DE69034171T2 - Rekombinanter Proteaseinhibitor des Alzheimer-Amyloid-Proteins - Google Patents

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Description

  • Fachgebiet
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Analogon vom Protease-Inhibitor des humanen Amyloidplaque-Core-Proteins.
  • Hintergrund
  • Über die Demographie der Alzheimer-Krankheit liegen immer bessere Kenntnisse vor. Es wird geschätzt, dass über 5% der Bevölkerung der USA über 65 Jahren und über 15% der Bevölkerung über 85 Jahren von dieser Krankheit befallen sind (Cross, A. J., Eur J Pharmacol (1982) 82: 77–80; Terry, R. D., et al., Ann Neurol (1983) 14: 497–506). Es wird davon ausgegangen, dass der Hauptgrund für die Unterbringung von älteren Menschen in Dauer-Pflegeeinrichtungen auf diese Krankheit zurückzuführen ist und dass etwa 65% jener, die in Fachpflegeeinrichtungen sterben, daran gelitten haben.
  • Was das Problem, dass die Therapie derzeit eine Sache des Eperimentierens ist, noch verwirrender macht, ist, dass die Diagnose ebenfalls unzuverlässig ist. Es gibt keinen umkomplizierten diagnostischen Test, und die Diagnose beruht auf einer Reihe von Auswertungen auf der Basis von negativen Ergebnissen für alternative Erklärungen für die aufgewiesene Symptomatik. Ausgehend von der Annahme, dass das Vorhandensein der Krankheit nach dem Tode durch Autopsien des Gehirns exakt beurteilt werden kann, zeigen die derzeitigen Ergebnisse, dass die aktuellen diagnostischen Methoden bei lebenden Individuen eine Rate von etwa 20% falsch positiver Diagnosen erbringt.
  • Es wäre extrem hilfreich für die Zuweisung einer geeigneten Pflege für die Patienten und die Entwicklung von Therapien, eine unkomplizierte Assaymethode für die Diagnose des Vorhandenseins von Alzheimer-Krankheit zur Verfügung zu haben. Die nachstehend beschriebene Erfindung bietet einen Ansatz für diese Diagnose.
  • Gewisse Tatsachen über die biochemischen und metabolischen Phänomene in Verbindung mit dem Vorhandensein der Alzheimer-Krankheit sind bekannt. Zwei morphologische und histopathologische Veränderungen, die in den Gehirnen von Alzheimer-Kranken bemerkt wurden sind Fibrillenveränderungen (NFT) und Amyloidablagerungen. Intraneuronale Fibrillenveränderungen sind auch bei anderen degenerativen Erkrankungen vorhanden, doch scheint das Vorhandensein von Amyloidablagerungen sowohl in den interneuronalen Räumen (neuritische Plaques) als auch im umgebenden Mikrogefäßsystem (vaskuläre Plaques) für Alzheimer charakteristisch zu sein. Von diesen scheinen die neuritischen Plaques am weitesten verbreitet zu sein (Price, D. L., et al., Drug Development Research (1985) 5: 59–68). Plaques sind auch in den Gehirnen von älteren Down-Syndrom-Patienten, die die Alzheimer-Krankheit entwickeln, zu erkennen.
  • Das Protein, das die Masse dieser Plaques ausmacht, wurde teilweise ausgereinigt und sequenziert. Plaquereiche Gehirne von verstorbenen Alzheimer-Patienten wurden als einer Quelle zum Extrahieren eines "Core"-Polypeptids von etwa 4,2 kd, des Amyloidplaque-Core-Proteins (APCP), hierin bezeichnet als "β-Amyloid-Core-Protein", verwendet. Dieses Peptid wurde als β-Protein von Glenner, G., et al., [Biochem Biophys Res Commun (1984) 120: 885–890] bezeichnet. Die Aminosäuresequenz des Amino-Terminus wurde bestimmt [Glenner, G., et al., Biochem Biophys Res Commun (1984) 122: 1131–1135; Masters, C. L., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82: 4245–4259], wobei die von den beiden Gruppen berichteten Aminosäurensequenzen identisch sind, außer, dass Glenner et al. ein Glutamin an Position 11 für das zerebrovaskuläre Amy- loid bei Alzheimer-Krankheit berichten, wohingegen Masters et al. eine Glutaminsäure an Position 11 berichten. Auch berichten die ersteren Autoren, dass das zerebrovaskuläre Amyloid einen unikalen Amino-Terminus aufweist, wohingegen letztere Autoren berichten, dass die in Amyloidplaque-Kernen gefundene Form einen "ausgefransten" Amino-Terminus aufweist, d. h. den aus dieser Quelle isolierten Peptiden scheinen 3, 7 oder 8 Aminosäuren vom Amino-Terminus zu fehlen. Beide Gruppen haben gezeigt, dass dasselbe Peptid in den Amyloidplaque-Kernen und dem vaskulären Amyloid von erwachsenen, mit dem Down-Syndrom befallenen Individuen gefunden wird und berichten eine Glutaminsäure an Position 11.
  • Weitere Untersuchungen des β-Amyloid-Core-Proteins wurden außerdem vorgenommen von Roher, A., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1986) 83: 2662–2666, was die vollständige Aminosäure-Zusammensetzung des Proteins ergab und verifizierte, dass diese keiner eines bekannten Proteins entsprach. Die erhaltenen Zusammensetzungen stimmten jedoch ganz offensichtlich nicht mit denen von Allsop, D., et al., Brain Res (1983) 259: 348352 überein; noch bestand eine Übereinstimmung mit den von Glenner oder Masters (supra) veröffentlichten Zusammensetzungen.
  • Wong, C. W., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82: 8729–8732 zeigten, dass ein synthetisches Peptid, das homolog zu den ersten zehn Aminosäuren des von Masters (supra) beschriebenen β-Amyloid-Core-Proteins war, in der Lage war, Antikörper in Mäusen zu züchten, und dass diese Antikörper zum Färben nicht nur von Amyloid-beladenen Zerebralgefäßen, sondern auch von neuritischer Plaque verwendbar waren. Diese Ergebnisse wurden bestätigt von Allsop, D. et al., Neuroscience Letters (1986) 68: 252–256, unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die gegen ein synthetisches Peptid entsprechend den Aminosäuren 8–17 gerichtet warten. Daher scheint das in verschiedenen Lokalisationen des Gehirns von Alzheimer-Patienten gefundene Plaque-Protein hinsichtlich der Immunreaktivität im allgemeinen ähnlich zu sein. Es ist in hohem Grade unlöslich, wie durch die Unmöglichkeit gezeigt, einen Aufschluss in vielen herkömmlicherweise verwendeten Denaturierungsmitteln wie Detergenzien oder chaotropen Agenzien zu erreichen (Masters, supra, Allsop, D., et al., (supra)).
  • Es wird in Analogie zu einigen anderen Amyloid-Proteien angenommen, dass das β-Amyloid-Core-Protein aus einem Vorläufer im peripheren Kreislaufsystem oder lymphatischen System gebildet wird. Es gibt sechs bekannte Fälle von Krankheits-assozierten Amyloidablagerungen, bei denen die Beschaffenheit des Vorläufer-Proteins für das Amyloid-Protein bekannt ist: für die primäre Amyloidose ist die Quelle eine Immunglobulin-Leichtkette; für die sekundäre Amyloidose ist der Vorläufer das Amyloid-A-Protein; für die Familiäre Amyloid-Polyneuropathie und die senile Herzamyloidose ist es Präalbumin oder eine Variante davon; für das medulläre Karzinom der Schilddrüse ist es ein Procalcitonin-Fragment; und für die hereditäre Zerebralblutung ein Gamma-Trace-Fragment (siehe z. B. Glenner, G. New England Journal of Medicine (1980) 302: 1283; Sletton, K., et al., Biochem J (1981) 195: 561; Benditt, et al., FEBS Lett (1971) 19: 169; Sletton, K., et al., Eur J Biochem (1974) 41: 117; Sletton, K. et al., J Exp Med (1976) 143: 993). Das Vorangegangene stellt eine Teilauflistung dar, wobei es zumindest eine Anzahl weiterer Nachweise hinsichtlich des Procalcitonin-Fragments als einem Vorläufer für das Amyloid des Schilddrüsen-Karzinoms gibt. Alternativ oder zusätzlich kann solch ein Vorläufer für β-Amyloid-Core-Protein im Gehirn gebildet werden.
  • Es wurde beschrieben, dass ein Protein, das die β-Amyloid-Core-Proteinsequenz innerhalb des Gerüsts eines größeren Proteins enthält, existiert (Kang, J., et al., Nature (1987) 325: 733–736). Dieses Protein, das ein potenzieller Vorläufer in vivo des β-Amyloid-Core-Proteins ist, wurde aus der Sequenz eines cDNA-Klons vorhergesagt, der aus einer humanen fötalen Gehirngewebe-cDNA-Bank isoliert wurde und aus 695 Aminosäure-Resten besteht, wobei der Amino-Terminus des β-Amyloid-Core-Proteins bei Position 597 beginnt. In Analogie zur oben beschriebenen Reihe kann es sein, dass solch ein Vorläufer oder ein Fragment davon im Serum in einer bei Alzheimer-Erkrankten differenzierbaren Höhe, relativ zu nicht-betroffenen Individuen, zirkuliert. Alternativ oder zusätzlich können solche Differenzen in der Zerebrospinalflüssigkeit nachgewiesen werden.
  • Gemäß der Erfindung wird die Verwendung eines Analogons vom Protease-Inhibitor des humanen Amyloidplaque-Core-Protein bereitgestellt mit der folgenden Aminosäuresequenz:
    GluValCys SerGluGln AlaGluThr GlyProCys ArgAlaMet IleSerArg TrpTyrPhe AspValThr GluGlyLys CysAlaPro PhePheTyr GlyGlyCys GlyGlyAsn ArgAsnAsn PheAspThr GluGluTyr CysMetAla ValCysGly SerAlaIle
    worin die Aminosäure Arginin an Position 13 durch Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan ersetzt ist, in der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Chymotrypsin-Aktivität.
  • Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Analogon vom Protease-Inhibitor des humanen Amyloidplaque-Core-Protein bereit mit der folgenden Aminosäuresequenz:
    GluValCysSerGluGlnAlaGluThrGlyProCysArgAlaMet
    IleSerArgTrpTyrPheAspValThrGluGlyLysCysAla
    ProPhePheTyrGlyGlyCysGlyGlyAsnArgAsnAsnPhe
    AspThrGluGluTyrCysMetAlaValCysGlySerAlaIle
    worin die Aminosäure Arginin an Position 13 durch Leucin, Methionin oder Valin ersetzt ist, in der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Elastase-Aktivität.
  • Diese und weitere Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden bei Lektüre der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen umfassender erkennbar werden.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Basensequenz eines cDNA-Klons, bezeichnet als λAPCP168i4, welcher die Aminosäuren 1–751 des β-Amyloid-verwandten Proteins codiert. Das 168 bp-Insert, welches diesen Klon von der Sequenz von Kang et al. unterscheidet, ist unterstrichen.
  • 2 zeigt eine DNA-Sequenz eines genomischen Klons, die die ersten 18 Aminosäuren des β-Amyloid-Core-Proteins codiert, wie beschrieben von Masters et al. Sie codiert außerdem ein diesen Aminosäuren unmittelbar vorangehendes Methionincodon, das potenziell als ein Initiationscodon verwendet werden könnte;
  • 3 zeigt die Basensequenz eines cDNA-Klons, bezeichnet als λSM2W4, dessen 3'-Ende die ersten vier Aminosäuren des β-Amyloid-Core-Proteins codiert. Sie codiert außerdem ein diesen Aminosäuren unmittelbar vorangehendes Methionincodon, wie oben beschrieben;
  • 4 zeigt die Basensequenz eines cDNA-Klons, bezeichnet als λSM2W3, welche 97 Aminosäuren codiert; die ersten 26 davon entsprechen der Region des β-Amyloid-Core-Proteins, wie beschrieben von Masters et al., von Glu3 bis Ala28;
  • 5 zeigt die Basensequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz eines β-Amyloid-verwandten Proteins, die von λSM2W4 und λSM2W3 abgeleitet sind;
  • 6 zeigt das Nukleotid und die abgeleitete Aminosäuresequenz des λSM2W9-β-Amyloid-Klons;
  • 7 zeigt einen Vergleich der Sequenzen von λSM2W3 und λSM2W9;
  • 8 zeigt die Detektion der mRNAs für λAPCP168i4 und der von Kang et al. beschriebenen mRNA auf einem Nothern-Blot, wie unter Verwendung von RNAs erzeugt, die aus menschlichem Gehirn und Humanzellen in Kultur isoliert und an Oligonukleotidsonden hybridisiert wurden, die für jede Spezies spezifisch sind;
  • 9 zeigt das Konstruktionsschema für einen bakteriellen Expressionsvektor zur Produktion eines β-Amyloid-verwandten Proteins in Bakterien;
  • 10 zeigt das Konstruktionsschema für einen rekombinanten Vaccinia-Virus-Expressionsvektor zur Expression des durch λAPCP168i4 codierten Proteins;
  • 11 zeigt das Konstruktionsschema für einen Säugerzell-Expressionsvektor zur Expression des durch λAPCP168i4 codierten Proteins;
  • 12 zeigt die Konstruktion eines Expressionsvektors für die Produktion des in 5 beschriebenen β-Amyloid-verwandten Proteins, wenn das unmittelbar stromaufwärts der β-Amyloid-Core-Proteinsequenz codierte Methionin als ein initiierendes Methionin verwendet wird;
  • 13 zeigt die Verwandtschaft des Peptids, das durch das λAPCP168i4-168-bp-Insert codiert ist, mit einer Superfamilie von Proteinen, von der viele Mitglieder eine Inhibitionsaktivität für basische Proteasen zeigen; und
  • 14 zeigt die Konstruktion eines synthetischen Tryptophan-Operon-Promotors und einer Operator-Regulationssequenz, ebenso wie eine Restriktionsstellen-Karte des Plasmids pTRP233.
  • 15 zeigt die Ergebnisse einer Western-Blot-Analyse der CV-1-Zellen, die das β-Amyloid-Protein mit 751 Aminosäuren produzieren, unter Verwendung von β-Amyloid-spezifischen polyklonalen Antiserum. Als Kontrolle dient das pSC11-Vaccinia-Virus, dem die β-Amyloid-codierende Sequenz fehlt.
  • 16 zeigt eine Darstellung der Oligonukleotidsequenzen, die zur Konstruktion von chimären Genen verwendet werden, die entweder die ompA-Signalsequenz, fusioniert an die Protease-Inhibitorsequenz (16A), oder die phoA-Signalsequenz, fusioniert an die Protease-Inhibitorsequenz (16B), enthält. Die Sternchen weisen auf die für jede Konstruktion verwendeten einzelnen Oligonukleotide hin.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • A. Definitionen
  • Wie hierin verwendet, meint "β-Amyloid-Core-Protein" das von Masters, C. L., et al. Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82: 4245–4249, beschriebene Protein, das hierin als "Masters, et al." bezeichnet wird. Dieses ca. 4 kD-Protein ist am Amino-Terminus per Sequenzanalyse als ein Gemisch aus vier Peptiden mit leicht abweichenden Amino-Termini definiert, wobei die Amino-Termini der drei kleineren Peptide vollständig durch den des größten codiert sind. Die ersten 28 Aminosäuren der längsten Form sind Asp1-Ala2-Glu3-Phe4-Arg5-His6-Asp7-Ser8-Gly9-Tyr10-Glu11-Val12-His13-His14-Gln15-Lys16-Leu17-Val18-Phe19-Phe20-Ala21-Glu22-Asp23-Val24-Gly25-Ser26-Ser27-Ala28.
  • "β-Amyloid-verwandtes Protein" oder "β-Amyloid-verwandtes Peptid", wie hierin definiert, sind solche Proteine, die innerhalb ihrer Sequenz die β-Amyloid-Core-Proteinsequenz, wie oben definiert, oder Fragmente solcher Proteine enthalten, die nicht notwendigerweise die oben definierte β-Amyloid-Core-Proteinsequenz umfassen. Als ein Beispiel wird diese Bezeichnung zur Bezugnahme auf das Protein verwendet, beschrieben von Kang, J. et al., Nature (1987) 325: 733–736, hierin bezeichnet als "Kang, et al.", welches das β-Amyloid-Core-Protein innerhalb seiner Struktur bei Aminosäure 597 eines Proteins mit 695 Aminosäuren enthält. Als ein anderes Beispiel betrifft sie das Protein, das durch λAPCP168i4 codiert ist, wie in 1 gezeigt, welches innerhalb seiner Struktur das β-Amyloid-Core-Protein bei Aminosäure 653 eines Proteins mit 751 Aminosäuren enthält.
  • "Immunogenes β-Amyloid-Core-Peptid" oder "immunogenes β-Amyloid-verwandtes Peptid" beziehen sich auf Peptide, deren Aminosäurensequenzen denen einer bestimmten Region des β-Amyloid-Core-Proteins oder β-Amyloid-verwandten Proteins entspricht, und die zum Provozieren einer Antikörperreaktion in einem immunisierten Tier fähig sind.
  • "Genetische Prädisposition für Alzheimer-Krankheit" bezieht sich auf eine identifizierbare genetische Mutation oder Alteration, die in den Genomen von Individuen mit Alzheimer-Krankheit gefunden wird, oder solcher Individuen, die zur Entwicklung der Alzhei mer-Krankheit destiniert sind, doch nicht in normalen (nicht-erkrankten) Individuen.
  • B. DNA-Sequenzen
  • DNAs entsprechend β-Amyloid-Core-Protein oder β-Amyloid-verwandten Proteinsequenzen sind als Sonden in der Diagnostik nützlich. Mehrere DNAs, die Sequenzen enthalten, die Abschnitte einer β-Amyloid-verwandten Proteinsequenz und β-Amyloid-Core-Proteinsequenz mit angrenzenden nicht-codierenden Segmenten codieren, sind hierin beschrieben. Diese DNA-Sequenzen sind daher als Ganzes oder als Teil in der Diagnostik entweder als intakte Sonden oder als Fragmente nützlich.
  • Eine DNA-Sequenz, die ein β-Amyloid-verwandtes Protein codiert, umfassend die Nukleotidsequenz und die entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz, ist in 1 gezeigt. Diese DNA-Sequenz codiert ein etwa 82.610 Dalton-Protein, das das β-Amyloid-verwandte Core-Protein enthält.
  • Die in 1 dargestellte β-Amyloid-Protein-cDNA-Sequenz kann aus dem Bakteriophagen λAPCP168i4 isoliert werden. Dieser humane Fibroblasten-cDNA-Klon wurde erhalten aus einer cDNA-Bank, die in λgt10 unter Anwendung standardmäßiger Techniken aus SV40-transformierten Fibroblasten-(SV80)-Zellen hergestellt wurde (Todaro, G. J., et al., Science (1966) 153: 1252–1254). Die λgt10-SV80-Bank wurde mit einem Gemisch von markierten Oligonukleotiden gescreent. Zwei unikale Phagen, die β-Amyloid-verwandte Sequenzen enthielten, wurden erhalten; diese β-Amyloid-verwandten Sequenzen wurden in einen Plasmid-Vektor subkloniert, und die Sequenzieranalyse ergab eine mit der Sequenz, die das Kang et al.-β-Amyloid-verwandte Protein codiert, colineare Sequenz, mit Ausnahme des Vorhandenseins eines 168-Basenpaar-Inserts. Das 168-Basenpaar-Insert unterbricht das Codon für Val289 der Kang et al.-Sequenz, was zum Verlust dieser Aminosäure aus dem λAPCP168i4-Protein führt. Das 168-Basenpaar-Insert codiert, zusammen mit den aus dem unterbrochenen Val289-Codon gewonnenen 3 Basenpaaren, 57 neue Aminosäuren, die in 1 unterstrichen sind. Stromabwärts dieser Insertion liegt bei Codon 653 der 1 das Amino-terminale Aspartat des β-Amyloid-Core-Proteins, beschrieben von Masters et al. Der λAPCP168i4-Klon wurde hinterlegt bei ATCC am 1. Juli 1987 unter der Zugriffs nummer 40347.
  • Besonders nützlich sind jene Sequenzen, die das in λAPCP168i4 gefundene Insert von 57 Aminosäuren codieren, als auch solche Sequenzen, die die entsprechende "Junktion" der Kang et al.-β-Amyloid-verwandten Proteinsequenz codieren.
  • Zum Beispiel sind DNA-Sequenzen, die ein β-Amyloid-verwandtes Protein mit einer Aminosäuresequenz entsprechend den Resten 289 bis 345 des oben identifizierten Proteins codieren, d. h. ein β-Amyloid-verwandtes Protein der Aminosäuresequenz:
  • Figure 00090001
  • Dieses spezielle Peptid, einschließlich seiner Fragmente, unterscheidet das in 1 dargestellte β-Amyloid-verwandte Protein von anderen berichteten Formen.
  • In dieser Beschreibung wird auch ein β-Amyloid-verwandtes Protein mit der DNA-Sequenz und der abgeleiteten Aminosäuresequenz entsprechend den Aminosäure-Resten 284-Val289-(V289-345)-349 der in 1 dargestellten β-Amyloid-verwandten Sequenz offengelegt (worin V eine Deletion der Reste 289 bis 345 symbolisiert). Ein diese spezifische Region durchspannendes Oligopeptid wäre zur Erzeugung eines Proteinspezifischen diagnostischen Reagenz zur Differenzierung zwischen der von Kang et al. beschriebenen genetischen Variante des β-Amyloid-verwandten Proteins und des in 1 dargestellten β-Amyloid-verwandten Proteins nützlich. Daher umfasst dieses ein β-Amyloid-verwandtes Protein der Aminosäuresequenz:
  • Figure 00090002
  • Ein innerhalb der Sequenz dieses Peptids enthaltenes kleineres Peptid könnte eben falls verwendet werden.
  • Oligonukleotide, die für das 168-Basenpaar-Insert und für die Junktionen dieser Region des von Kang et al. beschriebenen β-Amyloid-verwandten Proteins spezifisch sind, können synthetisiert und zum Vergleich der Höhen der mRNA-Expression dieser beiden unterschiedlichen Proteine verwendet werden. Als ein Beispiel wurden für das 168-Basenpaar-Insert spezifische Oligonukleotide, bezeichnet als Oligo #2734
    Figure 00100001
    und für die "Junktions"-Region, bezeichnet als Oligo #2733
    Figure 00100002
    unter Anwendung der Phosphoramidit-Chemie auf einem Applied Biosystems DNA-Syntheseautomaten synthetisiert.
  • Das "Junktions"-Oligo ist zu 15 Basenpaaren auf beiden Seiten des Inserts komplementär und wird zur Unterscheidung zwischen der veröffentlichten β-Amyloid-verwandten Proteinsequenzen und der λAPCP168i4-Sequenzen unter im Fachgebiet bekannten spezifischen Hybridisationsbedingungen verwendet, unter denen eine perfekte Passung von 15 Basenpaaren instabil ist, wohingegen eine perfekte Passung von 30 Basenpaaren stabil ist. Diese Oligonukleotide werden zum Screenning von cDNA-Banken oder von mRNA von verschiedenen Quellen als einem Assay zur Messung der Expressionshöhe einer spezifischen Sequenz verwendet.
  • Ein anderes nachstehend beschriebenes Beispiel ist eine genomische Sequenz, die die ersten 18 Aminosäuren (19, sofern Met enthalten ist) der β-Amyloid-Proteinsequenz codiert, die für Alzheimer-Krankheit in neuritischen Plaques charakteristisch sind. Der Klon wurde erhalten in λ Charon 4A aus der genomischen Bank, beschrieben von Lawn, R. M., et al., Cell (1978) 15: 1157–1174, und wurde teilweise sequenziert, wie in 2 gezeigt. Wie zu erkennen, enthält der sequenzierte Abschnitt des genomischen Klons ein 57-Basenpaar-Segment, welches die Aminosäuren 1–18 des zuvor berichteten β-Amyloid-Core-Proteins und ein unmittelbar vorangehendes Methionin codiert. Stromabwärts des 18-Aminosäure-Codons weicht die genomische Sequenz hinsichtlich der Codonsequenz von der ab, die für die berichtete Aminosäuresequenz des β-Amyloid-Core-Proteins zu erwarten war. Unter Bezugnahme auf das durch die Sequenz der 4 codierte Protein und durch Untersuchung der Sequenzen, die diese Region flankieren, unter Einbeziehung von im Fachgebiet bekannten Kenntnissen, handelt es sich bei dieser Divergenz wahrscheinlich um eine Intronsequenz. Dieser Klon, bezeichnet als λSM2, wurde hinterlegt bei ATCC am 13. November 1986.
  • Eine von dem genomischen Klon (siehe 2) abgeleitete HindIII/RsaI-Sonde wurde als einer Sonde zum Isolieren von cDNA-Fragmenten gemäß standardmäßiger Verfahrensweisen aus einer cDNA-Bank verwendet, die in λgt10 aus temporalem und parietalem Cortexgewebe eines normalen menschlichen Gehirns (das Individuum war ein 55 Jahre alter Mann, der an Herzinfarkt gestorben war) konstruiert. Die drei cDNA-Klone, die isoliert wurden, wurden in konventioneller Weise sequenziert und eine Passung mit Aminosäuresequenzen in jedem der drei möglichen Leseraster zum Identifizieren der Regionen, die für β-Amyloid-verwandte Proteine codieren, vorgenommen. Einer der Klone, bezeichnet als λSM2W4, enthält eine 3'-End-terminale Sequenz, welche die Asp Ala Glu Phe-Aminosäuren am 5'-Ende des β-Amyloid-Core-Proteins codiert, wie zu sehen in 3, welche die komplette Basensequenz des Klons zeigt. Dem Asp1-Codon geht unmittelbar ein Methionincodon voran. Ein zweiter Klon, bezeichnet als λSM2W3, enthält ein 5'-Region-Segment, welches eine 6-bp-Überlappung mit dem 3'-Ende des λSM2W4-Klons (einer EcoRI-Restriktionsstelle) aufweist, die Aminosäuren 3 und 4 des β-Amyloid-Core-Proteins codiert, und zusätzliche 95 Codons, die den Rest eines β-Amyloid-verwandten Proteins codieren. Die DNA-Sequenz für das Protein von 100 Aminosäuren (einschließlich Met), codiert in λSM2W4 und λSM2W3, ist in 5 gezeigt. Es ist natürlich klar, dass das Methionin möglicherweise in vivo prozessiert wird und dass das in dieser Figur dargestellte β-Amyloid-verwandte Protein daher eine Sequenz aus 99 Aminosäuren sein kann.
  • Ein dritter cDNA-Klon codiert einen Abschnitt eines β-Amyloid-verwandten Proteins, welcher von λSM2W3 in der Region abweicht, wie durch Differenzen von 15 Nukleotiden und Differenzen von 4 Aminosäuren in der Region der Aminosäuren 3 bis 44 der 5 gezeigt. Die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz für diesen Klon, bezeichnet als λSM2W9, sind in 6 angegeben. Ein Vergleich mit λSM2W3 ist in 7 angegeben.
  • C. Protein-Produktion
  • Die hierin beschriebenen cDNA-Klone ermöglichen die Konstruktion von Codierungssequenzen, die zum Erhalt eines vollständigen β-Amyloid-verwandten Proteins, eines β-Amyloid-verwandten Proteins von 100 Aminosäuren, das die für β-Amyloid-Core-Protein berichteten Amino-terminalen Sequenzen enthält, und weiterer gewünschter Proteine exprimiert werden können. Diese Sequenzen können in einen geeigneten Expressionsvektor zur Produktion des Proteins inseriert werden. Einzelheiten zur Methode des Konstruierens einer DNA-Subsequenz der 1 und die Insertion dieser Sequenz in einen bakteriellen Expressionsvektor sind in Beispiel 2 wiedergegeben.
  • Kurz gesagt wurde ein E. coli-Expressionsvektor, bezeichnet als pAPCP118-3, für die Expression eines Fusionsproteins konstruiert, bestehend aus den in 1 angegebenen Aminosäure-Resten 655 bis 751. Die Konstruktion des pAPCP118-3 wurde durch Zusammenbringen der folgenden drei Fragmente erreicht: (1) einem Plasmid-Rückgrat (bestehend aus pBR322-Replikationsfunktionen, einem Ampicillin-Resistenzgen, dem Tryptophan-Promotor und Operator, einer Ribosomen-Bindungsstelle, der DNA, die sieben Amino-terminale Codons des β-Galactosidase-Strukturgens codiert, gefolgt von sechs Threonin-Resten und den Transkriptions-Terminationssignalen); (2) einem Eco-RI-HaeII-Fragment, das die Aminosäure-Reste 655–728 der Sequenz der 1 codiert; und (3) ein synthetisches Fragment, das die Aminosäure-Reste 729–751 der Sequenz der 1 codiert, gefolgt von einem Stoppcodon.
  • Der resultierende Vektor wurde zum Transformieren von E. coli-W3110 verwendet, und die Expression des Fusionsproteins wurde durch Reduzieren der Tryptophankonzentration, gefolgt von der Zugabe von 3–8-Indolacrylsäure, induziert. Das resultierende Protein kann unter Anwendung herkömmlicher Reinigungstechniken ausgereinigt werden, woraufhin das resultierende gereinigte Material zur Verwendung in der Produktion von Antikörpern für diagnostische Assays zur Verfügung steht.
  • Die komplette Codierungssequenz des in 1 dargestellten β-Amyloid-verwandten Proteins wurde in zwei Fragmente aus dem hinterlegten λAPCP168i4-Klon subkloniert und in pSC11 inseriert, einem Vaccinia-Virus-Expressionsvektor. Die Konstruktion des resultierenden Vektors, pFL4T4BV, ist in 10 veranschaulicht. Kurz gesagt wird ein etwa 1,06 Kilobasen-(kb)-EcoRI-Fragment, das die Aminosäure-Reste 655–751 des in 1 dargestellten Proteins überspannt, in EcoRI-verdautes Plasmid pGEM-3TM (erhältlich von Promega Biotec) kloniert, um einen Intermediat-Vektor zu schaffen, bezeichnet als p4BI. Anschließend wurde p4BI mit HindIII verdaut, um einen Großteil der 3'-nicht-codierenden Sequenz der β-Amyloid-verwandten Sequenz zu entfernen. Der resultierende Vektor p4BΔRI wurde mit EcoRI verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt, bevor er in das 2088 bp-EcoRI-Fragment, abgeleitet von λAPCP168i4, ligiert wurde, um p4T4B zu erhalten. Dieses Plasmid wurde mit SmaI und XmnI verdaut, um ein 2678 bp-Fragment zu erzeugen, das die komplette, in 1 gezeigte Protein-codierende Sequenz überspannte.
  • Das durch dieses SmaI-XmnI-Fragment codierte Gen wurde in einen wohlbekannen Vaccinia-Virus-Vektor, pSC11, zur anschließenden Expression des β-Amyloid-verwandten Proteins in CV-1-Affennierenzellen unter Verwendung eines eukaryontischen transienten Expressionssystems inseriert, wie beschrieben bei Cochran, M. A., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82: 19–23. Häufiger wird dieser Vektor zur in vivo-Protein- und Antikörper-Produktion in Tieren verwendet, nachdem seine Sequenzen in das Vaccinia-Virus-Genom inseriert wurden (siehe nachstehender "Antikörper-Produktions"-Abschnitt).
  • In ähnlicher Weise können Säuger-Vektoren zur Expression des hierin beschriebenen β-Amyloid-Core-Proteins oder β-Amyloid-verwandten Proteins genützt werden. Zum Beispiel enthält Plasmid phGH-SV (10) (ein in EPA 217 822, veröffentlicht am 15. April 1987, beschriebenes und hierin durch Bezugnahme mit aufgenommenes Plasmid) ein pUC8-Plasmid-Rückgrat, den hMT-IIa-Genpromotor und Regulatorelemente, SV-40- DNA-Promotor und Enhancer-Elemente, und die codierenden Abschnitte des hGH-Gens und die 3'-regulatorischen Sequenzen. Dieses Plasmid kann mit BamHI und SmaI verdaut und mit BamHI-Linkern behandelt werden, um die humanes Wachstumshormon-Protein codierende Sequenz zu deletieren und die 3'-nicht-codierenden Sequenzen und regulatorischen Elemente an das Plasmid-Rückgrat angeknüpft zu belassen. Dieses DNA-Stück von etwa 5100 Basenpaaren wird gelgereinigt und an BamHI-Linker ligiert. Der Verdau mit BamHI, die nochmalige Reinigung des DNA-Fragments und die anschließende Ligation ergeben ein als pMTSV40 polyA Bam bezeichnetes Plasmid, welches die strukturellen und regulatorischen Elemente enthält, die einen Säugerzell-Expressionsvektor ausmachen. Nach dem BamHI-Verdau des pMTSV40 polyA BamHI und der Reparatur in Gegenwart von DNA-Polymerase I und aller vier dNTPs, steht dieser Vektor zur Insertion des 2678 bp-SamI-XmnI-Restriktionsfragments des Plasmids p4T4B zur Verfügung. Der resultierende Vektor kann für eine effiziente Proteinexpression in CHO-Zellen verwendet werden, wie in Beispiel 4 beschrieben.
  • Außerdem kann die Sequenzinformation aus dem λSM2W4-Klon, dargestellt in 3, kombiniert mit den im λSM2W3-Klon vorhandenen Sequenzen, zur Konstruktion eines Säugerzell-Expressionsvektors verwendet werden, der das in 5 beschriebene Protein codiert.
  • Der sekretierte Proteaseinhibitor kann in biologisch aktiver, rückgefalteter und im wesentlichen reiner Form aus der Bakterienbrühe unter Verwendung einer Festträger-Affinitätsmatrix, wie zum Beispiel Sepharose-Kügelchen, an die eine Serinprotease mit hoher Affinität für die Inhibitor-Aktivität gebunden ist, rückgewonnen werden. Zu für diesen Zweck verfügbaren Enzymen zählen zum Beispiel die humanen Serinproteasen Trypsin und Chymotrypsin. Ist der Proteaseinhibitor einmal an den Kügelchen eingefangen, so kann das Protein unter Anlegen saurer Bedingungen, wie etwa einem niedrigen pH-Milieu im Bereich von etwa 1,0 bis 5,0, bevorzugt 1,25, eluiert werden. Das eluierte Protein kann wesentlich ausgereinigt werden, das heißt zu mindestens 70%, bevorzugt 80%, bevorzugter 90%, am bevorzugtesten zu mindestens 95%, rückgewonnen werden, wie mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) gemessen (z. B. einer C4-Säule unter Verwendung eines 60% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure- Elutionsgradienten).
  • D. Antikörper-Präparierung
  • Gegen β-Amyloid-Core-Protein und β-Amyloid-verwandte Proteine spezifische Antikörper werden mittels bekannter Verfahrensweisen präpariert. Beispielsweise wird unter Verwendung synthetischer Peptide typischerweise die Proteinsequenz für Regionen von mindestens etwa 10 Aminosäuren Länge analysiert, die hauptsächlich polare und/oder geladene Aminosäure-Reste aufweisen, um günstige immunogene Regionen zu identifizieren.
  • Als anderes Beispiel kann die in 1 gezeigte DNA-Sequenz für das Design von Oligopeptiden verwendet werden, die für die inserierte Sequenz in λAPCP168i4 spezifisch sind, als auch die entsprechende Junktion dieses Inserts an das β-Amyloid-verwandte Protein, beschrieben von Kang et al. Zum Beispiel kann ein Oligopeptid, das die inserierte Junktion überspannt, wie etwa Glu-Glu-Val-Val-Arg-Val-Pro-Thr-Thr-Ala, zur Immunisierung von Tieren verwendet werden, um ein spezifisches Antiserum gegen diese von Kang et al. beschriebene Region des Proteins zu erzeugen. Die Untersuchung der Kang et al.-Sequenz ohne Kenntnis der λAPCP168i4-Sequenz würde die zur Identifizierung dieses Peptids erforderliche Information als einem wertvollen Reagenz mittels irgendeiner im Fachgebiet bekannten Methode nicht liefern. Als ein anderes Beispiel könnten Oligopeptide, die zur Darstellung der in der 168-Basenpaar-Insertregion vorhandenen Sequenzen designed sind, in ähnlicher Weise verwendet werden, um ein Antiserum gegen diese unikale Region des APCP168i4-Proteins zu erzeugen. Folglich werden die Regionen, die als für die Immunogenität günstig identifziert sind, mittels herkömmlichen Peptidsynthesemethoden synthetisiert und kovalent an ein geeignetes Trägerprotein, wie etwa Napfschnecken-Hämocyanin, gebunden. Antikörper werden gegen das Peptid/Protein-Konjugat in Kaninchen oder ähnlichem mittels herkömmlichen Methoden gezüchtet. Das Vorhandensein des Antikörpers wird in immunisierten Tieren mittels standardmäßigen Methoden nachgewiesen, wie etwa der Immunreaktivität auf das immunisierende synthetische Peptid, das an einer Mikrotiterplatte fixiert ist, gefolgt von ELISA.
  • Eine andere Methode der Antikörperproduktion verwendet das bakteriell erzeugte β-Amyloid-verwandte Fusionsprotein des Beispiels 2 als dem Immunogen. Die Immunogenität dieses Proteins wird durch die Immunreaktivität des Antiserums auf das bakteriell erzeugte Fusionsprotein nachgewiesen.
  • Noch eine weitere Methode der Antikörper-Produktion beruht auf der Beimpfung des Wirtstiers mit einem rekombinanten Lebend-Vaccinia-Virus, der ein β-Amyloid-verwandtes Protein codiert, wobei solche rekombinante Viren mittels etablierter Techniken unter Einbeziehung der Rekombination zwischen dem Wildtyp-Vaccinia-Virus und den von pSC11 abgeleiteten Vektoren, wie etwa pFL4T4BV, erzeugt werden, wie hierin beschrieben. Diese Antikörper können dann in den nachstehend beschriebenen diagnostischen Assays verwendet werden.
  • Ein Panel von Antikörpern, die gegen Peptide spezifisch sind, die von unterschiedlichen Regionen des β-Amyloid-verwandten Proteins abgeleitet sind, wie etwa dem 57 Aminosäuren-Insert von λAPCP168i4, werden weiter auf die Immunreaktivität der im Serum oder der Zerebrospinalflüssigkeit von Patienten mit Alzheimer-Krankheit vorhandenen β-Amyloid-verwandten Proteine analysiert, um für einen diagnostischen Assay der Alzheimer-Krankheit geeignete Antikörper zu identifizieren, wie nachstehend erörtert.
  • E. Diagnostische und prognostische Methoden
  • Die in 3, 4 und 6 für β-Amyloid-verwandtes Protein beschriebenen DNA-Sequenzen stammen hauptsächlich von einem offensichtlich gesunden Mann im fortgeschrittenen Alter, der keine Anzeichen der Alzheimer-Krankheit zum Zeitpunkt des Todes zeigte. Die in 1 für ein anderes β-Amyloid-verwandtes Protein beschriebene λAPCP168i4-Sequenz ist von kultivierten Fibroblastenzellen abgeleitet. Diese Sequenzen liefern einen Standard zum Identifizieren von Mutationen in genomischen Sequenzen, die in Individuen mit Alzheimer-Krankheit gefunden werden und die daher wahrscheinlich mit einer Prädisposition für die Krankheit verbunden sind.
  • 1. Prognostische Methoden. Die Assays werden zur Bestimmung der genetischen Prädisposition eines Individuums für die Alzheimer-Krankheit verwendet. Diese Tests wen den die hierin bezeichneten DNA-Sequenzen in einer vergleichenden Studie mit Proben der DNA des Patienten an, um Polymorphismen in der Region des Chromosoms zu definieren, die das β-Amyloid-Gen enthält. Alternativ oder gleichzeitig können die hierin genannten DNA-Sequenzen bei einer Nukleinsäure-Hybridisationsanalyse verwendet werden, um Alterationen zu definieren, welche Alterationen Additionen, Deletionen, Mutationen oder Substitutionen in der DNA oder RNA umfassen sollen, die β-Amyloid-verwandte Proteine codiert.
  • Alterationen in den β-Amyloid-verwandten Proteinsequenzen, die mit Alzheimer-Krankheit korrelieren, können mittels einer differenziellen Sondenbindungsmethode untersucht werden. Unter geeigneten Hybridisationsbedingungen, wie im Fachgebiet bekannt, binden die Oligonukleotidsonden an völlig komplementäre Sequenzen, doch nicht an eng verwandte, doch veränderte Sequenzen.
  • Bei einer Assaymethode werden aus dem Testpatienten präparierte Nukleinsäureproben mit jeder Sonde unter den definierten Hybridisationsbedingungen hybridisiert und auf die Bindung an spezifische Oligonukleotide untersucht. Alterationen, und daher eine Prädisposition für Alzheimer-Krankheit, werden durch Bindung an eine Sonde, doch nicht an die andere Sonde, bestätigt. Die Sondenbindungsmethode wurde in ihrer Anwendung auf andere genetische Krankheiten beschrieben von Conner, B. J., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1983) 80: 278–282.
  • Alternativ können Sonden, die von den oben beschriebenen genomischen oder cDNA-Sequenzen abgeleitet sind, zur Identifizierung von Polymorphismen der Restriktionsfragmentlänge verwendet werden, die mit einer genetischen Prädisposition für Alzheimer-Krankheit verbunden sind. Anfänglich werden die Sonden zur Identifizierung von Restriktionsfragmentlängen von sowohl gesunden als auch erkrankten genomischen Verdauproben verwendet. Veränderungen der Restriktionsfragmentlängen, die mit der Alzheimer-Krankheit korrelieren, werden dann einem genetischen Screening mittels standardmäßiger Methoden unterzogen. Das heißt, das genomische Material der Testperson wird mit dem/n Restriktionsenzym(en) von Interesse verdaut und das Fragmentmuster bei Southern-Blotting mit der markierten Sonde bestimmt.
  • 2. Diagnostische Methoden. Bei verschiedenen anderen klinischen Amyloidosen stellen die amyloidogenen Peptide Varianten der normal exprimierten Genprodukte dar. Diese Peptide wurden entweder durch abweichende proteolytische Prozessierung oder durch genetische Läsionen verändert, die eine Alteration in den primären Aminosäuresequenzen ergeben. Es gibt bekannte Amyloidosen, wie etwa die Familiäre Amyloid-Polyneuropathie (FAP), bei der eine Mischung von normalem Vorläufer und von amyloidogener Variante innerhalb des Kreislaufs coexistiert. Eine abweichende Gewebeverteilung für die Expression des aberranten Genprodukts, oder irgendeine andere Abweichung in seiner Expressionshöhe, seiner Sequenz oder seiner Prozessierung bei der Alzheimer-Krankheit könnte Signifikanz bezüglich der Ethiologie der Amyloidablagerung besitzen.
  • Der erste diagnostische Test, welcher die hierin beschriebenen Materialien nützt, ist ein direkter Antikörper-Assay auf die Zunahme oder Abnahme des β-Amyloid-Core-Proteins oder der β-Amyloid-verwandten Proteine in Alzheimer-Patienten relativ zu normalen Individuen. Bei dieser Methode werden die wie oben beschrieben erhaltenen Antikörper auf die spezifische Immunreaktivität mit Proteinen von Individuen, bei denen die Alzheimer-Erkrankung bekannt ist, gescreent. Das Vorhandensein von immunreaktiven Serumproteinen wird mittels standardmäßiger Immunoassay-Techniken bestimmt, wie etwa den Festphasen-ELISA-Techniken.
  • Die Körperprobe, die auf das Vorhandensein des β-Amyloid-Core-Proteins oder β-Amyloid-verwandten Proteins untersucht wird, ist zum Beispiel Serum oder Zerebrospinalflüssigkeit. Bei hereditärer Zerebralblutung mit Amyloidose zum Beispiel, einer Störung, bei der das Amyloid vom Gamma-Trace-Vorläufer erzeugt wird, kann der Vorläufer in der Zerebrospinalflüssigkeit unter Verwendung eines Immunoassays nachgewiesen werden. Die Mengen des Vorläufers sind bei Patienten mit der Krankheit vermindert, was zu der Schlussfolgerung führt, dass es während der Bildung der Ablagerungen aufgebraucht wird. Der Vorläufer wird im Gehirn erzeugt, weshalb die Zerebrospinalflüssigkeit die geeignete Probe darstellt.
  • Bei einem anderen diagnostischen Test ist die DNA, die das β-Amyloid-verwandte Protein codiert, direkt als einer Sonde zum Nachweis einer Zunahme oder Abnahme in der Synthese von mRNAs, die β-Amyloid-verwandte Proteine in den geeigneten Zielzellen codieren, dank ihrer Fähigkeit zum Hybridisieren an die entsprechende mRNA nützlich. Ein Fall, der die Nützlichkeit dieser Methode zeigt, ist nachstehend in Beispiel 5 angegeben.
  • Ein dritter diagnostischer Assay ermöglicht den Nachweis von Antikörpern gegen das Amyloid-Protein im Serum eines Patienten unter Anwendung solcher standardmäßiger ELISA-Techniken, bei denen das gereinigte rekombinante Amyloid-Protein oder synthetische Peptid an den Festträger gebunden ist.
  • F. Therapeutische Methoden
  • Im folgenden werden verbesserte therapeutische Behandlungsformen für die Alzheimer-Krankheit beschrieben. Eine therapeutische Behandlung mittels der Sequenz des Proteins, das durch das 168 bp-Insert in λAPCP168i4 codiert ist, wird vorgeschlagen. Unter Anwendung von im Fachgebiet wohlbekannten Methoden, wie etwa der Verwendung von Computerprogrammen, die Protein-Datenbanken durchsuchen, um die Protein-Verwandtschaft eines Proteins mit einem anderen zu vergleichen, wurde das durch das 168 bp-Insert codierte Protein als homolog zu einer Familie von Proteinen befunden, die als Kunitz-artige basische Proteaseinhibitoren bekannt sind. Der Grad der Verwandtschaft des Proteinsegment-Inserts mit drei Mitgliedern der Kunitz-Familie ist in 13 gezeigt, worin das Symbol (:) eine Identität zwischen den beiden verglichenen Sequenzen angibt, und das Symbol (.) die Substitution einer Aminosäure mit ähnlichen chemischen Eigenschaften angibt. Von der Insertsequenz, dargestellt durch den Einbuchstaben-Aminosäure-Code als EVCS ... GSAI, wird gezeigt, dass sie in hohem Grade über ihre gesamte Länge mit allen Mitgliedern der Kunitz-Familie verwandt ist (lediglich drei sind als ein Beispiel gezeigt). Die gezeigten Vergleiche erfolgen mit: (1) einem humanen Trypsininhibitor, d. h. einem sekretierten Plasmaprotein, welches Trypsin, Plasmin und lysosomale granulozytische Elastase hemmt (Wachter, E. und Hochstrassrer, K. Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem (1981) 362: 1351–1355; Morii, M. und Travis, J. Biol Chem. Hoppe-Seyler (1985) 366: 19–21; (2) einem Rinder-Trypsininhibitor, welcher Trypsin, Chymotrypsin, Elastasen und Plasmin hemmt (Hochstrasser, K. und Wachter, E., Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem (1983) 364: 1679–1687; Hochstrasser, K. et al. Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem (1983) 364: 1689–1696; und (3) einem basischen Rinderserum-Proteaseinhibitor (und seinem Vorläufer), welcher Trypsin, Kallikrein, Chymotrypsin und Plasmin hemmt (Anderson, S. und Kingston, I. B. Proc Natl Acad Sci (USA) (1983) 80: 6838–6842. Basierend auf diesem Verwandtschaftsgrad zur 168 bp-Insert-Proteinsequenz ist eine Interpretation die, dass diese Region des λAPCP168i4-Proteins eine Funktion als ein Proteaseinhibitor in vivo aufweist.
  • Dieser Inhibitor kann zur Milderung oder Verhütung der Alzheimer-Krankheit in zahlreichen Weisen eingesetzt werden. Da die mit der Alzheimer-Krankheit verbundenen Amyloid-Plaques aus der Proteolyse des β-Amyloid-Vorläufer-Proteins resultieren, verhütet die Verabreichung des Inhibitors zur Verhinderung der Spaltung des β-Amyloid-Vorläufers wahrscheinlich die Plaquebildung. Ohne an diese Interpretation gebunden werden zu wollen, kann ein alternativer Wirkmechanismus für den Inhibitor seine Rolle in der Hemmung einer Protease, was Plaque abbaut, einbeziehen. Die Verabreichung eines Antagonisten, zum Beispiel eines spezifischen monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers, der mit dem Inhibitor reaktiv und zum Blockieren der Wechselwirkung des Inhibitors mit der Protease fähig ist, ist therapeutisch von Nutzen.
  • Dieser oder andere peptidische oder nicht-peptidische Proteaseinhibitoren könnten zur Behandlung oder Verhütung der Alzheimer-Krankheit durch einen Mechanismus verwendet werden, wie z. B. der Verhinderung der Bildung von neuritischen Plaques. Eine Verabreichungsmethode könnte die nasale Verabreichung eines solchen Peptids beinhalten (da bekannt ist, dass die Blut-Hirn-Grenze unmittelbar hinter der Nasenhöhle offener ist). Die nasale Verabreichung könnte durch Formulierung des Proteaseinhibitor-Peptids mit Arzneimittelträgern und einer wirksamen Menge eines Adjuvans, wie etwa den Fusidinsäure-Derivaten oder einem Polyoxyethylenether bei einer Konzentration von 0,1 bis 10% (w/w) erreicht werden. Stabilisatoren oder Desinfektionsmittel könnten wahlweise zugesetzt werden. Die Menge an Peptid würde in Abhängigkeit von seiner Wirksamkeit und Bioverfügbarkeit variieren, könnte aber im Bereich von 0,1–25% (w/w) liegen. Die Verabreichung würde durch Sprühen von 10 bis 100 μl der Lösung in jede Seite der Nase 1–4-mal täglich erfolgen, obschon die Dosierung auch häufiger oder weniger häufig erfolgen könnte. Zu weiteren Verabreichungsformen zählen eine Lösung des Inihibitors in einem pharmazeutisch geeigneten Arzneimittelträger, wobei der Inhibitor 0,1–25% (w/w) beträgt und wobei der Inhibitor durch Injektion in den Blutstrom oder in die Wirbelsäule oder direkt auf das Gehirn verabreicht wird. Ist der Inhibitor nicht-peptidisch, so kann eine orale Dosierung möglich sein.
  • Weitere Nützlichkeiten des vorliegenden Protease-Inhibitors zeigen auf eine Anwendbarkeit außerhalb der Behandlung von Alzheimer-Krankheit hin. Zum Beispiel findet bei einer akuten Pankreatitis eine generelle Freisetzung von Verdauungsproteasen wie Trypsin, Chymotrypsin und Elastase vom Pankreas in den Blutkreislauf statt. Es wäre für die klinische Handhabung dieser Krankheit nützlich, ein oder mehrere Proteaseinhibitoren systemisch zu verabreichen, um diese Proteasen zu inaktivieren. Zum Beispiel wurde von Aprotinin, einem Proteaseinhibitor, der eine etwa 50%-ige Aminosäure-Homologie mit dem vorliegenden A4i-Inhibitor teilt, festgestellt, dass er in Tiermodellen einen klinischen Nutzen zeigt (H. Fritz und G. Wunderer, Drug Res 33(I), Nr. 4 (1983) S. 479–494). Der vorliegende Inhibitor ist für diese Anwendung bevorzugt, da er in geringen Mengen im Blutkreislauf in Form seines größeren Vorläufers vorhanden ist, so dass keine allergische oder Immunreaktion auftreten würde, wie bei Aprotinin oder anderen Inhibitoren von nicht-humanem Ursprung zu erwarten gewesen wäre.
  • Hierin werden noch weitere Formen des vorliegenden Inhibitors bereitgestellt. Die Analoga des Proteaseinhibitors mit 57 Aminosäuren enthalten mindestens eine Aminosäure-Substitution, was effektiv ist, um einen Inhibitor mit einer veränderten Protease-Spezifität zu erhalten. Im Fachgebiet ist bekannt, das der als P1 bezeichnete Rest eine Hauptrolle beim Definieren der Spezifität eines Proteaseinhibitors spielt. Im reifen sekretierten Inhibitor ist dieser P1-Rest Arg13, von dem erwartet wird, dass es diesen Inhibitor zu Enzymen mit Trypsin-artigen Aktivitäten lenkt. In Analogie zu Aprotinin, bei dem gezeigt wurde, dass die Modifikation seines P1-Rests die Protease-Aktivität des Inhibitors modifiziert hat (siehe Gebhard, W., et al. in Proteinase Inhibitors, Hrsg. Barrett und Salvesin, Amsterdam, N.Y., Oxford: Elsevier 1986), führt die Modifikation über die ortsspezifische Mutagenese des Inhibitors zu ähnlichen Ergebnissen. Für eine verstärkte Inhibition von Enzymen mit Chymotrypsin-Aktivität ist Arg13 des Inhibitors mit aromatischen Aminosäuren, wie z. B. Phe, Tyr und Trp, substituiert; wohingegen zur Erzeugung eines Inhibitors mit einer erhöhten Fähigkeit zum Hemmen von Enzymen, die eine Humanelastase-Aktivität besitzen, der Arg13-Rest mit neutralen hydrophoben Amino säuren, wie z. B. Leu, Met und Val, substituiert ist.
  • Die Analoga der Proteaseinhibitoren sind aus Oligonukleotiden, die die spezifischen Codons enthalten, die gewünschte Aminosäure an dieser Lokation codieren, unter Anwendung ortsspezifischer Mutagenesetechniken konstruiert, wie im Fachgebiet bekannt. Die gewünschten Aktivitäten der derart konstruierten Analoga werden unter Verwendung des geeigneten Enzyms untersucht, zum Beispiel entweder Trypsin, Chymotrypsin oder Elastase als dem Standard in einem der jeweiligen Assays, zum Beispiel den Trypsin- oder Chymotrypsin-Assays, beschrieben bei Tan, N. H. Biochem (1977) 16: 1531–1541, und den Elastase-Assays, Barrett, A. J. (1981) in Methods in Ezymology, Band 80, L. Lorand Hrg., Academic Press, New York. Die Aktivität der Analoga kann mit der des natürlichen Proteaseinhibitors verglichen werden. Die Kinetik der Inhibition (Ki) des natürlichen Proteaseinhibitors für Trypsin (Ki = 3 × 10–9 M) und Chymotrypsin (8,5 × 10–9 M) liegt im nanomolaren Bereich und ist daher recht spezifisch.
  • G. Methoden und Materialien
  • Die meisten der Techniken, die zum Transformieren von Zellen, Konstruieren von Vektoren, Extrahieren von Messenger-RNA, Präparieren von cDNA-Banken und dergleichen eingesetzt werden, werden im Fachbereich breit praktiziert, wobei die meisten Fachleute in der Praxis mit den standardmäßigen Quellenmaterialien vertraut sind, die spezifische Bedingungen und Verfahrensweisen beschreiben. Zu Zwecken der Bequemlichkeit sollen die folgenden Abschnitte jedoch als eine Richtlinie dienen.
  • Wirts- und Kontrollsequenzen
  • Sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Systeme können zum Exprimieren des β-Amyloid-Cores und der β-Amyloid-verwandten Sequenzen verwendet werden; wobei prokaryontische Wirte für die Klonierverfahren natürlich am bequemsten sind. Prokaryonten sind am häufigsten durch verschiedene Stämme von E. coli vertreten; andere mikrobielle Stämme können jedoch ebenfalls verwendet werden. E. coli-Stämme können den β-Amyloid-Kern und die β-Amyloid-verwandten Proteine in das Periplasma sekretieren, wenn die Gene, die diese Proteine codieren, an geeignete Signalpeptide fusioniert sind, wobei bestimmte E. coli-Stämme, z. B. ein Lipoprotein-Mutantenstamm wie JE5505 (Kanamari, T. Gene (1988) 66: 295–300), die chimären Proteine direkt in das Kulturmedium absondern wird.
  • Plasmid-Vektoren, die Replikationsstellen, selektierbare Marker und Kontrollsequenzen die von einer mit dem Wirt kompatiblen Spezies abgeleitet sind, enthalten, werden verwendet; zum Beispiel wird E. coli typischerweise unter Verwendung von Derivaten von pBR322 transformiert, einem Plasmid, das von einer E. coli-Spezies von Bolivar, et al., Gene (1977) 2: 95, abgeleitet ist. pBR322 enthält Gene für die Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt so multiple selektierbare Marker bereit, die in der Konstruktion des gewünschten Vektors entweder beibehalten oder zerstört werden können. Üblicherweise verwendete prokaryontische Kontrollsequenzen, die hierin definiert sind, beinhalten Promotoren für die Transkriptionsinitiation, wahlweise mit einem Operator, zusammen mit Sequenzen von Ribosomen-Bindungsstellen, einschließlich solch häufig verwendeter Promotoren wie den β-Lactamase-(Penicillinase)- und Lactose-(lac)-Promotorsystemen (Chang, et al., Nature (1977) 198: 1056) und dem Tryptophan-(trp)-Promotorsystem (Goeddel, et al., Nucleic Acids Res (1980) 8: 4057) und dem Lambda-abgeleiteten PL-Promotor und der N-Gen-ribosomalen Bindungsstelle (Shimatake, et al., Nature (1981) 292: 128).
  • Zu weiteren prokaryontischen Kontrollsequenzen zählen Signalsequenzen, welche die Sekretion eines Proteins in das Periplasma steuern. Zu häufig verwendeten bakteriellen Signalpeptiden zählen die ompA- (Kikuchi, et al., Nucleic Acids Res (1981) 9: 5671–5678) und phoA- (Beck und Bremer, Nucleic Acids Res (1980) 8: 3011–3024)-Signalpeptide, die an die Proteaseinhibitorsequenz fusioniert werden können.
  • Über Bakterien hinaus können auch eukaryontische Mikroben, wie etwa Hefen, als den Wirten verwendet werden. Laborstämme von Saccharomyces cerevisiae, Bäckerhefe, werden am häufigsten verwendet, obschon eine Anzahl weiterer Stämme oder Spezies allgemein verfügbar sind. Vektoren, die beispielsweise den 2-μ-Replikationsursprung von Broach, J. R., Meth Enz (1983) 101: 307, oder andere Hefe-kompatible Replikationsursprünge (siehe zum Beispiel Stinchcomb, et al., Nature (1979) 282: 39; Tschumper, G., et al. Gene (1980) 10: 157 und Clarke, L., et al., Meth Enz (1983) 101: 300) verwenden, können eingesetzt werden. Zu Kontrollsequenzen für Hefevektoren zählen Promotoren für die Synthese von glykolytischen Enzymen (Hess, et al., J Adv Enzyme Reg (1968) 7: 149; Holland, et al., Biochemistry (178) 17: 4900). Zu weiteren, im Fachgebiet bekannten Promotoren zählen der Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman, et al., J Biol Chem (1980) 255: 2073). Weitere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen und/oder genetischen Hintergrund kontrollierten Transkription aufweisen, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Säurephosphatase, Abbauenzyme in Verbindung mit dem Stickstoff-Metabolismus, das Alpha-Faktorsystem und die für die Maltose- und Galactose-Verwertung verantwortlichen Enzyme. Es wird auch davon ausgegangen, dass Terminatorsequenzen am 3'-Ende der Codierungssequenzen erwünscht sind. Solche Terminatoren sind zu finden in der 3'-untranslatierten Region, die den Codierungssequenzen in Hefe-abgeleiteten Genen folgen.
  • Es ist natürlich auch möglich, Gene zu exprimieren, die Polypeptide in von multizellulären Organismen abgeleiteten eukaryontischen Wirtszell-Kulturen codieren. sind. Sie zum Beispiel Axel et al., US-Patent Nr. 4 399 216. Diese Systeme weisen den zusätzlichen Vorteil der Herausspleißbarkeit von Intronen auf und können daher zum Exprimieren genomischer Fragmente direkt verwendet werden. Zu nützlichen Wirtszelllinien zählen VERO- und HeLA-Zellen, ebenso wie Chinesische Hamster-Ovarien-(CHO)-Zellen. Die Expressionsvektoren für diese Zellen enthalten gewöhnlich Promotoren und Kontrollsequenzen, die mit Säugerzellen kompatibel sind, wie zum Beispiel die herkömmlicherweise verwendeten frühen und späten Promotoren von Simian-Virus 40 (SV 40) (Fiers, et al., Nature (1978) 273: 113) oder andere virale Promotoren, wie etwa die von Polyoma, Adenovirus 2, Rinderpapilloma-Virus oder Vogelsarkomviren abgeleiteten Promotoren. Der kontrollierbare Promotor, hMTII (Karin M., et al., Nature (1982) 299: 797–802) kann ebenfalls verwendet werden. Allgemeine Aspekte der Säugerzell-Wirtssystem-Transformationen wurden beschrieben von Axel (supra). Obschon diese "Enhancer"-Regionen zur Optimierung der Expression wichtig sind, scheint es heute, dass dies generell Sequenzen sind, die stromaufwärts oder stromabwärts der Promotorregion in nicht-codierenden DNA-Regionen zu finden sind. Replikationsursprünge können, sofern erforderlich, von viralen Quellen erhalten werden. Die Integration in das Chromosom stellt jedoch einen herkömmlichen Mechanismus für die DNA-Replikation in Eukaryonten dar.
  • Transformationen
  • In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Anwendung für solche Zellen geeigneter standardmäßiger Techniken vorgenommen. Die Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, wie beschrieben bei Cohen, S. N., Proc Natl Acad Sci (USA) (1972) 69: 2110, oder die RbCl2-Methode, wie beschrieben bei Manniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Press, S. 254 und Hanahan, D., J Mol Biol (1983) 166: 557–580, kann für Prokaryonten oder andere Zellen verwendet werden, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Für Säugerzellen ohne diese Zellwände kann die Calciumphosphat-Präzipitationsmethode von Graham und van der Eb, Virology (1978) 52: 546, optional modifiziert durch Wigler, M., et al., Cell (1979) 16: 777–785, verwendet werden. Transformationen in Hefe können gemäß der Methode von Beggs, J. D., Nature (1978) 275: 104–109 oder von Hinnen, A., et al., Proc Natl Acad Sci (USA) (1978) 75: 1929, durchgeführt werden.
  • Vektorkonstruktion
  • Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die die gewünschten Codierungs- und Kontrollsequenzen enthalten, wendet standardmäßige Ligations- und Restriktionstechniken an, die im Fachgebiet wohlverstanden sind. Isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonukleotide werden gespalten, maßgeschneidert und in der gewünschten Form religiert.
  • Die DNA-Sequenzen, die die Vektoren bilden, sind aus einer Reihe von Quellen erhältlich. Rückgrat-Vektoren und Kontrollsysteme sind allgemein zu finden auf verfügbaren "Wirts"-Vektoren, die für die Masse der Sequenzen in Konstruktion verwendet werden. Für die zweckmäßige Codierungssequenz kann die anfängliche Konstruktion im Entnehmen der geeigneten Sequenzen aus cDNA- oder genomischen DNA-Banken bestehen und tut dies gewöhnlich auch. Ist die Sequenz jedoch einmal offenbar, so ist die Synthese der gesamten Gensequenz in vitro möglich, ausgehend von den einzelnen Nukleotid-Derivaten. Die gesamte Gensequenz für Gene einer beachtlichen Länge, z. B. 500 bis 1000 bp, kann durch Synthetisieren einzelner überlappender komplementärer Oligonukleotide und Auffüllen mit einzelsträngigen nicht-überlappenden Abschnitten unter Verwendung von DNA-Polymerase in Gegenwart der Desoxyribonukleotid triphosphate hergestellt werden. Dieser Ansatz wurde in der Konstruktion verschiedener Gene einer bekannten Sequenz erfolgreich eingesetzt. Siehe zum Beispiel Edge, M. D., Nature (1981) 292: 756; Nambair, K. P., et al., Science (1984) 223: 1299; Jay, Ernest, J Biol Chem (1984) 259: 6311.
  • Synthetische Oligonukleotide werden entweder mittels der Phosphotriester-Methode hergestellt, wie beschrieben von Edge et at., Nature (supra) und Duckworth, et al., Nucleic Acids Res (1981) 9: 1691, oder der Phosphoramidit-Methode, wie beschrieben von Beaucage, S. L., und Caruthers, M. H., Tet Letts (1981) 22: 1859 und Matteucci, M. D., und Caruthers, M. H., J Am Chem Soc (1981) 103: 3185, und können unter Verwendung handelsüblicher Oligonukleotid-Syntheseautomaten hergestellt werden. Das Kinasieren der Einzelstränge vor dem Vereinigen oder zum Markieren wird unter Verwendung eines Überschusses erreicht, z. B. etwa 10 Einheiten Polynukleotidkinase auf 1 nmol Substrat in Gegenwart von 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM Dithiothreitol, 1–2 mM ATP, 1,7 pmol γ32P-ATP (2,9 mCi/mmol), 0,1 mM Spermidin, 0,1 mM EDTA.
  • Stehen die Komponenten der gewünschten Vektoren auf diese Weise einmal zur Verfügung, so können sie ausgeschnitten und unter Anwendung standardmäßiger Restriktions- und Ligationsverfahrensweisen ligiert werden.
  • Die ortsspezifische DNA-Spaltung wird durch Behandeln mit dem geeigneten Restriktionsenzym (oder Enzymen) unter Bedingungen vorgenommen, die im Fachgebiet allgemein verstanden sind, wobei die Einzelheiten dazu vom Hersteller dieser handelsüblichen Restriktionsenzyme spezifiziert sind. Siehe z. B. New England Biolabs, Produkt-Katalog. Im allgemeinen wird etwa 1 μg der Plasmid oder DNA-Sequenz durch eine Einheit des Enzyms in etwa 20 μl Pufferlösung gespalten; in den hierin angegebenen Beispielen wird typischerweise ein Überschuss an Restriktionsenzym verwendet, um den vollständigen Verdau des DNA-Substrats zu gewährleisten. Inkubationsdauern von etwa einer Stunde bis zwei Stunden bei etwa 37°C sind realistisch, obschon Abweichungen davon tolerierbar sind. Nach jeder Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol/Chloroform entfernt, dem eine Etherextraktion folgen kann, und die Nukleinsäure aus den wässrigen Fraktionen durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Sofern erwünscht, kann eine Größenauftrennung der gespaltenen Fragmente mittels Polyacrylamidgel- oder Agarosegel-Elektrophorese unter Anwendung standardmäßiger Techniken erfolgen. Eine allgemeine Beschreibung der Größenauftrennungen ist zu finden in Methods in Enzymology (1990) 65: 499–560.
  • Die Restriktions-gespaltenen Fragmente können durch Behandeln mit dem großen Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart der vier Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) unter Anwendung von Inkubationsdauern von etwa 15 bis etwa 25 Min. bei 20 bis 25°C in 50 mM Tris, pH 7,6, 50 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 6 mM DTT und 0,1–1,0 mM dNTPs stumpfendig gemacht werden. Das Klenow-Fragment füllt einzelsträngige Überhänge am 5'-Ende auf, doch kaut überstehende 3'-Einzelstränge zurück, obschon die vier dNTPs vorhanden sind. Sofern erwünscht, kann eine selektive Reparatur vorgenommen werden durch Bereitstellen lediglich eines, oder eines ausgewählten, der dNTPs innerhalb der durch die Natur des Überhangs vorgegebenen Begrenzungen. Nach der Behandlung mit Klenow wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und Ethanol-präzipitiert. Die Behandlung unter geeigneten Bedingungen mit S1-Nuklease oder BAL-31 führt zur Hydrolyse jeglichen einzelsträngigen Abschnitts.
  • Ligationen werden in 15–50 μl-Volumina unter den folgenden Standardbedingungen und -temperaturen vorgenommen: zum Beispiel 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 μg/ml BSA, 10 mM–50 mM NaCl und entweder 40 μM ATP, 0,01–0,02 (Weiss)-Einheiten T4-DNA-Ligase bei 0°C (für eine "klebrige Enden"-Ligation) oder 1 mM ATP, 0,3–0,6 (Weiss)-Einheiten T4-DNA-Ligase bei 14°C (für "stumpfendige" Ligation). Intermolekulare "klebrige Enden"-Ligationen werden gewöhnlich bei 33–100 μg/ml Gesamt-DNA-Konzentrationen (5–100 nM Gesamtenden-Konzentration) vorgenommen. Intermolekulare stumpfendige Ligationen werden bei 1 μM Gesamtenden-Konzentration vorgenommen.
  • Bei der Vektor-Konstruktion unter Verwendung von "Vektorfragmenten" wird das Vektorfragment gewöhnlich mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) oder alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CIP) behandelt, um das 5'-Phosphat zu entfernen und Selbstligation des Vektors zu verhindern. Die Verdaus werden bei pH 8 in etwa 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA unter Verwendung von etwa 1 Einheit BAP oder CIP pro μg des Vektors bei 60°C für etwa eine Stunde durchgeführt. Um die Nukleinsäure-Fragmente rückzugewinnen, wird das Präparat mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Alternativ kann eine Religation in Vektoren verhindert werden, die durch einen zusätzlichen Restriktionsenzym-Verdau und Abtrennung der unerwünschten Fragmente doppelt verdaut wurden.
  • Für von cDNA oder genomischer DNA abgeleitete Portionen des Vektors, die Sequenzmodifikationen erfordern, kann eine ortsspezifische Primer-gelenkte Mutagenese angewendet werden (Zoller, M. J. und Smith, M. Nucleic Acids Res (1982) 10: 6487–6500 und Adelman, J. P., et al., DNA (1983) 2: 183–193). Dies wird unter Verwendung eines synthetischen Primer-Oligonukleotids vorgenommen, das zu einer einzelsträngigen, zu mutagenisierenden Phagen-DNA komplementär ist, mit Ausnahme einer begrenzten Fehlpaarung, die die gewünschte Mutation darstellt. Kurz gesagt wird das synthetische Oligionukleotid als ein Primer zum Steuern der Synthese eines zu dem Phagen komplementären Strangs verwendet, und die resultierende teilweise oder vollständig doppelsträngige DNA wird zu einem Phagen-unterstützenden Wirtsbakterium transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien werden in Top-Agar ausplattiert, welcher die Plaquebildung einzelner Zellen, die den Phagen beherbergen, ermöglicht.
  • Theoretisch werden 50% der neu gebildeten Plaques den Phagen enthalten, der die mutierte Form als einem Einzelstrang aufweist; 50% werden die ursprüngliche Sequenz aufweisen. Die resultierenden Plaques werden nach der Hybridisation mit kinasiertem synthetischem Primer bei einer Waschtemperatur gewaschen, die die Bindung an eine exakte Paarung erlaubt, doch bei der ausreichende Fehlpaarungen mit dem ursprünglichen Strang vorliegen, um die Bindung zu verhindern. Die Plaques, die mit der Sonde hybridisieren, werden dann gepickt, gezüchtet und die DNA gewonnen.
  • Verifikation der Konstruktion
  • Bei den nachstehend dargestellten Konstruktionen werden die korrekten Ligationen für die Plasmidkonstruktion bestätigt, indem zunächst der von Dr. M. Casadaban (Casadabon, M., et al., J Mol Biol (1980) 138: 179–207) erhaltene transformierte E. coli-Stamm MC1061 oder ein anderer geeigneter Wirt mit dem Ligationsgemisch transformiert wird. Erfolgreiche Transformanten werden durch Ampicillin-, Tetracyclin- oder eine andere antibiotische Resistenz oder unter Verwendung anderer Marker ausgewählt, was von der Art der Plasmidkonstruktion abhängt, wie im Fachgebiet verstanden. Plasmide von den Transformanten werden dann gemäß der Methode von Clewell, D. B., et al., Proc Natl Acad Sci (USA) (1969) 62: 1159, präpariert, wahlweise gefolgt von einer Chloramphenicol-Amplifikation (Clewell, D. B., J Bacteriol (1972) 110: 667). Mehrere Mini-DNA-Preps werden gewöhnlich verwendet, z. B. Holmes, D. S., et al., Anal Biochem (1981) 114: 193–197, und Birnboim, H. C., et al., Nucleic Acids Res (1979) 7: 1513–1523. Die isolierte DNA wird durch Restriktion analysiert und/oder durch die Didesoxynukleotid-Methode von Sanger, F., et al., Proc Natl Acad Sci (USA) (1977) 74: 5463, sequenziert, wie weiter beschrieben von Messing et al., Nucleic Acids Res (1981) 9: 309, oder durch das Verfahren von Maxam, et al., Methods in Enzymology (1980) 65: 499.
  • Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter beschrieben werden. Diese sind lediglich zur Veranschaulichung der Ausführungsformen der Erfindung angegeben und sollen nicht als Einschränkungen des Rahmens der Erfindung verstanden werden.
  • Beispiel 1
  • Isolierung eines genomischen Klons und von cDNA-Klonen, die β-Amyloid-Core-Protein und β-Amyloid-verwandte Proteine codieren
  • Eine humangenomische Bank in Charon 4A λ-Phage wurde unter Verwendung einer sechsfach degenerativen 38-mer-Sonde entsprechend den ersten 13 Aminosäuren der N-terminalen Sequenz einer 28 Aminosäuresequenz gescreent. Diese Sonde,
    Figure 00290001
    worin I Inosin ist, wenn zum Screening der humangenomischen Bank verwendet, ergab eine starke hybridisierende Kolonie, bezeichnet als λSM2. λSM2-DNA wurde isoliert und teilweise sequenziert, mit den in 2 gezeigten Ergebnissen. Der sequenzierte Abschnitt stellt lediglich eine kleine Fraktion des etwa 10–20 kb-Inserts im aus der genomischen Bank isolierten Phagen dar.
  • Eine Sonde wurde aus dem HindIII/RsaI-Fragment konstruiert, das etwa Positionen 201–294 darstellt. Die genomische Sonde wurde zum Screening einer cDNA-Bank verwendet, präpariert in λgt10 unter Anwendung standardmäßiger Techniken aus Hirngewebe eines 55 Jahre alten Mannes ohne Anzeichen von Alzheimer-Krankheit. Die drei als λSM2W4, λSM2W3 und λSM2W9 bezeichneten Klone wurden identifiziert.
  • Beispiel 2
  • Die oben beschriebenen genomischen und cDNA-Sequenzen können zum Präparieren eines rekombinanten Proteins in einem effizienten Expressionssystem verwendet werden. Genomische DNA kann in Zellen verwendet werden, wie z. B. Säugerzellen, die zum Prozessieren von Introns fähig sind. Bakterienzellen können zur Expression der cDNA-Sequenzen verwendet werden.
  • Bakterielle Expression von β-Amyloid-verwandtem Protein und Erzeugung des Antiserums
  • A. Konstruktion des Plasmids pAPCP118-3.
  • Die Konstruktion eines E. coli-Expressionsvektors für humanes β-Amyloid-verwandtes Protein (655–751) erforderte das Zusammenbringen von drei DNA-Fragmenten: (1) einem Plasmid-Rückgrat (bestehend aus Replikationsfunktionen, Ampicillin-Resistenzgen, Tryptophan-Promotor/Operator, Ribosomen-Bindungsstelle, den Amino-Terminus von E. coli-β-Galactosidase (7 Aminosäuren) codierender DNA, gefolgt von sechs Threonin-Resten und Transkriptions-Terminationssignalen), (2) einem Fragment der β-Amyloid-verwandten DNA, das Aminosäuren 655–728 codiert, der 1, und (3) einem synthetischen Fragment der β-Amyloid-verwandten DNA, das Aminosäuren 729–751 der 1 codiert und dem Stoppcodon UAA.
  • Das oben genannte Plasmid-Rückgrat ist aus pTRP83-1 abgeleitet. Plasmid pTRP83-1 ist ein bakterielles Expressionsplasmid, welches in folgender Weise konstruiert wurde:
  • 1. Konstruktion des synthetischen Tryptophan-Operon-Promotors und Operator-Regulationssequenz
  • Die zehn in 14 gezeigten Oligodesoxynukleotide wurden mittels der Phosphotriester-Methode synthetisiert und gereinigt. 500 pmol jedes Oligodesoxynukleotids mit Ausnahme von 1 und 10 wurden einzeln in 20 μl, bestehend aus 60 mM Tris-HCl, pH 8, 15 mM DTT, 10 mM MgCl2, 20 μCi an [λ-32P]-ATP und 20 Einheiten Polynukleotidkinase (P/L Biochemicals) für 30 Min. bei 37°C, phosphoryliert. Dem folgte die Zugabe von 10 μl, enthaltend 60 mM Tris-HCl, pH 8, 15 mM DTT, 10 mM MgCl2, 1,5 mM ATP und 20 zusätzlichen Einheiten der Polynukleotidkinase, gefolgt von weiteren 30 Min. der Inkubation bei 37°C. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Proben bei 100°C für 5 Minuten inkubiert. 500 pmol der Oligodesoxynukleotide 1 und 10 wurden auf 30 μl im obigen Puffer ohne ATP verdünnt.
  • 16,7 pmol jedes Oligodesoxynukleotids, die ein doppelsträngiges Paar darstellten (z. B. Oligodesoxynukleotide 1 und 2, 3 und 4, etc., 14) wurden gemischt und bei 90°C für 2 Min. inkubiert, gefolgt von langsamer Abkühlung auf Raumtemperatur. Jedes Paar wurde dann mit den anderen in der Konstruktion kombiniert und mit Phenol/Chloroform extrahiert, gefolgt von einer Ethanol-Ausfällung. Die Oligodesoxynukleotid-Paare wurden in 30 μl rekonstituiert, enthaltend 5 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM MgCl2, 20 mM DTT, erhitzt auf 50°C für 10 Min. und sich abkühlen gelassen auf Raumtemperatur, gefolgt von der Zugabe von ATP zu einer Endkonzentration von 0,5 mM. 800 Einheiten der T4-DNA-Ligase wurden dann zugegeben und das Gemisch bei 12,5°C für 12–16 Stunden inkubiert.
  • Das Ligationsgemisch wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA mit Ethanol ausgefällt. Die getrocknete DNA wurde in 30 μl rekonstituiert und mit EcoRI und PstI für 1 Stunde bei 37°C verdaut. Das Gemisch wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt, gefolgt von der Auftrennung der verschiedenen doppelsträngigen DNA-Segmente durch Elektrophorese auf einem 8%-igen Polyacrylamidgel gemäß der Methode von Laemmli et al., Nature (1970) 227: 680. Die DNA-Fragmente wurden durch Nassgelautoradiographie sichtbar gemacht und eine Bande entsprechend etwa 100 bp Länge wurde ausgeschnitten und über Nacht wie beschrieben eluiert. Das ausgeschnittene synthetische DNA-Fragment wurde an Plasmide M13-mp8 oder M13-mp9 ligiert (Messing und Vieira, (1982) Gene 19: 259–268), ebenso mit EcoRI und PstI verdaut und einer Didesoxynukleotid-Sequenzanalyse unterzogen, um die designte Se quenz zu bestätigen. Diese designte Sequenz enthält den Promotor (–35 und –10-Regionen) und die Operatorregionen des Tryptophan-Operons (trp), als auch die Ribosomen-Bindungsregion des Tryptophan-Operon-Leader-Peptids. Analoge Sequenzen zu der in 14 gezeigten Sequenz haben sich als nützlich in der Expression der heterologen Proteine in E. coli erwiesen (Hallewell, R. A. und Emtage, S., Gene (1980) 9: 27–47, Ikehara, M., et al., Proc Natl Acad Sci (USA) (1984) 81: 5956–5960).
  • 2. Konstruktion des synthetischen trp-Promotors/Operators, enthaltend Plasmid pTRP233
  • Plasmid pKK233-2 (Amann, E. und Brosius, J., Gene (1985) 40: 183) wurde komplett mit NdeI verdaut und die Enden mit 5 Einheiten E. coli-Polymerase I, Klenow-Fragment (Boehringer-Mannheim, Inc.) und der Zugabe aller vier dNTPs auf 50 μM stumpfendig gemacht. Dies wurde bei 25°C für 20 Min. inkubiert. Im Anschluss an die Phenol/Chloroform-Extraktion und die Ethanol-Ausfällung wurde die NdeI-verdaute DNA ligiert und in E. coli transformiert (Nakamura, K., et al., J Mol Appl Genet (1982) 1: 289–299). Das resultierende Plasmid, dem die NdeI-Stelle fehlte, wurde als pKK-233-2-Nde bezeichnet.
  • Zwanzig Nanogramm des Plasmids pKK-233-2-Nde wurden komplett mit EcoRI und PstI verdaut, gefolgt von einer Kälberdarm-Phosphatase-Behandlung. Fünfzig Nanogramm der synthetischen trp-Promotor/Operator-Sequenz, erhalten aus M13 RF durch Verdau mit EcoRI und PstI, wurden mit zehn Nanogramm EcoRI- und PstI-verdautem pKK-233-2-Nde gemischt und mit T4-DNA-Ligase ligiert, gefolgt von einer Transformation in E. coli-JA221-lpp–/l'lacI. Die Transformanten wurden auf das Vorhandensein der Plasmid-DNA, enthaltend den synthetischen 100 bp-EcoRI-PstI-trp-Promotor/Operator, gescreent; das korrekte Plasmid wurde dann isoliert und als pTRP233 bezeichnet.
  • pTRP233 wurde mit EcoRI verdaut, die Enden mit Klenow stumpf gemacht, und ligiert, um die EcoRI-Restriktionsstelle zu entfernen. Das Plasmid wurde als nächstes mit NdeI und HinIII verdaut, und ein NdeI-EcoRI-HinIII-Fragment, das β-gal-(thr)6 codiert, zwischen den NdeI- und EcoRI-Stellen zur Schaffung des Plasmids pTRP83-1 inseriert.
  • Plasmid pTRP83-1 wurde dann mit EcoRI- und HinIII-Restriktionsendonukleasen ver daut, und der Verdau wurde in einem 0,6% Agarosegel elektrophoretisch behandelt (Maniatis, T. et al., S. 157–160). Das große Fragment, das das Plasmid-Rückgrat enthielt, wurde aus dem Gel eluiert. Als nächstes wurde das EcoRI-Fragment, das β-Amyloid-verwandte Sequenzen, abgeleitet von λSM2W3 (entsprechend den Aminosäuren 655–751 der 1 und 500 bp der 3'-untranslatierten Sequenzen), enthielt, wurde dann mit HaeII-Restriktionsendonuklease verdaut und in einem 12% Polyacrylamidgel elektrophoretisch behandelt. Das etwa 230 bp-EcoRI-HaeII-Fragment (enthaltend β-Amyloid-verwandte Sequenzen, die Aminosäuren 655–728 codieren) wurde eluiert. Der verbliebene Anteil der β-Amyloid-verwandten Sequenzen der 1, der Aminosäuren 728–751 codiert, wurde unter Verwendung der sechs in 9 dargestellten Oligodesoxynukleotide präpariert. 500 pmol jedes Oligodesoxynukleotids mit Ausnahme von 1 und 6 wurden einzeln phosphoryliert. 167 pmol jedes Oligodesoxynukleotids, die ein Paar darstellen (z. B. 1 und 2, 2 und 3, etc.) wurden gemischt und bei 90°C für 2 Min. inkubiert, gefolgt von langsamem Abkühlen auf Raumtemperatur. Jedes Paar wurde dann mit den anderen kombiniert und mit Phenol/Chloroform extrahiert, gefolgt von einer Ethanol-Ausfällung. Die Paare wurden in 30 μl rekonstituiert, enthaltend 5 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM MgCl2, 20 mM DTT, erhitzt auf 50°C für 10 Min., und auf Raumtemperatur sich abkühlen gelassen. ATP wurde zu einer Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben, 800 Einheiten T4-DNA-Ligase wurden zugegeben und das Gemisch bei 12°C für 12–16 Stunden inkubiert. Die Ligation wurde in einem 12% Polyacrylamidgel elektrophoretisch behandelt, und das 79 bp-HaeII-HinIII-Synthesefragment wurde eluiert.
  • Das EcoRI-HinIII-Plasmid-Rückgrat von pTRP83-1, das etwa 240 bp-EcoRI-HaeII-β-Amyloid-cDNA-Fragment und das synthetische 79 bp-HaeII-HinIII-β-Amyloid-Fragment wurden bei 12°C für 12–16 Stunden ligiert. E. coli-Stamm MC1061 wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert (Maniatis, T., et al., S. 250–251), und die resultierenden Ampicillin-resistenten Kolonien wurden über Nacht in 1 ml L-Bouillon, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillinsulfat, gezüchtet. Plasmid-DNA wurde mittels der alkalischen Lysemethode präpariert (Maniatis et al., S. 368–369). Die Plasmide wurden auf die korrekten Inserts durch Verdau mit EcoRI und HinIII gescreent. Ein Plasmid, das ein etwa 300 bp-EcoRI-HinIII-Fragment freisetzte, wurde als pAPCP118-3 bezeichnet.
  • B. Expression von β-Amyloid-verwandtem Fusionspolypeptid (655–751)
  • Das Plasmid pAPCP118-3 exprimiert ein 110 Aminosäuren-β-Galactosidase-Threonin-β-Amyloid-verwandtes Fusionsprotein unter der Kontrolle des E. coli-Tryptophan-Promotors/Operators. E. coli-Stamm W3110 wurde mit Plasmid pAPCP118-3 transformiert, und eine der resultierenden Ampicillin-resistenten Kolonien wurde für 12–16 Stunden bei 37°C in einem Medium gezüchtet, das M9-minimale Salze enthielt (Miller, J., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), ergänzt mit Glucose (0,4%), Thiamin (2 μg/ml), MgSO4·7H2O (200 μg/ml), Tryptophan (40 μg/ml), Casaminosäuren (0,5%) und Ampicillin (100 μg/ml). Die Expression wurde durch eine 100-fache Verdünnung der Kultur in ein neues Medium mit reduziertem Tryptophan (4 μg/ml) für 2 Stunden induziert, gefolgt von der Zugabe von 3-β-Indolacrylsäure bei einer Endkonzentration von 25 μg/ml. Die Expression des β-gal-thr-β-Amyloid-(655–751)-Fusionproteins erfolgt bei einer Menge von 10–20% des Gesamtzellproteins und ist in Form von Einschlusskörpern vorhanden, die durch Phasenkontrastmikroskopie (1000-fache Vergrößerung) sichtbar gemacht werden können. Die Zellen wurden 6 Stunden nach der Zugabe der 3-β-Indolacrylsäure durch Zentrifugation abgeerntet, mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, gewaschen und das Zellpellet bei –20°C eingefroren.
  • C. Ausreinigung des Beta-gal-thr-β-Amyloid-(655–751)-Fusionsproteins für die Herstellung von Antiserum
  • Ein Zellpellet von 500 ml der Kultur wurde in 40 ml an 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,6 M NaCl, resuspendiert und mit 8 mg Lysozym und den Protease-Inhibitoren Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Aprotinin (0,5 mM bzw. 25 μg/ml) für 10 Min. bei 4°C inkubiert. Die Lösungen der beiden Detergenzien, Natriumdesoxycholat (480 μl an 10% Lösung) und NP-40 (240 μl an 20% Lösung) wurden dann für weitere 10 Min. der Inkubation bei 4°C zugegeben. Das Zellpellet wurde zum Zerstören der Zellen und der freien Einschlusskörper beschallt. RNAse (10 μg/ml) und DNAse (10 μg/ml) wurden zugegeben und das Gemisch 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, um RNA und DNA zu verdauen. Die Einschlusskörper (und ein Teil der Zelltrümmer) wurden durch Zentrifugation für 10 Min. bei 5000 UpM (SA600-Rotor) abgesammelt. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in Proteingel-Probenpuffer für 20 Min. zum Anlö sen des Fusionsproteins gekocht. Das Fusionsprotein wurde dann mittels Elektrophorese in 12% SDS/Polyacrylamidgelen gereinigt (Laemmli, U. K., Nature (1970) 227: 680). Die Kanten jeden Gels wurden entfernt und mit Coomassie-Blau zur Sichtbarmachung des 15 Kilodalton-(kD)-Fusionsproteins angefärbt. Sie wurden dann mit dem Gel nochmals angeordnet, so dass die Region des Gels, das das Fusionsprotein enthielt, ausgeschnitten werden konnte. Das Polyacrylamid wurde dann durch eine Reihe von Nadeln (16 Gauge bis hinunter zu 22 Gauge) unter Zugabe einer physiologischen Salzlösung zerstochen, um die Polyacrylamid-Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Das zerstochene Polyacrylamid/Fusionsprotein wurde mit Adjuvans [RIBI(RAS)] direkt vor der Immunisierung der Kaninchen gemischt. Etwa 150 bis 200 μg des Fusionsproteins wurden jedem Tier für die erste Immunisierung verabreicht. Bei den folgenden Immunisierungen wurden 50–100 μg des Fusionsproteins verwendet.
  • D. Western-Blot-Analyse von β-Amyloid-Synpep-Antiserum unter Verwendung des Beta-gal-thr-β-Amyloid-(655–751)-Fusionsproteins
  • Zellpellets von E. coli W3110 (pAPCP118-3) und W3110 (pTRP83-1)-Kulturen, induziert mit 3-β-Indolacrylsäure, wurden in Laemmli-Gel-Probenpuffer gekocht und in 12 SDS-Polyacrylamid elektrophoretisch behandelt. Der zweite transformierte Stamm ist eine negative Kontrolle, die alle Proteine enthält, außer der β-gal-thr-β-Amyloid-(655–741)-Fusion. Die Gele wurden dann auf Nitrocellulose elektrogeblottet, zunächst mit von immunisierten Kaninchen erhaltenem APCP-Synpep-Antiserum inkubiert und dann mit 125I-Staphylococcus-Protein A inkubiert, um gebundenen Antikörper zu identifizieren (Johnson, D. A., et al., Gene Anal Tech (1984) 1: 3). Ein Autoradiogramm wurde von diesen Nitrocellulose-Filtern erzeugt, welches eine Kreuzreaktivität zwischen dem Anti-APCP3-Serum und dem Fusionsprotein nachwies; Synpep APCP3 setzt sich aus den Aminosäuren 705–719 der 1 zusammen, die innerhalb des β-Amyloid-Abschnitts des Fusionsproteins enthalten sind. Die Kreuzreaktivität wurde auch für andere β-Amyloid-Synpep-Antiseren beobachtet.
  • Beispiel 3
  • Generierung der polyklonalen und monoklonalen Antikörper gegen β-Amyloid-verwandtes Protein unter Verwendung von rekombinantem Vaccinia-Lebendvirus
  • 1. Konstruktion des Plasmids pFL4T4B.
  • Die Konstruktion des Plasmids, welches die Generierung polyklonaler und monoklonaler Antikörper ermöglichte, ist in 10 schematisch dargestellt. Plasmid pGEM-3TM (Promega-Biotec) wurde EcoRI-verdaut und mit Kälberdarm-Phosphatase gemäß Maniatis, et al., behandelt. Fünfzig Nanogramm des gereinigten 1,06 kb EcoRI-Fragments, das von der λAPCP168i4 abgeleitet war, wurden mit 10 Nanogramm EcoRI-verdautem pGEM-3TM gemischt und mit T4-DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 20 μl für 30 min bei 25°C inkubiert. E. coli-Stamm MC1061 wurde für die Transformation mittels der CaCl2-Methode kompetent gemacht und mit dem Ligationsgemisch transformiert. Die resultierenden Ampicillin-resistenten Kolonien wurden über Nacht in 2 ml L-amp-Bouillon gezüchtet, aus der Plasmid-DNA mittels der Triton-Lysemethode (Maniatis et al.) präpariert wurde. Die Plasmide wurden auf die korrekte Orientierung durch Verdau mit HinIII gescreent. Ein Plasmid mit 150 und 3700 bp HinIII-Restriktionsfragmenten wurde ausgewählt und mit p4BI bezeichnet. Das resultierende Plasmid p4BI wurde mit HinIII verdaut, mit T4-Ligase für 30 Min. bei 25°C religiert, und die kompetenten MC1061-Zellen wurden mit dem Ligationsgemisch transformiert. Die Plasmide wurden auf den Verlust des 130 bp-HinIII-Fragments mittels EcoRI-Verdau gescreent. Ein Plasmid, das eine einzelne EcoRI-Stelle enthielt, wurde ausgewählt und mit p4BΔRI bezeichnet. Zehn Nanogramm des Plasmids p4BΔRI wurden EcoRi-verdaut, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt und mit 100 Nanogramm des gereinigten ~2 kb-EcoRI-Fragments, abgeleitet von λAPCP168i4, ligiert. Das Ligationsgemisch wurde zum Transformieren kompetenter MC1061-Zellen verwendet. Resultierende Ampicillin-resistente Kolonien wurden über Nacht in L-amp-Bouillon gezüchtet und die Plasmid-DNA präpariert. Die Plasmide wurden auf die korrekte Orientierung durch Verdau mit BamHI und HinIII gescreent. Ein Plasmid mit einem 1,5-kb-BamHI- und einem ~1,5 kb-BamHI-HinIII-Fragment wurde ausgewählt und mit p4T4B bezeichnet. Plasmid p4T4B wurde mit SmaI und XmnI verdaut, und das resultierende ~2,7 kb-Fragment wurde aus 0,8% Agarose, gefolgt von einer Ethanol-Ausfällung, eluiert, in vacuo getrocknet und in dH2O resuspendiert.
  • Fünf μg des Vaccinia-Virus-Expressionsvektors pSC11 (Chakrabarti, et al., Mol Cell Biol (1985) 5: 3403–3409) wurden vollständig mit SmaI verdaut, gefolgt von einer Behandlung mit Kälberdarm-Phosphatase. Fünfhundert Nanogramm des gereinigten ~2,7-kb-SmaI-XmnI-Fragments, das von p4T4B abgeleitet war, wurden mit 50 ng SmaI-verdautem pSC11 gemischt und mit T4-DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 20 μl für 16 Stunden bei 15°C über Nacht inkubiert. E. coli-Stamm MC1061 wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert. Die resultierenden Ampicillin-resistenten Kolonien wurden über Nacht gezüchtet und die Plasmid-DNA durch die Schnellkochmethode isoliert (Maniatis et al.). Die Plasmide wurden auf die Insertion und die korrekte Orientierung durch Verdau mit EcoRI gescreent. Ein Plasmid sowohl mit einem ~2500 bp- als auch einem ~600 bp-EcoRi-Fragment wurde ausgewählt und als pFL4T4BV bezeichnet.
  • Monoklonale und polyklonale Antikörper gegen das β-Amyloid-verwandte Protein der vollen Länge wurden unter Anwendung einer neuartigen Methode generiert, beschrieben von Yilma, T., et al., (Hybridoma (1987) 6: 329–337). Kurz gesagt ermöglicht die Methode die Produktion von Antikörpern gegen ein spezifisches Protein, ohne dass ein gereinigtes Antigen (Protein) in der Immunisations- noch in der Screeningphase des Verfahrens erforderlich wäre. Die Methoden verwenden die Vaccinia-Virus-Kloniervektoren an (Smith, et al., Nature (1983) 302: 490–495), die zum Tragen isolierter Gene gentechnisch verändert werden können. Das infektiöse rekombinante Vaccinia-Virus kann dann zum Immunisieren von Mäusen verwendet werden. Zwei Wochen nach der Infektion werden die Mäuse geopfert und ihre Milzzellen mit Myelomzellen für die monoklonale Antikörper-Produktion fusioniert, wie beschrieben im von Kohler und Milstein Nature (1973) 256: 495 entwickelten klassischen Ansatz. Alternativ können die Kaninchen in herkömmlicher Weise mit der infektiösen Vaccinia-Virus-Rekombinante immunisiert werden, um das polyklonale Antiserum zu erzeugen.
  • Zehn μg des Plasmids p4T4BV werden zum Transfizieren von CV-1-Affen-Nierenzellen verwendet, die mit Wildtyp-Vaccinia-Virus gemäß standardmäßiger Methoden infiziert sind (Mackett, et al., J Virol (1984) 49: 857–864). TK–-Rekombinanten werden mittels Plaque-Assay auf TK–-Zellen in Gegenwart von 25 μg/ml Bromdesoxyuridin (BudR) isoliert. Für Plaque-Assays unter Einbeziehung der Erzeugung einer blauen Farbe, wie im Falle des pSC11-Vaccinia-Virus-Koexpressionsvektors werden 300 μg des X-Gal pro Milliliter im Agarose-Überzug platziert und die Plaques nach 4 bis 6 Stunden bei 37°C sichtbar gemacht. Die Plaques werden zwei- bis dreimal in Folge gereinigt. Die DNA aus dem rekombinanten Virus wird durch Restriktionsendonuklease-Analyse und DNA-Hybridisation an ein 32P-Nick-translatiertes 2091 bp-EcoRI-Fragment von λAPCP168i4 untersucht, um die vorhergesagte Struktur zu bestätigen.
  • Rekombinantes Virus, das die komplette β-Amyloid-verwandte cDNA-Sequenz von λAPCP168i4 trägt, wird isoliert und zu hohem Titer (1 × 108–9 pfu/ml) amplifiziert. Diese rekombinanten Viren werden zum Immunisieren von Kaninchen und Mäusen für die anschließende Produktion von polyklonalen bzw. monoklonalen Antikörpern gegen β-Amyloid-verwandte/s Protein(e) der vollen Länge unter Anwendung wohletablierter Methoden verwendet oder können zur direkten Expression des rekombinanten Proteins verwendet werden. Die verschiedenen Antiseren werden entweder auf ihre Fähigkeit zum spezifischen Immunpräzipitieren des Proteins der korrekten Größe aus 35S-Methionin-markierten CV-1-Zellen, die mit einer β-Amyloid-verwandten Protein-Virus-Rekombinante infiziert wurden, oder auf ihre Fähigkeit zum Nachweisen des denaturierten Proteins auf einem Western-Blot von ähnlichen Zellen, die nicht einer radiomarkierten Aminosäure ausgesetzt worden waren, gescreent.
  • Beispiel 4
  • Expression des β-Amyloid-verwandten Proteins (1–751) in kultivierten Säugerzellen
  • Um die Expression des β-Amyloid-verwandten Proteins in Säugerzellen zu erleichtern, wird ein Plasmid so konstruiert, dass das Codierungssegment für das Protein an einen starken regulierten Promotor, abgeleitet vom humanen Metallthionein-II-(hmtII)-Gen, fusioniert wird. Dieses Verfahren wird in zwei Schritten vorgenommen. Zunächst wird eine Expressionsvektor, pMTSV40 polyA Bam, vom phGH-SV(10)-Vektor durch Verdau von phGH-SV(10) mit BamHI- und SmaI-Restriktionsenzymen abgeleitet, gefolgt von einer Inkubation mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment), um ein stumpfendendes Molekül zu schaffen. Die stumpfen Enden werden anschließend an BamHI-Linker ligiert, mit BamHI geschnitten und religiert, um die Rezikularisation zu ermöglichen. Bei diesem Schritt wird die gesamte genomische Sequenz des humanen Wachstumshor mons von phGH-SV(10) entfernt, mit Ausnahme des Großteils der 3'-untranslatierten Region der mRNA- und genomischen Sequenzen, die mutmaßliche 3'-transkriptionelle Stopp- und Prozessiersignale codiert. Für das Säugerzell-Expressionskonstrukt wird pMTSV40 polyA Bam mit BamHI verdaut, dann mit allen vier Nukleotidtriphosphaten und mit DNA-Polymerase I inkubiert, um stumpfe Enden zu schaffen. Dieses Fragment wird anschließend mit dem gereinigten 2678 bp SmaI-XmnI-Fragment, das von p4T4B (zuvor beschrieben) abgeleitet ist, ligiert. Die rekombinanten Moleküle werden in MC1061 durch Transformation eingeführt.
  • Chinesische Hamster-Ovarien-(CHO)-K1-Zellen werden in einem Medium gezüchtet, das sich aus einem 1 : 1-Gemisch von F12-Medium und DME-Medium mit 10% fötalem Kälberserum zusammensetzt. Die kompetenten Zellen werden mit dem rekombinanten Expressionsvektor und pSU2:NEO cotransformiert (Southern, P., et al., J Mol Appl Genet (1982) 1: 327–341). pSV2:NEO enthält ein funktionelles Gen, das dem Neomycin-Analogon G418 Resistenz verleiht. Bei der Transformation werden 500 ng an pSV2:NEO und 5 μg des rekombinanten Vektors auf eine 60 mm-Schale der CHO-Zellen als einem Calciumphosphat-DNA-Copräzipitat aufgebracht, wie beschrieben bei Graham, F. L. und Van der Eb, A. J. Virology (1973) 52: 456–467. Das Wachstum der Zellen im antibiotischen G418, wie beschrieben von Southern et al., ergibt einen Pool an stabil transfizierten CHO-Zellen, die die Expressionsvektor-DNA mit der Fähigkeit zum Exprimieren von β-Amyloid-verwandtem mRNA und Protein enthält.
  • Beispiel 5
  • Expression des β-Amyloid-verwandten Proteins (652–751) in kultivierten Säugerzellen
  • Ein Säugerzell-Expressionsvektor, der für die Produktion eines β-Amyloid-verwandten Proteins codiert, kann wie in 12 gezeigt wie folgt konstruiert werden: der p4BΔRI-Vektor aus 10 wird durch Verdau mit EcoRI linearisiert. Der Vektor wird mit zwei Oligonukleotiden mit den folgenden Sequenzen gemischt:
    Figure 00390001
    und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Diese Oligonukleotide rekonstruieren die Met-Asp-Ala-Codons von λSM2W4, wobei diesen die EcoRI- und SmaI-Stellen vorangehen und ihnen eine weitere EcoRI-Stelle folgt.
  • Kompentente E. coli-Stamm-DH1-Zellen werden mit dem Gemisch transformiert, und Ampicillin-resistente Bakterien werden durch Wachstum auf L-Amp-Platten ausgewählt. Eine Transformante, die das in die EcoRI-Stelle in der geeigneten Orientierung inserierte Oligonukleotid-Paar enthält, wird mittels standardmäßiger Screening-Techniken ausgewählt und als pΔW4/W3 bezeichnet. Die Plasmid-DNA-pΔW4/W3 wird mit SmaI und XmnI verdaut, um Sequenzen zu entfernen, die das in 5 beschriebene β-Amyloid-verwandte Protein codieren, und das korrekte Stück wird durch Gelreinigung isoliert.
  • Das Stück kann dann in den Säugerzell-Expressionsvektor pMTSV40 polyA Bam inseriert werden, der mit BamHI linearisiert und stumpfendig gemacht wurde, wie oben in Beispiel 4 beschrieben. Der resultierende Vektor, pMT-APCP (652–751) kann für die Produktion des β-Amyloid-verwandten Proteins (652–751) verwendet werden.
  • Beispiel 6
  • Expression des β-Amyloid-Vorläufers in Säugerzellen
  • Skizziert in Beispielen 4 und 5 ist die Konstruktion eines Expressionssystems für das durch den humanen β-Actin-Promotor angetriebene β-Amyloid-verwandte Protein (1–751). Ein nahezu identisches Konstrukt wurde unter Verwendung des gereinigten 2548 bp-SmaI-XmnI-Fragments, abgeleitet von p4T4B (zuvor in Beispiel 3 beschrieben), präpariert, von welchem 116 bp aus der 5'-untranslatierten Region deletiert worden sind. Dieses Fragment wurde in die SalI-Stelle hinter dem humanen β-Actin-Promotor an einem Plasmid inseriert, das den Neomycin-selektierbaren Marker für die Säugerzell-Expression und das Ampicillin-Resistenzgen für die Selektion der bakteriellen Transformanten beherbergte. Dieser Vektor, pHbAPr-1-neo, wurde beschrieben von Gunning, et al., (Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84: 4831–4835) un wurde modifiziert, um die EcoRI-Stelle aus dem Körper des ursprünglichen Vektors zu entfernen und die ursprüngliche Polylinker-Region mit einem neuen Polylinker zu substituieren, der eine EcoRI-Stelle zusätzlich zu den SalI-, HindIII- und BamHI-Klonierstellen, die ursprünglich vorhanden waren, enthielt. Der modifizierte Vektor wird als pAXneoR bezeichnet. Der pAXneoR-Vektor wurde mit SalI linearisiert, die Endigungen unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase aufgefüllt, um stumpfendige Moleküle zu schaffen. Das 2548 bp SmaI-XmnI-β-Amyloid-Fragment wurde in den Vektor unter Verwendung von T4-Ligase stumpf ligiert. Die rekombinanten Moleküle wurden in E. coli MC1061 durch Transformation eingeführt, und ein Klon, der die geeignete Orientierung zeigte, wurde amplifiziert. Eine ähnliche Konstruktion wurde unter Verwendung der 695-β-Amyloid-Sequenzen hergestellt, wie beschrieben von Kang et al. (supra), was das 695 Amyloid-Protein unter die Kontrolle des humanen β-Actin-Promotors stellt.
  • 600 μg Gesamt-DNA von pAXneo/751-β-Amyloid oder pAXneo/695-β-Amyloid oder ein äquivalentes Massengemisch beider Plasmid-Konstrukte wurde in 107 CHO-Zellen durch Elektroporation (Neumann, J Membrane Biol (1972) 10: 279–290; Zimmerman, Biophys J (1973) 13: 1005–1013) unter Verwendung eines BTX-Transfektor 100, Bio-Rad, sterilen Einweg-Küvetten und eined maßgeschneiderten Küvettenhalters eingeführt. G418-resistente Zellen, die die exogene DNA erhielten, wurden mittels standardmäßiger Protokolle (Southern, 1982, supra) unter Verwendung von 500 μg/ml G418 von Gibco ausgewählt.
  • Der Pool der positiv transfizierten Zellen, die resistent gegen G418 aus jeder der drei Transfektionen waren, wurde bezüglich der β-Amyloid-Vorläuferprotein-Expression charakterisiert. Etwa 2 × 106 Zellen aus jedem Pool, enthaltend 5 ml serumfreies Medium, wurden bei 37°C für 48 Stunden inkubiert. Das konditionierte Medium wurde entfernt und das Protein durch Zugabe von Trichloressigsäure zu einer Endkonzentration von 10% ausgefällt. Die Zellen wurden durch Abschaben geerntet, in mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in 50 μl an Puffer für eine 30-fache Konzentration resuspendiert. 25 μl jeder Probe wurden auf ein 12,5% Polyacrylamidgel aufgeladen (Laemmli, Nature (1970) 277: 680–685). Der β-Amyloid-Vorläufer wurde mittels Western-Blot-Analyse (Towbin, Proc Natl Acad Sci USA (1979) 76: 4350–4354) unter Anwendung standardmäßiger Verfahrensweisen und β-Amyloid-spezifischer polyklonaler Antikörper nachgewiesen, wie mittels rekombinantem Vaccinia-Virus erzeugt, das die β-Amyloid-751-cDNA beherbergte, wie in Beispiel 3 beschrieben. Typischerweise ist der Großteil des etwa 110.000 Dalton-β-Amyloid-Vorläufers als in das Kulturmedium freigesetzt feststellbar und sind sehr geringe Mengen des Proteins Zell-assoziiert. Dieses Ergebnis stimmt mit der Hypothese von Allsop, et al., (Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85: 2790–2794) überein, der vorschlägt, dass das β-Amyloid-Protein ein sekretiertes Prohormon ist. Das scheinbare Molekulargewicht von 110.000 Dalton des rekombinant exprimierten β-Amyloid-Proteins ist ähnlich zu dem, das von anderen (Dyrks, T., et al., EMBO J (1988) 7(4): 949–957) unter Verwendung von in vitro-Transkriptions/-Translationssystemen beobachtet wurde.
  • Das in einen wie in Beispiel 3 beschriebenen Vaccinia-Virus klonierte β-Amyloid-751-Protein wurde auch auf die Beschaffenheit der β-Amyloid-Protein-Expression untersucht. Das gereinigte rekombinante Virus wurde zum Infizieren von 106 CV-1-Zellen bei einem MOI von 1 unter serumfreien Bedingungen verwendet. 18 Stunden nach Infektion mit dem Virus wurden sowohl Zellen als auch Überstände abgeerntet, einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese und einem Western-Blotting unter Verwendung der oben beschriebenen polyklonalen Antiseren unterzogen. Wie in 15 gezeigt, wurde das 110.000 Dalton-β-Amyloid-Protein als in den konditionierten Medien vorhanden im Gegensatz zu Zell-assoziiert festgestellt.
  • Beispiel 7
  • Assay zur Unterscheidung genetischer Varianten der mRNA-Spezies des β-Amyloid-verwandten Proteins
  • Die Unterscheidbarkeit zwischen genetischen Varianten der mRNA-Spezies des β-Amyloid-verwandten Proteins unter Verwendung von Oligonukleotid-Sonden wird hierin gezeigt.
  • Ein diagnostischer Assay für Alzheimer-Krankheit könnte die Form einer Unterscheidung zwischen zwei eng verwandten genetischen Varianten der β-Amyloid-verwandten Proteine oder ihrer mRNAs und der Quantifizierung der relativen Expressionshöhen dieser Proteine oder mRNAs aufweisen. In 8 ist ein Beispiel der Verwendung der Sequenzen der Erfindung gezeigt, um einen Standard für den diagnostischen Assay zu liefern.
  • Die gesamte zelluläre RNA oder cytoplasmatische RNA wurde aus Humanzellen in Kultur oder humanem Hirngewebe (Alzheimer-Gehirn oder gesundes Gehirn) mit oder ohne Entfernung der Kerne (cytoplasmatische bzw. gesamte) mittels der Guanidinthiocyanat/CsCl-Methode präpariert, wie beschrieben von Maniatis et al. Die Proben entsprechend der Nummerierung in 8 sind: (1) Gesamt-RNA aus IMR-32-Zellen (ATCC #CCL127), eine gemischte Neuroblastom- und Fibroblastenkultur; (2) Gesamt-RNA aus MRCS-Zellen (ATCC #CCL171), ein normaler Fibroblast; (3) Gesamt-RNA aus HeLa-Zellen (ATCC #CCL2.2), eine epitheloide Zelle; (4) cytoplasmatische RNA aus MRC5-Zellen; (5) cytoplasmatische RNA aus HeLa-Zellen; (6) Gesamt-RNA aus HL-60-Zellen (ATCC #CCL240), eine promyelocytische Leukämiezelle; (7) Gesamt-RNA aus HL-60-Zellen, die mit 12-Tetra-Decanoylphorbol-13-acetat behandelt worden sind, um eine Differenzierung der Zellen zu Makrophagen zu induzieren; (8) Gesamt-RNA aus normalen Kleinhirnproben; (9) Gesamt-RNA aus normalen Proben der Stirnlappenrinde; (10) Gesamt-RNA aus der Stirnlappenrinde eines Alzheimer-Patienten; und (11) Gesamt-RNA aus einer normalen Scheitellappenrinde. Die RNA wurde durch Oligo-dT-Cellulose-Chromatographie fraktioniert, auf einem Formaldehydagarosegel elektrophoretisch behandelt und auf Nitrocellulose aufgetupft (alle wie beschrieben bei Maniatis et al.). Die Filter wurden festgebacken, prähybridisiert und an die angegebenen Sonden gemäß standardmäßiger Protokolle hybridisiert.
  • Die angegebenen Sonden sind: (1) Junktion, ein 30-Basen-Oligonukleotid #2733, das für die Kang et al.-Sequenz spezifisch ist, wie oben in der ausführlichen Beschreibung der Erfindung beschrieben; (2) Insert, ein 60-Basen-Oligonukleotid #2734, das für die in 1 beschriebenen β-Amyloid-verwandten Sequenzen spezifisch ist, wie auch oben beschrieben; und (3) ein humanes 1800 bp-Actin-cDNA-Insert, das aus dem Plasmid pHFBA-1 isoliert wurde (Ponte, P., et al., Nuc Acids Res (1984) 12: 1687–1696). Die Oligonukleotid-Sonden wurden mit [32P]-dCTP durch Inkubtion mit terminaler Transferase gemäß den Vorschlägen des Herstellers endmarkiert. Das Actin-Insert wurde mit [32P]-CTP durch Nick-Translatation radiomarkiert. Nach der Hybridisation wurden die an Oligonukleotide hybridisierten Filter bei 1 × S. S. C., 55°C, gewaschen. Der an Actin hybridisierte Filter wurde bei 0,1 × SSC bei 55°C gewaschen. Die Filter wurden dann einer Röntgenfilmbelichtung unterzogen, um das gezeigte Autoradiogramm zu erzeugen. Die Insert-Sonde weist die in 1 beschriebene β-Amyloid-verwandte Protein-mRNA in allen untersuchten Proben nach. Die Junktions-Sonde weist die von Kang et al. beschriebene β-Amyloid-verwandte mRNA in allen Zellen außer HeLa und MRC5 nach. Die Actin-Sonde stellt eine Kontrolle dar, von der das Hybridisieren an reichlich vorhandene RNA in allen Zellen erwartet wird.
  • Beispiel 8
  • Bakterielle Expression des β-Amyloid-verwandten Proteins (289–345)
  • A. Konstruktion des Plasmids pAPCP125-2.
  • Ein synthetisches Gen wurde gemäß den Lehren aus Beispiel 2 für das β-Amyloid-verwandte Protein (289–345) aus drei Paaren der Oligodesoxyribonukleotide (veranschaulicht in 9D) unter Verwendung der bevorzugten E. coli-Codonwahl für hoch exprimierte Gene zusammengesetzt, und eine Hydroxylamin-Spaltstelle (Asn-Gly) wurde vor die Aminosäure 289 (Glu) inseriert, um die Freisetzung des Polypeptids aus einem Fusionsprotein zu ermöglichen. Der Expressionsvektor pTRP83-1 wurde mit Restriktionsendonukleasen EcoRI und HindIII verdaut und das linearisierte Plasmid aus einem 0,6% Agarosegel ausgereinigt. Fünfzig μg der Plasmid-DNA und 200 μg synthetische Gen-DNA wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert, und E. coli-MC1061 wurde mit der Ligation transformiert. Ampicillin-resistente Kolonien wurden über Nacht in L-Bouillon gezüchtet, die 100 μg/ml Ampicillin enthielt, und alkalische Plasmid-Preps wurden vorbereitet. Die resultierende Plasmid-DNA wurde mit BamHI-Restriktionsendonuklease verdaut, um die Insertion des Gens innerhalb des Vektors durch Freisetzung eines etwa 350 bp-Fragments zu bestätigen. Ein Plasmid, das das synthetische Gen-Insert erhielt, wurde als pAPCP125-2 bezeichnet.
  • B. Expression des β-Amyloid-verwandten Fusionspolypeptids (289–345).
  • Das Plasmid pAPCP125-2 ist zum Exprimieren eines 74 Aminosäuren-β-Galactosidase-Threonin-β-Amyloid-verwandten Fusionsproteins unter der Kontrolle des E. coli-Tryptophan-Promotors/Operators gestaltet. E. coli-Stamm W3110 wird mit Plasmid-pAPCP125-2 transformiert und eine der resultierenden Ampicillin-resistenten Kolonien wie in Beispiel 2 gezüchtet. Die Expression wird durch die Zugabe von 3-β-Indolacryl säure bei einer Endkonzentration von 25 μg/ml induziert. Nach 5-stündiger Induktion wird eine Teilmenge von 1 ml der Zellen aus der Kultur entnommen, mittels Zentrifugation geerntet, dann in 100 μl Laemmli-Protein-Probenpuffer für die Elektrophorese durch ein 16% SDS-Polyacrylamidgel mittels standardmäßiger Methodiken gekocht. Die Auswertung der Bildung von Einschlusskörpern wird durch Phasenkontrastmikroskopie (1000×) vorgenommen. Die Expressionshöhen werden durch Coomassie-Blau-Anfärbung des Gels, gefolgt von einem Densitometer-Scan zum Quantifizieren der Intensität der Proteinbande, bewertet. Die zur Proteinreinigung zu verwendenden Zellen werden mittels Zentrifugation abgeerntet, mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, gewaschen und das Zellpellet bei –20°C bis zur Verwendung eingefroren.
  • C. Ausreinigung des Beta-gal-thr-β-Amyloid-verwandten Proteins (289–345)
  • Das Fusionsprotein wird wie für das β-gal-thr-β-Amyloid-verwandte (655–751) Fusionsprotein (Beispiel 2) beschrieben in Abwesenheit von PMSF und Aprotinin ausgereinigt. Eine Reihe von Waschvorgängen aus 2 M Harnstoff bis 4 M Harnstoff entfernt andere Proteine und reichert das in den Einschlusskörpern vorgefundene Fusionsprotein weiter an. Ist eine weitere Ausreinigung erwünscht, so wird das Fusionsprotein in 6–8 M Harnstoff angelöst und außerdem ein Gelfiltrations- oder Ionenaustausch-Chromatographieschritt aufgenommen. Ist keine weitere Ausreinigung erwünscht, so wird das Fusionsprotein in 6 M Guanidiumhydrochlorid mit Hydroxylamin unter den von Moks, et al., Biochem (1987) 26: 5239–5244 beschriebenen Bedingungen zur Spaltung zwischen den Asn- und Gly-Resten angelöst, wodurch β-Amyloid-verwandtes Protein (289–345) mit einem Gly-Rest an seinem Amino-Terminus freigesetzt wird. Die gespaltenen Peptide werden durch Umkehrphasen-Nochdruckflüssigchromatographie, Ionenaustausch- oder Gelfiltrationschromatographie ausgereinigt. Das ausgereinigte β-Amyloid-verwandte Protein wird dann reduziert und mittels den von Tan und Kaiser, J Org Chem (1976) 41: 2787 und Biochemistry (1977) 16: 1531–1541, beschriebenen Methoden reoxidiert, um die Disulfidbindungen zwischen den sechs Cys-Resten wiederherzustellen. Die erfolgreiche Reoxidation des Rinderpankreas-Trypsininhibitors (Aprotinin), der ebenfalls sechs Cys-Reste enthält und in E. coli erzeugt wird, wurde mittels dieser Methoden erreicht (von Wilcken-Bermann, et al., EMBO (1986) 5: 3219–3225).
  • Beispiel 9
  • Konstruktion und Expression des Inhibitorproteins
  • Für jedes der beiden chimären Proteine codierende DNA-Sequenzen wurden aus synthetischen Oligonukleotiden zusammengesetzt. Die Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide sind in 16 gezeigt. Die Sequenz des phoA-Signalpeptids (16B) ist von Kikuchi et al. (supra), die Sequenz des ompA-Signalpeptids (16A) stammt von Beck und Bremer (supra). Jedes Oligonukleotid wurde mit Kinase behandelt (außer der beiden außen gelegenen 5'-Enden).
  • Alle 8 Oligonukleotide, die entweder die phoA- oder ompA-Fusionen codierten, wurden zusammengemischt und mit Ligase behandelt. Die analytischen Gele zeigten eine neue Bande der erwarteten Länge (250 bp). Die ligierten Konstrukte wurden dann in die NdeI-HindIII-Stellen des Vektors pTRP233 ligiert. Die ligierten Vektoren wurden in E. coli-Stamm MC1061 transfiziert und die AmpR-Kolonien ausgewählt. Plasmid-Minipreps zeigten rekombinante Plasmide mit der korrekten Restriktionskarte. Die Miniprep-DNA wurde zum Transfizieren der Stämme W3110 und JE5505 verwendet. Kleinmaßstäbliche Kulturen jeder der drei Stämme wurden gezüchtet und mit IAA über Nacht induziert. Die Kulturüberstände wurden auf die Trypsin-inhibitorische Aktivität untersucht. Trypsin wird auf seine Hydrolysefähigkeit des synthetischen Substrats N-Benzoyl-D-arginin-p-nitroanilin zur Freisetzung von p-Nitroanilin (pNA) untersucht. Die Freisetzung der pNA als einer Funktion der Zeit lässt sich mit einem Spektrophotometer ohne weiteres überwachen und kann zur Messung der Trypsin-Aktivität quantifiziert werden. Der Inhibitor wird bei diesem Assay dank seiner Fähigkeit zum Binden an Trypsin und Verhüten der Hydrolyse des Substrats durch Trypsin nachgewiesen. Die Inhibitionsaktivität wurde im Kulturmedium sowohl für ompA- als auch phoA-Konstrukte in JE5505, doch nicht in W3110 oder MC1061, nachgewiesen. Die Expressionshöhen schienen mit dem phoA-Konstrukt zu steigen, weshalb lediglich dieses Konstrukt für die anschließenden Experimente verwendet wurde.
  • Ein Zeitverlaufs-Studie wurde vorgenommen, bei der die Mengen an Inhibitor im Medium untersucht und die Syntheseraten des Inhibitors durch den 35S-Methionin-Einbau in Inhibitor-Protein überwacht wurden. Diese Studie zeigte, dass die Synthese zwischen 4 und 6 Stunden nach der Induktion mit IAA auf Null zurückging, während sich das Inhibitor-Protein im Medium annähernd 8 Stunden nach der Induktion anhäufte. Diese Ver zögerung stellt vermutlich die Zeit dar, die das Protein benötigt, um aus dem Periplasma durch die Außenmembran in das Medium zu diffundieren. Die Mengen an Inhibitor im Medium schienen 8 bis 24 Stunden nach Induktion stabil zu bleiben.
  • Beispiel 10
  • Ausreinigung des Inhibitor-Proteins
  • Eine 5-Liter-Kultur von E. coli JE5505, die mit dem phoA-Konstrukt transformiert war, wurde über Nacht gezüchtet, bei OD550 = 0,1 induziert und 8 Stunden nach der Induktion mit IAA abgeerntet. Die Zellen wurden herauszentrifugiert und verworfen. Der Überstand wurde durch 8 μm- und 0,45 μm-Filter filtriert und durch eine Trypsin-Sepharose-Affinitätssäule (insgesamt 10 ml Sepharose, 6 mg/ml Trypsin auf Sepharose, 5 ml/min Fließgeschwindigkeit, 4°C) geleitet. Die Säule wurde mit 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 4, gewaschen, der 0,3 M Natriumchlorid (NaCl) und 0,01 M Calciumchlorid (CaCl2) enthielt, um nicht-spezifisch gebundenes Protein zu entfernen. Der Inhibitor wurde mit einem Puffer aus 0,1 M Salzsäure–0,5 M NaCl–0,01 M CaCl2, pH 1,25, eluiert. Alternativ kann anstelle der Verwendung der Trypsin-Affinitätssäule als einer Affinitätsmatrix eine Trypsin-Kügelchenaufschlämmung verwendet werden. 5 Liter des E. coli JE5505-Überstands wurden etwa 20 ml einer Trypsin-Sepharose-Kügelchenaufschlämmung zugegeben und dies mit einem Mixer (bei 300 UpM, 1 Stunde, Raumtemperatur) sanft gerührt. Das Gemisch wurde in einen gesinterten Glastrichter abgegossen und die Flüssigkeit aus den Kügelchen abgesaugt. Unter Verwendung von etwa 4 Litern an 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, wurden die Kügelchen reäquilibriert und dann mit 0,1 M Essigsäure–0,3 M NaCl, pH 4,5, gewaschen. Die Kügelchen wurden unter Verwendung von 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, reäquilibriert und dann der Proteaseinhibitor unter Verwendung von etwa 80 ml an 0,1 M HCl–0,5 M NaCl, pH 1,25, eluiert. Das Eluat wurde unter Verwendung von etwa 2,5 ml an 2 M Tris-Base, pH 10,0, neutralisiert.
  • Ein Trypsin-Affinitätssäuleneluat wurde auf eine Jones Chromatography-APEX-WP®-Butyl-HPLC-Säule (1 cm ID × 25 cm Länge), äquilibriert in 20% Acetonitril–0,1% Trifluoressigsäure–80% Wasser, injiziert. Ein linearer Gradient auf 60% Acetonitril/0,1% TFA in H2O wurde zum Eluieren des Inhibitors laufen gelassen. Der Inhibitor eluiert in einem Hauptpeak (Peak 4) und einem Nebenpeak (Peak 2). Beide sind im Tryps-Ininhibitionsassay aktiv, beide scheinen auf dem Proteinsequenzierer (40 Zyklen für Peak 4, 49 Zyklen für Peak 2) homogen zu sein und beide weisen die für den A4-Inhibitor erwartete Aminosäure-Zusammensetzung auf. Die Behandlung von Peak 2 mit 10 mM DTT (Dithiotreitol) bewirkt eine partielle Umwandlung des Peaks 2 zu Peak 4, was nahelegt, dass Peak 2 durch Oxidation von Methionin ansteigen kann. In jedem Fall hatte die endogene E. coli-Signalpeptidase das chimäre Protein an der erwarteten Stelle gespalten, wie durch die Pfeile in 16 gezeigt. Die massenspektrometrische (MS) Analyse ergibt, dass Peak 4 eine Molekularmasse von 6,267 Dalton aufweist, was dem vorhergesagten Wert von 6,267,7 für die volle Länge von A4i mit 3 Disulfid-Brückenbindungen sehr nahe kommt. Da jede S-S-Brückenbildung Ergebnisse wie den Verlust von 2H+ (= 2 Dalton) ergab, kann die Zahl der S-S eingeschätzt werden. Peak 2 ergibt einen heterogenen Peak in MS um etwa 80 Dalton größer als Peak 4, was mit der Oxidation übereinstimmt. Die angewandten Säurebedingungen zum Eluieren des Proteins aus der Trypsin-Sepharose-Affinitätssäule werden die Oxidation von Methionin fördern, wobei jedoch die Peak 2-Bildung durch die schnelle Neutralisation bei Verwendung einer gepufferten Lösung, wie zum Beispiel 2 M Tris-Base mit einem pH-Wert im Bereich von etwa 8 bis etwa 11, vorzugsweise pH 10,0, nach der Elution aus der Trypsin-Sepharose-Affinitätssäule minimiert.
  • Zwar wurden bevorzugte Ausführungsformen der Herstellung und Anwendung der Erfindung beschrieben, doch wird zu erkennen sein, dass verschiedene Veränderungen und Abwandlungen daran vorgenommen werden können, ohne von der Erfindung abzuweichen.
  • Die folgenden Kulturen wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA, für Patentzwecke hinterlegt. Bakteriophagen λSM2, λSM2W9 und λAPCP168i4 wurden unter den durch das Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms (Budapest Treaty) spezifizierten Bedingungen hinterlegt.
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Die Verfügbarkeit der hinterlegten Stämme soll nicht als Lizenz zur Ausführung der Erfindung im Widerspruch zu den Rechten verstanden werden, die unter der Autorität jeglicher Regierung in Übereinstimmung mit ihren Patentgesetzen gewährt wurden.

Claims (2)

  1. Verwendung eines Analogons vom Protease-Inhibitor des humanen Amyloidplaque-Core-Proteins mit der Aminosäuresequenz: GluValCysSerGluGlnAlaGluThrGlyProCysArgAlaMet IleSerArgTrpTyrPheAspValThrGluGlyLysCysAla ProPhePheTyrGlyGlyCysGlyGlyAsnArgAsnAsnPhe AspThrGluGluTyrCysMetAlaValCysGlySerAlaIle worin die Aminosäure Arginin an Position 13 mit Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan substituiert ist, in der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Chymotrypsin-Aktivität.
  2. Verwendung eines Analogons vom Protease-Inhibitor des humanen Amyloidplaque-Core-Potein mit der Aminosäuresequenz: GluValCysSerGluGlnAlaGluThrGlyProCysArgAlaMet IleSerArgTrpTyrPheAspValThrGluGlyLysCysAla ProPhePheTyrGlyGlyCysGlyGlyAsnArgAsnAsnPhe AspThrGluGluTyrCysMetAlaValCysGlySerAlaIle worin die Aminosäure Arginin an Position 13 mit Leucin, Methionin oder Valin substituiert ist, in der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Elastase-Aktivität.
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Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0527823A1 (de) * 1990-04-24 1993-02-24 The Regents Of The University Of California Reinigung, nachweis und verfahren zur verwendung der protease-nexin-2
US5213962A (en) * 1990-04-24 1993-05-25 The Regents Of The University Of California Purification, detection and methods of use of protease Nexin-2
US6174916B1 (en) 1990-04-27 2001-01-16 Milkhaus Laboratory, Ltd. Methods for treating herpes virus infections
US5753624A (en) * 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
US5672805A (en) * 1991-07-18 1997-09-30 The Regents Of The University Of California Transgenic mice expressing the neurotoxic C-terminus of β-amyloid precursor protein
WO1993009233A2 (en) * 1991-10-31 1993-05-13 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates Inc. Recombinant amyloid precursor protein inhibitor domain and treatment of various disease states
DE69229718D1 (de) * 1992-03-20 1999-09-09 Innogenetics Nv Mutierte Form von dem Beta-Amyloidprecursor Proteine Gen
EP0561087B1 (de) * 1992-03-20 1999-08-04 N.V. Innogenetics S.A. Mutierte Form von dem Beta-Amyloidprecursor Proteine Gen
CA2086165A1 (en) * 1992-04-09 1993-10-10 Paul P. Tamburini Diagnostic assay for alzheimer's disease based on the proteolysis of alzheimer's precursor protein
US5441870A (en) * 1992-04-15 1995-08-15 Athena Neurosciences, Inc. Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein
US5851787A (en) * 1992-04-20 1998-12-22 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding amyloid precursor-like protein and uses thereof
TW327194B (en) * 1992-05-01 1998-02-21 American Cyanamid Co Novel amyloid precursor proteins and methods of using same
US5605811A (en) * 1992-10-26 1997-02-25 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for monitoring cellular processing of beta-amyloid precursor protein
JPH08511005A (ja) * 1993-06-01 1996-11-19 コーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 神経疾患の治療におけるアルカリ性または酸性ホスファターゼインヒビター
US5795954A (en) * 1994-03-04 1998-08-18 Genentech, Inc. Factor VIIa inhibitors from Kunitz domain proteins
US6114133A (en) * 1994-11-14 2000-09-05 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of Alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41)
US7427392B1 (en) 1994-11-14 2008-09-23 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41) and tau
ZA963619B (en) * 1995-05-08 1996-11-22 Scios Inc Protease inhibitor peptides
US5786328A (en) * 1995-06-05 1998-07-28 Genentech, Inc. Use of kunitz type plasma kallikrein inhibitors
US5780265A (en) * 1995-06-05 1998-07-14 Genentech, Inc. Kunitz type plasma kallikrein inhibitors
PT891426E (pt) * 1996-03-11 2006-10-31 Bayer Corp Bicunina humana
US5798102A (en) * 1997-03-04 1998-08-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Treatment of cardiomyopathy
US6303127B1 (en) 1997-03-04 2001-10-16 Milkhaus Laboratory, Inc. Treatment of disease states
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
EP1033998B1 (de) * 1997-12-03 2005-10-19 Neuralab, Ltd. Unterdrückung von veränderungen in zusammenhang mit beta-amyloid bei alzheimer
EP1095183B1 (de) * 1998-03-31 2012-02-22 Esoterix Genetic Laboratories, LLC Verfahren zur diagnose und behandlung von lungenkrebs
EP1125135B1 (de) 1998-10-30 2004-12-08 Jordan L. Holtzman Komplex, bestehend aus einem chaperon und beta-amyloidprotein sowie verfahren, die diesen komplex benutzen
EP1374891B1 (de) * 1998-12-22 2008-09-10 Bayer Aktiengesellschaft Methode zur Beschleunigung der Schleimauflöserate
US20070140979A1 (en) * 1998-12-22 2007-06-21 Bayer Aktiengesellschaft Method for accelerating the rate of mucociliary clearance
JP5025871B2 (ja) * 2000-02-21 2012-09-12 エイチ．リュンドベック エイ／エス アミロイドの新規なダウン−レギュレート方法
CZ20022748A3 (cs) * 2000-02-21 2004-03-17 Pharmexa A/S Nová metoda regulace obsahu amyloidu
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
US7264810B2 (en) * 2001-01-19 2007-09-04 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
US20040191264A1 (en) * 2001-02-19 2004-09-30 Nielsen Klaus Gregorius Synthetic vaccine agents
US7097837B2 (en) * 2001-02-19 2006-08-29 Pharmexa A/S Synthetic vaccine agents
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
US7816149B2 (en) * 2004-03-29 2010-10-19 Applied Photonics Worldwide, Inc. Nanobioprocessor for protein and cell therapy
TW200635607A (en) 2004-12-15 2006-10-16 Elan Pharm Inc Humanized Aβ antibodies for use in improving cognition
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
DK1905839T4 (da) * 2006-09-22 2019-10-07 Wacker Chemie Ag Fremgangsmåde til fermentativ fremstilling af proteiner
EP1903105B1 (de) * 2006-09-22 2010-04-21 Wacker Chemie AG Verfahren zur fermentativen Herstellung von Proteinen
EP2481408A3 (de) 2007-03-01 2013-01-09 Probiodrug AG Neue Verwendung von Inhibitoren der Glutaminyl Cyclase
DK2142514T3 (da) 2007-04-18 2015-03-23 Probiodrug Ag Thioureaderivater som glutaminylcyclase-inhibitorer
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
DK2182983T3 (da) 2007-07-27 2014-07-14 Janssen Alzheimer Immunotherap Behandling af amyloidogene sygdomme med humaniserede anti-abeta antistoffer
WO2009034158A2 (en) * 2007-09-12 2009-03-19 Probiodrug Ag Transgenic mice
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
AU2010294214B2 (en) 2009-09-11 2015-05-07 Vivoryon Therapeutics N.V. Heterocylcic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
JP6026284B2 (ja) 2010-03-03 2016-11-16 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの阻害剤
AU2011226074B2 (en) 2010-03-10 2015-01-22 Vivoryon Therapeutics N.V. Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (QC, EC 2.3.2.5)
EP2560953B1 (de) 2010-04-21 2016-01-06 Probiodrug AG Hemmer der glutaminylzyklase
JP6050264B2 (ja) 2011-03-16 2016-12-21 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの阻害剤としてのベンゾイミダゾール誘導体
PT2017095250B (pt) 2015-11-30 2021-08-06 Univ De Coimbra Peptídeos inibidores da bace1 para o tratamento de doenças neurológicas
PL3461819T3 (pl) 2017-09-29 2020-11-30 Probiodrug Ag Inhibitory cyklazy glutaminylowej
CN112888787A (zh) 2018-07-24 2021-06-01 瓦克化学股份公司 新型细菌lpp突变体及其在重组蛋白质的分泌生产中的用途

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU560584B2 (en) * 1983-07-28 1987-04-09 Bayer Aktiengesellschaft Homologues of aprotinin
US4666829A (en) * 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
AU611122B2 (en) * 1986-11-17 1991-06-06 Scios Nova Inc. Recombinant alzheimer's amyloid protein
US4912206A (en) * 1987-02-26 1990-03-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services CDNA clone encoding brain amyloid of alzheimer's disease
DE3724570A1 (de) * 1987-06-27 1989-01-05 Bayer Ag Human-aprotinin, dessen lys-rest in position 15 gegen einen anderen protogenen aminosaeurerest ausgetauscht ist
GB2208511A (en) * 1987-08-07 1989-04-05 Bayer Ag Variants of bovine pancreatic trypsin inhibitor produced by recombinant dna technology
CA1340802C (en) * 1987-08-15 1999-10-26 Yasuyuki Takahashi Senile amyloid precursor protein and an antibody specific for the same
JPH02101017A (ja) * 1988-10-05 1990-04-12 Asahi Chem Ind Co Ltd 疾患治療用医薬組成物
DE3912638A1 (de) * 1989-04-18 1990-10-31 Bayer Ag Gentechnologisch hergestellte homologe des alzheimer protease inhibitors, wirtstaemme sowie expressionsvektoren fuer ihre herstellung und ihre verwendung als arzneimittel

Also Published As

Publication number Publication date
EP0692490B1 (de) 2004-11-03
EP0476015A1 (de) 1992-03-25
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CA2057053C (en) 1998-05-26
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EP0692490A2 (de) 1996-01-17
US5223482A (en) 1993-06-29
ATE281470T1 (de) 2004-11-15
DE69034171D1 (de) 2004-12-09
CA2057053A1 (en) 1990-12-07
EP0476015A4 (en) 1993-02-17

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