DD279687A5 - Verfahren zur herstellung von erythropoietin - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin, die als Arzneimittel angewandt werden. Mit der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin bereitgestellt. Aufgabe der Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin zur Verfuegung zu stellen. Erfindungsgemaess wird so verfahren dass Wirtszellen in einem entsprechenden Medium gezuechtet werden, die eine wie im wesentlichen in Abb. 3 B dargestellte DNA-Sequenz enthalten, die wirksam an eine Expressions-Kontrollsequenz gebunden ist und das auf diese Weise von den Zellen und dem Medium produzierte Erythropoietin abgetrennt wird.

Description

Hierzu 45 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin. Dieses wird als Arzneimittel angewandt, beispielsweise zur Behandlung von Anämie.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung klonierte Gene des menschlichen Erythropoietins, die hohe Expressionsraten liefern, die Expression der genannten Gene und dio In-vitro- Produktion des menschlichen Erythropoietins.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Erythropoietin (im folganden als EPO abgekürzt) ist ein zirkulierendes Glycoprotein, das die Erytl rozytenbildung in höheren Organismen stimuliert (vgl. Carnot et al. Comgst. Rend. 143,384 [15061). Deshalb wird EPO manchmal auch als Elektropoesestimulierender-Faktor bezeichnet.

Die Lebenszeit von menschlichen Erythrozyten beträgt ungefähr 120 Tage. Dies bedeutet, daß ungefähr V120 der gesamten Erythrozyten täglich im reti-kulocudothelialen-System zerstört werden, gleichzeitig wird eine relativ konstante Anzahl von Erythrozyten täglich produziert, um die Konzentration von Erythrozyten konstant zu halten (Guyton, Textbcok of Medical Physiclocy, S.56-60, W.B.SaundersCo., Philadelphia 1976).

Erythrozyten werden bei der Reifung und Differenzierung der Erythroblasten im Knochenmark gebildet. EPO ist ein Faktor, der auf weniger differenzierte Zellen wirkt und deren Differenzierung zu Erythrozyten induziert (Guyton, s.o.). EPO ist ein vielversprechendes therapeutisches Mittel für die klinische Behandlung von Anämie oder im speziellen von renaler Anämie. Der Gebrauch von EPO ist leider in der praktischen Therapie aufgrund seiner geringen Verfügbarkeit noch nicht geläufig.

Um EPO als therapeutisches Mittel anwenden zu können, sollte Rücksicht auf die mögliche Antigenwirkung genommen werden, und deshalb sollte EPO vorzugsweise aus Rohmaterial menschlichen Ursprungs hergestellt werden. Beispielsweise können menschliches Blut oder Urin von Patienten verwendet werden, die an aplastischer Anämie oder ähnlichen Krankheiten leiden und hohe Mengen an EPO ausscheiden. Diese Rohmaterialien jedoch sind nur in begrenzter Menge verfügbar (vgl.

beispielsweise White et al., Rec. Progr. Horm. Res. 16,219 [19601; Espada et al., Biochem. Med. 3,475 [19701; Fisher, Pharmacol.

Rev. 24,459 [1972] und Gordon, Vitam. Horm. (N. Y.) 31,105 [19731).

Die Herstellung von EPO-Produkten erfolgte im allgemeinen durch Konzentrierung und Reinigung von Urin von Patienten mit hohem EPO-Spiegel, die beispielsweise an aplastischer Anämie oder ähnlichen Krankheiten leiden (vgl. US-PS 4.397.840, 4.303.650 und 3.865.801). Die begrenzte Verfügbarkeit von solchem Urin ibt ein Hindernis für die praktische Verwendung von EPO. Deshalb ist es wünschenswert, EPO-Proriukte aus dem Urin von gesunden Menschen herzustellen. Das Problem bei der Verwendung von Urin von gesunden Menschen liegt in dem geringen Gehalt von EPO im Vergleich zu dem von anämischen Patienten. Zusätzlich enthält der Urin von gesunden Menschen gewisse Inhibierungsfaktoren, die in ausreichend hohen Konzentrationen gegen Elektropoese wirken, so daß ein befriedigender therapeutischer Effekt nur nach gründlicher Reinigung des EPO erhalten werden kann.

EPO kann ebenfalls aus dem Blutplasma von Schafen erhalten werden. Die Trennung von EPO aus dem Blutplasma ergibt ausreichend starke und stabile wasserlösliche Präparationen (vgl. Goldwasser, Control Cellular Dif. Develop., Part A, S.487-494, Alan R. Liss, Inc., N. Y. [1981]). EPO von Schafen jedoch könnte im Menschen eine Antigen-Wirkung besitzen.

Obwohl EPO ein wünschenswertes therapeutisches Mittel darstellt, sind die bisherigen Isolierungs- und Reinigungstechnikcn aus natürlichen Quellen für eine Massenproduktion dieser Verbindung nicht angemessen. Sugimoto et al. beschreiben im US·PS 4.377.513 eine Methode für die Massenproduktion von EPO, die die In-vivo-Vermehrung von menschlichen lymphoblastischen Zellen, wie Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1, und IBL umfaßt.

Die Produktion von EPO über andere gentechnologische Methoden ist in der Literatur beschrieben. Jedoch ist weder eine vollständige Enthüllung noch die chemische Natur des Produktes bisher veröffentlicht. Die vorliegende Anmeldung liefert die vollständige Enthüllung für die Massenproduktion von Proteinen und zeigt die biologischen Eigenschaften der Proteine und des menschlichen EPO auf. Durch solche Techniken ist es ebenso möglich, Proteine zu produzieren, die sich chemisch vom authentischen menschlichen EPO unterscheiden, jedoch ähnliche (und in manchen Fällen bessere) Eigenschaften aufweisen. Solche Proteine, die biologische Eigenschaften von menschlichem EPO aufweisen, sollen im folgenden als EPO bezeichnet werden, unabhängig davon, ob sie chemisch mit EPO identisch sind oder nicht.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von Erythropoietin.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin zur Verfügung zu stellen. Die geeigneten Eypressionsvektoren für die Produktion von EPO, Expressionszellen, Reinigungsschemata und damit verwandte Prozesse werden erfindungsgemäß beschrieben.

Ein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen cDNA-Klons, der biologisch aktives Erythropoietin exprimiert, ist dadurch gekennzeichnet, daß

a) gereinigtes Erythropoietin-Protein durch Trypsin verdaut wird.

Erfindungsgemäß wird in der Weise vorfahren, daß Wirtszellen in einem entsprechenden Medium gezüchtet werden, die eine wie im wesentlichen in Abb. 3 B dargestellte DNA-Sequenz enthalten, die wirksam an eine Expressions-Kontrollsequenz gebunden ist und das auf diese Weise von den Zellen und dem Medium produzierte Erythropoietin abgetrennt wird. Bevorzugt wird so verfahren, daß eukaryontische Wirtszellen in einem entsprechenden Medium gezücr '.et werden, die eine wie im wesentlichen in Abb.4C dargestellte DNA-Sequenz enthalten, die wirksam an eine Expressions-Kontrollsequenz gebunden ist, und das auf diese Weise von den Zellen und dem Medium produzierte Erythropoietin abgetrennt wird. Erfindungsgemäß sind die Wirtszellen Säugerzellen, beispielsweise 3T3-Zellen oder Ovarien-Zellen des Chinahamsters (CHO). Weiterhin ist erfindungsgemäß die betreffende DNA-Sequenz in einem Vektor beinhaltet, der auch die Rinder-Papilloma-Virus-DNA enthält.

Wie im folgenden näher beschrieben wird, wurde EPO in teilweise gereinigter Form erhalten, vollständig gereinigt und mit Trypsin verdaut, um spezifische Fragmente zu erzeugen. Diese Fragmente wurden gereinigt und sequenziert. Aus diesen Sequenzen wurden EPO-Oligonucleotide zugeordnet und synthetisiert. Diese Oligonucleotide wurden zum Screening einer menschlichen Genkartei benutzt, aus der ein EPO-Gen isoliert wurde.

Die Richtigkeit des EPO-Gens wurde aufgrund seiner DNA-Sequenz, die mit vielen sequenzierten tryptischen Protein-Fragmenten übereinstimmte, festgestellt. Ein Teil des genomischen Klons wurde dann verwendet, um durch Hybridisierung zu zeigen, daß EPO in menschlicher fötaler, 20 Wochen alter mRNA nachgewiesen werden konnte. Eine cDNA-Bibliothek der menschlichen fötalen Leber wurde aufgestellt und im Screening-Vertahren getestet. Drei EPO-cDNA-Klone wurde erhalten (nach dem Screening von 750000 Rekombinanten). Zwei dieser Klone besaßen die volle Länge, wie aus der kompletten Codierungssequenz und der im wesentlichen unübersetzten Sequenz des 3'- und 5'-Endes gefolgert wurde. Diese cDNA wurde sowohl in SV-40 virustransformierten Mfenzellen (COS-1-Zellinie; Gluzam, Cell 23,175-182 [1981]) und in Ovarien des Chinahamsters (CHO-Zellinie; Urlaub G. und Chasin L.A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77,4216-4230 (1980)) exprimiert. Das von COS-Zellen produzierte EPO ist In-vitro und In-vivo biologisch aktives EPO. Das von CHO-Zellen produzierte EPO ist In-vitro biologisch aktiv und wurde In-vivo nicht getestet.

Der EPO-cDNA-Klon hat einen interessanten offenen Ableserahmen von 14-15 Aminosäuren (aa) mit Initiator und Terminator von 20-30 Nucleotiden (nt) oberhalb der Codierungsregion. Eine repräsentative mit dem klonierten EPO-Gen transfektierte Probe von E.coli wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinkriegt, und ist unter der Zuordnungsnummer ATCC 40153 erhältlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Abbildung 1: stellt sie Basissequenz eines Exons von 87 Basenpaaren des menschlichen EPO-Gens dar.

Abbildung 2: zeigt den Nachweis des EPOmRNA in der menschlichen fötalen Leber-mRNA.

Abbildung 3a: zeigt die Aminosäuresequenz eines EPO-Proteins, die von der Nucleotidsequenz von Lambda-HEPOFL 13

abgeleitetwurde

Abbildung 3 b: zeigt die Nucleotidsequenz der EPO-cDNA in Lambda-HEPOFL 13 und die davon abgeleitete

Aminosäuresequenz

Abbildung 4a: zeigt die relativen Positionen von DNA-Einschüben von vier unabhängigen menschlichen

EPO-Genomklonen.

Abbildung 4 b: zeigt eine Karte der aparentsn Intron- und Exonstrukturen des menschlichen EPO-Gens.

Abbildung 4c: zeigt eine DNA-Sequenz des EPO-Gens, das in Abbildung 4b dargestellt ist.

Abbildung bc, 5b

und 5c: zeigen die Konstruktion des Vektors 91023 (B).

Abbildung 6: zeigt die SDS-Polyacrylamidgel-Analyse des in COS-1 -Zellen produzierten EPO im Vergleich zum

nativenEPO.

Abbildung 7: zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenz des EPO-Klons, Lambda-HEP0FL6.

Abbildung 8: zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenz des EPO-Klons Lambda-HEPOFLB. -

Abbildung 9: zeigt die Nuci jotid- und Aminosäuresequenz des EPO-Klons Lambda-HEPOFL 13.

Abbildung 10: zeigt eine schematische Darstellung des Plasmides pRKL-4.

Abbildung 11: zeigt eine schematische Darstellung des Plasmides pdBPV-MMTneo (342-12).

Nähere Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Klonierung von EPO-Genen und die Produktion von EPO durch die In-vitro-Expression dieser Gene.

Die Patentliteratur und die wissenschaftliche Literatur sind überfüllt mit Prozess .en, die für dio Pi crib tion von rekombinanten Produkten anwendbar sind. Diese Techniken enthalten im allgemeinen die i-oliprung oder Synthese der gewünschten Gensequenz und die Expression dieser Sequenz in prokaryontischen oder eu.veryor.tinchen Zellen, indem die vom Fachmann üblichen Techniken angewendet werden. Sobald oin bestimmtes Gen i l^!s. t, goi einigt und in einen Transfer-Vektor inseriert (d.h. kloniert) wurde, ist seine Verfügbarkeit in größeren Mengen sicneit M. (Jer Vektor wird mit seinem klonierten Gen in einen passenden Mikroorganismus oder eine Zellinie transferiert, z. B. in Lakteri°n ! (efe, Säugerzellen, wie z. B. COS-1 (Affenniere), CHO (Ovarium des Chinahamsters), Zellinien von Insekten, und dnr^'eichen, in denen der Vektor repliziert wird, sobald der Mikroorganismus oder die Zellinie sich vermehrt, und "cn de. .en der V ;ktor durch konventionelle Methoden isoliert werden kann.

Auf diese Weise wird eine kontinuierlich erneuerbare Quelle des Gens geliefert und damit weitere Manipulationen, Modifikationen und der Transfer zu anderen Vektoren oder anderen Orten innerhalb des gleichen Vektors er !vöglicht. Die Expression kann oft erreicht werden durch Transfer des klonierten Gens (in korrekter Richtung und Ableserahmen) in die entsprechende Stelle eines Transfervektors, so daß die Übersetzung von einem prokaryontischen oder eukaryontischen Gen zu der Synthese eines Protein-Precursors führt. Damit ist die Aminosäuresequenz mitumfaßt, die vom klonierten Gen kodiert wird, das an Methionin oder an einer aminoterminalen Sequenz des prokaryontischen oder eukaryontischen Gens angeknüpft ist. In anderen Fällen können die Signale für die Initiierung der Transkription und Translation durch ein entsprechendes Genomfragment des klonierten Gens geliefert werden. Eine Vielzahl von spezifischen Proteinspaltungstechniken kann angewendet werden, um den Protein-Precursor an einem gewünschten Punkt zu spalten, um so die gewünschte Aminosäuresequenz abzuspalten, die dann durch konventionelle Methoden gereinigt werden kann. In einigen Fällen wird das Protein, das die gewünschte Aminosäuresequenz enthält, ohne die Notwendigkeit spezifischer Spaltungstechniken produziert und kann somit auch von Zellen in das extrazelluläre Nahrmedum abgegeben werden.

Isolierung eines Genklons des menschlichen EPO

Menschliches EPO wurde aus Urin von Patienten mit aplastischer Anämie in hochreiner Form isoliert, wie im folgenden beschrieben wird. Dieses gereinigte EPO wurde durch Trypsin vollständig verdaut. Dabei wurden Fragmente erhalten, die durch reversed-phase-HPLC getrennt wurden. Aus den Gradient-Fraktionen wurden die einzelnen Fragmente gewonnen und der Mikroanalyse unterworfen. Die Sequenzen der typtischen Fragmente sind in Abbildung 3 unterstrichen und werden im folgenden näher diskutiert. Zwei der Aminosäuresequenzen, Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys und Val-Tyr-Asn-phe-Leu-Arg wurden für die Konstruktion von Oligonucleotidproben ausgewählt (dies ergibt einen 17 Nucleotide langen und 32fach entarteten Pool von Oligonucleotiden bzw. einen 18 Nucleotide langen und 128fach entarteten Pool von Oligonucleotiden, aus den früheren tryptischen Fragmenten, sowie zwei 14 Nucleotide lange, jeweils 48fach entarteten Pools aus den letzteren trypischen Fragmenten). Der 32fach entartete 17-rner-Pool wurde verwendet für das Screening einer menschlichen Genom-DNA-Bibliothek in einem Ch4A-Vektor (22), indem für die Herstellung der Filter für das Screening eine Modifizierung des Woo-und-O'Malley-insitu-Verstärkungsverfahrens (47) angewendet wurde.

Die im Text verwendeten arabischen Nummern (1)—(61) beziehen sich auf die Publikationen, die am Ende dieser Anmeldung in numerischer Reihenfolge aufgelistet sind.

Die Phagen, welche mit den 17-mer-Nucleotiden hybridisieren, wurden gesammelt, in kleine Gruppen zusammengegeben und mit den 14-mer-und 18-mer-Pools überprüft. Die Phagen, welche mit den 17-mer-, 18-mer-und 14-mer-Pools hybridisieren, wurden mittels der Plaque-Technik gereinigt und Fragmente wurden in M 13-Vektoren subkloniert für die Sequenzierung mittels der Dideoxy-Kettenterminierungs-Methode von Sanger und Coulson (23) (1977). Die Sequenz der Region, die mit dem 32fach entarteten 17-mer-Nucleotid in einem der Klone hybridisiert, ist in Abbildung 1 dargestellt. Diese DNA-Sequenz enthält innerhalb eines offenen Ableserahmens die Nucleotide, die genau das tryptische Fragment codieren konnten, das für die Ableitung des 17-mer-Pools der Oligonucleotide verwendet wurde. Weiterhin zeigt die Analyse der DNA-Sequenz, daß die 17-mer-Hybridiserungsregion innerhalb eines 87-bp-Exons enthalten war, das durch potentielle Spleißakzeptoren und Donorstellen eingegrenzt war. Die positive Bestätigung, daß diese beiden Klone (im folgenden als Lambda-HEP01 und Lambda-HEPO 2 bezeicl.net) EPO-Genomklone sind, wurde durch Sequenzierung zusätzlicher Exons erhalten, die weitere Code-Informationen beinhalten, die über tryptische Fragmentierung gewonnen wurden.

Isolierung von EPO-cDNA-Klonen

Die Northern-Analyse (56) menschlicher fötaler (20 Wochen alter) Leber-mRNA wurde durchgeführt, indem eine 95 nucleotidlange einsträngige Probe verwendet wurde, die aus einem M 13-Klon hergestellt wurde, der ein Teil des in Abbildung 1 beschriebenen 87-bp-Fxons enthäit. Wie in Abbildung 2 gezeigt ist, konnte ein starkes Signal in fötaler Leber-mRNA entdeckt werden. Die genaue Identifizierung dieser Bande als EPO-mRNA gelang, indem die gleiche Probe für das Screening der Bakteriophagen-Lambda-cDNA-ßibliothek der fötalen Leber-mRNA verwendet wurde (25). Mehrere Hybridisierungsklone wurden mit einer Häufigkeit von ungefähr 1 pro 250000 Rekombinanten erhalten. Die kompletten Nucleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenzen für die^e Klone (Lambda-HEPOFL 13 und Lambda-HEPOFL8) sind in den Abbildungen 7 und 8 dargestellt. Die EPO-codierende Information ist innerhalb 594 Nucleotiden in der 5'-Hälfte der cDNA en'halten, die ein sehr hydrophobes, 27 Aminosäuren langes Anfangsstück und das fertige Protein mit einer Länge von 166 Aminosäuren beinhalten. Die Zuordnung des N-Terminus des fertigen Proteins beruht auf der N-terminalen Sequenz des Proteins, das im Urin von Personen mit aplastischer Anämie ausgeschieden wird (vgl. Abbildung 1; Goldwasser [26], Sue and Sytkowski |27] und

Yanagawa [21 ]). Ob dieser N-Terminus (Ala-Pro-Pro-Arg ) den aktuellen N-Terminus des zirkulierenden EPO darstellt, oder

ob Spaltungen in der Leber oder im Urin stattfinden, ist zur Zeit unbekannt. Die Aminosäuresequenzen, die in Abbildung 3 unterstrichen sind, weisen auf diejenigen tryptischen Fragmente odei Teile des N-Terminus hin, für die die Proteinsequenz eri>; 'ten wurde. Die abgeleitete Aminosäuresequenz stimmt exakt mit den tryptischen Fragmenten überein, die sequenziert wurden, womit bestätigt wird, daß die isolierten Gene menschliches EPO codieren.

Struktur und Sequenz von menschlichen EPO-Genen

Die Abbildung 4a zeigt die relativen Positionen von DNA-Einschüben von 4 unabhängigen menschlichen EPO-Genomklonen. Hybridisierungsanalysen von diesen Monierten LNA's mit Oligonucleotidproben und mit verschiedenen Proben, die von zwei verschiedenen Klassen der EPO'cDNA-Klonen hergestellt wurden, belegen die Position des EPO-Gens schätzungsweit," innerhalb der 3,3kb-Region, wie in Abbildung 4a durch die dunklen Linien gezeigt wird. Vollständige Sequenzanalysen von dieser Region (vgl. Beispiel 4) und Vergleich mit den cDNA-Klonen ergeben die Karte der Intron- und Exonstrukturen der EPO-Gene (vgl. Abbildung 4b). Das EPO-Gen ist in fünf Exons unterteilt. Ein Teil von Exon I, die gesamten Exons II, III und IV und ein Teil von Exon V enthalten die Proteincodierungsinformation. Der Rest von Exon I und V codiert die 5'- und 3'-unübersetzten Sequenzen.

Vorübergehende Expression von EPO in COS-Zellen

Um zu zeigen, daß biologisch aktives EPO in einem In vitro-Zellkultursystem exprimiert werden kann, wurden COS-Zellexpressionsstudien durchgeführt (58). Der Vektor p91023(B), der für die vorübergehenden Studien verwendet wurde, ist in Beispiel 5 beschrieben. Dieser Vektor enthält den Adenovirus-major-late-Promotor, eine SV40-Polyadenylierungs-Sequenz, einen SV40-Ursprung der Replikation, einen SV40-Enhancer und das Adenovirus-VA-Gen. Der cDNA-Einschub Lambda-HEPOFL13 (vgl. Abbildung 8) wurde ir einen p91023(B)-Vektor inseriert, unterhalb des Adenovirus-major-late-Promotors. Dieser neue Vektor wird als pPTFL 13 identifiziert.

24 Stunden nach derTransfektion dieser Konstruktion in den M6-Stamm von COS-1-Zellen (Horowitz et al., J. Mol. Appl. Genet. 2, 147-149 [1983)) wurden die Zellen gewaschen und das Medium gegen serumfreies Medium ausgetauscht. Die Zellen werden 48 Stunden später geerntet. Der Grad der Abgabe von EPO in den Kulturüberstand wurde dann mit Hilfe eines quantitativen Radioimunoassays für EPO (55) untersucht. Wie Tabelle 1 (Beispiel 6) zeigt, wurde immunologisch reaktives EPO exprimiert. Die biologische Aktivität des EPO, das von COS-1 -Zellen erzeugt wurde, wurde ebenfalls untersucht. In einem getrennten Experiment wurde der Vektor, der l:PO-cDNA von Lambda-HEP0FL13 enthält, in CCS-1-Zellen transfektiert und die Medien, wie oben beschrieben, geernte'.. EPO wurde dann im Medium quantitativ durch einen von zwei in vitro biologischen Assays bestimmt, ³H-Trymidin und CFJ-E (12,29), und durch einen der beiden In-vivo-Assays (bei hypoxischen Mäusen und bei hungernden Ratten [30,31 ]) (vgl. Tabelle 2, Beispiel 7).

Diese Ergebnisse zeigen, daß biologisch aktives EPO in COS-1-Zellen produziert wird. In Western-Blots konnte mit Hilfe eines polyklonalen Anti-EPO-Antikörpers gezeigt werden, daß EPO, das von COS-Zellen produziert wird, eine Mobilität auf SDS-Polyacrylamidgelen besitzt, die identisch mit derjenigen des nativen EPO ist, das aus menschlichem Urin hergestellt wurde (Beispiel 8). Daher kann geschlossen werden, daß das Ausmaß der Glycosilierung von COS-1 produziertem EPO ähnlich der des nativen EPO ist.

Unterschiedliche Vektoren, die andere Promotoren enthalten, können ebenso in COS-Zellen oder in anderen Säugerzellen oder eukaryontischen Zellen verwendet werden. Beispiele von solchen anderen Promotoren im Sinne der vorliegenden Erfindung beinhalten SV40-Früh- und Spätpromotoren, den Mäuse-Metallothionein-Gen-Promotor, den Promotor, der in Retro»iren von Vögeln oder Säugern gefunden wird, der Bacculovirus-Polyeder-Gen-Promotor und andere. Beispiele von anderen Zelltypen im Sinne der vorliegenden Erfindung beinhalten E. coli, Hefe, Säugerzellen, wie z. B. CHO (Ovarium des Chinahamsters), C127 (Affenepithelium), 3T3 (Mäusefibroblasten), CV-1 (african green monkey kidney) und Insektenzellen, wie z. B. diejenigen von Spodoptera frugiperda und Drosophila metanogaster. Diese wechsenden Promotoren und/oder Zelltypen können die Regulation hinsichtlich der Zeit oder des Grades der F.PO-Expression bewirken, indem Sie einen zellspezifischen Typ von EPO produzieren oder das Wachstum von großen Mengen von EPO-produzierenden Zellen unter weniger teuren, aber leichter kontrollierbaren Bedingungen ermöglichen.

Ein Expressionssystem, das die Vorzüge einer Expression bei Säugern besitzt, aber weniger Zeit benötigt, um eine hochgradige Expressionszellinie zu produzieren, setzt sich zusammen aus einer Insektenzellinie und einem DNA-Virus, der sich in dieser Zellinie vermehrt. Der Virus ist ein Nuclear-polyhedrosis-Virus. Er besitzt ein doppelsträngiges zirkuläres DNA-Genom von 128kb. Das Nucleokapsid ist stäbchenförmig und liegt in zwei Formen vor, der nichtokkludierten Form im membrangebundenen Virus und in einer okkludierten Form, die im infizierten Zellkern von einem Proteinkristall eingehüllt wird. Diese Viren können üblicherweise in In-vitro-lnsektenzellkulturen fortgepflanzt werden und sind durch alle routinemäßigen tierisch-virologischen Methoden abänderbar. Das Zellkulturmedium ist üblicherweise eine Nährsalzlösung von 10%igem fötalem Kälberserum. Das Viruswachstum wird in vitro iniziiert, wenn ein nichtokkludierter Virus (NOV) in eine Zelle eindringt und sich zum Kern hinbewegt, in dem er sich fortpflanzt. Die Replikation findet im Kern statt. Während der Anfangsphase (8-18 Stunden nach der Infektion) werden Nucleokapside im Zellkern angesammelt und keimen daraufhin als NOV durch die Plasmamembran und verbreiten somit die Infektion durch die Zellkultur. Einige Nucleokapside verbleiben daraufhin zusätzlich (mehr als 18 Stunden nach der Infektion) im Zellkern und werden in einer Proteinmatrx okkludiert (bekannt als polyhedrale Inclusions-Körper, (PIB]). Diese Form wirkt nicht infektiös in der Zellkultur. Die Matrix setzt sich zusammen aus einem Protein, das als Polyhedrin bekannt ist (Molmasse 33kd).

Jeder PIB besitzt einen ungefähren Durchmesser von 1 mm und es können mehrere hundert PIB pro Nucleus vorkommen. Es wird sicherlich eine große Menge von Polyhedrin erst später im Infoktionszyklus produziert (ungefähr 25% der gesamten zellulären Proteinmenge).

Da die PIB keine Rolle in den In-vitro-Replikationszyklen spielen, kann das Polyhedrin-Gen ohne nachhaltigen Effekt auf die In-vitro-Lebensfähigkeit vom Viruschromosem gelöscht werden. Durch Verwendung des Virus als Expressionsvektor haben wir die codierende Region für das Polyhedrin-Gen mit der fremden zu exprimierenden DNA ersetzt, indem wir es unter die Kontrolle des Polyhedrin-Promotors stellten. Dies ergibt einen nicht-PIB-bildenden Virus-Phänotyp.

Dieses System wurde von vielen Forschern verwendet, insbesondere von Pennock et al. und Smith et al., Pennock et al. (Gregory D. Pennock, Charles Shoemaker und Lois K.Miller, Mol. Cell. Biol. 3,399-406 [1984]) berichteten über den hohen Expressionsgrad eines bakteriellen Proteins, ß-Galactnsidase, wenn es unter Kontrolle des Polyhedrin-Promotors gestellt wird. Ein anderer nuclearer vom Polyhedrosisvirus abgeleiteter Expressionsvektor wurde von Smith et al. vorgestellt (Gale E. Smith, Mas.D. Summers und M. J. Fräser, Mol. Cell. Biol., 16. Mai, 2156-2165 [19831). Die Autoren demonstrierten die Effektivität ihres Vektors durch die Expression von menschlichem ß-lnterferon. Das synthetisierte Produkt wurde als glycosilierte Form gefunden und wie erwartet von Insektenzellen sekretiert. In Beispiel 14 werden Modifizierungen des Plasmides beschrieben, welches das

Polyhedron-Gen des Autographa-californica-nucleare-polyhedrosis-Virus (AcNPV) enthält, das eine einfache Insertion des EPO-Gens in das Plasr.iid erlaubt, so daß es unter der Transkriptionskontrolle des Polyhedron-Promotors steht. Die resultierende DNA wird in Insektenzellen co-transfektierc mit intakter chromosomaler DNA des Wildtyps AcNPV. Ein genetischer Rekombinationsversuch ergibt die Ersetzung der AcNPVC-Polyhedrin-Gen-Region durch die DNA des Plasmides. Der resultierende rekombinante Virus kann aus der viralen Nachkommenschaft durch das Vorhandenrein der DNA-Sequenzen des EPO-Gens identifiziert werden. Dieser rekombinante Virus sollte erwartungsgemäß nach Reinfektion von Insektenzellen EPO produzieren.

Beispiele der EPO-Expression in CHO, C127 und 3 Γ3 und Insektenzellen sind in den Beispielen 10 und 11 (CHO), 13 (C 127 und 3T3) und 14 (Insektenzellen) gegeben.

Das biologisch aktive EPO, das durch prokaryontische oder eukaryontische Expression der klonierten EPO-Gene der vorliegenden Erfindung produziert wurde, kann von Ärzten und/oder Veterinären für die In-vivo-Behandlung von Säugern angewendet werden. Die Menge von aktiven Bestandteilen wird natürlich von der Schwere des zu behandelnden Zustandes abhängen, vom Weg der gewählten Verabreichung, von der spezifischen Aktivität des aktiven EPO und wird letztendlich vom behandelnden Arzt oder Veierinärmediziner entschieden werden. Diejenige Menge von aktivem EPO, die vom behandelnden Arzt festgelegt wird, wird im folgenden als „EPO-hehandlungseffektive Menge" bezeichnet. Beispielsweise wurde für die Behandlung von induzierter hypoproliferativer Anämie, die bei Schafen von einer chronischen renalen Schwäche begleitet wird, über den Zeitraum vor 15-40 Tagen eine tägliche effektive Menge von EPO von 10 U/kg gefunden (vgl. Eschbachetal., J. Clin. Invest. 74,434 [1984]). Das aktive EPO kann auf jedem, vom zu behandelnden Zustand abhängigen Weg verabreicht werden. Vorzugsweise wird das EPO in die Blutbahn des zu behandelnden Säugertieres injiziert. Es kann leicht durch den Fachmann abgeschätzt werden, daß der bevorzugte Verabreichungsweg je nach Art des zu behandelnden Zustandes variieren kann. Obwohl es möglich :st, das aktive EPO in reiner Form oder als nahezu reine Verbindung zu verabreichen, wird es vorzugsweise als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Verbindungen, sowohl für die Anwendung im Veterinär- als auch im Humanbereich, umfassen das aktive EPO-Protein, wie oben beschrieben, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutischen verträglichen Trägerstoffen und gegebenenfalls anderen therapeutischen Beimischungen. Die Trägerstoffe müssen verträglich sein mit anderen Inhaltsstoffen der Zusammensetzung und für den Patienten nicht schädlich. Die Zusammensetzung sollte keine Oxidationsmittel und andere Substanzen enthalten, von denen bekannt ist, daß sie mit Peptiden unverträglich sind. Die Zusammensetzungen können zweckmäßigerweise in einheitlichen Dosierungsformen abgepackt werden und können durch viele in dsr Pharmazie bekannten Methoden hergestellt werden. Alle Methoden beinhalten den Schritt des Mischens von aktivem Inhaltsstoff mit dem Trägermaterial, das sich aus einem oder mehreren Hilfsstoffen zusammensetzt. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen durch einheitliches und intensives Mischen von aktivem Inhaltsstoff mit flüssigen Trägern oder feinverteilten festen Trägerstoffen oder beidem hergestellt und dann, falls notwendig, wird das Produkt in die gewünschte Form der Zusammensetzung überführt.

Die Zusammensetzungen für pirenterale Verabreichungen umfassen zweckmäßigerweise sterile wäßrige Lösungen des aktiven Inhaltsstoffes und Lösungen, die vorzugsweise isotcnisch mit dem Blut des Empfängers sind. Solche Zusammensetzungen können zweckmäßigerweise hergestellt werden durch Lösen des festen aktiven Inhaltsstoffes in Wasser, um eine wäßrige Lösung zu erzeugen, und unter sterilen Bedingungen kann diese Lösung in einheitlichen oder mehrfach dosierbaren Darreichungsformen, z. B. in versiegelten Ampullen oder Gefäßen, abgepackt werden.

Die hier verwendete EPO-cDNA beinhaltet das reife EPO-cDNA-Gen, dem ein ATG-3odon vorausgeht, und EPO-cDNA, die für allelomorphische Variationen des EPO-Proteins codiert. Eine allelomorphische Variation ist in den Abbildungen 3a und 3 b dargestellt. Das EPO-Protein enthält das 1 Methionin-Derivat des EPO-Proteins (Met-EPO) und allelomorphische Variationen des EPO-Proteins. Das reife EPO-Protein, das durch die Sequenz in Abbildung 3 a dargestellt ist, beginnt mit der Sequenz Ala-Pro- Pro-Arg ..., deren Anfang durch die Zuhl „ 1" in Abbildung 3 gekennzeichnet wird. Das Met-EPO würde mit der Sequenz Met-Ala-Pro-Pro-Arg... beginnen.

Ausführungsbeispiel

Die folgenden Beispiele sollen zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung dienen, deren wahre Reichweite in den anliegenden Patentansprüchen dargelegt wird. Ebenso sind Abänderungen der dargelegten Verfahren möglich, die von der vorliegenden Erfindung mitumfaßt werden. Alle Temperaturen werden in ⁰C angegeben und shd unkorrigiert. Das Symbol für Micron oder Micro, z. B. Microliter, Micromol usw., ist „μ", ζ. B. μΙ, um usw..

Beispiel 1: Isolierung eines Genom-Klons von EPO

EPO aus dem Urin von Patienten mit aplastischer Anämie wurde im wesentlichen nach der von Miyake et al., J. Biol. Chem. 252, 5558 (1977) entwickelten Methode gereinigt, mit der Ausnahme, daß die Phenolbehandlung nicht durchgeführt wurde und durch eine Hitzebehandlung bei 80°C (fünf Minuten) ersetzt wurde, um die Neuraminidase zu inaktivieren. Der letzte Schritt der Reinigung erfolgte durch Fraktionierung auf einer C-4-Vydac- HPLC-Säure (The Seoaratious Group), indem ein 0-95%iger Acetonnitril-Gradient mit 0,1 %Trifluoressigsäure (TFA) für eine Dauer von 100 Minuten angelegt wurde. Die EPO-Fraktion wurde durch Gelelektrophorese und N-termin?le Sequenzanalyse (21,26,27) der Hauptfraktionen bestimmt. Das EPO wurde bei etwa 53% Acetonnitrl eluiert und stellte ungefähr 40% des Proteins oar, Has durch reversed-phase-HPLC getrennt wurde. Die EPO enthaltenden Fraktioner wurden zu ΙΟΟμΙ einrotiert, mit Amoniumbiearbonat auf pH 7,0 eingestellt und mit 2% TPCK-behandeltem Trypsin (Worthington) 18 Stunden lang bei 37⁰C vollständig verdaut. Die tryptischen Verdauungsprodukte wurden dann einer reversed-phase-HPLC, wie oben beschrieben, unterworfen. Die optische Dichte bei 280 nm und 214 nm wurde gemessen. Gut separierte Peaks wurden bis fast zur vollständigen Trockne oinrotiert und direkt der N-terminalen Aminosäuresequenzanalyse (59) unterworfen (Applied Biosystems Model 480A Gas phase sequenator). Die erhaltenen Sequenzen sind in Abbildung 3 unterstrichen. Wie zuvor beschrieben, wurden zwei dieser tryptischen Fragenmente für die Synthese von Oligonucleotidproben ausgewählt. Auo der Sequenz Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys (Aminosäuren 46-52 in Abbildung 3) wurde 17mer mit 32facher Entartung

AAA

TTCCANGCGTAGAAGTT und ein 18mer mit 128facher Entartung AAA

CCANGCGTAGAAGTTNAC

hergestellt. Aus der Sequenz Vel-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg (Aminosäuren 144-150 in Abbildung 3) wurden zwei Pools von 14mers, jeweils 32fach entartet

TTGN TT

TACACCTAACTTCCT und TTGN TT

TACACCTAACTTCTT

hergestellt, die oich in der ersten Position des Leucincodons unterscheiden. Die Oligonucleotide wurden am 5'-Ende mit ³²p durch Polynucleotid-Kinase (New England Biolabs) und ³²p-ATP (New England Nuclear) markiert. Die spezifische Aktivität der Oligonucleotide variierte zwischen 1000 und SOOOCi/mmol. Im Screening-Verfahren der menschlichen Genom-DNA-Bibliothek im Bakteriophagen-Lambda (Lawn et al., [22]) v/urde eine Modifizierung der In-situ-Vermehrungsmethode vorgenommen, wie ursprünglich von Woo et al. (47) (1978) beschrieben. Ungefähr 3,5 x 10^s Phagen wurden mit einer Dichte von 6000 Phagen auf Petrischalen mit 150mm Durchmesser (NZTYM-Medium) platiert und bei 37⁰C inkubiert, bis Plaques von etwa 0,5mm sichtbar wurden. Nach einstündigem Abkühlen auf 4°C wurden doppelte Replika der Plaques-Muster auf Nylonmembranen (New England Nuclear) übertragen und übe. Macht bei 37°C auf frischen NZCYM-Platten inkubiert. Die Filter wurden dann denaturiert und durch lOminütiges Waschen mit 0,5η NaOH/1m NaC 1 undO,5mTris(pH8) 1 m NaC 1 neutralisiert. Nach darauffolgendem Erhitzen im Vakuum bei 8O⁰C für zwei Stunden wurden die Filter gewaschen (5 χ SSC, 0,5% SDS; 1 h) und der Zellrückstand auf der FiH.-/oberfläche durch vorsichtiges Ankratzen mit einem feuchten Tuch entfernt. Dieses Ankratzen reduziert das Anhaften der Probe auf den Filtern. Die Filter wurden dann mit Wasser gewaschen und für eino Dauer von 4-8 Stunden bei 48'C in 3 m tetramethylammonium-clo-rid, 1OmM NaPO₄(pH6,8), 5 χ Denhardt's, 0,5% SDS und 1OmM EDTA prehybridisiert. DaS³V markierte 17mer wurde dann mit einer Konzentration von 0,1 pmol/ml zugegeben und die Hybridisierung wurde bei 48°C 72 Stunden lang durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Filter intensiv mit 2 χ SSC (0,3m NaCI/0,03m Na-Citrat, pH7) bei Raumtemperatur gewaschen, dann für eine Stunden in 3m TMACI/10mM NaPO₄ (pH6,8) bei Raumtemperatur und anschließend für eine Dauer von 5-15 Minuten beider Hy bridisierungstemperatur. Nach zweitägiger Autoradiographie mit einem verstärkenden Schirm wurden ungefähr 120 starke Duplett-Signale aufgenommen. Die Positiven wurden herausgesucht, in Pools zu acht zusammengegeben, replatiert und ein Screening-Verfahren durchgeführt, indem eine Hälfte des 14-mer-Pools auf jedem der beiden Filter und die 17mer auf dem dritten Filter verwendet wurden. Die Bedingungen für das Auftragen auf die Platten und die Hybridisierung sind weiter oben beschrieben, allerdings wurde die Hybridisierung des 14mer bei 37⁰C durchgeführt. Nach der Autoradiographie wurde die Probe vom 17mer-Filter in 50% Formamid überführt, und nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde der Filter bei 52°C mit der 18-mer-Probe rehybridisiert. Zwei unabhängige Phagen hybridisierten in allen drei Proben. Die DNA einor dieser Phagen (im folgenden als Lambda-HEP01 bezeichnet) wurde mit 3au3A vollständig verdaut und in M13 für die DNA-Sequenzanalyse subklonieri, inc'em dia Dideoxy-Kettenterminierungsmethode von Sanger und Coulson (23) (1977) verwendet wurde. Die Nu-ileotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz des offenen Ableserahmens, der für das EPO tryptische Fragment (unterstrichene Region) codiert, ist in dieser Anmeldung beschrieben, die Intron-Sequenzen werden in Kleinbuchstaben angegeben, die Εχυη-Sequenzen (87 Nucleotide) werden in Großbuchstaben angegeben. Übereinstimmende Sequenzen zwischen Spleiß-Akzeptor-(a) und Dnor-(d)-Stellen sind unterstrichen (vgl. Abbildung 4c).

Beispiel 2: „Northern"-Analyse der menschlichen fötalen-Leber-mRNA

5ug der menschlichen fötalen Leber-mRNA (aus einer 20 Wochen alten fötalen Leber hergestellt) und eine Leber-mRNA eines Erwachsenen wurden in einem 0,8%igen Agarose-Formaldehyd-Gel einer Elektrophorese unterworfen und mit Hilfe der Methode von Derman et al., Cell, 23,731 (1981) auf Nitrocellulose transferiert. Eine einsträngige Probe wurde dann aus dem M 13-Templat hergestellt, das den in Abbildung 1 dargestellten Einschub enthält. Der Prirnei war ein 20mer, der aus dem gleichen tryptischen Fragment wie die ursprüngliche 17-mer-Probe abgeleitet wurde. Die Probe wurde, wie bereits von Anderson et al., PNAS, (50) (1984) beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, daß nach der Verdauung mit Sma I (womit die gewünschte Probe mit einer Länge von 95 Nucleotiden hergestellt wurde, die 74 Nucleotide der Codierungssequenz enthält), die kleinen Fragmenten von M 13-Templat durch Chromatographie an einer Sepharose-CI4B-Säule mit 0,1 η NaOH/0,2m NaC 1 gereinigt wurden. Der Filter wurde zu ungefähre x 10⁶cpm dieser Probe 12 Stunden lang bei 68⁰C hybridisiert, zweimal mitSSCbei68°C gewaschen und sechs Tage lang einem verstärkenden Schirm ausgesetzt. Eine einzelne Marker-mRNA von 1200 Nucleotiden (durch einen Pfeil gekennzeichnet) wurde als Vergleich in der benachbarten Reihe (siehe Abbildung 2) mitlaufen gelassen.

Beispiel 3: Fötale Leber-cDNA

Eine zu Beispiel 2 identische Probe wurde hergestellt und für das Screening einer fötalen Leber-cDNA-Bibliothek benutzt, die durch das Standard-Plaques-Screening-Verfahren (Benton Davis, Science (541 (1978) im Vektor Lambda-Ch 21A Toole et al., Nature, [25] [1984]) hergestellt wurde. Drei unabhängige positive Klone (im folgenden als Lambda-HEPOFL611350 bpl, Lambda-HEP0FL8 [700bpl und Lambda-HEPOFL13 [1400bp]) wurden isoliert und anschließend erfolgte ein Screening der 1 χ 10^e Flecken. Der gesamte Einschub von Lambda-HEPOFL 13 und Lambda-HEPOFL6 wurde sequenziert und anschließend in M13 subkloniert (vgl. Abbildung 9 bzw. 7). Von Lambda-HEPOFL8 wurden nurTeile sequenziert und der Rest als identisch zu den anderen beiden Klonen angenommen (vgl. Abbildung 8). Die 5'- und 3'-unübersetzten Sequenzen werden durch Kleinbuchstaben gekennzeichnet. Die Codierungsregion wird durch Großbuchstaben dargestellt.

Bezüglich der Abbildung 3 a und 3 b wird die abgeleitete Aminosäuresequenz, die unterhalb der Nucleotidsequenz abgebildet ist, beginnend mit Nummer 1 für die erste Aminosäure des fertigen Proteins durchnumeriert. Das mutmaßliche Vorläuferpeptid wird ebenso angegeben. Cystein-Reste im fertigen Protein werden zusätzlich durch die Bezeichnung SH und mögliche N-Glycosilierungsstellen durch einen Stern angegeben. Die unterstrichenen Aminosäuren weisen auf solche Reste hin, die durch

N-terminale Proteinstquenzierung oder durch Sequenzierung der tryptischen Fragmente von EFO, wie in Beispiel 1 beschrieben, identifiziert wurden. Teilweise durchgezogene Linien weisen auf Reste in der Aminosäuresequenz von gewissen tryptischen Fragmenten hin, die nicht eindeutig bestimmt werden konnten. Die cDNA-Klone Lambda-HEP0FL6, Lambda-HEP0FL8 und Lambda-HEPOFL 13 wurden hinterlegt und sind von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter den Zuordnungsnummern ATCC 40156, ATCC 40152 und ATCC 40153 erhältlich.

Beispiel 4: Genom-Strukturen der EPO-Gene

Die relativen Größen und Positionen der vier unabhängigen Genom-Klonen (Lambda-HEP01, 2,3 und C) von der Haelll/Alu I-Bibliothek sind durch die überlappenden Linien in Abbildung 4a dargestellt. Die stärker durchgezogene Linie weist auf die Position des EPO-Gens hin. Eine Skalierung (in Kb) und die Positionen der bekannten Spaltungsstellen für die Restriktions-Endonucleasen sind angegeben. Die das EPO-Gen enthaltende Region wurde vollständig von beiden Strängen sequenzier ι, indem durch Exonuclease-Ill erzeugte Serien von Auslöschungen innerhalb dieser Region verwendet wurden. Eine schematische Darstellung von fünf Exons, die für EPO-mRNA codieren, ist in Abbildung 4 b dargestellt. Die genaue 5'-Grenze des Exons I ist zur Zeit nicht bekannt. Der proteincodierende Teil dieser Exons ist schattiert. Die komplette Nucleotidsequenz dieser Region ist in Abbildung 4c dargestellt. Die bekannten Grenzen jedes Exons sind durch vertikale Balken skizziert. Die Genomklone Lambda-HEP01, Lambda-HEPO2, Lambda-HEPO3 und Lambda-HEPO6 wurden hinterlegt und sind von dor American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter den Zuordnungsnummern ATCC 40154, ATCC 40155, ATCC 40150 und ATCC 40151 erhältlich.

Beispiel 5: Konstruktion des Vektors ρ91023 (B)

Der verwendete Transformationsvektor war pAdD26 SVpA (3), wie von Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 2,1304 (1982) beschrieben. Die Struktur dieses Vektors ist in Abbildung 5a dargestellt. Dieses Plasmid enthält ein Mäuse-Dihydrofolat-Reduktase-(DHFR)-cDNA-Gen, das unter der Transkriptionskontrolle des Adenovirus-2-(Ad 2)-major-late-Promotors steht. Eine 5'-Spleiß-Stelle ist in der Adenovirus-DNA angegeben und eine 3'-Spleiß-Stelle, von einem Immunglobulin-Gen abgeleitet, befindet sich zwischen dem Ad2-maj~r-late-Promotor und der DHFR-Codierungssequenz. Die SV40-early-Polyaden/lierungsstelle befindet sich im Strang unterhalb der DHFR-Codisrungssequenz. Die prokaryontisch abgeleitete Sektion von pAdD26SVpA(3) stammt von pSVÜd (Mellon et al.. Cell 27,279 (1981 ]) und enthält nicht die pBR322-Sequenzen, die bekannt sind für die Inhibierung der Replikation in Säugerzellen (Lusky et al., Nature 293,79 [19811).

pAdD26SVpA(3) wurde in das Plasmid pCVSVL2 überführt, (vgl. Abbildung 5a). pAdD26SVpA(3) wurde in das Plasmid pAdD26SVpA(3) (d) durch Löschen einer der beiden Potl-Stelien in pAdD26SVpA(3) überführt. Dies wurde durch teilweise Verdauung mit Pstl erreicht, indem ein Unterschluß von Enzym verwendet wurde, so daß eine Subpopulation von linearisierten Plasmiden erhalten wurde, in denen nur eine einzige Pstl-Stelle gespalten wurde, anschließend erfolgte eine Behandlung mit Kien jw, die Ligation, um zu rezirkulurisieren, und das Screening bzgl. Auslöschungen der Pstl-Stelle, die sich am 3'-Ende der SV 40-Polyadenyiations-Sequenz befindet.

Der Adenovirus-Tripartit-Leader und die virusassoziierten Gene (VA-Gene) wurden in pAdD26SVpA(3) (d) inseriert (vgl. Abbildung 5a). Zuerst wurde pAdD26SVpA(3) (d) mit Pvull gespalten, um ein lineares Molekül zu erhalten, das innerhalb der 3'-Region der drei Elemente, die den Tripartit-Leader umfassen, geöffnet ist. Dann wurde pJAW43 (Zain et al.. Cell 16,851 [1979]) mit Xhol verdaut, mit Klenow behandelt, mit Pvu Il verdaut und die 140 bp-Fragmente, die den zweiten Teil des dritten Leaders enthalten, wuidsn durch Elektrophorese auf Acrylamidgel (6% in Tris-Borat-Puffer; Maniatis et al., s.u.) isoliert. Das 140bp-Fragment wurde dann mit dem Pvull-verdauten pAdD26SVpA(3) (d) verbunden. Das verbundene Produkt wurde dazu verwendet, E. coli zur Tetracyclinresistenz zu transformieren, und die Kolonien wurden nach dem Grundstein-Hoguess-Verfahren gescreent, indem eine '²p-markierte Probe verwendet wurde, die zu dem 140bp-Fragment hybridisiert. Eine DNA aus positiv hybridisierten Kolonien wurde hergestellt, um zu testen, ob die rekonstruierte Pvu Il-Stolle ein 5'- oder 3'-Ende der inserierten 140 bp-DNA war, die spezifisch für die zweiten oder dritten Adenovirus-Iate-Leaders ist. Die richtige Orientierung der Pvu Il-Stelle ist das 5'-Ende des 140bp-Einschubes. Dieses Plasmid wird als pTPL in Abbildung 5a bezeichnet.

Das Ava Il D-Fragment von SV40, das die SV40-Enhancer-Sequenz enthält, wurde durch Verdauung von SV40-DNA mit Ava Il erhalten, die Enden wurden mit dem Klenow-Fragment von Po Il in glatte Enden überführt, Xhol-Linkei" mit den Fragmenten verbunden, mit Xhol verdaut, um die Xhol-Stellen zu öffnen, und die vier größten (D)-Fragmente durch Gelclektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde dann mit aus Xhol geschnittener pTPL verknüpft und somit das Plasmid pCVSVL2-TPL erhalten. Die Orientierung des SV40-D-Fragmentes in pCVSVL2-TPL war derart, daß der SV40-late-Promotor in der gleichen Orientierung war wie der Adenovirus-major-iate-Promotor.

Um die Adenovirus-assoziierten (VA)-Gene in die pCVSVL2-TPL zu überführen, wurde zuerst ein Plasmid pBR322 konstruiert, das das Adenovirus-Typ-2-HIND Ill-B-Fragment enthielt. Die Adenovirus-Typ-2-DNA wurde mit Hind III verdaut und das B Fragment durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde in pBR 322 inseriert, das zuvor mit Hind III verdaut wurae. Nach der Transformation von E. coli zur Ampicillin-Resisten7 wurden die Rekombinanten hinsichtlich der Insertion des Hind W-B-Fragmentes gescreent und die inserierte Orientierung durch Verdauung mit Restriktionsenzymen bestimmt. pBR322-AdHindlll-B enthält das Adenovirus-Typ-2-Hindill-B-Fragment in der in Abbildung 5b gezeigten Orientierung. Wie in Abbildung 5 b dargestellt wird, werden die VA-Gene üblicherweise aus dem Plasmid pBR322-Ad Hind Hl-B durch Verdauung mit Hpa I erhalten, indem EcoR 1-Linker zugegeben werden und mit EcoR 1 verdaut wird, und anschließend das 1,4 kb-Fragment zurückgewonnen wird. Das Fragment mit den überstehenden EcoR 1 -Enden wird dann mit der EcoR 1 -Stelle von PTL verknüpft, das zuvor mit EcoR 1 verdaut wurde. Nach der Transformation von E.coli HB101 und Selektion hinsichtlich Tetracyolin-Resisteriz wurde mit den Kolonien ein Screening-Verfahren durch Filterhybridisieruiig zur DNA durchgeführt, die für die VA-Gene spezifisch ist. Die DNA wurde aus positiv hybridisierten Klonen hergestellt und durch Verdauung mit Restriktionsendonucleasen charakterisiert. Das erhaltene Plasmid wird als p91023 bezeichnet.

Wie in Abbildung 5c dargestellt ist, werden die zwei EcoR 1-Stellen in p91023 durch vollständiges Schneiden von p91023 mit EcoR 1 entfernt, so daß zwei DNA-Fragmente erzeugt werden, eines mit ungefähr 7 kb, das andere mit ungefähr 1,3kb. Das letztere Fragment enthielt die VA-Gene. Die Enden von beiden Fragmenten wurden mit Hilfe des Klenow-Fragmentes von Poll aufgefüllt, und die beiden Fragmente wurden dann zusammengefügt. Ein Plasmid p91023(A), das die VA-Gene enthält und zu p91P?3 ähnlich ist, jedoch die beiden EcoR 1-Stellen nicht enthält, wurde sowohl nach dem Grundstein-Hogness-Screening-Verfahren mit dem VA-Gen-Fragment als auch durch konventionelle Restruktionsstellen-Analyse identifiziert.

Die einzelne Pstl-Stelle in p91023(A) wurde entfernt und durch sine EcoR 1-Stelle ersetzt. p91023(A) wurde vollständig mit Pstl geschnitten und mit dem Klenow-Fragment von Poll behandelt, um frische Enden zu erhalten. EcoR 1-Linker wurden mit den glatten Pstl-Stellen von p91023 (A) verknüpft. Die lineare p91023 (A) mit den EcoR 1 -Linkern an den glatten Pstl-Stellen wurde von den unverknüpften Linkern abgetrennt und vollständig mit EcoR 1 verdaut und wieder neu verknüpft. Ein Plasmid p91023(B) wurde erhalten (vgl. Abbildung 5c) und mit einer zu p9102JiA) ähnlichen Struktur charakterisiert, jedoch mit einer EcoR 1 -Stelle anstelle der früheren Pstl-Stel!^. Das Plasniid p91023(B) wurde hinterlegt und ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 39754 erhältlich.

Beispiele:

Die cDNA-Klone (Lambda-HEPOFL6 und Lambda-HEPOFL13, vgl. Beispiel 3) wurden in das Plasmid p91023(B) inseriert, so daß pPTFL6und pPTFL 13 erhalten wurden. 8μg jeder gereinigten DNA wurden dann dazu verwendet, 5 x 10⁶COS-Zellen mit Hilfe der DEAE-Dextran-Methode (siehe unten) zu transferieren. Nach 12 Stunden wurden die Zellen gewaschen und mit Chlorochin (0,1mM) zwei Stunden lang behandelt, wieder gewaschen und für 24 Stunden 10ml Medium ausgesetzt, das 10% fötales Kälberserum enthält. Das Medium ;«urde dann gegen 4ml serumfreies Medium ausgetauscht und 48 Stunden später go°rntet. Die Produktion von immunologisch aktivem EPO wurde mit Hilfe eines Rauioimmunoassays nach der Methode Sherwoou ->d Goldwdsser (55) quantifiziert. Der Antikörper wurde von Dr. Judith Sherwood zur Verfügung gestellt. Der jodierte Tracer wurde aus dem gereinigten EPO (vgl. Beispiel 1) hergestellt. Die Empfindlichkeit des Assays beträgt ungefähr 1 ng/ml. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1	Konz. an in das Medium
Vektor	abgegebenem EPO (ng/ml)
	330
pPTFL13	31
pPTFL6

pPTFL 13 wurde hinterlegt und ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 3999 erhältlich.

Beispiel 7:

Die EPO-cDNA (Lambda-HEPOFL13) wurde in den p91023(B)-Vektor inseriert, in COS-1-Zellen transferiert und wie oben (Beispiel 6) geerntet, mit der Ausnahme, daß die Chlorochinbehandlung weggelassen wurde.

In vitro biologisch aktives EPO wurde dadurch vermessen, indem entweder ein koloniebildender Assay mit fötalen Leberzellen aus Mäusen als Quelle für CFU-E oder der ³H -Tymidinaufnahmeassay verwendet wurde, bei dem Milzzellen mit Phenylhydrazin injizierten Mäusen verwendet werde. Die Empfindlichkeit dieser Nachweise beträgt ungefähr 25mU/ml. Biologisch aktives EPO wurde In vivo entweder nach der Methode mit hypoxisuhen Mäusen oder mit hungernden Ratten gemessen. Die Empfindlichkeit dieser Nachweise beträgt ungefähr 100mU/ml. Bei beiden Nachweisen wurden in Blindversuchen keine Aktivitäten nachgewiesen. Die Ergebnisse des durch den Klon HEPOFL13 expriinierten EPO's sind in Tabelle 2 dargestellt, in der die Aktivitäten in U/ml ausgedrückt sind, wr.bei kommerzielles EPO (Toyobo Incorp.) als Standard verwendet wurde.

Tabelle 2 Aue .τιit Typl-EPO-cDNA transferierten Zellen ausgeschiedenes EPO Nachweis Aktivität

RIA 100ng/ml

CFU-E 2<0,EU/ml

³H-Thy 3,1<1,8U/ml

hypoxischeMaus 1 U/ml

hungernde Ratte 2 U/ml

Beispiel 8: SDS-Polyacrylamid-Gel-Analyse von EPO aus COS-Zellen

180ng von EPO, das in das Medium von COS-Zellen abgegeben wurde, die mit EPO (Lambda-HEPOFL 13)-cDNA im Vektor 91023(B) (siehe oben) transferiert wurden, wurden auf einem 10%igen SDS-Laemlli-Polyacryalamid-Gel elektrophoretisch getrennt und auf Nitrocellulose-Papier elektrotransferiert (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 76,4350 [1979]). Der Filter wurde mit Anti-EPO-Antikörpern, wie in Tabelle 1 beschrieben, überprüft, gewaschen und mit ¹²⁵l-staph-A-Protein neu überpiüft. Der Filter wurde zwei Tage lang autoradiographiert. Natives reines EPO, wie in Coispiel 1 beschrieben, wurde entweder vor (Linie B) oder nach der Jodierung (Linie C) elektrophoretisch getrennt (vgl. Abbildung 6). Die verwendeten Marker beinhalten ³⁵S-Methionin-markiertes Serumalbumin (68000D) und Ovalbumin (45000D).

Beispiel 9: Konstruktion von RK1-4

Das BamHI-Pvull-Fragment aus dem Plasmid PSV2DHFR (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1,854-864 (1981), das den zum Mäuse-Dihydrofolat-fleductase-(DHFR)-Gen benachbarten SV40-early-region-Promotor, einen SV40-Enhancer, das kleine t-Antigen-lntron und die SV40-Polyadenylierungssequenz enthält, wurde isoliert (Fragment A). Die verbleibenden Fragmente wurden aus dem Vektor p91023(A) (siehe oben) wie folgt erhalten:

p91023 (A) wurde mit Pst I an der einzelnen Pst I-Seite neben dem Adenovirus-Promotor verdaut, um das Plasmid zu linearisieren, und entweder mit synthetischem Pstl oder mit EcoRI-Konvertern verknüpft und rezirkularisiert (dabei werden die Stellen Pstl-EcoRI-Pstl an der ursprür.glichen Pstl-Stelle erzeugt; 91023[B']) oder mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I behandelt, um die Pstl-Stellen zu zerstören, und mit den synthetischen EcoR 1-Linker verknüpft und rezirkularisiert (dabei wird eine EcoR 1-Stelle an der ursprünglichen Pstl-Stelle erzeugt; 91023[B]).

Jedes der beiden resultierenden Plasmide 91023 (B) und 91023 (P') wurden mit Xba und EcoR I verdaut, wobei zwei Fragmente (F und G) gebildet werden. Durch Verbinden von Fragment F aus p91023(B) und Fragment G aus p91023(B') und Fragment G aus

p91023(B) und Fragment F aus p91023(B') wurden zwei neuo Plasmide erzeugt, die entweder eine EcoR I-Pst I-Stelle oder eine Pstl-EcoRI-Stelle an der ursprünglichen Pstl-Stelle enthielten. Das Plasmid, das die Pstl-EcoRI-Stelle enthielt, wo die Pstl-Stelle dem Adenovir js-major-late-Promotor am nächsten ist, wurde als p91023(C) bezeichnet.

Der Vektor p91023(C) wurde mit Xhol vollständig verdaut und die resultierende linearisierte DNA mit überstehenden Enden wurde mit einen großen Fragment von E.coli DNA-Polymerpse 1 in eine DMA mit glatten Enden überführt. An diese DNA wurde ein 340 bp Hindlll-EcoRI-Fragment gebunden, das den SV40-Enhancer enthält, der wie folgt hergestellt wurde:

Das Hind Ill-Pvu Il-Fragment aus SV40, das den SV40-Ursprung oder die Replikation und den Enhancer enthält, wurde in das Plasmid c-lac inseriert (Little et al., Mol. Giol. Med. 1,473-488 [1983]). Der c-lac-Vektor wurde durch Verdauung von c-lac-DNA mit RamH I hergestellt, anschließend die überstehenden Enden mit einem großen Fragment von DNA-Polymerase 1 aufgefüllt und die DNA mit Hind III verdaut. Das resultierende Plasmid (c-SVHP 1 ac) regenerierte]' die BamH I-Stelle durch Verknüpfen der glatten Enden von Pvu II. Das EcoR I-Hind Ill-Fragment wurde aus c-SVHPIac horgestellt und an das EcoR I-Hind Ill-Fragment von PSVOd gebunden (Mellou et al., siehe oben), das den Plasmid-Ursprung der Replikation enthielt, und das resultierende Plasm'd PSVHPOd wurde selektioniert. Das 340bp EcoR I-Hind HI-Fragment von PSVHPOd, das den SV40-Ursprung/E ,hancer enthält, wu'de dann hergestellt, beide Enden mit einem großen Fragment von DNA-Polymerase in glatte Enden überführt und an den Xhol-verdauten p91023(c)-Vektor, wie oben beschrieben, gebunden.

Das resultierende Plasmid (p91023[C)/Xho/glattes Ende plus EcoRI/Hindlll/glattes Ende, SV40-Ursprung plus Enhancer), in dem die Orientierung des Hind !H-EcoR I-Fragmentes derart war, daß die BamH I-Stelle innerhalb dieses Fragmentes dem VA-Gen am nächsten war, wurde als pES 105 bezeichnet. Das Plasmid-pES 105 wurde mit BamH I und Pvu Il und ebenso mit Pvu Il allein verdaut, und das SamH I-Pvu Il-Fragment, das den Adenovirus-major-late-Promotor (Fragment B) enthält, und das Pvu Il-Fragment, das das Plasmid innerhalb der Resistenzgene (Tetracyclinresistenz) enthält, und andere Sequenzen (Fragment

C) wurden isoliert. Die Fragmente A, B und C wurden verknüpft und das in Abbildung 10 b dargestellte Plasmid wurde isoliert und als RK1 -4 bezoichnet. Das Plasmid RK1 -4 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt und ist dort unter der Zuordnungsnummer ATCC 39940 erhältlich.

Beispiel 10: Expression von EPO in CHO-Zellen (Methode I)

Die DNA (20Mg) aus dem Plasmid pPTFL13(vgl. Beispiel 6) wurde mit der Restriktion-Endonuclease C1 al verdaut, (im das Plasmid zu linearisieren, und wurde mit Cla-l-verdauter DNA aus dem Plasmid pAdD26SVp(A) 1 (2pg) verknüpft, das ein durch den Adenovirus-major-late-Promotor (Kaufmann und Sharp, Mol. and Cell. Biol. 2,1304-1319 (1982]) reguliertes intaktes Dihydrofoiatreductase-(DHFR)-Gen enthält. Diese verknüpfte DNA wurde verwendet, um DHFR-negative CHO-Zellen (DUKX-B II, Chasin L. A. und Urlaub G., Proc. Natl. Acad. Sei. 77,4216-4220 [1980]) zu transfektieren, und nach zweitätigem Züchten wurden die Zellen, die mindestens ein DHFR-Gen beinhalteten, in nucleosidfreiem Alphamedium selektioniert und 10% dialysiertem fötalem Kälberserum zugegeben. Nach zweiwöchigem Wachstum in selektiven Medien wurden die Kolonien von den Originalplatten entfernt, in Gruppen zu 10 bis 100 Kolonien zusammengefügt, replattiert und in nucleosidfreiem Alphamedium gezüchtet. Die überstehenden Medien der Pools, die vor der Methotrexat-Selektion gewachsen waren, wurden auf EPO mit Hilfe eines RIA getestet.

Pools mit positiver EPO-Produktion wurden in Gegenwart von Methotrexat (0,02 UM) gezüchtet, dann subkloniert und wieder getestet. EPO-Cla4alpha4.02-7, ein einzelner Subklon aus dem EPO-Cla4alpha4.02-Pool, gibt 460ng/ml EPO in das Medium ah, das 0,02 μΜ MTX (vgl. Tabelle 3) enthält. EPO-Cla4alpha4.02-7 ist die Zellinie der Wahl für die EPO-Produktion und wurde bei der American Type Culture Collection (Zuordnungsnummer ATCC CRL8695) hinterlegt. Zur Zeit wird dieser Klon einer schrittweisen Selektion mit steigender Konzentration vom MTX unterworfen und wird voraussichtlich Zellen ergeben, die noch höhere Konzentrationen von EPO produzieren. Für Pools, die im RIA negativ waren, wurden Methotrexat-resistente Kolonien, welche aus den Gegenkulturen erhalten wurden, die in der Gegenv art von Methotrexat (0,02μΜ) gewachsen waren, erneut mittels RIA auf EPO geprüft. Diejenigen Kulturen, die nicht positiv ware i, wurden subkloniert und in weiter steigenden Konzentrationen von Methotrexat gezüchtet.

Die schrittweise Methotrexat-(MTX)-Selektion wurde durch sich wiederholende Zyklen des Züchters von Zellen in Gegenwart von steigenden Konzentrationen an Methotrexat und durch die Selektion der überlebenden Zellen erreicht. Nach jedem Durchgang wurde EPO im Kulturüberstand durch RIA und durch in-vitro-biologische Aktivität gemessen. Die Konzentrationen von Methotrexat, die in jeder schrittweisen Verstärkung verwendet wurden, waren 0,02 M, 0,1 M und 0,5 M. Wie in Tabelle 3 dargestellt ist, wurden nach eintim Durchgang der Selektion in 0,02 M MTX signifikante Konzentrationen von EPO in das Kulturmedium abgegeben.

Tabelle 3

Konzentration von in das Medium abgegebenem EPO

Prcbe Test alpha-Medium-Ernte 0,02 pMmethotrexa*^:n der

alpha-Medium Ernte

4a4Pool RIA 17 Mg/ml 50ng/ml

4a4Single

(.02-7) - 460ng/ml

Beispiel 11: Expression von EPO in CHO-Zellen (Methode 2)

Die DNA des Klons- Lambda-HEPOFL13 wurde mit EcoRI verdaut und das kleine Rl-Fragment, das das EPO-Gen enthält, wurde in die EcoRI-Stelle des Plasmides RK1-4 (vgl. Beispiel 10) subkloniert. Diese DNA (RKFL13) wurde dann benutzt, um die DHFR-negativen CHO-Zellen direkt zu transfektieren (ohne Verdauung). Die Selektion und Verstärkung wurde wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt.

Die RDFL13-DNA wurde ebenfalls in CHO-Zellen durch Protoblastenfusion und Mikroinjektion inseriert. Das Plasmid RKFL13 wurde hinterlegt und ist von der American Typs Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 39989 erhältlich.

Kolonie Pool A	RIA
	3
	H-Thy
Einzelner
Kolonieklon	RIA
;.02c-Z)	3H-Thy
Mikroinji-	RIA
zierterPool
(DEPO-I)	3H-ThV

Tabelle 4 Konzentration von In das Medium abgegebenem EPO

Probe Test alpha-Medium-Einte 0,(^MMethotrexatin

der alpha-Medium-Ernte

3ng/ml 42ng/ml(Pool)

150ng/ml(Klon) 1,5U/ml

90ng/ml 5,9 U/ml 60ng/ml 160ng/ml

1,8 U/ml

Der bevorzugte einzelne Kolonie-Klon wurde hinterlegt und ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC CRL8695 erhältlich.

Beispiel 12: Expression des EPO-Genom-Klons in COS-1-Zellen

Der Vektor, der für die Expression dos EPO-Genom-Klons verwendet wurde, ist pSVod (Mellon et. al., s. o.). Die DNA von pSVOd wurde vollständig mit Hindill verdaut und die Enden mit dem großen Fragment von DNA-Polymerase-I in glatte Enden umgewandelt. Der EPO-Genom-Klon Lambda-HEP03 wurde mit EcoRi und Hindlll vollständig verdaut und das 4,0kb-Fragment, das das EPO-Gen enthält, wurde isoliert und wie oben beschrieben in glatte Enden umgewandelt. Die Nucleotidsequenz dieses Fragmentes von der Hindlll-Stelle bis zur Region oberhalb des Polyidenylierungssignals ist in Abbildung 4 dargestellt. Das EPO-Gen-Fragment wurde in das pSVOd-Plasmid-Fragment inseriert. Korrekt konstruierte Rekombinanten in beide Richtungen konnten isoliert und verifiziert werden. Das Plasmid CZ2-1 besitzt das EPO-Gen in der Orientierung „a" (d. h., daß das 5'-Ende von EPO dem SV40 Ursprung am nächsten liegt) und das Plasmid CZ1-3 besitzt die entgegengesetzte Orientierung (Orientierung

„b").

Die Plasmide CZ1 -3 und CZ2-1 wurden in COS-1 -Zellen, wie in Beispiel 7 beschrieben, transfektiert, das Medium geerntet und auf immunologisch aktives EPO getestet. Ungefähr 31 ng/ml von EPO wurde im Kulturüberstand von CZ2-1 nachgewiesen bzw.

16-31 ng/ml von CZ1-3.

Die Genom-Klone HEP01, HEP02 und HEP06 können in COS-Zellen zur Expression auf ähnliche Weise inseriert werden.

Beispiel 13: Expression in C127 und CHO-Zellen und Konstruktion von pBPVEPO Ein Plasmid, das die EPO-cDNA-Sequenz unter der Transkriptions-Kontrolle des Metallothionein-Promotors von Mäusen enthält und das an die komplette Papilloma-virus-DNA von Rindern gebunden ist, wurde wie folgt hergestellt:

pEP049f

Das Plasmid SP6/5 wurdo von Promega Biotec. käuflich erworben. Dieses Plasmid wurde mit EcoRI vollständig verdaut und das 1340bp EcoRI-Fragment von Lambda-HEP0FL13 wurde durch DNA-Ligase inseriert. Das resultierende Plasmid, in dem das 5'-Ende des EPO-Gens dem SP6-Promotor (durch 3g11 und Hindlll-Verdauung bestimmt) am nächsten war, wurde als pEPO49f bezeichnet. In dieser Orientierung ist die BamHI-Stelle im PSP6-5-Poly-Linker dem 5'-Ende des EPO-Gens direkt benachbart.

pMMTneoABPV

Das Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12) (Law et al., Mol. and Cell Biol. 3,2110-2115 [1983)), das in Abbildung 11 dargestellt ist, wurde mit BamHI vollständig verdaut, um zwei Fragmente zu erzeugen: Ein großes Fragment einer Länge von etwa 8kb, das das BPV-Genom enthält, und ein kleineres Fragment der Länge von ungefähr 6,5 kb, das den pML2-Ursprung der Replikation und das Ampicillin-Resistenz-Gen, den Methallothionein-Promotor, das Neomycin-Resistenz-Gen und das SV40-Polyadenylierungssignal enthält. Die verdaute DNA wurde durch DNA-Ligase rezirki'larisiert und die Plasmide, die nur das 6,8kb-F agment enthielten, wurden durch Verdauung mit EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonucleasen identifiziert. Eines dieser Plasm;de wurde als pMMTneoABPV bezeichnet.

pEP015a

pMMTneo BPV wurde mit BgIII vollständig verdaut. pEPO49f wurde mit BAMHI und BgIII vollständig verdaut und die ungefähr 700bp-Fragmente, dio die aosamte EPO-Codierungsregion enthielten, wurden durch Gelisolierung hergestellt. Die BgIIl verdauten pMMTneo BPV und die 700bp BamHI/BG1ll-EPO-Fragmente wurden verknüpft und die resultierenden Plasmids, die die EPO-cDNA enthielten, wurden identifiziert durch Koloniehybndisierung mit der Oligonucleotidd(GGTCATCTGTCCCCTGTCC)-Probe, die spezifisch für das EPO-Gen ist. Von don Plasmiden, die bei der Hybridisierungsanaiyse positiv waren, wurde eines (pEP015a), das die EPO-cDNA in der Orientierung besaß, so daß das 5'-Ende der EPO-cDNA dem Metallothicnein-Promotor am nächsten war, durch Verdauung mit EcoRI und Kpnl identifiziert.

pBPVEPO

Das Plasmid pEP015a wurde vollständig durch BamHI verdaut, um das Plasmid zu linearisieren. Das Plasmid pdBPVMMTneo (342-12) wurde ebenfalls vollständig mit BamHI verdaut, um zwei Fragmente von 6,5 und 8kb zu erzeugen. Das 8kb-hragment, das das gesamte Rinder-Papilloma-Virus-Genom enthielt, wurde isoliert (Gel). pEP015a/BamHI und das 8kb-BamHI-Fragment wurden miteinander verknüpft und ein Plasmid (pBPV-EPO), das das BPV-Fragment enthielt, wurde du ch Koloniehybridisierung identifiziert, indem eine Oligonucleotidprobe d(P-CCACACCCGGTACACA-OH) verwendet wurde, die spezifisch für das BPV-Genom ist. Die Verdauung von pBPV-EPO-DNA mit Hindlll wies darauf hin, daß die Richtung der Transkription des BPV-Genoms die gleiche war wie die Richtung der Transkription des Meiallothionein-Promotors (wie in pdPBV-MMTneo[342-12), vgl. Abbildung 11). Das Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12) ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 37224 erhältlich.

Expression

Die folgenden Methoden wurden für die Expression von EPO verwendet.

Methode I

DNA-pBPV-EPO wurde hergestallt und ungefähr 25pg wurden verwendot, um ungefähr 10⁶ C127 (Lowy et al., J. of Virol. 26, 291-298 [1978])-CHO-Zelleri zu transferieren, indem die Standardtechnik der Kalziumphosphatfällung verwendet würde (Grahm et al., Virology 52,45&-467 [19731).

Fünf Stunden nach der Transfektion wurde dasTransfektionsmedium entfernt, die Zellen mit Glycerin abgeschreckt, gewaschen und frisches alpha-Medium mit 10%igem fötalem Rinderserum zugegeben. 48 Stunden später wurden die Zellen trypsiniert und im Verhältnis von 1:10 in DME-Medium m:¹500Mg/ml G418 (Southern et al., Mol. Appl. Ganet. 1,327-341 !1982)) aufgeteilt und die Zellen für zwei bis drei Wochen inkubiert. G418-resistente Kolonien wi.rden einzeln auf in Mikrotiterplatten isoliert und in der Gegenwart von G 418 gezüchtet. Die Zellen wurden dann gewaschen, frisches Medium mit 10% fötalem Rin Jerserum zugegeben und die Medien 24 Stunden später geerntet. Die konditicnierten Medien wurden durch Radioimmunoassay und durch In vitro biologische Versuche getestet und waren positiv für EPO.

Methode Il

C127 oder CHO-Zellen wurden cotransfektiert mit 25 Mg von pBPV-EPO und 2 jig von pSV2nco (Southern et al, si she oben; vgl. Methode I). Dies bedeutet einen ungefähr 10fachen molaren Überschuß von pBPV-EPO- Nac. der Transfektion ist das Verfahren das gleiche wie in Methode I.

Methode II!

C 127-Zellen wurden mit 30 pg von pBPV-EPO transferiert (vgl. Methode I". Nach derTransfektion unddur Auftei'ung \^Λ·Λ0) wurde das Medium alie drei Tage gegen frisches ausgetauscht. Nach ungefähr zwei Wochen wurden Punkte von pBPV transformierten Zellen sichtbar. Einzelne Punkte wurden getrennt in 1 crn Vertiefungen von Mikrotiterplatten gegeben, zu einem subkonfluentsn Monolayer gezüchtet und auf EPO-Aktivität oder auf Antigenität im konditionierten Medium getestet.

Beispiel 14: Expression in Insektenzellen Konstruktion von pIVEV EP0FL13

Der Plasmidvektor pIVEV wurde hinterlegt und ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unte.' der Zuordnungsnummer ATCC 39991 erhältlich. Der Vektor wurde wie folgt modifiziert:

pIVEVNI

pIVEV wurde mit EcoRI veidaut, um das Plasmid zu lihearisieren, durch Verwendung eines großen Fragmentes von DNA-olymerase I wurden die Enden in glatte Enden umgewandelt und ein einzelner Notl-Linker GGCGGCCGCC

CCGCCGGCGG wurde durch Verbinden der glatten Enden inseriert. Das resultierende Plasmid wird als pIVEVNI bezeichnet.

pIVEVSI

pIVEV wurde mit Smal verdaut, um das Plasmid zu linearisieren, und ein einzelner Sfil-Linker GGGCCCCAGGGCCC

CCCGGGTCCCCGGG wurde durch Verbinden der glatten Enden inseriert. Das resultierende Plasmid wurde als pIVEVSI bezeichnet.

pIVEVSIBgKp

Das Plasmid pIVEVSI wurde mit KPnI verdaut, um das Plasmid zu linearisieren, und ungefähr 0-1000 bp wurden von jedem Ende durch Verdauung mit der doppelsträngigcn Exonucloase Ba 131 entfernt. Alle resultierenden Enden, die nicht vollständig glatt waren, wurden mit Hilfe des großen Fragmentes von DAN-Polymerase I in glatte Enden umgewandelt und der Poly-Linker

Xhol Xbal

I j I "Π

ι Ii '

BgLII EJco^I CIaI Kpnl

¹AGATC afcG/LGÄA üWtAG'aTCG AT*GG TACC¹ TCTAGAGCTCTTAAGATGTAGCTACCATGG

wi/rdedurch Verbinden derglatten Enden inseriert. Der Poly-Linker wurde in beide Richtungen inseriert. Ein Plasmid, in dem der Poly-Linker so orientiert ist, daß die Bglll-Stelle innerhalb des Poly-Linkers dem Polyhedron-Gen-Promoior am nächsten ist, wird als pIVEVSIBgKp bezeichnet. Ein Plasmid, in dem Kpnl-Stells innerhalb des Poly-Linkers dem Polyhedron-Gen-Promotor am nächsten liegt, wird als pIVEVSIKpBg bezeichnet. Die Anzahl der Basenpaare, die zwischen der ursprünglichen KPnl-Stelle in pIVEVSI und dem Polyhedron-Promotor gelöscht wurde, wurde nicht bestimmt.

plEIVSIBgKp wurde hinterlegt und ist unter der Zuordriungsnummer ATCC 33988 von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, erhältlich.

plVEVSIBgKpN

plVEVNI wurde mit KPnI und Pstl vollständig verdaut, um zwei Fragmente zu erhalten. Das größere Fragment, das den Plasmidursprung der Replikation und das 3'-Enao des Polyhedron-Gens enthält, wurde durch Gelisolierung hergestellt (Fragment A). plVEVSIBgKp wurde vollständig mit Pstl und KPn verdaut, um zwei Fragmente sowie ein kleines Fragment zu erhalten, das den Polyeder-Gen-Prortiotor enthält. Der Poly-Linker wurde durch Gelisclation hergestellt (Fragment B). Die Fragmente A und B wurden dann durch die DNA-Ligase miteinander verbunden, um das neue Plasmid plVEVSIBgKpNI zu bilden, das ein teilweise gelöschtes Polyeder-Gen enthält, in das ein Poly-Linker inseriert wurde, und das ebenso die Notl-Stelle (Ersetzen der zerstörten EcoRI-Stelle) und eine SHI-Stelle enthält, die die Polyhedron-Gen-Region flankiert.

plVEPO

plVEVSI BgKpNI wurde vollständig mit EcoRI verdaut, um das Plasmid zu linearisieren, und das 1340 bp EcoRI-Fragment von Lambda-HEPOFL13 wurde inseriert. Die Plasmide, die das EPO-Gen in der Orientierung enthielten, so daß das 5'-Ende des EPO-Gens dem Polyeder-Promotor am nächsten war, und das 3'-Ende dos Polyeder-Gens wurden durch Verdauung mit Bg1 Il identifiziert. Eines dieser Plasmide in der oben beschriebenen Orientierung wurde als plVEPO bezeichnet.

Expression von EPO in Insektenzellen

Große Mengen des plVEPO-Plasmides wurden durch Transformation des E.coli Stranges JM101-tgi hergestellt. Die Plasmid-DNA wurde durch die „cleared-lysate"-Technik isoliert (Maniatis und Fritsch, Cold Spring Harbor Manual) und weiter durch CsC1 -Zentrifugation gereinigt. Die L-1 -DNA aus dem Wildtyp autographa-californica-Polyhydrosis Virus (AcANPV) wurde durch Phenolextraktion von Viir ,partikeln und darauffolgender CsC1-Reinigung der viralen DNA hergestellt.

Diese beiden DNAs wurde dann in spod.-frugiperda-Zellen IPLB-SF-21 (Vaughn et al.. In vitro, Vol. B, S. 213-217 [1977]) cotransfektiert, indem das Verfahren der Kalziumphosphat-Transfektion (Potter und Miller, 1977) verwendet wurde. Für jede Platte der zu cotransfektierenden Zellen wurden 1 pg des Wild-Typs AcNPV-DNA und 10pg von plVEPO verwendet. Die Platten wurden fünf Tage lang bei 27⁰C inkubiert. Der Überstand wurde dann geerntet und die EPO-Expression im Überstand wurde durch Radioimmunoassay und durch In-vitro-biologische Methoden bestätigt.

Beispiel 15: Reinigung von EPO

Die mit COS-Zellen konditionierten Medien (121) mit EPO-Konzentrationen bis zu 200 pg/1 wurden auf 600 ml konzentriert, indem Ultrafiltrationsmembranen mit einer Ausschlußgrenze eines Molekulargewichts von 10000 verwendet wurden, z. B. eine Millipore-Pellikan-Membran. Die Tests wurden mit Hilfe eines RIA, wie in Beispiel 6 beschrieben, durchgeführt.

Der Überstand aus der Ultrafiltration wurde gegen 4ml eines lOmM-Natriumpho.viiatpuffers (pH 7,0) diafiltriert.

Die konzentrierten und diafiltrierten, konditionierten Medien enthielten 2,5mg EPO (380mg Gesamtprotein). DieEPO-Lösung wurde auf 186ml weiterkonzentriert und die ausgefallenen Proteine wurden 30 Minuten lang bei 120000xg abzentrifugiert. Der Überstand, der 2,0mg EPO enthielt, wurde mit 50%iger Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt, 30 Minuten bei 4°C gerührt und der Niederschlag 30 Minuten lang bei 13000xg abzentrifugiert.

Carbonylmethyl-Sepharose-Chromatographie

Der Überstand der Zentrifugation (20 ml), der 200pg von EPO (24 mg Gesamtprotein) enthielt, wurde auf eine Säule aufgetragen, die mit CM-Sepharose (20ml) gepackt und mit 1OmM Natriumacetat (pH 5,5) äquilibriert war. Anschließend wurde die Säule mit 40 ml des gleichen Puffers gewaschen. Das an die CM-Sepharose gebundene EPO wurde nach 100 ml eines Gradienten von NaU (0-1) in 1OmM Natriumphosphat (pH 5,5) eluiert. Die Fraktionen, die EPO enthielten (insgesamt 50μg von 2mg Gesamtprotein) wurden vereinigt und auf 2ml mit Hilfe einer Amicon-YMIO-Ultrafiltrationsmembran konzentriert.

Reversed-phase-HPLC

Die konzentrierten Fraktionen nach der Säulenchromatographie, die EPO enthielten, wurden weiter durch reversed-phase-HPLC über eine Vydac C-4-Säule gereinigt. Das EPO wurde mit einer Flußrate von 1 m! min auf die Säule aufgetragen, die mit 10% Lösung B (Lösung A war 0,1% CF₃COOH in Wasser; Lösung B war 0,1% CF₃COOH in CF₃CN) äquilibriert wurde. Die S.iule wurde mit 10% der Lösung B 10 Minuten lang gewaschen und das EPO wurde mit einem linearen Gradienten von B (10-70%; 60min) eluiert. Die EPO enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt (ungefähr 40 pg von EPO von 120pg Gesamtprotein) und lyophilisiert. Das lyophilisierte EPO wurde in 0,1 m Tris-HCI-Puffer (pH 7,5) mit 0,15 m NaCI rekonstituiert und auf einer reversed-phase-HPLC rechromatographiert. Die EPO enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid-(10%)-Gel Elektrophorese (Lameiü, U.K. Nature) analysiert. Die vereinigten Fraktionen von EPO enthielten 15,5pg von EPO(25Mg Gesamtprotein).

Claims (5)

1. Verfahrer ^ur Herstellung von Erythropoiethin, dadurch gekennzeichnet, daß

A) Wirtszellen in einem entsprechenden Medium gezüchtet werden, die eine im wesentlichen in Abb. 3 B dargestellte DNA-Sequenz enthalten, die wirksam an eine Expressions-Kontrollsequenz gebunden ist und das auf diese Weise von den Zellen und dem Medium produzierte Erythropoietin abgetrennt wird

oder

B) eukaryontische Wirtszellen in einem entsprechenden Medium gezüchtet werden, die eine wie im wesentlichen in Abb.4C dargestellte DNA-Sequenz enthalten, die wirksam an eine Expressions-Kontrollsequenz gebunden ist, und das auf diese Weise von den Zellen und dem Medium produzierte Erythropoietin abgetrennt wird.

2. Vorfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen Säugerzellen sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Säugerzellen 3T3-Zellen sind.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Säugerzellen Ovarienzellen des China-Hamsters (CHO) sind.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die betreffende DNA-Sequenz in einem Vektor beinhaltet ist, der auch die Rinder-Papilloma-Virus-DNA enthält.