese Lösung wurde mit einem 1/50 Volumen von Staphylococcus aureus-V8- Protease (Miles Laboratory) vermischt und bei 37ºC über Nacht unter Gewinnung einer Peptidmischung inkubiert. Diese Mischung wurde einer Umkehrphasen- Hochdruckflüssigchromatggraphie unter Verwendung einer C8- Säule unterzogen (Bakerbond, 4,6 x 250 mm), während die Acetonitrilkonzentration von 0 % auf 60 % mit einer Rate von 1 % pro Minute erhöht wurde.
- Ca. 10 eluierten Peptidpeaks wurden einer Aminosäureanalyse unterzogen, welche zeigte, daß der Peak, der bei ca. 18 Minuten eluierte, die in der folgenden Tabelle gezeigte Aminosäurezusammensetzung hatte. TABELLE Aminosäurezusammensetzung
- Die in der Tabelle gezeigte Zusammensetzung fällt im wesentlichen mit der theoretischen Zusammensetzung eines Peptids zusammen, das sich von der 32sten Glutamin- bis zum 41sten Glutaminsäure erstreckt, wie aus dem Methionin berechnet, in der Aminosäuresequenz (Fig. 1), abgeleitet von der Basensequenz der cDNA, welche für hHGF kodiert (Fig. 2).
- Dieses Peptid wurde durch "fast-atom-bombardment"- Massensprektroskopie (NIHON DENSHI, Japan, Modell HX-100) analysiert. Es wurde ein Peak bei einer Messung von 1321 gefunden, was darauf hindeutete, daß das Peptid ein Molekulargewicht von 1320 hatte. Da das theoretische Molekulargewicht des sich vom 32sten Glutamin bis zum 41sten Glutaminsäure erstreckende Peptid 1337 der Aminosäuresequenz, in Fig. 1 gezeigt, ist, kann daraus geschlossen werden, daß das Amino-terminale Glutamin dieses Peptids durch die Deaminierung in Pyroglutaminsäure umgewandelt wurde.
- Daher wurde gefunden, daß die N-terminale Aminosäure des ausgeschiedenen hHGF-Proteins Pyroglutaminsäure ist, die aus der 32sten Aminosäureglutamin in der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz abgeleitet ist.
Claims (23)
1. Hepatischer parenchymaler Zellwachstumsfaktor,
dargestellt durch die folgende Aminosäuresequenz:
2.
Hepatischer parenchymaler Zellwachstumsfaktor,
dargestellt durch die folgende Aminosäuresequenz, die
sich von der 30sten Glutaminsäure bis zum letzten Serin
in der in Anspruch 1 definierten Sequenz erstreckt:
3.
Hepatischer parenchymaler Zellwachstumsfaktor,
dargestellt durch die folgende Aminosäuresequenz, die
sich von der 32sten Glutaminsäure bis zum letzten serin
in der in Anspruch 1 definierten Sequenz erstreckt:
4. Hepatischer parenchymaler Zellwachstumsfaktor,
dargestellt durch die folgende Aminosäuresequenz, worin
X Pyroglutaminsäure bedeutet:
5. DNA, kodierend für hepatischen parenchymalen
Zellwachstumsfaktor, dargestellt durch die
Aminosäuresequenz definiert in Anspruch 1.
6. DNA, kodierend für hepatischen parenchymalen
Zellwachstumsfaktor, dargestellt durch die
Aminosäuresequenz definiert in Anspruch 2.
7. DNA, kodierend für hepatischen parenchymalen
Zellwachstumsfaktor, dargestellt durch die
Aminosäuresequenz definiert in Anspruch 3.
8. DNA, kodierend für hepatischen parenchymalen
Zellwachstumsfaktor, welche durch die folgende
Basensequenz dargestellt wird:
9. DNA,
kodierend für hepatischen parenchymalen
Zellwachstumsfaktor, die dargestellt wird durch die
folgende Basensequenz, die sich vom 88sten Guanin bis
zum letzten Guanin in der in Anspruch 8 definierten
Sequenz erstreckt:
10. DNA, kodierend für hepatischen parenchymalen
Zellwachstumsfaktor, die durch die folgende Basensequenz
dargestellt wird, die sich vom 94sten Cytosin bis zum
letzten Guanin in der in Anspruch 8 definierten Sequenz
erstreckt:
11. Expressionsvektor&sub1; welcher eine DNA umfaßt, die für
humanen hepatischen parenchymalen Zellwachstumsfaktor
kodiert, dargestellt durch die Aminosäuresequenz,
definiert in Anspruch 1.
12. Expressionsvektor, welcher eine DNA umfaßt, die für
humanen hepatischen parenchymalen Zellwachstumsfaktor
kodiert und durch die Basensequenz, definiert in
Anspruch 8, dargestellt ist.
13. Expressionsvektor pKCRHGF gemäß Fig. 4, erhältlich durch
Einbau von zwei HGF-Genen in Tandemanordnung in die
SmaI-Spaltstelle, die zwischen dem Promotor und dem
Polyadenylierungssignal und dem Expressionsvektor pKCR
vorliegt.
14. Verfahren zur Herstellung von humanem hepatischem
parenchymalem Zellwachstumsfaktor, umfassend die
Transformation einer Wirtszelle mit dem
Expressionsfaktor wie in Anspruch 11 definiert, und
Kultur der erhaltenen Transformante.
15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die
Transformationsverfahren wiederholt werden.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, worin die Wirtszelle
eine tierische Zelle ist.
17. Verfahren zur Herstellung von humanem hepatischem
parenchymalem Zellwachstumsfaktor, umfassend die
Transformation einer Wirtszelle mit dem
Expressionsvektor wie in Anspruch 12 definiert, und
Kultur der erhaltenen Transformanten.
18. Verfahren nach Anspruch 17, worin die
Transformationsverfahren wiederholt werden.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, worin die Wirtszelle
eine tierische Zelle ist.
20. Tierische Zelle, die mit einem Expressionsvektor nach
Anspruch 11, 12 oder 13 transformiert wird, und humanen
hepatischen parenchymalen Zellwachstumsfaktor
produziert.
21. Tierische Zelle nach Anspruch 20, die durch wiederholte
Transformation wie in Ansprüchen 15 oder 18 erhalten
wird.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch
gekennzeichnet, daß sie einen hHGF nach
einem der Ansprüche 1 bis 4 zusammen mit einem
pharmazeutisch verträglichen Verdünner oder Exzipienten
enthält.
23. Verwendung von hHGF nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur
Herstellung eines Pharmazeutikums.
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