CZ20022748A3 - Nová metoda regulace obsahu amyloidu - Google Patents

Nová metoda regulace obsahu amyloidu Download PDF

Info

Publication number
CZ20022748A3
CZ20022748A3 CZ20022748A CZ20022748A CZ20022748A3 CZ 20022748 A3 CZ20022748 A3 CZ 20022748A3 CZ 20022748 A CZ20022748 A CZ 20022748A CZ 20022748 A CZ20022748 A CZ 20022748A CZ 20022748 A3 CZ20022748 A3 CZ 20022748A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cell
epitope
polypeptide
nucleic acid
analog
Prior art date
Application number
CZ20022748A
Other languages
English (en)
Inventor
Martin Roland Jensen
Peter Birk
Klaus Gregorius Nielsen
Original Assignee
Pharmexa A/S
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pharmexa A/S filed Critical Pharmexa A/S
Publication of CZ20022748A3 publication Critical patent/CZ20022748A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Description

Nová metoda regulace obsahu amyloidu
Oblast techniky
Vynález se týká zlepšení v léčbě a prevenci Alzheimerovy choroby (AD) a jiných chorob charakterizovaných uložením amyloidu, tzn. charakterizovaných ložisky amyloidu v centrálním nervovém systému (CNS). Specifičtěji vynález poskytuje metodu „regulace za účelem snížení (nežádoucích) ložisek amiloidu poskytnutím produkce protilátek proti odpovídajícímu proteinu nebo těmto složkám v objektech trpících nebo ohrožených chorobami vyznačujícími se patologickým ukládáním amyloidu.. Vynález také poskytuje metody produkce polypeptidů užitečných při tomto způsobu a modifikované polypeptidy jako takové. Vynález také zahrnuje produkci fragmentů nukleových kyselin kódujících modifikované polypeptidy a vektory začleňující tyto fragmenty nukleových kyselin a hostitelské buňky a transformované linie buněk. Vynález déle poskytuje metodu identifikace analogů ložisek polypeptidů, které jsou užitečné podle vynálezu a současně pro kompozice obsahující modifikované polypeptidy nebo obsahující nukleové kyseliny kódující modifikované polypeptidy.
Dosavadní stav techniky
Amyloidóza je extracelulární ukládání nerozpustných vláken proteinů vedoucí k poškození tkání a chorobě (Pepys, 1996; Tan et al., 1995; Kelly, 1996). Vlákna jako normálně tvoří rozpustné proteiny a peptidy, ale sdružují se abnormálním způsobem (Kelly, 1997).
Amyloid je spojen s vážnými chorobami zahrnujícími systémovou amyloidózu, AD, diabetes s nástupem v dospělosti, • · · ·
Parkinsonovu chorobu, Huntingtonovu chorobu, fronto-temporální demenci a s priony související transmisní spongiformní encephalopatii (kuru a Creutzfeldt-Jacobova choroba lidí a scrapie a BSE ovcí a dobytka). Tvorba povlaků amyloldů například u Alzheímerovy choroby se zdá být úzce spojena s vývojem lidských nemocí. Na zvířecích modelech nadexprese nebo exprese modifikovaných forem proteinů nalezených v ložiscích jako je β-amyloidový protein, bylo ukázáno, že vyvolávají různé symptomy choroby, např. symptomy podobné jako u Alzheimerovy choroby. V současnosti neexistuje specifické ošetření ukládání amyloidu a tyto choroby jsou obvykle smrtelné.
Subjednotky amyloidových vláken mohou být divokého typu, různorodé nebo zkrácené proteiny a podobná vlákna se mohou tvořit ín vitro z oligopeptidů a denaturovaných proteinů (Bradbury et al., 1960; Filshie et al., 1964; Burke & Rougvie, 1972). Druh polypeptidových složek vláken určuje charakter amyloidózy. Přes velké rozdíly ve velikosti, přirozené struktuře a funkci amyloidových proteinů, mají všechna amyloidová vlákna kolísavou délku, jsou nerozvětvená, dlouhá v průměru od 70 do 120 Á a jsou viditelná při barvení Kongo červení (Pepys, 1996). Jsou charakteristická křížovou β strukturou (Pauling & Corey, 1951), ve které je polypeptidový řetězec organizovaný v β-plátech. I když mají amyloidové proteiny velmi různorodou strukturu, jsou také schopné podstoupit strukturální konverzi do formy, která je stavebním prvkem β-plátů spirály protofilamentů, snad podobným způsobem.
Tento charakteristický vzor vláken vede k amyloidóze, která se nazývá β-fibrilóza (Glenner, 1980a, b) a protein vlákna AD byl nazván jako β-protein ještě předtím, než byla ·· ··· · známa jeho sekundární struktura (Glenner & Wong, 1984). Charakteristický křížový-β difrakční vzor, spolu s přítomností vláken a tinktoriálními vlastnostmi jsou v současnosti akceptované diagnostické charakteristické známky amyloidu a naznačují, že vlákna, i když jsou tvořena ze zcela odlišných proteinových prekursorů, mají podíl na stupni strukturální podobnosti a tvoří strukturální superrodinu, bez ohledu na původ jejich prekursorových proteinů (Sunde M., Serpell L.C., Bartlam M. , Fraser P.E., Pepys M.B., Blake C.C.F.J., Mol. Biol. 1997, 31. říjen; 273(3): 729-739).
Jednou z nejrozšířenějších a dobře známých nemocí, kde se předpokládá, že ložiska amyloidu v centrálním nervovém systému hrají hlavní roli ve vývoji choroby, je Alzheimerova choroba.
Alzheimerova choroba
Alzheimerova choroba (AD) je nevratné progresivní onemocnění mozku, které se vyvíjí postupně a výsledkem je ztráta paměti, změny chování, změny osobnosti a snížení duševních schopností. Tyto ztráty mají vztah k smrti mozkových buněk a k přerušení spojení mezi nimi. Průběh choroby kolísá od osoby k osobě podle rychlosti úpadku. Pacienti trpící AD žijí průměrně 8 až 10 let od doby, kdy jsou diagnostikováni, i když choroba může trvat více než 20 let.
AD se vyvíjí postupně, od občasné mírné zapomnětlivosti k silné ztrátě duševních funkcí. Tato ztráta je známá jako demence. U většiny lidí trpících AD, se symptomy poprvé objevují ve věku 60 let, ale časnější nástup je také častý. První, časné symptomy často zahrnují ztrátu současné paměti, porušené úsudky a změny osobnosti. Lidé postižení prvotními • · · · · · • · · ··· · · ·· ··· · · · · · • · ··· · · ··· · · • · · ···· · • · · · · ·· ·· ·· stádii AD neuvažují jasně a zapomínají jména příslušníků rodiny a známých míst. Později s průběhem choroby, mohou zapomínat, jak vykonat i jednoduché úkony. Případně lidé trpící AD ztrácejí veškerou schopnost úvahy a stávají se závislými na druhých lidech při jejich každodenním životě. Nakonec v konečném stádiu se choroba stává tak vyčerpávající, že jsou pacienti připoutáni na lůžko a náchylní na vývoj jiných onemocnění a infekcí. Ve většině případů pacienti trpící AD umírají na zápal plic.
I když se riziko vývoje AD zvyšuje s věkem, AD a symptomy demence nejsou součástí normálního stárnutí. AD a jiná duševní onemocnění jsou způsobena poruchami, které ovlivňují mozek. Při normálním stárnutí se nervové buňky v mozku neztrácejí ve velkém počtu. Naopak AD přerušuje tři klíčové procesy: komunikaci mezi nervovými buňkami, metabolismus a náhrady (opravy). Toto přerušení nakonec způsobuje ztrátu funkce velkého počtu nervových buněk, ztrátu spojení s ostatními nervovými buňkami a odumírání buněk.
Na počátku AD ničí neurony v části mozku, která ovládá paměť, především v hippokampu a přidružených strukturách. Současně, jak nervové buňky v hippokampu silně ztrácejí svoji funkci, dochází ke krátkodobým výpadkům paměti a často se snižuje schopnost pacientů vykonávat známé úkony. AD také atakuje mozkovou kůru, hlavně oblast odpovědnou za řeč a úvahu. Nakonec jsou zasaženy také jiné oblasti mozku, všechny tyto mozkové regiony atrofují (hroutí se) a pacienti trpící AD jsou připoutáni na lůžko, jsou inkontinentní, zcela bezmocní a nereagující na okolí (zdroj: National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Desease, 1999).
• · · · • · • ·
Následek AD
Ad je nejběžnější příčina demence u lidí ve věku 65 let a starších. Představuje hlavní ohrožení zdraví, protože má vážný vliv na jednotlivce, rodiny, zdravotnický systém a společnost jako celek. Výzkumní pracovníci odhadují, že 4 miliony lidí současně trpí touto chorobou a rozšíření se zdvojnásobuje každých 5 let po dosažení věku 65 roků. Také se odhaduje, že se objeví každý rok přibližně 360 000 nových případů (výskytu) a předpokládá se, že tento počet poroste s rostoucím věkem populace (Brookmayer et al., 1998).
AD klade velké ekonomické náklady na společnost. Poslední studie ve Spojených státech odhaduje, že každoroční náklady na ošetřování jednoho pacienta jsou 18 408 USD u pacienta s mírnou formou AD, 30 096 USD u pacienta se střední AD a 36 132 USD u pacienta se silnou AD. Roční náklady na ošetřování pacientů trpících AD se v USA odhaduje na mírně nad 50 miliard dolarů (Leon et al., 1998).
Přibližně 4 miliony amerických občanů má 85 roků nebo víc a ve většině průmyslových zemí je tato věková skupina jednou z nej rychleji rostoucích skupin obyvatelstva. Odhaduje se, že tato skupina bude mít počet téměř 8,5 milionů v roce 2030 v USA; někteří experti, kteří se zabývají populačními trendy předpokládají, že tento počet může být dokonce i vyšší. Při tom, jak čím dál tím víc lidí žije déle, se počet lidí postižených nemocemi spojenými se stárnutím, zahrnujícími AD, zvyšuje. Například některé studie ukazují, že skoro polovina všech 851etých lidí nebo starších trpí nějakou formou demence (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Desease, 1999).
·· ···· • · • · · · · · • · • · ·· ·«
Hlavní charakteristiky AD
Abnormální struktury v mozku jsou hlavní znaky AD: povlaky amyloidů a neurofibrilární zámotky (NFT). Povlaky jsou hustá, do značné míry nerozpustná ložiska proteinu a buněčného materiálu vně a okolo mozkových neuronů. Zámotky jsou nerozpustná stočená vlákna, která se tvoří uvnitř neuronů.
Existují dva typy AD: dědičná AD (FAD), která pochází z jistého typu dědičnosti a náhodná (sporadická) AD, kde není pozorovatelný zřejmý typ dědičnosti. Vzhledem k rozdílům ve věku při nástupu choroby, se AD dále rozděluje na AD s časným nástupem (vyskytující se u lidí mladších než 651etetých) a AD s pozdním nástupem (vyskytující se u lidí 651etých a starších) . Časný nástup AD je řídký (asi 10 % případů) a zpravidla postihuje lidi ve věku od 30 do 60 let. Některé formy AD s časným nástupem také často postupují rychleji než mnohem obvyklejší forma s pozdním nástupem.
Veškeré dosud známé dědičné formy AD (FAD) mají časný nástup a o víc než 50 procentech případů FAD je známo, že jsou způsobeny defekty ve třech genech umístěných na třech rozdílných chromosomech. Jsou to mutace v APP genu na chromosomu 21; mutace v genu na chromosomu 14; nazývaném jako presenilin 1; a mutace na chromosomu 1; nazývaném jako presenilin 2. Neexistují však doposud údaje o tom, že jakákoliv mutace hraje podstatnou roli v mnohem běžnější sporadické nebo nedědičné formě AD s pozdním nástupem (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's
Desease, 1999).
9999
9999
9 • 4 9 9
9 9 • 9 9 <9999 99 9 • 99 999 9 ·
9 9 9999 9999
999 99 99 99 99
Amyloidové povlaky
U AD se amyloidové povlaky nejprve vyvíjejí v oblasti mozku, která se používá pro paměť a jiné poznávací funkce. Skládají se z převážně nerozpustných ložisek beta amyloidu (déle označovaného jako Αβ) - proteinový fragment velkého proteinu nazývaného amyloidový prekursorový protein (APP, sekvence aminokyselin z kterých je sestavena SEQ ID NO: 2) promíchaných s částí neuronů a s nenervovými buňkami jako jsou mikroglia a astrocysty. Není známo, zda .amyloidové povlaky samotné jsou hlavní příčinou AD nebo zda jsou vedlejším produktem procesů AD. Je jisté, že změny v APP proteinu mohou způsobit AD, jak je ukázáno u dědičné formy AD způsobené mutacemi v APP genu, a tvorba Αβ povlaků se zdá být úzce spojená s vývojem choroby lidí (Lippa CF et al., 1998).
APP
APP je jeden z mnoha proteinů, které jsou spojené s buněčnými membránami. Potom když se vytvoří, usazuje se APP v membráně nervové buňky, částečně uvnitř a částečně zvenku buňky. Poslední studie, používající transgenní myši demonstrují, že APP hraje důležitou úlohu v růstu a přežívání neuronů. Například určité formy a množství APP mohou chránit neurony jak proti krátkodobému, tak i dlouhodobému poškození a mohou pomoci při opravě poškození neuronů mezi sebou a mohou části neuronů pomoci v růstu po zranění mozku.
Jakmile se APP usadí v buněčné membráně, proteázy působí na určitá místa v APP a rozštěpují je na proteinové fragmenty.
Jedna proteáza napomáhá štěpení APP za vytvoření formy Αβ a jiná proteáza štěpí APP uprostřed amyloidového fragmentu tak,
9999 99 99 ·· 9999 • · 9 9 9 9 · 9 · • 9 · 9 · 9 9999 9 9 9
O 99 999999999 9 υ 99 999999999
999 99 ·· ·9 ·· ·· že sa Αβ nemůže vytvořit. Vytvořený Αβ má dvě odlišné délky, kratší 40 (nebo 41)aminokyselinový Αβ, který je relativně rozpustný a shlukuje se pomalu, a poněkud delší 42 aminokyselinový „přilnavý Αβ, který rychle tvoří nerozpustné shluky. Není doposud přesně známo, jak se Αβ pohybuje skrz nebo okolo nervových buněk, potom když se vytvoří. V závěrečných fázích tohoto procesu se „přilnavý Αβ shlukuje do dlouhých vláken zvenku buňky a podél fragmentů mrtvých a odumírajících neuronů a mykroglií a astrocytů a tvoří povlaky, které jsou charakteristické pro AD v tkáni mozku.
Existují některá data, že jsou pravděpodobné mutace v APP předtím, než je Αβ vystřihnut z APP prekursoru, což způsobuje že se vytvoří buď více celkového Αβ nebo relativně více „přilnavé formy APP. Zdá se také, že mutace v presenilinových genech mohou přispívat k degeneraci neuronů přinejmenším dvěma způsoby: Modifikací produkce Αβ nebo přímo spuštěním smrti buněk. Jiní pracovníci v oboru předpovídají, že mutované preseniliny 1 a 2 mohou být zapojeny do zrychlení procesu apoptózy.
Očekává se, že jak nemoc pokračuje, tvoří se víc a víc povlaků, které vyplňují stále se zvětšující plochu mozku. Studie předpokládají, že je možné, že se Αβ shlukuje a naopak odděluje ve stejnou dobu, v jakémsi dynamickém rovnovážném stavu. To vyvolává naději, že by bylo možno rozbít povlaky potom, když se vytvoří (National Institute on Agíng Progress Report on Alzheimer's Desease, 1999).
Předpokládá se, že Αβ je toxický pro neurony. V studiích s tkáňovými kulturami pracovníci pozorovali zvýšení odumírání neuronových buněk hippokampu řízených k nadexpresi mutovanými
9999
9« 99*9
9
999
9 9 9 9 9
9 999 »99
9 9 9 99 9 9 99 9 >9 9*9 99 99 99 99 formami lidského APP ve srovnání s neurony nadexpresovanými normálním lidským APP (Luo et al., 1999).
Navíc, nadexprese nebo exprese modifikovaných forem Αβ proteinu demonstrovaná na zvířecím modelu vyvolala symptomy podobné Alzheimerovým (Hsiao Κ., et al., 1998).
Když je dáno, že zvýšená tvorba Αβ, jeho shlukování do povlaků a z toho vyplývající neurotoxicita mohou vést k AD, má terapeutický význam zkoumat podmínky při kterých může být shlukování Αβ do formy povlaků zpomaleno nebo dokonce zablokováno.
Preseniliny
Mutace v presenilinu-1 (S-180) odpovídají za téměř 50 % všech případů dědičné AD s časným nástupem (FAD). Bylo identifikováno přibližně 30 mutací, které dávají vzniknout AD. Nástup AD se mění podle mutací. Mutace v presenilinu-2 odpovídají za mnohem menší část případů FAD, ale jsou stále významným faktorem. Není známo, zda se preseniliny podílejí na sporadické nedědičné AD. Funkce presenilinů není známa, ale zdá se, že se podílejí na zpracování APP za vytvoření Αβ-42 (delší lepivá forma peptidu, SEQ ID NO:2, zbytky 673-714), protože AD pacienti s presenilinovými mutacemi mají zvýšené hladiny tohoto peptidu. Není jasné, zda preseniliny mají také roli při tvorbě NFT. Předpokládá se, že preseniliny by mohly také mít přímější úlohu při degeneraci neuronů a odumírání neuronů. Presenilin-1 je umístěn na chromosom 14, zatímco presenilin-2 je spojen s chromosomem 1. Když v sobě osoba přenáší mutovanou verzi právě jednoho z těchto genů, zcela určitě se u něho nebo u ní vyvine AD s časným nástupem.
.« ··«« »· *· »· ·»·· • · « · · · · · <
• ···· · ···* ♦ · · • Φ ·β· ······ · « · · · · <· · · · · ·
9 99 99 99 99 99
Existuji některé nejistoty v tom, zda je presenilin-1 identický s hypotetickou gamma-sekretázou podílející se na tvorbě APP (Naruse et al., 1998).
Apolipoprotein E
Apolipoprotein E je obvykle spojen s cholesterolem, ale byl nalezen také v povlacích a zámotcích mozku s AD. I když se nezdá, že by se alely 1-3 podílely na AD, existují signifikantní korelace mezi přítomností APOE-e4 alel a vývojem AD s pozdějším nástupem (Strittmatter et al., 1993). Avšak je to rizikový faktor a ne přímá příčina jak pro preseniliny, tak APP mutace a není omezen jen na dědičnou AD.
Způsob, jakým ApoE-e4 protein zvyšuje pravděpodobnost vývoje AD není doposud s určitostí znám, ale jedna možná teorie je taková, že usnadňuje tvorbu Αβ a tak přispívá k snížení věku při nástupu AD nebo přítomnost nebo nepřítomnost určitých APOE alel může ovlivnit způsob, jakým neurony reagují na poškození (Buttini et al., 1999).
Také bylo ukázáno, že Apo Al může být amyloidogenní. Celý Apo Al může sám tvořit amyloidům podobná vlákna in vitro, která jsou pozitivní při barvení Kongo červení (Am. J. Pathol. 147(2): 238-244 (září, 1995), Wisniewski T, Golabek AA, Kida E, Wisniewski KE, Frangione B).
Některé výsledky se zdají být protichůdné, když naznačují, že existuje pozitivní vliv APOE-e4 alely při zvyšování symptomů ztráty duševních schopností ve srovnání s jinými alelami (Stern, Brandt, 1997, Annals of Neurology 41).
0« 0«··
9 0 »0 0
9 000 · 0 · «9 09 9·0 6 0
00 0 ····
09 0« ·0
00·· • 0 0 · 009 • 9 0 • 0 · • 9 ·09
Neurofibrilární zámotky
Druhý charakteristický znak AD spočívá v abnormálních kolekcích stočených vláken nalézaných uvnitř nervových buněk. Hlavní složkou zámotků je jedna forma proteinu, která se nazývá tau (t) . V centrálním nervovém systému jsou tau proteiny nejlépe známy, vzhledem k jejich schopnosti vázat a pomáhat stabilizovat mikrotubuly, které jsou jedním ze stavebních prvků vnitřní podpůrné struktury buněk nebo skeletonu. Avšak u AD jsou tau proteiny chemicky pozměněny a tato změna nedovoluje tau proteinům stabilizovat nadále mikrotubuly, což potom způsobí, že mikrotubuly ztrácejí soudržnost. Toto selhání transportního systému má v první řadě za následek chybné fungování při komunikaci mezi nervovými buňkami a později může vést k neuronálnímu odumírání.
U AD se chemicky pozměněné tau proteiny stáčejí do párovaných spirálovitých filamentů - dvě vlákna tau proteinu, které jsou vzájemně stočené jedno okolo druhého. Tyto filamenty tvoří hlavní složku nalezenou u neurofibrilárních zámotků. V jedné současné studii zjistili výzkumní pracovníci neurofibrilární změny u méně než 6 % neuronů v určité oblasti hippokampu v zdravých mozcích, u více než 43 % těchto neuronů u lidí, kteří zemřeli na mírnou formu AD a u 71 % těchto neuronů u lidí, kteří zemřeli na silnou formu AD. Když byla studována ztráta neuronů, bylo pozorováno podobné procentické zvyšování. Údaje tohoto typu podporují názor, že tvorba zámotků a ztráta neuronů dohromady urychlují průběh AD. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
• · · <
·· ··
Tauopathie a zámotky
Některé neurodegenerativní choroby, jiné než AD, jsou charakteristické agregací tau proteinů do nerozpustných filamentů v neuronech a glia, což vede ke ztrátě funkčnosti a odumírání. Nejnověji našlo několik skupin vědců, kteří studovali rodiny trpící různými dědičnými demencemi jinými než AD, první mutace v tau genu na chromosomu 17 (Clark et al., 1988; Hutton et al., 1988; Poorkaj et al., 1988; Spillantiani et al., 1998). V těchto rodinách mutace v tau genu způsobily odumírání nervových buněk a demenci. Tyto poruchy, které vykazují některé vlastnosti jako u AD, ale liší se v některých důležitých ohledech, se souhrnně nazývají fronto-temporální demence a parkinsonismus spojené s chromosomem 17 (FTDP-17).
Existují choroby jako je Parkinsonova choroba, některé formy sklerózy (ALS) , kortikobazální supranukleární mrtvice a Pickova laterální progresivní amyotrofické degenerace, choroba, a všechny tyto choroby jsou. charakterizovány abnormální agregací tau proteinu.
Jiné neurologické choroby podobné AD
Existují důležité podobnosti mezi AD a jinými neurologickými chorobami, zahrnujícími prionové choroby (jako je kuru, Creutzfeld-Jacobova choroba a hovězí spongiformní encefalitida), Parkinsonova choroba, Huntingtonova choroba a fronto-temporální demence. Všechny tyto choroby se vyznačují ložisky abnormálních proteinů v mozku. AD a prionové choroby způsobují demenci a smrt a u všech se tvoří nerozpustná amyloidová vlákna, která jsou tvořena proteiny, které se liší jeden od druhého.
• to ····
Vědci zabývající se Parkinsonovou chorobou, která je druhé nejběžnější neurodegenerativní onemocnění po AD, objevili první gen spojený s touto chorobou. Tento gen kóduje protein nazývaný synuclein, který se netušené také nachází v amyloidových povlacích u pacientů trpících AD (Lavedan C, 1988, Genom Res. 8(9): 871-880). Vědci také zjistili, že genetické defekty u Huntingtonovy choroby, dalšího progresivního neurodegenerativního onemocnění, které způsobuje demenci, způsobuje Huntingtonův protein, který tvoří nerozpustná vlákna velmi podobná Αβ vláknům u AD a proteinovým vláknům u prionových chorob (Scherzinger E. et al., 1999, PNAS U.S.A. 96(8): 4604-9) .
Vědci také objevili nový gen, který, když je mutován, je odpovědný za dědičnou britskou demenci (FBD), což je zřídka se vyskytující dědičné onemocnění, které způsobuje silné pohybové těžkosti a progresivní demenci podobnou AD. Při biochemických analýzách amyloidových vláken nalezených u FBD povlaků, byl objeven unikátní peptid, nazvaný ABri (Vidal et al., 19,99). Mutace v určitém místě podél tohoto genu měla za následek produkci delšího Bri proteinu než je normální. ABri peptid, který je odstřihnut z mutovaného konce Bri proteinu se ukládá jako amyliodová vlákna. O těchto povlacích se předpokládá, že vedou k neuronální dysfunkci a demenci, která je charakteristická pro FBD.
Imunizace AD
Imunitní systém je normální součástí při čištění organismu od cizích proteinů a proteinových částic, ale ložiska spojená se shora uvedenými chorobami jsou tvořena především vlastními proteiny a proto je role imunitního
Φ φφφ φ φ φ φφ φφ systému v řízení těchto chorob méně zřetelná. Ložiska jsou navíc umístěna v kompartmentech (CNS) obvykle oddělených od imunitního systému. Z těchto skutečností se dá předpokládat, že vakcinace nebo imunoterapie by měly být neúspěšné.
Avšak vědci v současnosti provedli imunizaci myši vakcínou složenou z heterologního lidského Αβ a látkou, o které je známo že podněcuje imunitní systém (Chenk et al., 1999 a WO 99/27944). Vakcina byla testována na částečně transgenním myším modelu AD lidským mutovaným genem APP vloženým do DNA myši. Myši produkovaly modifikovaný APP protein a tvořily amyloidové povlaky, tak jak stárly. Tento myší model byl použit pro testaci, zda má vakcinace proti modifikovanému transgennímu lidskému APP vliv na tvorbu povlaků. V prvním pokusu byla jedné skupině transgenních myší podána jednou za měsíc injekce vakciny, začínalo se v 6 týdnech věku a končilo v 11 měsících věku myší. Druhá skupina transgenních myší nedostala žádné injekce a sloužila jako kontrola. V 13 měsících věku vykazovala kontrolní skupina povlaky pokrývající 2 až 6 % jejich mozku. Naopak imunizované myši neměly zjevně žádné povlaky.
V druhém experimentu začali vědci s injekcemi v 11 měsíci, když se povlaky už vytvořily. Za 7 měsíců měly kontrolní transgenní myši 17 krát zvýšené množství povlaků v mozku, zatímco myši, které dostávaly vakcínu, vykazovaly 99% starými kontrolními se některá předtím snížení ve srovnání s 18 měsíců transgenními myšmi. U některých myší existující povlaková ložiska zásluhou ošetření odstranila. Bylo také pozorováno, že jiná poškození spojená s povlaky jako je zánět a abnormální procesy v nervových buňkách se snížila jako výsledek imunizace.
• · · · • ·· · • · · · · • · · · · · ·
0 0 · 0 · 0·
00 00 00
Shora uvedené pokusy tvoří předběžnou studii na myších, protože vědci potřebují zjistit, zda vakcinované myši zůstávají zdravé i v jiných ohledech a zda vědomí myší, které byly vakcinovány zůstává normální. Navíc protože myší model netvoří kompletní reprezentaci AD (zvířata nevytvářejí neurofibrilární zámotky a mnoho jejich nervových buněk neodumírá) budou nezbytné následné studie pro určení toho, zda lidé budou mít podobné nebo odlišné reakce jako myši. Další věcí, kterou je třeba vzít v úvahu je to, že tato metoda může snad léčit amyloidové ukládání ale může selhat při zastavení vývoje demence.
Technické aspekty musí také udělat důležitý pokrok. Například je nepředstavitelné, nicméně možné, použití této technologie na vytvoření vakcíny, která dovoluje lidem vytvořit si protilátky proti jejich vlastním proteinům. Je proto třeba vyřešit mnoho aspektů bezpečnosti a efektivity před tím, než bude možno uvažovat o testech na lidech.
Práce Schenka et al. ukazuje, že kdyby bylo možno vyvolat silnou imunitní reakci proti vlastním proteinům v ložiscích proteinů v centrálním nervovém systému, jako jsou povlaky tvořené u AD, bylo by možno zabránit tvorbě těchto ložisek a možná také odstraňovat již vytvořené povlaky.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je zajistit novou léčbu proti podmínkám charakterizovaným ukládáním amyloidů, jako u AD.
Dalším cílem vynálezu je vyvinout autovakcínu proti amyloidům, • · 4 4 • · 4 ·
• · 4 4 4 4 4 4 4 44 44 4 za účelem získání nového způsobu ošetření AD a jiných patologických onemocnění zahrnujících ukládání amyloidů.
Souhrnný popis vynálezu
Zde popsané řešení je tvořeno použitím technologie autovakcinace za účelem vytvoření silné imunitní reakce proti jinak neimunogenním vlastním proteinům obsaženým v ložiscích amyloidů, které mají patologický účinek. Tímto způsobem se vytvoří silná imunitní reakce buď proti amyloidům nebo jednomu nebo více komponentům obsaženým v ložiscích nebo proti jednomu nebo více proteinům odpovědným za tvorbu amyloidů. Je tu také popsána příprava takových vakcín pro prevenci, možnou léčbu nebo zmírnění symptomů chorob spojených s ukládáním amyloidů.
V širším a obecnějším rozsahu se předkládaný vynález vztahuje k metodě in vivo regulace za účelem snížení amyloidů v živočiších, včetně lidí; metoda zahrnuje provedení zásahu do imunitního systému živočichů pomocí imunologicky efektivního množství přinejmenším jednoho amyloidogenního polypeptidu nebo subsekvence, které byly vytvořeny tak, aby imunizace živočicha amyloidogenním polypeptidem nebo subsekvencí vyvolala tvorbu protilátek proti amyloidogennímu polypeptidu a/nebo přinejmenším jednoho amyloidového analogu, který je zaveden jako modifikace v amyloidogenním polypeptidu, což má za následek, že imunizace živočicha analogem vyvolá tvorbu protilátek proti amyloidogennímu polypeptidu.
• · · ·
Předkládaný vynález proto zahrnuje použití 1) vyskytujících antigenů a fragmentů tvořených spouštěly imunitní reakci jakož i 2) analogů přirozeně se vyskytujících antigenů, analogů, schopny vyvolat křížovo-reaktivní imunitní reakce.
přirozeně se tak, aby takovýchto které jsou
Předkládaný vynález se také týká analogů amyloidogenních polypeptidů, jakož i fragmentů nukleových kyselin kódujících jejich podskupinu. Součástí vynálezu jsou také imunogenické kompozice, obsahující analogy fragmentů nukleových kyselin.
Předkládaný vynález se také týká metod identifikace imunogenicky efektivních analogů amyloidogenních polypeptidů jakož i metod přípravy kompozic obsahujících tyto analogy.
Vysvětlivky k obrázku
Obr. 1: Schematické znázornění variant autovakcíny pocházejících z amyloidového prekursorového proteinu, s účelem vyvolat tvorbu protilátek proti Αβ proteinu Αβ-43 (nebo C100). APP je ukázán schematicky v horní části obrázku a zbývající schematická vyobrazení ukazují, že modelové epitopy P2 a P30 jsou nahrazeny nebo inzertovány do různých zkrácení APP. Na obrázku černý vzor označuje APP signální sekvenci, obousměrné křížné šrafování je extracelulární část APP, tmavé vertikální šrafování je transmembránová doména APP, světlé vertikální šrafování je intracelulární doména APP, tučné křížné šrafování označuje P30 epitop a jemné křížné šrafování označuje P2 epitop. Obdélník nakreslený plnou čarou představuje Αβ-42/43 a obdélník nakreslený plnou čarou spolu ·· ···· ·· ·· ·· ···« ··· ♦ 9 9 ·· « • ··«· · · · · · ft 9 · · · ····· .....
χ υ ·· ········· ·· ··· ·· ·· ·· 99 s obdélníkem, nakresleným tečkovanou čarou, představuje C-100. „Abeta označuje Αβ.
Detailní popis vynálezu
Definice
V dalším textu budou detailně definovány a vysvětleny termíny, použité v popisu vynálezu a nárocích, aby se ujasnily cíle a hranice vynálezu.
Termíny „amyloidy a „amyloidový protein, které jsou použity zaměnitelně, označují třídu proteinových nerozvětvených vláken s kolísavou délkou. Amyloidová vlákna vykazují charakteristické barvení za použití Kongo červeně a vyznačují se křížovou-β strukturou, ve které je polypeptidový řetězec organizován v β-plátech. Amyloid je obecně tvořen amyliodogenními proteiny, které mají velmi rozdílnou prekursorovou strukturu, které však všechny mohou podstoupit strukturální konverzi na formu, která je stavebním prvkem β-plátových spirálovitých profilamentů. Průměr amyloidových vláken se běžně pohybuje mezi 70 a asi 120 Á.
Termín „amyloidogenní protein označuje polypeptid, který má vztah k formování amyloidových ložisek. Je buď přímou součástí ložisek samotných, nebo je součástí biosyntetické dráhy vedoucí k tvorbě ložisek. Příklady amyloidogenních proteinů je APP nebo Αβ, avšak také proteiny, podílející se na jejich metabolismu, mohou být amyloidogenní proteiny. Mnoho amyloidogenních polypeptidů je zde podrobně diskutováno.
·· ··· ·
Termín obsahuj ící „amyloidový sekvenci polypeptid označuje aminokyselin shora amyloidogenních proteinů pocházejících od lidí nebo jiných savců (nebo zkrácení tvořící podstatné množství B-buňkových epitopů s neporušeným amyloidogenním proteinem) amyliodogenní polypeptid může proto např. obsahovat podstatné části prekursoru pro amyloidogenní polypeptid (v případe Αβ může být odvozený od APP jeden možný amyloidový polypeptid). Takové neglykosylované formy amyloidogenních polypeptidů, které se připraví v prokaryotickém systému spadají do rozsahu tohoto termínu jako formy, které mají měnící se způsob glykosylace např. vlivem použití kvasinek nebo jiných eukaryotických expresních systémů, lišících se od savčích. Je polypeptidy popsaných se používá vzít když termín v úvahu, že je poskytován Jinými slovy, však třeba poznamenat, že když „amyloidogenní polypeptid je nutné polypeptid je běžně neimunogenní, živočichům, kteří mají být ošetření, amyloidogenní polypeptid je vlastní protein, nebo je to analog takového vlastního proteinu, který běžně neumožňuje vyvolání imunitní reakce proti amyloidogenicitě živočichů.
„Analog amyloidogenního polypeptidů je amyloidogenní polypeptid, u kterého byly vyvolané změny v jeho základní struktuře. Takové změny mohou být např. realizovány ve formě fúze amyloidového polypeptidů za účelem získání vhodného fúzního partneru (tzn., že změny v základní struktuře hlavně zahrnují C- a/nebo N-terminální přídavky aminokyselinových zbytků) a/nebo mohou být ve formě inzercí a/nebo delecí a/nebo substitucí aminokyselinových sekvencí amyloidogenních polypeptidů. Tento termín také zahrnuje odvozené amyloidogenní molekuly, které budou diskutovány v následujícím textu u modifikací amyloidogenních polypeptidů. V případe, že ····
0000 ·· 0 0 •00 · 0 0 0 0 0 • 0000 0 9 000 0 0 · • · 0000 0000 ·· ··· 00 ·0 00 00 amyloidogenní polypeptid je amyloid nebo prekursor, analog může být zkonstruován tak, aby byl méně schopen nebo dokonce neschopen vyvolat tvorbu protilátek proti normálnímu prekursorovému proteinu (proteinům) amyloidu, a tak se vyvarovat nežádoucí interferenci s (fyziologicky normální) neagregovanou formou polypeptidu, který je prekursorem amyloidového proteinu.
Je třeba poznamenat, že si je možno představit použití xeno-anologu (např. psího nebo porcine analogu) lidského amyloidogenního polypeptidu jako vakcíny pro lidi, za účelem vyvolání žádoucí imunity proti amyloidogennímu polypeptidu. Takovéto použití xeno-analogu za účelem imunizace tvoří též součást vynálezu.
Termín „polypeptid v tomto kontextu znamená jak krátké peptidy s 2 až 10 aminokyselinovými zbytky, tak oligopeptidy s 11 až 100 aminokyselinovými zbytky jakož i polypeptidy s více než 100 aminokyselinovými zbytky. Navíc termín také zahrnuje proteiny, tzn. funkční biomolekuly obsahující přinejmenším jeden polypeptid; když tyto molekuly obsahují přinejmenším dva polypeptidy, mohou být tyto ve formě komplexů a mohou být připojeny kovalentně nebo nekovalentně. Polypeptid(y) může být v proteinu glykosylovaný a/nebo lipidovaný nebo může obsahovat prostetické skupiny.
Termíny „T-lymfocyt a „T-buňka budou používány zaměnitelně pro lymfocyty brzlíkového původu, které jsou odpovědné za různé buňkou mediované imunitní reakce i za pomocnou aktivitu v humorální imunitní reakci. Termíny „Blymfocyt a „B-buňka budou používány též zaměnitelně pro lymfocyty produkující protilátky.
4444 • 4 4 • · 4 4 · • 4 4
4 4
444
44
4 4 • 4 4 44
4 4 4 4
4 4 4
4444
4 4
4 4
4 4 4
4 4 4
44
Termín „subsekvence znamená po sobě jdoucí úsek přinejmenším 3 aminokyselin nebo relevantně přinejmenším 3 nukleotidů, pocházejících přímo z přirozeně se vyskytujících amyloidových aminokyselinových sekvencí nebo sekvencí nukleových kyselin.
Termín „živočich v tomto kontextu obecně označuje živočišné druhy (přednostně savce) jako je Homo sapiens, Canis domesticus, apod. a nejenom jednoho živočicha. Termín také označuje populaci takových živočišných druhů, protože je důležité, že jednotlivci imunizovaní metodou podle vynálezu v sobě nesou podstatné množství stejného amyloidogenního polypeptidu, což umožňuje imunizaci živočichů stejným imunogenem (imunogeny). Když například existují v různých lidských populacích genetické varianty amyloidogenního polypeptidu, může být nezbytné použít odlišné imunogeny v těchto rozdílných populacích tak, aby bylo možno překonat autotoleranci vůči amyloidogennímu polypeptidu optimálním způsobem u každé populace. Odborníkům v oboru bude jasné, že živočichem se v této souvislosti rozumí žijící živočich s imunitním systémem. Preferuje se, když je živočich obratlovec, jako je savec.
Termínem „in vivo regulace amyloidu za účelem snížení jeho obsahu se v tomto textu rozumí redukce celkového množství uloženého amyloidu odpovídajícího typu v živém organismu. Regulace za účelem snížení obsahu může být získána prostřednictvím několika mechanismů: z nich je jednoduché zasažení do amyliodu vazbou na protilátku za účelem zabránění agregaci nejjednodušší. Avšak v rozsahu vynálezu je také to, že vazba protilátky má za následek odstranění amyloidů odstraňujícími (scavenger) buňkami (jako jsou makrofágy a jiné ·· ···· • «· • · · ·· ·· ···· fagocytické buňky) a že protilátky interferují s jinými amyloidogenními polypeptidy, které vedou k tvorbě amyloidu.
·· to·· ·· ·· • · • · ·· • · · • · · ·· ·· ·· · ··· ·· · • ·· · • to ··
Výraz „poskytnutí (zavedení) .... do imunitního systému znamená, že imunitní systém živočicha je vystavený imunogennímu povzbuzení kontrolovaným způsobem. Jak bude jasné z následujícího vysvětlení, takové povzbuzení imunitního způsoby, z kterých je systému je možno provézt nejdůležitější vakcinace mnoha polypeptidem „pharmaccines (tzn. vakcínu, která je vytvořena tak, aby léčila nebo zlepšovala stav trvajících chorob) nebo vakcinace nukleovými kyselinami „pharmaccines. Významným výsledkem, který má být dosažen je to, že buňky odpovídající za imunitu jsou v živočiších konfrontovány s antigenem imunologicky efektivním způsobem, zatímco přesný způsob dosažení tohoto výsledku má z hlediska vynálezecké myšlenky vynálezu menší význam.
obsahuj ícím
Termín „imunologicky efektivní množství se běžně používá v oboru a znamená množství imunogenu, které je schopno vyvolat imunitní reakci, která významně omezí patogennímu původci, aby se podílel na imunologických rysech s imunogenem.
Když se použije výraz, že amyloidogenní polypeptid byl „modifikován, tak se tím rozumí chemická modifikace polypeptidu, která tvoří základní strukturu amyloidogenního polypeptidu. Takovou modifikací může být např. derivatizace (např. alkylace) určitých aminokyselinových zbytků v sekvenci amyloidogenního polypeptidu, ale jak bude zřejmé z dále uvedeného popisu, preferované modifikace zahrnují změny primární struktury aminokyselinové sekvence.
• 9 9 « 9 9 9 9
9 9 ·· ·♦·· • · 9 • · · 9 ·
9
9
999
9 9 • 9 9
99
Když se diskutuje výraz „autotolerance proti amyloidogennímu polypeptidu rozumí se tím to, že protože je amyloidogenní polypeptid sobě vlastní protein, v populaci, která má být očkována, normální jednotlivci nevytvoří imunitní reakci proti amyloidogennímu polypeptidu; není možné však vyloučit, že náhodní jedinci v populaci živočichů mohou být schopní produkovat protilátky proti přirozeným amyloidogenním polypeptidům, např. jako součást poruch autoimunity. V každém případě budou živočiši normálně autotolerantní proti jejich vlastnímu amyloidogennímu polypeptidu, ale není vyloučeno, že analogy pocházející od jiných živočišných druhů nebo od populací, které mají odlišný fenotyp, budou též těmito živočichy tolerovány.
„Cizí T-buňkový epitop (nebo „cizí T-lymfocytový epitop) je peptid, který je schopen vázat MHC molekuly a který stimuluje T-buňky živočišných druhů. Preferovanými cizími Tbuňkovými epitopy podle předkládaného vynálezu jsou „promiskuitní epitopy, tzn. epitopy, které se váží k podstatným frakcím určité třídy MHC molekul živočišných druhů nebo populací. Je znám jen velmi omezený počet takových promiskuitních T-buňkových epitopů a tyto budou diskutovány detailněji dále. Promiskuitní T-buňkové epitopy jsou označovány také jako „universální T-buňkové epitopy. Je však nutno poznamenat, že aby imunogeny, které jsou použity podle vynálezu, byly efektivní ve velké části živočišné populace je nezbytné 1) vložit několik cizích T-buňkových epitopů do stejného analogu nebo 2) připravit několik analogů, ze kterých každý analog bude mít vložený odlišný promiskuitní epitop. Je třeba také poznamenat, že koncept cizích T-buňkových epitopů též zahrnuje použití kryptických T-buňkových epitopů, tj. epitopů, které jsou odvozeny od vlastního proteinu a které,
9 4« 9
44
4 4
4 4 44
4 4 •9 9999 « 9
999
• 44
9
4 4
9
9 4
44 když existují v izolovány formě, aniž by byly součástí vlastního proteinu, projevují imunogenní funkci.
„Cizí T pomocný lymfocytový epitop (cizí TH epitop) je cizí T-buňkový epitop, který váže MHC třídu II molekul a může být přítomen na povrchu antigen poskytujících buněk (APC) vázaných k MHC třídě II molekul.
„Funkční část (bio)molekuly znamená v předkládaném vynálezu část molekuly, která je odpovědná za přinejmenším jeden biochemický nebo fyziologický efekt projevující se v molekule. V oboru je dobře známo, že mnoho enzymů a jiných efektorových molekul má aktivní místa, které jsou odpovědná za účinky projevující se v takových molekulách. Jiné části molekuly mohou sloužit pro účely zvýšení stabilizace nebo rozpustnosti a mohou proto být vynechány, když tyto účely nemají v kontextu určitých aspektů vynálezu důležitost. Například je možné použití určitých cytokinů jako modifikující, části v amyloidogenním polypeptidů (viz detailnější diskuse uvedená dále) a v takovém případe, může být stupeň stability irevelantní, protože vazba na amyloidogenní polypeptid může nezbytnou stabilitu zajistit.
Termín „adjuvant je běžný termín v oboru technologií očkování a znamená látku nebo kompozici látek, které 1) nejsou samotné schopny vyvolat specifickou reakci proti imunogenu vakcíny, ale které jsou však 2) schopné zvýšit imunitní reakci vůči imunogenu. Jinými slovy, očkování samotným adjuvantem nezajistí imunitní reakci vůči imunogenu, očkování imunogenem může nebo nemusí vyvolat imunitní reakci vůči imunogenu, ale kombinované očkování imunogenem a adjuvantem vyvolá imunitní to* toto·· *ι« ·« • •to ··« • « · · ♦» « ···· · 9 « • > *·· ·· ··· · · • · · ···· ···· ·· ··· ·· ·· >· ·· • to to·· · reakci vůči imunogenu, která je silnější než reakce vyvolaná samotným imunugenem.
„Zacílení molekuly v tomto kontextu znamená situaci, kdy se zaváděná molekula v živočichu objeví přednostně v určitém pletivu(ech) nebo se přednostně spojí s jistými buňkami nebo druhy buněk. Účinek může být dosažen mnoha způsoby zahrnujícími formulaci molekuly v kompozici usnadňující zacílení nebo zavedení ve skupině molekul, které usnadňují zacílení. Tyto aspekty budou dále detailněji diskutovány.
„Stimulace imunitního systému znamená, že látka nebo kompozice látek vykazuje celkový, nespecifický imunostimulační efekt. Mnoho adjuvantů a domnělých adjuvantů (jako jsou určité cytokiny) se účastní schopnosti stimulovat imunitní systém. Výsledkem použití takových imunostimulačních činidel je zvýšení „ostražitosti imunitního systému, čímž se rozumí, že současná nebo následná imunizace imunogeny vyvolává významně efektivnější imunitní reakci ve srovnání se samotným použitím imunogenu.
Preferovaná realizace regulace amyloidu za účelem jeho omezení
Amyloidogenní polypeptid použitý jako imunogen podle metody podle vynálezu je přednostně modifikovaná molekula, kde je přítomna přinejmenším jedna změna v aminokyselinové sekvenci amyloidogenního polypeptidu, protože příležitost získat obecně důležité rozrušení autotolerance vůči amyloidogennimu polypeptidu je tímto způsobem velmi podpořena - to je například evidentní z výsledků uvedených v příkladu 2, kde imunizace divokým typem Αβ je porovnávána s imunizací Αβ variantní molekulou. Je nutné poznamenat, že použití • 9 0004 40 Μ 00 0440 • · ♦ ·»4 ·· 0 • ·00· 0 400« 0 0 0 • » 444 »00000 * <0 · »4 0 0 0000
0*0** 40 »0 00 00 modifikované molekuly nevylučuje možnost použití takového modifikovaného amyloidogenního polypeptidu ve formulacích, napomáhají rozrušit autotoleranci vůči např. formulacích obsahujících které déle amyloidogennímu adjuvanty.
polypeptidu,
Bylo ukázáno (Dalum I. et al. , 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804), že potenciálně samo-reaktivní B-lymfocyty rozpoznávající vlastní proteiny jsou fyziologicky přítomny v normálních jedincích, povzbuzeny ke skutečné buňkami (APC) proteinu (tj .
Avšak aby tyto B-lymfocyty byly tvorbě protilátek reagujících s odpovídajícími vlastními proteiny, je zapotřebí podpora od cytokiny produkujících T-pomocných lymfocytů (TH-buňky nebo THlymfocyty). Normálně není tato podpora zajišťována, protože Tlymfocyty obecně nerozpoznávají T-buňkové epitopy pocházející od vlastních proteinů prezentovaných antigen poskytujícími Avšak zajištěním prvku „cizosti ve vlastním zavedením imunologicky významné modifikace), se
T-buňky rozpoznávací cizí prvok aktivují tak, že rozpoznají cizí epitop na APC (nejprve jako mononukleární buňku). Polyklonální B-lymfocyty (které jsou také APC) schopné rozpoznat vlastní epitopy na modifikovaných vlastních proteinech také internalizují antigen a následně poskytují cizí T-buňkový epitop(y) a aktivované T-lymfocyty následně zajistí pomoc cytokinů těchto samo-reagujících polyklonálních B-lymfocytů. Protože protilátky produkované těmito
B-lymfocyty reagují s různými epitopy polypeptidů, zahrnujících ty, které jsou přítomny v přirozených polypeptidech, indukuje se protilátková křížová reakce s nemodifikovanými lymfocyty mohou působit tak, polyklonálních lymfocytů byla polyklonálními modifikovaných polypeptidy. Souhrnně, jako kdyby populace rozpoznána úplně cizím ·· ···>
• · · • > ··· • · «4
4 0
0 0 0«
00 • 0 4* • 0 4 • 0 ···
4 4 4
0 0 0
00 • 0 0·· * 0
0·· 0 0 0
4 0
00 antigenem, zatímco ve skutečnosti jen vložený epitop(y) je/jsou cizí ve vztahu k hostiteli. Tímto způsobem se vytvoří protilátky schopné křížové reakce s nemodifikovanými vlastními antigeny.
V oboru je známo několik metod modifikujících peptidový vlastní protein za účelem rozrušení autotolerance. Podle vynálezu, modifikace mohou zahrnovat skutečnost, že:
je zaveden přinejmenším jeden cizí T-buňkový epitop a/nebo je zavedena přinejmenším jedna první část (moiety), která ovlivňuje zacílení modifikované molekuly do antigen poskytující buňky (APC), a/nebo je zavedena přinejmenším jedna druhá část, která stimuluje imunitní systém, a/nebo je zavedena přinejmenším jedna třetí část, která optimalizuje poskytnutí modifikovaného amyloidogenního polypeptidu do imunitního systému.
Nicméně všechny tyto modifikace by měli být realizovány při zachování podstatné frakce původních B-lymfocytových epitopů v amyloidogenním polypeptidu, protože B-lymfocytové rozpoznávání přirozené molekuly se tak zvýší.
V jednom přednostním provedení, jsou postranní skupiny (ve formě cizích t-buňkových epitopů nebo shora uvedených prvních, druhých nebo třetích částí) kovalentně nebo nekovalentně zaváděny. To znamená, že úseky amino• · · · • · · · kyselinových zbytků, pocházejících z amyloidogenního polypeptidů jsou derivatizovány beze změny primární aminokyselinové sekvence, nebo přinejmenším bez zavedení změn v peptidových vazbách mezi jednotlivými aminokyselinami v řetězci.
Při alternativním přednostním provedení je využita substituce a/nebo dalece a/nebo vložení a/nebo přidání aminokyselin (což může být provedeno rekombinaci nebo prostřednictvím peptidové syntézy; modifikací, které zahrnují delší úseky aminokyselin a mohou vyvolat fúzi polypeptidů). Jednou zvláště preferovanou verzí tohoto provedení je způsob popsaný ve WO 95/05849, který zahrnuje metodu snižování obsahu vlastních proteinů imunizací analogy vlastních proteinů, kde určité množství aminokyselin bylo substituováno odpovídajícím počtem aminokyselinových sekvencí, jež každá obsahuje cizí imunodominantní T-buňkový epitop, zatímco současně zůstává zachovaná celková terciární struktura vlastního proteinu v analogu. Pro účely vynálezu je však dostačující, když modifikace (vložení, adice, delece nebo substituce) umožňuje růst cizího T-buňkového epitopu a současně zachovává podstatný počet B-buňkových epitopů v amyloidogenním polypeptidů. Nicméně za účelem získání maximální účinnosti vyvolané imunitní reakce se přednost dává tomu, když je zachována celková terciární struktura amyloidogenního polypeptidů v modifikované molekule.
Následující vzorec popisuje molekulární konstrukty obecně zahrnuté vynálezem:
(MODi) sl (amyloidei) ni (MOD2) s2 (amyloide2) n2 · · · (MODX) sx (amyloidex) nx (I) ·· ···· • · • · · ·
kde amyloidei-amyloidex jsou x B-buňkové epitopy obsahující subsekvence amyloidogenního polypeptidu, které jsou nezávisle identické nebo neidentické a které mohou obsahovat nebo neobsahovat cizí postranní skupiny, x je celé číslo > 3, nl-nx jsou celá čísla > 0 (přinejmenším jedno je > 1), MODi~MODx jsou x modifikace vložené mezi zachované B-buňkové epitopy, a sx -sx jsou x celá čísla > 0 (přinejmenším jedno je > 1, když nejsou vloženy žádné postranní skupiny do amyloidex sekvencí). Tak, vzhledem k obecné funkční kontrole imunogenicity konstruktů, vynález poskytuje všechny druhy permutací původní sekvence amyloidogenního polypeptidu a všechny druhy jejich modifikací. Vynález zahrnuje modifikované amyloidogenní polypeptidy získané vynecháním části sekvence amyloidogenního polypeptidu, které např. vykazují silné účinky in vivo nebo vynecháním částí, které jsou normálně intracelulární, a tak zvyšují nežádoucí imunologické reakce.
umístěn pochází.
intracelulárně něhož amyloid
Jednou přednostní použitelnou verzí konstruktů, jsou takové konstrukty, kde B-buňkový epitop obsahující sekvence amyloidového proteinu, není v prekursorovém polypeptidu, z
Provedením takového výběru amyloidových epitopů se zajistí, že se nevytvoří protilátky, které by reagovaly s buňkami produkujícími amyloidový prekursor a tak je imunitní reakce, která je vyvolána, omezena na imunitní reakci vůči nežádoucím amyloidovým ložiskům. Podobný výběr může, když je použitelný, být proveden pro jiné amyloidogenní polypeptidy jako je amyloid. V těchto případech bude například přiměřené vyvolat imunitu vůči epitopům amyloidogenního polypeptidu, které jsou jen nekrytě umístěny do extracelulární fáze, která je bez jakýchkoliv vazeb k buňkám, z kterých jsou vytvořeny.
• ··· • · · ·
Udržování podstatné frakce B-buňkových epitopů nebo dokonce celkové terciární struktury proteinu, který podstupuje modifikaci a je tu popsaný, může být dosaženo různými způsoby. Jedním jednoduchým způsobem je příprava polyklonálního antiséra přímo vůči amyloidogennímu polypeptidu (např. antiserum připravené v králících) a pak použití tohoto antiséra jako testačního činidla (např. kompetitivní ELISA) vůči modifikovaným proteinům, které jsou produkovány. Modifikované verze (analogy), které reagují ve stejném rozsahu s antiserem jako amyloidogenní polypeptid, mají stejnou terciární strukturu jako amyloidogenní polypeptid, zatímco analogy vykazující omezenou (ale stále významnou a specifickou) reaktivitu s takovým antiserem, mají zachovanou podstatnou frakci původních B-buňkových epitopů.
Alternativně může být připraven výběr monoklonálních protilátek reagujících s odlišnými epitopy na amyloidogenním polypeptidu a použit jako testovací panel. Tento přístup má následující výhody umožňující 1) mapování epitopů amyloidogenního polypeptidu a 2) mapování epitopů, které jsou zachovány v připravených analozích.
Třetím přístupem by bylo rozlišení 3-dimenziální struktury amyloidogenního polypeptidu nebo jeho biologicky aktivního zkrácení (viz shora) a porovnání s rozlišenou 3-dimenziální strukturou připraveného analogu. Troj-dimineziální struktura může být rozlišena prostřednictvím rentgenových difrakčních studií a NMR-spektroskopií. Další informace vztahující se k terciární struktuře mohou být, za účelem zajištění užitečnosti informace o terciární struktuře molekuly v určitém rozsahu, získány ze studií kruhového dichroismu, které mají výhodu v tom, že požadují polypeptid jen v čisté formě (zatímco • · · · · · • ·
rentgenová difrakce vyžaduje zajištění krystalizovaného polypeptidů a NMR vyžaduje izotopové varianty polypeptidů). Nicméně nakonec jsou přece jenom nezbytné rentgenová difrakce a/nebo NMR pro získání přesvědčivých dat, protože kruhový dichroismus může zajistit pouze nepřímé údaje o správnosti 3dimenziální struktury prostřednictvím, informací o elementech sekundární struktury.
Jeden preferovaný aspekt vynálezu využívá několikanásobné poskytnutí B-lymfocytových epitopů amyloidogenního polypeptidů (vzorec I, kde přinejmenším jeden B-buňkový epitop je přítomen ve dvou pozicích). Tento efekt může být dosažen různým způsobem, např. jednoduchou přípravou fúzních polypeptidů majících strukturu (amyloidogenní polypeptid)m, kde m je celé číslo > 2 a potom vložením zde diskutovaných modifikací do přinejmenším jedné amyloidové sekvence. Přednost se dává tomu, když vložené modifikace zahrnují přinejmenším jednu duplikaci B-lymfocytového epitopu a/nebo vložení haptenu. Tyto aspekty, které zahrnují násobné poskytnutí vybraných epitopů, jsou zvláště preferovány v situacích, kde je jen malá část amyloidogenního polypeptidů užitečná jako stavební prvek vakcínového činidla.
Jak bylo uvedeno shora, zavedení cizího T-buňkového epitopu může být doprovázeno zavedením přinejmenším jedné aminokyselinové inzerce, adice, delece nebo substituce. Samozřejmě, že normální situací bude zavedení více než jedné změny v aminokyselinové sekvenci (např. inzerce nebo substituce úplného T-buňkového epitopu) ale důležitý cil, který má být dosažen, je to, že analog, když je zpracován antigen poskytující buňkou (APC), zvýší přítomnost cizího imunodominantního T-buňkového epitopu, který je přítomen • · · · · · • · • · · · · ·
v souvislosti s MCH třída II molekulou na povrchu APC. Když aminokyselinová sekvence amyloidogenního polypeptidu ve vhodné pozici obsahuje množství aminokyselinových zbytků, které je možno také najít v cizím TH epitopu, potom může být zavedení cizího TH epitopu doprovázené zajištěním zbývajících aminokyselin cizího epitopu prostřednictvím aminokyselinové inzerce, adice, delece nebo substituce. Jinými slovy, pro dosažení cíle předkládaného vynálezu je nezbytné zavést kompletní TH epitop pomocí inzerce nebo substituce.
Přednost má to, když počet aminokyselinových inzercí, delecí, substitucí a adicí je přinejmenším 2, jako je 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 a 25 inzerci, substitucí, adicí a delecí. Dále se preferuje to, když počet aminokyselinových inzercí, substitucí, adicí a delecí nepřevýší 150 jako je nejvíce 100, nejvíce 90, nejvíce 80 a nejvíce 70. Speciální přednost má to, když počet aminokyselinových substitucí, inzercí, delecí a adicí nepřesáhne 60 a zvláště 50 nebo dokonce 40. Nejpřednostnějším počtem je ne víc než 30. S ohledem na aminokyselinové adice, je třeba poznamenat, že ty, kde výsledný konstrukt je ve formě fúzního polypeptidu, mají počet často značně vyšší než 150.
Přednostní aspekt vynálezu zahrnuje modifikaci zavedením přinejmenším jednoho cizího imunodominantního T-buňkového epitopu. Rozumí se, že otázka imunitní dominance T-buňkového epitopu závisí na živočišném druhu. Zde použitý termín „imunodominance se jednoduše vztahuje k epitopům, které u očkovaného jednotlivce/populaci vyvolají signifikantní imunitní reakci, ale je dobře známa skutečnost, že T-buňkový epitop, který je imunodominantní v jednotlivci/populaci nemusí být nezbytně imunodominantní v jiném jednotlivci stejného • ·
··· ·· · druhu, i když může u tohoto jednotlivce být schopen vázat MHCII molekuly. Nicméně pro účely předkládaného vynálezu je imunodominantní T-buňkový epitop takový epitop, který bude efektivní při zajištění pomoci T-buňkám, když je přítomen v antigenů. Typicky mají imunodominantní T-buňkové epitopy vrozené charakteristické rysy, které budou vždy v podstatě přítomné jako vázané k MHC třída II molekule, bez ohledu na polypeptid, kde se objeví.
Dalším důležitým bodem je problém MHC restrikce Tbuňkových epitopů. Přirozeně se vyskytující T-buňkové epitopy jsou obecně restrikovány MHC, tzn. že určité peptidy tvořící T-buňkový epitop se efektivně váží pouze na subjednotku MHC třída II molekul. To má naopak ten efekt, že ve většině případů využití jednoho specifického T-buňkového epitopu má za následek získání složky vakcíny, která je efektivní jen v části populace a v závislosti na velikosti této části, může být nezbytné vložit víc T-buňkových epitopů do stejné molekuly, nebo alternativně připravit multi-složkovou vakcinu, kde složkami jsou varianty amyloidogenního polypeptidu, které
se jeden epitopu. od druhého liší původem zavedeného T-buňkového
Když je MHC restrikce použitých T-buněk zcela neznámá
(například v situaci, kdy očkovaný živočich má špatně
definována MHC složení), může být část populace pokryta
vakcínou se specifickou složkou, určenou prostřednictvím následujícího vzorce n
/populace = 1 ~ Π (l~Pi) (II) • 0 0 0 0 0 ••0 ·
0 0 0 0 0 • · 0 0 0 0 • · 0 0 ·· ·0 0 « 0 kde pi je frekvence jednotlivců v populaci, kteří odpovídají na i cizí T-buňkový epitop přítomný v složce vakcíny a n je celkový počet cizích T-buňkových epitopů v složce vakcíny. Složka vakcíny obsahující tři cizí T-buňkové epitopy mající frekvence reakce v populaci 0,8, 0,7 a 0,6 dá
- 0,2 x 0,3 x 0,4 = 0,976 tzn., že 97,6 procent populace bude statisticky vykazovat MHCII mediovanou reakci na vakcínu.
Shora uvedený vzorec není použitelný v situaci, kdy je znám více nebo méně přesný MHC restrikční vzor peptidů. Když se například určitý peptid váže pouze na lidské MHC-II molekuly kódované HLA-DR alelami DR1, DR3, DR5 a DR7, potom použitím tohoto peptidu dohromady s jiným peptidem, který se váže na zbývající MHC-II molekuly kódované HLA-DR alelami bude dosaženo 100% pokrytí populace. Podobně, když se druhý peptid váže jen na DR3 a DR5, přidání tohoto peptidu nezvýší vůbec pokrytí. Když je základem kalkulace populace reagující čistě na MHC restrikci T-buňkových epitopů ve vakcínš, část populace pokryté speciální složkou vakcíny může být určena prostřednictvím následujícího vzorce:
./populace ~ 1 - Π (IU) kde φ-j je suma frekvencí v populaci alelických haplotypů kódujících MHC molekuly, které váží jakékoliv T-buňkové epitopy ve vakcíně a které patří k j třech známých HLA loci (DP, DR, DQ) ; prakticky je to první doklad, že MHC molekuly rozpoznávají každý T-buňkový epitop ve vakcíně a potom jsou • · · · • · · · · · · • ···· · ···· 9 ·· ····*· ·· ··· ·· ·· podle toho typově označené (DP, DR nebo DQ) - jednotlivé frekvence rozdílných uvedených alelických halotypů jsou sumarizovány pro každý typ, za zisku φΐ7 φ2 a <p3.
Může se stát, že hodnota p3 ve vzorci II přesáhne odpovídající teoretickou hodnotu pí;
= 1 ~ Π (1-Vj)2 (IV) kde Vj je suma frekvencí v populaci alelických haplotypů kódujících MHC molekuly, které váží i T-buňkové epitopy ve vakcíně a které patří k j třech známých HLA loci (DP, DR, DQ) . To znamená, že 1-pi populace je frekvence reagujících jednotlivců íZbývajíci_i = (Pi-Pi) / (l~Pi) · Potom může být vzorec III upravený tak, že vznikne vzorec V:
n ./populace ~ “ ΓΙ ~ ΓΊ (1 —./zbývá jící_i) ) (V) kde termín 1-p zbývající_í je určen jako 0, když je negativní. Je třeba poznamenat, že vzorec V vyžaduje aby všechny epitopy byly haplotypy mapované proti identické sadě haplotypů.
Proto, když se mají selektující T-buňkové epitopy vložit do analogu, je důležité vzít v úvahu všechny vědomosti o epitopech, které jsou dostupné: 1) frekvenci reagujících jednotlivců v populaci na každý epitop, 2) MHC restrikční data a 3) frekvenci relevantních haplotypů v populaci.
· · ·«······· ·· ··· ·· ·· *· *·
Existuje množství přirozeně se vyskytujících „promiskuitních T-buňkových epitopů, které jsou aktivní ve velké části jednotlivců živočišných druhů nebo živočišných populací a tyto jsou přednostně vkládány do vakcíny, čímž se redukuje potřeba velkého počtu rozdílných analogů ve stejné vakcíně.
Promiskuitní epitop může být, v soulade s vynálezem, přirozeně se vyskytující lidský T-buňkový epitop jako jsou epitopy z tetanus toxoid (např. P2 a P30 epitopy), diptheria toxoid, Influenza virus hemagluttinin (HA) a P. falciparum CS antigen.
Během let bylo identifikováno mnoho jiných promiskuitních T-buňkových epitopů. Především byly identifikovány peptidy schopné vázat velké části HLA-DR molekul kódovaných rozdílnými HLA-DR alelami a tyto jsou všechny T-buňkové epitopy schopné vložení do analogů použitelných podle vynálezu. Viz také epitopy diskutované v následujících odkazech, které jsou takto vložené do textu ve formě referencí: WO 98/23635 (Frazer I.H. et al., zastupující Universitu z Queenslandu); Southwood S. et al. , 1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F. et al., 1988, Nátuře 336: 778-780; Chicz R.M. et al., 1993, J. Exp. Med 178: 27-48; Hammer J. et al., 1993, Cell 74: 197-203; a Falk K. et al, 1984, Immunogenetics 39: 230-242. Později uvedené reference se zabývají také HLA-DQ a -DP ligandami. Všechny epitopy uvedené v pěti referencích jsou relevantní jako kandidáti přirozených epitopů použitelných podle předkládaného vynálezu, jako jsou epitopy, které s nimi mají společný obecný motiv.
·· ···· to toto· ··· toto · to ···· · · >
·· · ·*’ í( * ·· toto· ·4 ·« ·· ·φ
Epitop může být alternativně umělý T-buňkový epitop, který je schopen vázat velkou část MHC třída II molekul. V tomto kontextu pan DR epitopové peptidy („PADRE) popsané ve WO 95/07707 a v související práci Alexandra J. et al., 1994, Immunity 1: 751-761 (obě citace jsou začleněny do textu formou odkazu) jsou zajímaví kandidáti na epitopy použitelné podle předkládaného vynálezu. Je třeba poznamenat, že nejefektivnější PADRE peptidy objevené v těchto publikacích nejsou aminokyseliny na C- a A-konci za účelem vylepšení stability, když se s nimi pracuje. Avšak primárním cílem předkládaného vynálezu je inkorporace relevantních epitopů jako součást modifikovaných amyloidogenních polypeptidů, které by měli být potom následně enzymaticky rozrušené uvnitř lysozymálních kompartmentů APC, za účelem následného poskytnutí v souvislosti s MHC-II molekulou a proto není účelné inkorporovat D-aminokyseliny do epitopů použitých podle vynálezu.
Jedním přednostním PADRE peptidem je peptid mající aminokyselinovou sekvenci AKFVAAWTLKAAA nebo imunologicky efektivní subsekvenci. Tento a jiné epitopy postrádající stejnou MHC restrikci jsou preferované T-buňkové epitopy, které by měli být přítomny v analozích, použitých v metodě podle vynálezu. Takové super-promiskuitní epitopy by měly být brány v úvahu při nej jednodušším aspektu vynálezu, kde je živočišnému imunitnému systému poskytnut pouze jeden samotný modifikovaný amyloidogenní polypeptid.
Jak je uvedeno shora, modifikace amyloidogenního polypeptidu může také zahrnovat zavedení první části, která směruje modifikovaný amyloidogenní polypeptid do APC nebo Blymfocytu. Například první část může být specificky vázající ·· * 444
4 4 4 44 4 « ·« 4 4 • 4 4 » 4 4 4 4 • 4 4 « > · · 4 • 4 44 •4 4444
I 4 4 1
44 partner pro B-lymfocytový specifický povrchový antigen nebo pro APC specifický povrchový antigen. Mnoho takových specifických povrchových antigenů je známo v oboru. Například částí může být uhlohydrát, pro který existuje receptor na Blymfocytu nebo APC (např. mannan nebo manosa). Alternativně může být druhou částí hapten. Také fragment protilátky, který specificky rozpoznává povrch molekuly na APC nebo lymfocytech, může být použit jako první část (povrch molekuly může například být FCy receptor makrofágů a monocytů, jako je FCyRI nebo alternativně jakýkoliv specifický povrchový markér jako je CD40 nebo CTLA-4). Je třeba poznamenat, že všechny tyto příkladné cílené molekuly mohou být také použity jako součást adjuvantů, viz další text.
Jako alternativa nebo dodatek k zacílení modifikovaného amyloidogenního polypeptidu do určitých typů buněk za účelem dosažení zvýšené imunitní reakce, je možno zvýšit hladinu citlivosti imunitního systému vložením shora uvedených druhých částí, které stimulují imunitní systém. Typickým příkladem takových druhých částí jsou cytokiny a tepelně zpracované (heat-shock) proteiny nebo molekulární chaperony, jakož i jejich efektivní části.
Vhodné cytokiny, které je možné použit podle vynálezu, jsou ty cytokiny, které též ve vakcíně normálně fungují jako adjuvanty, jako je např. interferon γ (IFN-γ) , interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-β), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 15 (IL-15) a granulocytový-makrofágový kolonie stimulující faktor (GM-CSF); alternativně může funkční část cytokinové molekuly postačovat jako druhá část. Vzhledem ·· ·9 4 4 k použití takových cytokinů jako adjuvantní složky se odkazuje na diskusi uvedenou níže.
4 4444 * 4 4 • 9 999
9 9
9 4 ·44 • 4 *
9 9 99
9 4 • 4 4
4* 49
4 4 • 44 • 4 4 4
44
Podle vynálezu mohou být jako druhé části použity vhodné tepelně zpracované proteiny nebo molekulární chaperony, jako je HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 (také známy jako gp96, viz Wearsch P.A et al., 1998, Biochemistry 37: 5709-19) a CRT (calreticulin) .
Alternativně může být druhou částí toxin, jako je listeriolycin (LLO), lipid A a teplotně labilní enterotoxin. Zajímavými možnostmi je také mnoho mykobakteriálních derivátů jako je MDP (muramyl dipeptid), CFA (kompletní Freundův adjuvant) a diestery trehalosy TDM a TDE.
Také poskytnutí možnost zavedení třetí části, která zvyšuje modifikovaného amyloidogenního polypeptidů imunitnímu systému, je důležitou součástí vynálezu. V oboru je známo několik příkladů tohoto principu. Například je známo, že palmitoylová lipidační kotva v proteinu OspA Borrelia burgdorferi může být použita za účelem zajištění samo-adjuvace polypeptidů (viz např. WO 96/40718) - zdá se, že lipidované proteiny tvořené strukturami podobnými micelám s vrstvou skládající se z částí lipidačních kotev polypeptidů a zbývajících částí molekuly z toho vyčnívajících mají za následek násobná poskytnutí antigenních determinantů. Proto použití takovéhoto způsobu a jemu využívajících různé lipidační kotvy skupiny, farnesylové skupiny, geranyl-geranyl skupiny, GPIkotva a N-acyl diglyceridové skupiny) tvoří přednostní aspekt vynálezu, především protože zajištění takové lipidační kotvy v rekombinantně vytvořeném proteinu je dosti přímočaré podobných přístupů (např. myristylové • 9 ····
99 9 9 999# 9 · * 9 9 9 9 9 9« 9 9
40 9 9 9 9 9 9 9 99 9 ♦ 9 9 9·· · · • 9 99 999 9 • · 9 9 9 9 9
99 99« ♦9 99 99 «<
a vyžaduje pouze použití např. přirozeně se vyskytuj ících
signálních sekvencí jako fúzních partnerů pro modifikovaný
amyloidogenní polypeptid. Další možností je použití C3d
fragmentu doplňkového faktoru C3 nebo C3 samotného (viz Dempsey et al., 1996, Science 271, 348-350 a Lou & Kohler, 1998, Nátuře Biotechnology 16, 458-462).
Alternativním znakem vynálezu, který má také podstatu v preferovaném poskytnutí násobných (např. přinejmenším dvou) kopií důležitých epitopových regionů amyloidogenního polypeptidů imunitnímu systému, je kovalentní párování amyloidogenního polypeptidů, subsekvencí variant do určitých molekul. Například mohou být použity polymery, např. uhlohydráty jako je dextran, viz např. Lees A. et al., 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A. et al., 1990, J. Immunol. 145: 3594-3600, ale jako alternativa jsou užitečné také manosa a mannan. Integrální membránové proteiny z např. E. coli a jiných bakterií jsou také užiteční partneři konjugace. Tradiční nosičové molekuly jako je přílipkový hemocyanin (KLH), tetanus toxoid, diptheria albumin (BSA) mají také přednost konjugace.
toxoid a hovězí sérový jako užiteční partneři
Přednostní znaky kovalentního párování amyloidogenního polypeptidů do polyhydroxypolymerů, jako jsou uhlohydráty, zahrnují použití přinejmenším jednoho amyloidogenního polypeptidů a přinejmenším jednoho cizího T-pomocného epitopu, které se párují odděleně do polyhydroxypolymerů (tzn. cizí Tpomocný epitop a amyloidogenní polypeptid nejsou fúzovány jeden na druhý ale spíš vázány do polyhydroxypolymerů, který potom slouží jako nosičové kostra). Přednost má takový znak, kde jsou vhodné B-buňkové epitopy nesoucí regiony *« 0 4 * 0 *
4 0·· • ·0 <
• 0 4 I ·· » 0000
0 • 044 0 0
0 > 004
0000 · Φ • · 0 ♦ 0 0 0
0 0 0
00 amyloidogenního polypeptidu tvořeny krátkými peptidovými úseky - tento přístup je jedním velmi vhodným způsobem pro dosažení násobného poskytnutí vybraných epitopů vzniklého imunogenního činidla.
Zvláštní přednost má párování cizího T-pomocného epitopů a amyloidogenního (póly)peptidu prostřednictvím amidové vazby, která může být rozštěpena peptidázou. Tato strategie má ten účinek, že APC budou schopny konjugace a současně budou schopny procesu konjugace a následně poskytnou cizí T-buňkový epitop v souvislosti s MHC třída II.
Jedním způsobem dosažení párování peptidů (amyloidogenního polypeptidu a cizího epitopů) je aktivovat vhodný polyhydroxypolymer tresyl skupinami; tak je například možno připravit tresylované polysacharidy jako je popsáno ve WO 00/05316 a US 5 874 469 (obě citace jsou vloženy do textu formou odkazu) a párovat je do amyloidogenních peptidů a Tbuňkových epitopů připravených prostřednictvím obvyklých pevných nebo tekutých fází podle metod syntézy peptidů. Výsledný produkt se skládá z polyhydroxypolymerové kostry (např. dextranové kostry) která má, připojeny jejich N-konci nebo jinou dostupnou dusíkovou částí, amyloidogenní polypeptidy a cizí T-buňkové epitopy. Když je to požadováno, je možno syntetizovat amyloidogenní polypeptidy stejně jako chránit všechny dostupné aminoskupiny ale jen jednu v N-konci, následně párovat získané chráněné peptidy do tresylované dextranové části a konečně odstranit chránění výsledného konjugátu. Specifický příklad tohoto způsobu je popsán v níže uvedených příkladech.
to· • to toto·· • to tototo· • · · • to ··· • · to • to · • to ·«· ♦ ♦· • to··· ·· «· · • ♦· · to· ·« • · ♦ ··· ··· · • ·· · ·· to·
Namísto použití ve vodě rozpustných polysacharidových molekul jak se uvádí ve WO 00/05316 a US 5 874 469, je také možno využít zesítěné polysacharidové molekuly, čímž se získá partikulární konjugát mezi polypeptidy a polysacharidem předpokládá se, že to vede k vylepšení poskytnutí polypeptidu imunitnímu systému, protože se dosáhnou dva cíle, především získání efektu místního uložení, když se konjugát injektuje, a získání částic, které jsou přitažlivé cíle pro APC. Způsob využití takových partikulárních systémů je také podrobně popsán v příkladech.
Podklady tvořící základ vybraných oblastí zavedení modifikací do amyloidogenních polypeptidů jsou a) zachování známých a předpokládaných B-buňkových epitopů, b) zachování terciární struktury, c) vyvarování se B-buňkových epitopů přítomných na „produkční buňce apod. V jakémkoliv rozsahu, jak je diskutováno shora, je celkem snadné testovat sadu modifikovaných amyloidogenních molekul, které všechny byly podrobeny vložení T-buňkového epitopů v různých místech.
Protože nejvíce preferovaný znak předkládaného vynálezu zahrnuje regulaci s cílem omezení lidského Αβ, má následně přednost to, že shora diskutovaný amyloidový polypeptid je lidský Αβ polypeptid. V tomto aspektu se zvláště preferuje fakt, že lidský amyloidogenní polypeptid byl modifikován substitucí přinejmenším jedné aminokyselinové sekvence v SEQ ID NO: 2 spolu s přinejmenším jednou aminokyselinovou sekvencí se stejnou nebo rozdílnou délkou a obsahující cizí TH epitop. Preferované příklady modifikovaných amyloidogenních APP a Αβ jsou zobrazeny schematicky na obr. 1, kde jsou P2 a P30 epitopy použity jako příklady. Důvody použití takových konstruktů jsou diskutovány podrobně v příkladech.
«« ···+ • · • ··♦ • 0 ·· «««0 • · · ·
9 9
0« «0«
0 0 « ·00« • 0 0 0
0 0 ·
00
0 0
0 0 • 0 « 0
0 0 « «0
Specifičtěji TH obsahující (nebo dokončující) aminokyselinová sekvence, která je vložená do SEQ ID NO: 2 může být vložena do jakékoliv aminokyseliny v SEQ ID NO:2. To znamená, že vložení je možné za jakoukoliv aminokyselinou 1-
770, ale nej lép' e za jakoukoliv aminokyselinou 671, 672, 673
674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685
686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697
698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709
710, 711 , 712, 713 a 714 v SEQ ID NO:2. To ' může bý
kombinováno s odstraněním jakékoliv nebo všech aminokyselin 1
aminokyselin 715-770
Navíc,
671, nebo jakékoliv ze všech se použije metoda substituce,
672, 673, 674, 675, 676, 677,
684, 685, 686, 687, 688, 689,
696, 697, 698, 699, 700, 701,
708, 709, 710, 711, 712, 713
jakákoliv z aminokyselin
678, 679, 680, 681, 682
690, 691, 692, 693, 694
702, 703, 704, 705, 706
odstraněna v kombinaci s vložením.
když 671, 683, 695, 707, a 714 v SEQ ID NO: 2 může být
Formulace amyloidogenního polypeptidu a modifikovaných amyloidogenních polypeptidu
Za účelem zavedení amyloidogenního polypeptidu nebo modifikovaného amyloidogenního polypeptidu do živočišného imunitního systému, prostřednictvím jejich podání živočichům, bude použita příprava polypeptidů, která sleduje principy obecně známé v oboru.
Příprava vakcín, které obsahují peptidové sekvence jako aktivní složku, je obecně dobře známa z literatury, a je vysvětlena v US patentech 4 608 251; 4 601 903; 4 599 231;
599 230; 4 596 792; a 4 578 770, všechny tyto patenty jsou začleněny do textu formou odkazu. Typicky se takové vakcíny • fc fcfcfcfc • · • ··· • fc fcfcfcfc roztoky nebo suspendování • · fcfc • · · • fc fcfcfc připravují jako injektovatelné, buď jako tekuté suspenze; pevné formy vhodné pro rozpuštění nebo a může být také připravena kapalina pro injekce. Preparáty mohou také být emulgovány. Aktivní imunogenní složka je často míchána s excipienty,. které jsou farmaceuticky přijatelné a slučitelné s aktivní složkou. Vhodnými excipienty jsou například voda, roztok soli, dextrosa, glycerol, ethanol, apod. a jejich kombinace. Navíc, když je to požadováno, může vakcína obsahovat malé množství pomocných látek jako jsou zvlhčující nebo emulgující činidla, pH upravující činidla, nebo adjuvanty, které zvyšují efektivitu vakcíny; viz podrobná diskuse adjuvantů uvedená níže.
Vakcíny se běžně podávají parenterálně, například injekcí, buď subkutánně, intrakutánně, intradermálně, subdermálně nebo intramuskulárně. Přídavné formulace, které jsou vhodné u jiných způsobů podání zahrnují čípky a v některých případech, orální, bukální, sublinguální, intraperitoneální, intravaginální, anální, epidurální, spinální a intrakraniální formulace. U čípků mohou tradiční vázající látky a nosiče zahrnovat například polyalkanové glykoly nebo triglyceridy; takové čípky mohou být připraveny ze směsi obsahující aktivní složku v rozmezí od 0,5 % do 10 %, především 1-2 %. Orální formulace zahrnují běžně rozšířené excipienty jako jsou například mannítol, laktóza, škrob, magnesiumstearát, sodiumsacharin, celulóza, uhličitan hořečnatý apod. ve farmaceutickém stupni čistoty. Tyto kompozice roztoků, suspenzí, tablet, pilulek, kapslí, s trvalým uvolňováním nebo pudrů a obsahují 10-95 mají formu formulací aktivní složky a přednostně 25-70 % aktivní složky. U orálních formulací je zajímavým partnerem ve formulaci cholerový toxin (a také případný konjugační partner).
•0 0009 • · 0 • 00
• · · · • 0 9 ·
0 · 0 9
09 • 0 0 • ··· 9 • · · ·
Polypeptidy mohou být formulovány do vakcín v neutrální nebo solné formě. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují adiční soli kyselin (tvořené volnými aminoskupinami peptidů) a jsou tvořeny anorganickými kyselinami jako je například kyselina chlorovodíková nebo kyselina fosforečná nebo organickými kyselinami jako je kyselina octová, kyselina oxalová, kyselina vinná, kyselina mandlová apod. Soli tvořené volnými karboxylovými skupinami mohou být také odvozeny z anorganických bází jako je například sodík, draslík, amonium, vápník, hydroxidy železa a takových organických bází, jako je izopropylamin, trimethylamin, 2-ethylaminoethanol, histidin, prokain apod.
Vakcíny se podávají způsobem kompatibilním s dávkovou formou a v množství, které bude terapeuticky účinné a imunogenní. Podávané množství závisí na jednotlivci, který má být ošetřen, na kapacitě individuálního imunitního systému pro vyvolání imunitní reakce a stupni požadované ochrany. Vhodné rozmezí dávkování je od několika stovek mikrogramů aktivní složky na vakcínu s preferovaným rozmezím 0,1 pg až 2 000 pg (i když se mohou očekávat také vyšší množství v rozmezí 1-10 mg) jako je rozmezí od 0,5 pg do 1 000 pg, především rozmezí 1 pg až 500 pg a zvláště přednostně rozmezí od asi 10 pg do 100 pg. Vhodné režimy úvodního podání a posilovačích injekcí jsou také variabilní ale typizované úvodním podáním následovaným dalším očkováním nebo jiným podáním.
Způsob aplikace se může značně lišit. Jakákoliv konvenční metoda podání vakcíny je možná. Metody zahrnují orální aplikaci na pevné fyziologicky přijatelné bázi nebo ve fyziologicky přijatelné disperzi, parenterálně, injekcí apod.
*4
9949
·· 9444 • 94 · • · 949 4 • · 4 4 4 • · 4 4
4* 44«
4« • 4 • 499 • 4 4
4 4
Dávkování vakcíny bude záviset na způsobu podání a bude se měnit v závislosti na věku osoby, která má být očkována a formulaci antigenů.
Některé z polypeptidů ve vakcíně jsou dostatečně imunogenní, ale u některých jiných bude imunitní reakce zvýšena, když bude vakcína navíc obsahovat přídavnou látku (adjuvant).
Jsou známy různé metody pro dosažení adjuvantního efektu u vakcín. Obecné principy a metody jsou podrobně uvedeny v „The Theory and Practical Application of Adjuvants 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (ed.) John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-47195170-6, a také v „Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants, 1995, Gregoriadis G. et al. (eds.) Plenům Press, New York, ISBN 0-306-45283-9, obě citace jsou do textu vloženy formou odkazu.
Zvláště preferované je použití adjuvantu, o kterém je možno prokázat, že napomáhá rozrušení autotolerance k autoantigenům; to je ve skutečnosti podstatné v případech, kdy je nemodifikovaný amyloidogenní polypeptid použit jako aktivní složka autovakcíny. Nelimitující příklady vhodných adjuvantů jsou vybrány ze skupiny skládající se z imunitního cíleného adjuvantu; imunitního modulujícího adjuvantu jako je toxin, cytokin a mykobakteriální derivát; olejová formulace; polymer; micely tvořící adjuvant; saponin; imunostimulující komplexní matrice (ISCOM matrix); částice; DDA; hliníkové adjuvanty; DNA adjuvanty; γ-inulin; a zapouzdřovací adjuvant. Obecně je třeba poznamenat, že shora uvedené látky mají vztah k sloučeninám a činidlům užitečným jako první, druhá a třetí • 9 999 9
9«
9 9 ·· 9
99«
9 »99 « 9 9 * 9 9
99
9 9
99 složka v analozích a také se týkají mutatis mutandis jejich použití v adjuvantech ve vakcíně podle vynálezu.
Aplikace adjuvantů zahrnuje použití činidel jako je hydroxid hlinitý nebo fosforečnan hlinitý (alum) běžně jako 0,05 až 0,1% roztok v pufrovaném solném roztoku, příměs se syntetickými polymery cukru (např. Carbopol®) použitá jako 0,25% roztok, též je možná agregace proteinu ve vakcíně tepelným ošetřením při teplotě pohybující se v rozmezí od 70°C do 101°C během 30 sekund až 2 minut a také agregace prostřednictvím zesítěných činidel. Agregace reaktivací pepsinem ošetřených protilátek (Fab fragmenty) k albuminu, smíchané s bakteriálními buňkami jako je C. parvum nebo endotoxiny nebo lypopolysacharidovými komponenty gramnegativních bakterií, emulgace ve fyziologicky přijatelných olejových pojivech jako je manid mono-oleát (Aracel A) nebo emulgace s 20% roztokem perfluorkarbonu (Fluosol-DA), použité jako bloková náhrada, mohou být také využitelné. Přednost má také příměs s olejem jako je squalen a IFA.
DDA (dimethýldioktadecylamonium bromid) je také zajímavý kandidát na adjuvanty podle vynálezu, DNA a γ-inulin, ale také Freundův kompletní a nekompletní adjuvant jakož i quillaja saponiny jako je QuilA a QS21 a RIBI, jsou též zajímavé. Další možností jsou monofosforyl lipid A (MPL), shora uvedené C3 a C3d a muramyl dipeptid (MDP).
O lipozorrtových formulacích je také známo, že udělují adjuvantům účinnost, a proto jsou liposomové adjuvanty také v způsobech podle vynálezu preferovány.
*· »··♦ • · · • · »·· • · · « <
·· ·♦ «· ««·· • · · · · • ··♦ ♦ « · ···»·· · ·· ··· «9 4
99
Též imunostimulující komplexní matricové typy (ISCOM® matrix) adjuvantů jsou podle vynálezu preferovány, především proto, že bylo ukázáno, že tento typ adjuvantů je schopen
ISCOM® matrice se skládá saponinů (triterpenoidů) a fosfolipidu. Když je vzniká specifická kde saponin přimíchána formulace, regulace MHC třída II exprese u APC. z (příležitostně frakcionovaných) z Quillaja saponaria, cholesterolu k imunogennímu proteinu, která je známa jako ISCOM částice, zaujímá 60-70 % hmotn./hmotn., cholesterol a fosfolipid 10-15 % hmotn./hmotn. a protein 10-15 % hmotn./hmotn. Podrobnosti vztahující se ke kompozici a využití imunostimulujících komplexů je možno např. nalézt ve shora citované knize zabývající se adjuvanty, ale též v Morein B. et al., 1995, Clin. Imunother. 3: 461-475, jakož i v Barr I.G. a Mitchell
G.F, 1996, Imunol. And Cell Biol. 74: 8-25 (obě citace jsou do textu vloženy formou odkazu). Tato literatura poskytuje užitečné instrukce pro přípravu úplných imunostimulujících komplexů.
Další vysoce zajímavou (a proto preferovanou) možností dosažení adjuvantního účinku je využití techniky popsané v Gosselín et al., 1992 (citace je do textu vložena formou odkazu). V stručnosti, poskytnutí relevantního antigenu jako je antigen podle předkládaného vynálezu, může být dosaženo konjugací antigenu do protilátek (nebo antigen vázajících protilátkových fragmentů) proti Fcy receptorům na monocytech/makrofágách. Zvláště pro účely očkování bylo o konjugátech mezi antigenem a anti-FCyRI prokázáno, že zvyšují imunogenicitu.
Další možnosti zahrnují využití cílených a imunomodulujících látek (tzn. cytokinů) uvedených shora jako ·· >··· • · · • * ··· • · · • · · ♦ · ·«»· • · · • · · • ·
kandidátů pro první a druhou část v modifikovaných verzích amyloidogenních polypeptidů. V této souvislosti je také možné použití syntetických zaváděčů cytokinů jako je póly I:C.
Vhodné mykobakteriální deriváty jsou vybrány ze skupiny skládající se z muramyl dipeptidu, kompletního Freudova adjuvantu, RIBI a diesterů trehalosy jako je TDM a TDE.
Vhodné imunitní cílené adjuvanty jsou vybrány ze skupiny skládající se z CD40 ligandy a CD40 protilátek nebo specificky vázajících fragmentů (viz dále uvedená diskuse) manosy, Fab fragmentů a CTLA-4.
Vhodné polymerové adjuvanty jsou vybrány ze skupiny skládající se z uhlohydrátů jako je dextran, PEG, škrob, mannan a manosa; plastických polymerů, jako je latex ve formě latexových kuliček.
Ještě dalším zajímavým způsobem modulace imunitní reakce je zahrnutí imunogenu (případně spolu s adjuvantem a farmaceuticky přijatelným nosičem a vehikulem) do „virtuální lymfatické uzliny (VLN) (medicinální zařízení ve vlastnictví firmy ImunoTherapy, lne., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (tenké trubičkové zařízení) napodobuje strukturu a funkci lymfatické uzliny. Vložení VLN pod kůži vytváří místa sterilního zánětu se vzestupem cytokinů a chemokinů. T- a B-buňky jakož i APC rychle reagují na signály nebezpečí, usazují se v místě zánětu a akumulují uvnitř porézní matrice VLN. Bylo ukázáno, že nezbytná dávka antigenu požadovaná pro vyvolání imunitní reakce na antigen je snížena, když se VLN použije a že imunitní ochrana udělená očkováním používajícím VLN překonává běžnou imunizaci používající RiBi » ···· • · • ··· • · ·· *· • · · • · ··· • · · · • · · · ·· ·· ·· ··*· ·· • · • · • · • · · ·· jako adjuvant. Technologie je popsána v krátkosti v Gelbar C. et al., 1998 „Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Smáli Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node v: „From the Laboratory to the Clinc, kniha abstraktů, 12-15 říjen, 1998, Seascape Resort, Aptos, California.
O mikročástícové formulaci vakcin bylo v mnoha případech ukázáno, že zvyšuje imunogenicitu proteinových antigenů a je proto dalším preferovaným znakem vynálezu. Mikročástice jsou vyrobeny buď jako ko-formulace antigenů s polymerem, lipidem, uhlohydrátem nebo jinými molekulami vhodnými pro výrobu částic, nebo mohou mikročástice být homogenní částice skládající se ze samotného antigenů.
Příklady na polymeru založených mikročástic jsou na PLGA a PVP založené částice (Gupta, R.K. et al. 1998), kde polymer a antigen jsou kondenzovány do pevných částic. Částice založené na lipidech mohou být vyrobeny jako micely lipidu (tzv. liposomy) zachytávající antigen uvnitř micely (Pietrobon, P.J. 1995). Částice založené na uhlohydrátech jsou typicky vyrobeny z vhodného rozložitelného uhlohydrátu jako je škrob nebo chitosan. Uhlohydrát a antigen jsou smíchány a kondenzovány do částic v procesu podobném procesu použitému pro polymerové částice (Kas, H.S, et al., 1997).
Částice skládající se pouze z antigenů mohou být vyrobeny různými postřikovacími a vymrazovacími technologiemi. Zvláště vyhovujícím způsobem výroby pro účely vynálezu je super kritická fluidní technologie, která se používá pro výrobu vysoce jednotných částic s kontrolovanou velikosti (York, P. 1999 & Shekunov, B. et al., 1999).
Očekává se, že vakcína bude podávána 1 až 6 krát za rok, jako je 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6 krát za rok jednotlivcům, kteří to potřebují. V předešlém textu bylo ukázáno, že zapamatování imunity vyvolané použitím autovakcín, kterým se dává přednost, není trvalé a proto imunitní systém potřebuje to, aby byl periodicky povzbuzován amyloidogenním polypeptidem nebo modifikovaným amyloidogenním polypeptidem.
Vlivem genetických variací mohou jednotlivci při podání stejných polypeptidů vykazovat rozdílně silnou imunitní reakci. Proto může vakcína podle vynálezu za účelem zvýšení imunitní........ reakce obsahovao několik odlišných—po-lypeptidů-r—viztaké shora uvedená diskuse,, která se týká výběru cizích Tbuňkových epitopů určených pro aplikaci. Vakcína může obsahovat víc polypeptidů, přičemž všechny polypeptidy byly definovány shora.
Vakcína se může proto skládat z 3-20 modifikovaných nebo nemodifikovaných polypeptidů, jako je 3-10 odlišných polypeptidů.
Očkování (vakcinace) nukleovými kyselinami
Jako alternativa ke klasickému podání vakcíny na bázi peptidu, nabízí technologie vakcinace nukleovými kyselinami (také známá jako „imunizace nukleovými kyselinami, „genetická imunizace a „genová imunizace) řadu atraktivních rysů.
Zaprvé, na rozdíl od způsobu tradiční vakcinace, očkování nukleovými kyselinami nevyžaduje zdroje konzumované velkoobjemovou výrobou imunogenního činidla (např. ve formě průmyslové velkoobjemové fermentace mikroorganismů produkujících amyloidogenní polypeptidy). Navíc není potřebné • · · ·
zařízení pro čištění a schémata imunogenu. Konečně, protože se vakcinace nukleovými kyselinami spoléhá na biochemický aparát očkovaných jednotlivců, aby byl vytvořen expresní produkt zavedených nukleových kyselin, očekává se že vznikne optimální post-translační proces expresního produktu; to je zvláště důležité v případě autovakcinace, protože jak je uvedeno shora, významná frakce původních B-buňkových epitopů by měla být v modifikované molekule zachována, a protože B-buňkové epitopy mohou být v principu tvořeny částí jakékoliv (bio)molekuly (např. uhlohydrátem, lipidem, proteinem apod.). Proto způsob nativní glykosylace a lipidace imunogenu mohou mít.......vel ko u......- dů 1 e ži t o s t......pro celkovou—imu n o g e n i c i t u —a- to—je nejlépe zajištěno tím, když je k dispozici hostitel produkující imunogen.
poskytnutí imunitního kóduj ících
Proto preferovaný znak vynálezu zahrnuje modifikovaného amyloidogenního polypeptidu do systému zavedením nukleové kyseliny (kyselin) modifikované amyloidogenní polypeptidy do živočišných buněk a tím získání in vivo exprese buňkami se zavedenou nukleovou kyselinou (kyselinami).
U tohoto znaku vynálezu je zaváděnou nukleovou kyselinou přednostně DNA, která může být ve formě prosté DNA, DNA formulované s nasycenými nebo nenasycenými lipidy, DNA formulované v liposomech, DNA vložené do virového vektoru, DNA formulované s transfekci podporujícím proteinem nebo polypeptidem, DNA formulované s činidlem srážejícím vápník, DNA spojené dohromady s inertní nosičovou molekulou, DNA zapouzdřené do polymeru, např. do PLGA (viz mikrozapouzdřovací technologie popsaná ve WO 98/31398) nebo do chitinu nebo chitosanu a DNA formulované s adjuvantem. V tomto • · · · · · • · ·· ··· ·· kontextu je možno uvést, že prakticky všechny přístupy týkající se použití adjuvantů v tradičních vakcinových formulacích je možno aplikovat na formulace DNA vakcín. Proto všechny poznatky, které se týkají použití adjuvantů v kontextu vakcín na bázi polypeptidů, jsou aplikovatelné mutatis mutandis při jejich použití v technologii vakcinace nukleovými kyselinami.
Způsoby podávání a schémata podávání vakcín na bázi polypeptidů, které byly podrobně popsány shora, jsou také použitelné pro vakciny na bázi nukleových kyselin podle
......vynálezu—a celá—shora uvedená diskuse týkájící—se způsobů podávání a schémat podávání polypeptidů je aplikovatelná mutatis mutandis na nukleové kyseliny. K tomu je potřeba přidat to, že vakciny obsahující.nukleové kyseliny mohou být vhodně podávány intravenózně a intraarteriálně. Navíc je v oboru dobře známo, že vakciny založené na bázi nukleových kyselin mohou být podávány za použití tzv. genového děla (gene gun) , a proto také tento a jemu ekvivalentní způsob podání se považují za součást předkládaného vynálezu. Konečně také o použití VLN při podávání nukleových kyselin bylo uvedeno, že přináší dobré výsledky a proto je tento osobitý způsob podávání také preferován.
Nukíeová kyselina(a) použitá jako imunizační činidlo může obsahovat regiony kódující první, druhou a/nebo třetí část, např. ve formě imunomodulujících substancí popsaných shora, jako jsou cytokiny diskutované jako užitečné adjuvanty. Přednostní verze tohoto aspektu vynálezu zahrnuje existenci kódujícího regionu pro analog a kódujícího regionu pro imunomodulátor v rozdílných čítačích rámcích nebo přinejmenším pod kontrolou různých promotorů. Alternativně mohou být • · • · · · · · • · · ·· · · · použity dva odlišné fragmenty nukleotidu, ale to má menší význam, protože je výhodnější, když se zajistí koexprese existencí obou kódujících regionů obsažených ve stejné molekule.
Současně se vynález také týká kompozic pro vyvolání tvorby protilátek proti amyloidogennímu polypeptidů, které obsahují fragment aminokyseliny nebo vektor podle vynálezu (viz níže uvedená diskuse o vektorech) a
-.....farmaceuticky a imunologicky přijatelné vehikulum a/nebo nosič a/nebo adjuvant jak je diskutován dále.
Za normálních okolností je variantní kódující aminokyselina zavedena ve formě vektoru, přičemž exprese je pod kontrolou virového promotoru. Detailnější diskuse vektorů podle vynálezu je uvedena níže. Detailní popis vztahující se k formulaci a použití vakcín obsahujících nukleové kyseliny je uveden v Donnelly J.J. et al., 1997, Annu. Rev. Immunol'. 15: 617-648· a Donnely J.J. et al., 1997, Life Sciences 60: 163172. Obě tyto citace jsou do textu vloženy formou odkazu.
Živé vakcíny
Třetí alternativou efektivního poskytnutí modifikovaného amyloidogenního polypeptidů imunitnímu systému je použití technologie živé vakcíny. U vakcinace imunitního systému živou vakcínou se postupuje tak, že se živočichům podává nepatogenní mikroorganismus, který byl transformován fragmentem nukleové kyseliny kódujícím modifikovaný amyloidogenní polypeptid nebo vektorem obsahujícím takový fragment nukleové kyseliny.
· 0 · 0 0
I · · > 0 0 0 · ř - 0 4
4 0·
Nepatogenní mikroorganismus může být jakýkoliv vhodný zeslabený bakteriální kmen (zeslabený prostřednictvím pasážování nebo odstranění patogenních expresních produktů DNA rekombinantní technologií) jako je např. Mycobacterium bovis BCG., nepatogenní Streptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella apod. Souhrn, zabývající se přípravou živých vakcín, které jsou známy v dosavadním stavu v oboru, je možno nalézt v Saliou P., 1995, Rev. Prát. 45: 1492-1496 a Walker P.D., 1992, Vaccine 10: 977-990, obě tyto citace jsou do textu vloženy formou odkazu. Detaily týkající se fragmentů nukleových kyselin a vektorů v takových živých vakcínéch j sou uvedeny v následuj ící diskusi.----------- - ------------------------------—.....
Jako alternativa k živým bakteriálním vakcínám mohou být použity fragmenty nukleových kyselin podle vynálezu (dále diskutovány), které jsou začleněny do nevirulentních virových vakcínových vektorů jako je kmen vakcinie nebo jiný vhodný virus neštovic.
Běžně je nepatogenní mikroorganismus nebo virus živočichům podáván jen jednou, ale v určitých případech může být nezbytné podat mikroorganismus vícekrát než jednou za život, aby se zachovala ochranná imunita. Uvažuje se dokonce o tom, že imunizační schéma jako je to, které je popsáno shora pro polypeptidové očkování, bude užitečné při použití živých nebo virových vakcín.
je živá nebo virová vakcinace nebo následujícím očkováním kyselinou. Například je možné živou nebo virovou vakcínou
Alternativně s předcházejícím a/nebo nukleovou primární imunizaci kombinovaná polypeptidem uskutečnit následovanou
56 • 9 9 9 9 9 *· ·· 9 9« 9 9 9 9 9 999 9 9 9·· 9 9 9 9 9 9 9 9 « 9 « « 9 9 9 9 9 9 9 9
• 9 « « 9 9 9 « 9 9 9 9 9 9 9 9
zvýšenou imunizací za použití polypeptidů nebo nukleových
kyselin.
Mikroorganismy nebo viry mohou být transformovány
nukleovou kyselinou (námi) obsahující region kódující první,
druhou a/nebo třetí část, např. ve formě imunomodulujících substancí popsaných shora jako jsou cytokiny považované za užitečné adjuvanty. Přednostní verze tohoto aspektu vynálezu zahrnuje existenci kódujícího regiónu pro analog a kódujícího regionu pro imunomodulátor v rozdílných čítačích rámcích nebo přinejmenším pod kontrolou různých promotorů. Takto je možné
.....—se vyvarovat tomu,—že—analog nebo epitopy—jsou—produkovány.....
jako fúzní partneři k imunomodulátoru. Alternativně mohou být jako transformující činidla použity dva odlišné fragmenty nukleotidu. Existence první a/nebo druhé a/nebo třetí části ve stejném čítacím rámci může zajistit expresní produkt, analog podle vynálezu, a takový znak má podle předkládaného vynálezu mimořádnou přednost.
Použití metod podle vynálezu pro ošetřování nemocí
Jak je postiženo v shora uvedené diskusi, poskytnutí metod podle vynálezu dovoluje kontrolovat nemoci charakterizované ložisky amyloidů. V tomto kontextu je pro nové metody klíčovým cílem AD, ale také jiné nemoci charakterizované ložisky amyloidů jsou vhodným cílem. Proto důležitý znak metod podle vynálezu za účelem regulace s cílem omezení aktivity amyloidů zahrnuje ošetření a/nebo prevenci a/nebo zlepšení stavu AD nebo jiných chorob charakterizovaných ukládáním amyloidů; metoda zahrnuje regulaci za účelem snížení amyloidů za použití způsobů podle vynálezu v takovém rozsahu, že se množství amyloidů významně sníží.
• · · · • « · · toto·· ·· · ···· ·· ··· ·· ··
Zvláště preferováno je to, že redukce amyloidu vyplývá ze zvratu v poměru mezi tvorbou amyloidu a degradací/odstraněním amyloidu, tzn. že rychlost degradace/odstraňování amyloidu převýší rychlost tvorby amyloidu. Pečlivým řízením množství a imunologického dopadu imunizace na jednotlivce, kteří to potřebují, bude možno získat za určitou dobu takový poměr, který ve výsledku bude redukcí ložisek amyloidu, aniž by to mělo nadměrný nepříznivý účinek.
Alternativně, když u určitého jedince metoda podle vynálezu nebude moci odstranit nebo redukovat existující ložiska amyloidu,—bude metoda podle vynálezu moci—býr použita pro získání klinicky významných redukcí při formování nového amyloidu, čímž významně prodlouží dobu, ve které není choroba ještě tolik vysilující. Bude možné monitorovat rychlost ukládání amyloidu buď měřením koncentrace amyloidu v seru (o kterém se předpokládá, že je v rovnováze s ukládaným
materiálem) nebo použitím positron-emisní tomografie (PET),
viz Smáli G.W. et al., 1996, Ann. N.Y. Acad. Sci. 802: 70-78.
Jiné nemoci a stavy, kde mohou být prezentované
technologie a metody podobným způsobem použité pro ošetřování nebo zlepšení, byly uvedeny shora v „Dosavadním stavu techniky (systémové amyloidózy, diabetes s pozdním nástupem, Parkinsonova choroba, Huntingtonova choroba, fronto-temporální demence a s prionem spojená transmisní spongioformní encephalopatie) nebo jsou uvedeny dále v sekci nazvané „Jiné amyloidové choroby a proteiny s nimi spojené.
• 99« • · · · • 9 9*
Peptidy, polypeptidy a kompozice podle vynálezu
Jako je zřejmé ze shora uvedeného textu, je předložený vynález založen na konceptu imunizace jednotlivců proti amyloidogennímu antigenů za účelem dosažení redukce množství s patologií spojených ložisek amyloidu. Přednostním způsobem dosažení takové imunizace je použití modifikovaných verzí amyloidogenního polypeptidů, poskytnutím molekul, které nebyly doposud v tomto oboru popsány.
Předpokládá se, že modifikované molekuly, zde diskutované, jsou vynálezecky nové a proto se—důle žírá—část vynálezu syká analogů, které jsou odvozeny ze živočišného amyloidogenního polypeptidů, u kterých je zavedena modifikace, která má za následek imunizaci živočicha analogy, které vyvolávají tvorbu protilátek, reagujících specificky s nemodifikovaným Přednostně je, polypeptidy, přizpůsoben typům modifikací popsaných o různých protilátkách podle metody vynálezu. Proto jakékoliv nové poznatky zde prezentované týkající se modifikovaných amyloidogenních molekul jsou relevantní k účelům popisujícím amyloidogenní analogy podle vynálezu a jakékoliv takové nové poznatky jsou aplikovány mutatis mutandis na popis těchto analogů.
amyloidogenním polypeptidem. modifikované amyloidogenní když jsou použity původ modifikací shora v diskusi
Je třeba poznamenat, že přednostní amyloidogenní molekuly obsahují modifikace, které tvoří polypeptidy mající přinejmenším 70% identitu sekvencí s amyloidogenním proteinem nebo se subsekvencí s délkou přinejmenším 10 aminokyselin. Přednost mají vyšší identity sekvencí např. přinejmenším 75% nebo dokonce 80, 85, 90 nebo 95%. Sekvenční identita proteinů
59 • fc fcfcfcfc ·· fcfc ·· • · · fcfcfc ·· • fcfcfcfc · fcfcfcfc · · • · fc fcfcfcfc fcfc • fcfcfc • • • • · • fc
fcfc fcfcfc fcfc • fc fcfc
nebo nukleových kyselin může být vypočítána podle vzorce
(Nref - Ndif) . 100/Nref, kde Ndif je ce lkový počet neidentických
zbytků v dvou porovnávaných sekvencích a kde Nref je počet zbytků v jedné sekvenci. Proto DNA sekvence AGTCAGTC bude mít sekvenční identitu 75% se sekvencí AATCAATC (Ndíf = 2 a
Nref = 8 ) .
Vynález se také týká kompozic užitečných při realizaci metod podle vynálezu. Vynález se dále týká imunogenních kompozic obsahujících imunogenicky účinné množství amyloidogenního polypeptidu, který je vlastním proteinem ž i v o č i c h ů, kde-— amylcidog e η n í polypeptid—formulovaný—d o h r oma d y s imunologicky přijatelným adjuvantem, rozruší autotoleranci živočichů proti amyloidogennímu polypeptidu; kompozice navíc obsahují farmaceuticky a imunologicky přijatelná rozpouštědla a/nebo vehikula a/nebo nosiče a/nebo excipienty. Jinými slovy, tato část vynálezu se týká formulací přirozeně se vyskytujících amyloidogenních polypeptidů, které byly popsány ve spojení s metodami podle vynálezu.
Vynález se také vztahuje na imunogenní kompozice, které obsahují imunologicky účinné množství analogu popsaného shora, taková kompozice navíc obsahuje farmaceuticky přijatelná rozpouštědla a/nebo vehikula a/nebo nosiče a/nebo excipienty nebo popřípadě adjuvant. Jinými slovy tato část vynálezu se týká formulací modifikovaného amyloidogenního polypeptidu, především jak je popsán shora. Výběr adjuvantů, nosičů a vehikulí je realizován v rozsahu, který byl diskutován shora při popisu formulací modifikovaných nebo nemodifikovaných amyloidogenních polypeptidů pro použití na regulaci amyloidu s cílem jeho snížení, podle metod vynálezu.
• 0
0 0 0 0 0
0000 0 0000
0 000 00 0
0 0 0 0 0 0 00 000 0· 00
0000 «000
0
Polypeptidy se připravují podle metod dobře známých v oboru. Delší polypeptidy se běžně připravují prostřednictvím technologie genové rekombinace, zahrnující vložení sekvence nukleové kyseliny kódující analog do vhodného vektoru, transformací vhodné hostitelské buňky vektorem, expresí hostitelské buňky sekvencí nukleové kyseliny, získáním expresního produktu z hostitelských buněk nebo jejich supernatantu kultury a následnou purifikací a případně další modifikací, např. složením nebo derivatizací.
Kratší peptidy jsou přednostně připravovány prostřednictvím—dobře známých tecnnik—pevné nebo —nekuté peptidové syntézy. Avšak současné objevy v této technologii poskytnou tímto způsobem možnou přípravu polypeptidů s plnou délkou a též proteinů, a proto je také příprava dlouhých konstruktů syntetickým způsobem zahrnuta do rozsahu vynálezu.
Fragmenty nukleových kyselin a vektory podle vynálezu
Ze shora uvedených nových poznatků je možno pochopit, že modifikované amyloidogenní polypeptidy mohou být připraveny rekombinantní genovou technologií ale také chemickou syntézou nebo semisyntézou; dvě posledně uvedené možnosti jsou zvláště příhodné, když se modifikace skládá z připojení na proteinové nosiče (jako je KLH, diphtheria toxoid, tetanus toxoid a BSA) a nebílkovinných molekul jako jsou polymery uhlohydrátů a samozřejmě také, když modifikace zahrnuje přidání postranních řetězců nebo postranních skupin k peptidovému řetězci pocházejícímu z amyloidogenního polypeptidu.
Fragmenty nukleových kyselin kódující modifikované amyloidogenní polypeptidy jsou důležité chemické produkty pro •to to··· toto toto»· 9 · to tototo • to ·· • · · to · « to toto·· to · to toto ········· · ·· · toto·· ···· ·· tototo to· ·· ·· ·· účely rekombinantní genové technologie a také pro účely imunizace nukleovými kyselinami. Proto se významná část vynálezu týká fragmentů nukleových kyselin, které kódují analogy amyloidogenních polypeptidů, tzn. polypeptidů odvozených z amyloidogenních polypeptidů, které buď obsahují přirozené sekvence, ke kterým byl přidán nebo vložen fúzní partner nebo, přednostně, polypeptidů odvozených z amyloidogenních polypeptidů, kde byl vložen cizí T-buňkový epitop prostřednictvím inzerce a/nebo adice, přednostně prostřednictvím substituce a/nebo delece. Fragmenty nukleových kyselin podle vynálezu jsou buď DNA nebo RNA fragmenty.
Fragmenty nukleových kyselin podle vynálezu je běžně možno vkládat do vhodných vektorů za vytvoření klonových nebo expresních vektorů nesoucích fragmenty nukleových kyselin podle vynálezu; takové nové vektory jsou též součástí vynálezu. Detaily týkající se konstrukce těchto fragmentů podle vynálezu budou dále diskutovány v kontextu transformovaných buněk a mikroorganismů. Vektory mohou být v závislosti na účelu a typu aplikace ve formě plasmidu, fágů, kosmidů, mini-chromosomů nebo virů, ale také prostá DNA, která je expresována pouze přechodně v určitých buňkách, je důležitý vektor. Přednostní klonové a expresní vektory podle vynálezu jsou schopny autonomní replikace, čímž umožňují získat vysoký počet kopií pro účely vysokoúrovňové exprese nebo vysokoúrovňové replikace pro následné klonování.
Obecný hlavní rys vektoru podle vynálezu zahrnuje následující charakteristiky v 5'—> 3' směru a operačním spojení: promotor pro řízení exprese fragmentu nukleové kyseliny podle vynálezu, případně sekvenci nukleové kyseliny kódující vedoucí peptid uvolňující sekreci (do extracelulární
4« 4444 44 4» ·· 9444
449 444 44 9
9944 9 4499 4 4 4 /-/-) 44 49444 949 9 9
OZ 44 9 9999 4444
494 4494 44 94 fáze nebo, když je to proveditelné, do periplasmy) nebo integraci do membrány polypeptidového fragmentu, fragment nukleové kyseliny podle vynálezu a případně sekvenci nukleové kyseliny kódující terminátor. Když se pracuje s expresními vektory v producentských kmenech nebo buněčných liniích je za účelem genetické stability transformované buňky preferováno to, že se vektor, když je zaveden do hostitelské buňky, integruje v genomu hostitelské buňky. Na rozdíl od toho, když se pracuje s vektory, které mají být použity na vyvolání in vivo exprese v živočiších (tzn. když se vektor použije pro DNA vakcinaci) je z bezpečnostních důvodů preferováno to, že je vektor neschopný integrace dc genomu hostitelské buňky;— typicky se použije prostá DNA nebo neintegrující virové vektory, jejichž výběr je dobře znám odborníkům v oboru.
Vektory podle vynálezu jsou použity na transformaci hostitelských buněk tak, aby produkovali modifikovaný amyloidogenní polypeptid podle vynálezu. Takové transformované buňky, které jsou také součástí vynálezu, mohou být vypěstované buňky nebo buněčné linie použité pro vytvoření fragmentů nukleových kyselin a vektorů podle vynálezu, nebo použity na rekombinantní produkci modifikovaných amyloídogenních polypeptidů podle vynálezu. Alternativně mohou být transformované buňky vhodnými kmeny pro živou vakcínu, kde fragmenty nukleové kyseliny (jeden samotný nebo násobné kopie) byly vloženy tak, aby to vyvolalo sekreci nebo integraci modifikovaných amyloídogenních polypeptidů do bakteriální membrány nebo buněčné stěny.
Přednostní transformované buňky podle vynálezu jsou mikroorganismy jako jsou bakterie (jako jsou druhy Escherichia [např. E. coli], Bacillus [např. Bacillus subtilis],
9999 49 49 94 9444 • 44 444 44 4
4444 4 4 444 4 4 4
499444449 4
4 9494 4444
444 49 44 44 49
Salmonella nebo Mycobacterium [především nepatogenní, např. M. bovis BCG]), kvasinky (jako je Saccharomyces cerevisiae) a protozoa. Alternativně jsou transformované buňky odvozeny od mikrocelulárních organismů jako jsou houby, hmyzí buňky, rostlinné buňky nebo buňky savců. Mimořádně preferovány jsou buňky odvozené od lidí, viz níže uvedená diskuse buněčných linií a vektorů. Poslední výsledky ukazují velkou naději v použití komerčně dostupných Drosophila melanogaster buněčných linií (Schneider 2 (S2) buněčné linie a vektorové systémy dostupné od Invitrogen) pro rekombinantní produkci polypeptidů v aplikačních laboratořích a proto se tento
Za účelem klonování a/nebo optimalizované exprese se preferuje to, že je transformovaná buňka schopna replikace fragmentu nukleové kyseliny podle vynálezu. Buňky expresující nukleový fragment jsou preferovanými užitečnými součástmi předkládaného vynálezu; mohou být použity na maloobjemovou nebo velkoobjemovou přípravu modifikovaných amyloidogenních polypeptidů nebo, v případě nepatogenních bakterií, jako základní složka v živé vakcíně.
Když se připravují modifikované molekuly podle vynálezu prostřednictvím transformovaných buněk, je vhodné, i když ne nezbytné, aby byl expresní produkt buď exportován do růstového media nebo nanesen na povrchu transformované buňky.
Když byly identifikovány produkční buňky, preferuje se na základě toho, založit stabilní buněčnou linii, která nese vektor podle vynálezu a která expresuje fragmenty nukleových kyselin kódující modifikované amyloidogenní polypeptidy.
Přednostně tato stabilní buněčná linie vylučuje nebo nese analogy podle vynálezu, čímž usnadňuje čištění.
Μ « 999 ·· ·· «
I · · · * · · > · ··· · · ··♦ ·
I · 9 9 9 9 9 9 9 9
999
Obecně jsou ve spojení s hostitelem použity plasmidové vektory obsahující replikační a kontrolní sekvence, které jsou odvozeny od druhů kompatibilních s hostitelskou buňkou. Vektor obvykle nese replikační místo, jakož i označovací sekvence, které jsou schopny zajistit fenotypovou selekci v transformovaných buňkách. Například E. coli je typicky transformována použitím pBR322, což je plasmid odvozený od druhu E. coli (viz např. Bolivar et al., 1977). Plasmid pBR322 obsahuj e ger.y re sis tence k ainpí cillir.u a retracy klinu—a tak poskytuje snadný způsob identifikace transformovaných buněk. pBR plasmid nebo jiný mikrobiální plasmid nebo fág musí též obsahovat, nebo musí být modifikován tak, aby obsahoval, promotory, které mohou být použity prokarytickými mikroorganismy pro expresi. Tyto promotory nejčastěji použité při rekombinantných DNA konstrukcích obsahují B-laktamázové (penicilinázové) a laktózové promotorové systémy (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goedddel et al., 1979) a tryptofanový (trp) promotorový systém (Goeddel et al., 1979;
776). Zatímco tyto systémy jsou používány byly objeveny a použity jiné mikrobiální promotory, podrobnosti týkající se jejich nukleotidových sekvencí byly publikovány, a to poskytlo odborníkům možnost dodat jim funkčnost pomocí plasmidových vektorů (Siebwenlist et al., 1980). Určité geny z prokaryontů mohou být účinně expresovány v E. coli z jejich vlastních promotorových sekvencí, čímž se předchází potřebě dodání jiných promotorů
EP-A-0 036 nejčastěji, umělým způsobem ·♦ ·4« · • · ♦ · · • · · · · • * · • · • · ♦ · • · 9 • » · ♦ ·
Eukaryontní mikrobi, jako jsou kvasinkové kultury mohou být také použiti jako přídavek k prokaryontům a zde by promotor měl být schopen řízení exprese. Mezi eukaryontními mikroorganismy jsou nejběžněji používány Saccharomyces cerevisiae nebo běžné pekařské kvasinky, i když je běžně dostupných mnoho jiných kmenů. Pro expresi v Saccharomyces je například běžně používán plasmid Yrp7 (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Tento plasmid již obsahuje trpí gen, který zajišťuje selektivní markér pro mutantní kmen kvasinek postrádající schopnost růstu v tryptofanu jako je např. ATCC No. 44076 nebo PEP4-1 (Jones, 1977) . Přítomnost trpí leze 3ako charakteristický rys genomu kvasinkové hostitelské buňky potom zajistí efektivní prostředí pro detekci transformace růstem v nepřítomnosti tryptofanu.
Vhodné podporující sekvence v kvasinkových vektorech obsahují promotory pro 3-fosfoglycerát kinázu (Hitzman et al., 1980) nebo jiné glykolytické enzymy (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), jako je enoláza, glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza, hexokináza, pyruvát dekarboxyláza, fosfofruktokináza, glukoso-6-fosfát isomeráza, 3-fosfoglycerát mutáza, pyruvát kináza, triosofosfát isomeráza, fosfoglukozoisomeráza a glukokináza. Při konstrukci vhodných expresních plasmidů, jsou terminační sekvencí spojené s těmito geny také ligátovány do expresního vektoru 3' sekvence, od které se požaduje, aby byla expresována za účelem zajištění polyadenilace mRNA a terminace.
Jiné promotory, které mají dodatečnou výhodu transkripce kontrolované růstovými podmínkami, jsou promotorové regiony pro alkohol dehydrogenázu 2, isocytochrom C, kyselá • 9
9» 9·99 «· ··* · • ·
9*9
9
9 9 9 9 9
9999 · 9 9
99999 9*9 9 *
9 9999 9*99
99« 99 99 99 99 fosfatáza, degradační enzymy spojené s metabolismem dusíku a již uvedená glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza a enzymy odpovědné za využití maltosy a galaktosy. Je vhodný jakýkoliv plasmidový vektor obsahující s kvasinkou kompatibilní promotor, vycházející z replikačních a terminačních sekvencí.
Navíc k mikroorganismům mohou být jako hostitelé použity buněčné kultury odvozené od multicelulárních organismů. V principu jakákoliv taková buněčná kultura je zpracovatelná, buď z kultury obratlovců nebo jiných organismů. Avšak největší zájem je o buňky obratlovců a pomnožování obratlovců v kultuře (tkáňové...........kultuře) se stálo ~ v posledních---letech--------rutinní procedurou (Tissue Culture, 1973) . Příklady takových užitečných hostitelských buněčných linií jsou VĚRO a HeLa buňky, buněčné linie vaječníků čínského křečka (CHO) a W138, BHK, COS-7 293, buňky Spodoptera frugiperda (SF) (komerčně dostupné jako úplné expresní systémy od Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, USE a od Invitrogen) a MDCK buněčné linie. Podle předkládaného vynálezu mají zvláštní přednost buněčné linie S2 dostupné od Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, Nizozemí.
Expresní vektory pro takové buňky běžně obsahují (když je to nezbytné) zdroj replikace, promotor umístněný před genem, který má být expresován společně s jakýmikoliv nezbytnými ribosomovými vázajícími místy, RNA spojovací místa, polyadenylační místa a transkripční koncové sekvence.
Při použití v buňkách savců jsou kontrolní funkce na expresních vektorech často zajištěny virovým materiálem.
Například běžně používané promotory pocházejí z polyomního adenoviru 2 a velmi často Simian viru 40 (SV40). Časné a ·· • a ··«· • · • aaa • * « a a • · a · a > » · a · • « * 9 *· * · • · « • « · • · · • * · * • a ·« pozdní promotory SV40 viru jsou zvláště užitečné, protože jsou oba snadno získány z viru jako fragment, který také obsahuje SV40 virový zdroj replikace (Fiers et al., 1978). Menší a větší SV40 fragmenty je také možno použít, jejich připravením se zahrne přibližně 250 bp zvětšení sekvence z Hindlll místa směrem k Bgll místu uloženému ve virovém zdroji replikace. Navíc je také možné a často požadované použití promotorových nebo kontrolních sekvencí normálně spojených s požadovanou genovou sekvencí pro. zajištění toho, aby takové kontrolní sekvence byly kompatibilní se systémy hostitelských buněk.
'Zdroj- replikace může být—připraven buď kon s t ru kcí—vektoru, který obsahuje exogenní zdroj, tak že může pocházet ze SV40 nebo jiných virů (např. polyoma, adeno, VSV, BPV) nebo může být připraven replikačním mechanismem chromosomu hostitelské buňky. Když je vektor integrován do chromosomu hostitelské buňky, je druhý způsob často dostatečný.
Identifikace užitečných analogů
Odborníkům v oboru bude varianty nebo modifikace amyloidogenních polypeptidů, jasné, ze přirozeně které jsou ne všechny možné se vyskytujících křížně reaktivní s přirozenou formou, budou mít schopnost vyvolat tvorbu protilátek u živočichů. Není však těžké stanovit standardní kritéria pro modifikované amyloidogenní molekuly, které by měly splnit minimální požadavky imunologické reaktivity, jak je zde diskutována. Další část vynálezu se týká metod identifikace modifikovaných amyloidogenních polypeptidů, které jsou schopny vyvolání tvorby protilátek proti nemodifikovanému amyloídogennímu polypeptidu v živočišných druzích, kde
9* 99·· »9 »999 ·
• 999 • · 9 9 9 9 • 9999 1 Φ 9
999999999 9
9 9999 9999 ' 999 99 99 9« 99 nemodifikovaný amyloidogenní polypeptid je (neimunogenní) vlastní protein. Metody zahrnují přípravu souboru vzájemně odlišných modifikovaných amyloidogenních polypeptidu použitím peptidové syntézy nebo technik genetického inženýrství, kde byly aminokyseliny přidány do, vloženy do, odstraněny z, nebo substituovány v aminokyselinové sekvenci amyloidogenního polypeptidu živočišných druhů a takto vznikli v tomto souboru aminokyselinové sekvence, které obsahují Tbuňkové epitopy, které jsou cizí pro živočišný druh, nebo přípravu souboru fragmentů nukleových—kyselin, kódujících soubor vzájemně odlišných modifikovaných amyloidogenních polypeptidů, testování členů souboru modifikovaných amyloidogenních polypeptidů nebo fragmentů nukleových aminokyselin na jejich schopnost vyvolat u živočišných druhů tvorbu protilátek proti nemodifikovaným amyloidogenním polypeptidům, a identifikaci a případně izolaci člena(nův) souboru modifikovaných amyloidogenních polypeptidů, které významně ovlivňují tvorbu protilátek proti nemodifikovaným amyloidogenním polypeptidům u druhů, nebo identifikaci nebo případně izolaci polypeptidových expresních produktů kódovaných členy souboru aminokyselinových fragmentů, které významně ovlivňují tvorbu protilátek proti nemodifikovaným amyloidogenním polypeptidům v živočišných druzích.
·· ···· ·· ·· ·· «··· ··· ··· ·· · • · ··· · · ··. · · · ·· ·······«· · • · · ···· ···· ·· ··· ·· ·♦ ·· ··
V tomto kontextu znamená „soubor vzájemně odlišných modifikovaných amyloidogenních polypeptidů sbírku neidentických modifikovaných amyloidogenních polypeptidů, které byly např. selektovány na bázi kritérií diskutovaných shora (např. v kombinaci se studiemi kruhového dichroismu, NMR spektra, a/nebo rentgenové difrakční metody). Soubor může obsahovat pouze několik členů ale očekává se, že soubor může mít několik stovek členů.
Test členů souboru může být proveden in vivo, ale může být použita také řada in vitro testů, které omezují počet modifikovaných molekul, které budou sloužit účelům vynálezu.
Protože cílem zavedení cizích T-buňkových epitopů je podpora B-buňkové reakce pomocí T-buněk, je předpokladem to, že T-buňková proliferace je vyvolána modifikovaným amyloidogenním polypeptidem. T-buňková proliferace může být testována standardizovaným proliferačním způsobem in vitro. V krátkosti, vzorek obohacený o T-buňky se získá ze subjektu a následně se udržuje v kultuře. Napěstované T-buňky se kontaktují s APC subjektu, kterému byly předtím odebrány modifikované molekuly a zpracovány tak, aby poskytly jejich Tbuňkové epitopy. Proliferace T-buněk se monitoruje a srovnává s vhodnou kontrolou (např. T-buňky v kultuře v kontaktu s APC, které mají zpracovány neporušené, nativní amyloidogenní polypeptidy). Alternativně může být proliferace měřena určením koncentrace relevantních cytokinů uvolněných T-buňkami v reakci na jejich rozpoznání cizích T-buněk.
Když se jako přinejmenším jeden jakéhokoliv typu v velmi pravděpodobné předpokládá, že modifikovaný amyloidogenní polypeptid souboru je schopen vyvolat tvorbu • · · · protilátek proti amyloidogennimu polypeptidu, potom je možno připravit imunogenní kompozici obsahující přinejmenším jeden modifikovaný polypeptid amyloidu, který je schopen vyvolat tvorbu protilátek proti nemodifikovanému amyloidogennimu polypeptidu u živočišných druhů, kde nemodifikovaný amyloidogenní polypeptid je vlastní protein; metoda zahrnuje smíchání člena(ů) souboru, které významně vyvolávají tvorbu protilátek u živočišných druhů, které reagují s amyloidogenním polypeptidem, s farmaceuticky a imunologicky přijatelným nosičem a/nebo vehikulem a/nebo rozpouštědlem a/nebo excipientem, případně v kombinaci s přinejmenším jedním farmaceuticky a imunologicky přijatelným adjuvantem.
Shora uvedené aspekty vynálezu, týkající se testu souboru polypeptidů, se běžně provádějí způsobem, který nejprve zahrnuje přípravu řady vzájemně odlišných sekvencí nukleových kyselin nebo vektorů podle vynálezu, transformaci vhodných hostitelských buněk (nebo hostitelských živočichů) s vektory a efektivní expresi sekvencí nukleových kyselin podle vynálezu. Tyto stupně mohou být následovány izolací expresních produktů. Přednost má to, když jsou sekvence nukleových kyselin a/nebo vektory připraveny metodami zahrnujícími použití molekulárních amplifikačních technik jako je PCR nebo prostřednictvím syntézy nukleových kyselin.
Specifické amyloidogenní cíle
Vedle proteinů velmi často spojovaných s Alzheimerovou chorobou, APP, ApoE4 a Tau, existuje mnoho jiných proteinů, které jsou nějakým způsobem spojeny s AD, buď jejich přímou přítomností v povlacích nebo zámotcích v mozku postiženém AD nebo jejich zjevným genetickým spojením se zvyšujícím se • · • · · • · · ·« rizikem vývoje AD. Většina, když ne všechny tyto antigeny, jsou společné se shora uvedenými Αβ, APP, presenilinem a ApoE4, domnělými cílovými proteiny podle předkládaného vynálezu.
Alphal-antichymotripsin (ACT) je hlavní složkou SP a předpokládá se, že hraje důležitou roli v patogenesi lézí u AD a cerebrovaskulární amyloidózy (CA) (Acta Neuropathol. 1998, 96:628-36). Reaguje s Αβ in vitro a stimuluje formaci a roztržení Αβ-42 vláken (JBC, 1998, 273: 28360-4).
Alpha2-makroglobulin byl objeven imunobarvením ve vrstvě povlaku v mozku postiženém AD. Ve vrstvě povlaku byl objeven transmembránový fragment z beta-subjednotky, zatímco rozpustný alpha fragment byl zjištěn v povlacích extra-celulárně (Acta Neuropathol. 1998, 96: 628-636 a Brain Res. 1997, 777: 223227) .
ABAD (Αβ-peptid vázající alkohol dehydrogenáza) se váže s Αβ uvnitř buněk. Je to neuronální enzym přítomný v normálních buňkách, ale je nadexpresován v neuronech ovlivněných AD. Αβ je toxičtější pro buňky, které nadexpresují ABAD. ABAD je spojena s X-chromosomem (Yan, 1997, Nátuře 389).
APLPl a -2 (amyloidovému prekursoru podobný protein 1 a -2)
Oba proteiny patří k super-rodině proteinů APP homologů, ale postrádají Αβ peptidový region. Avšak existuje významné barvení APLP v povlacích (Acta Neuropathol. 1997, 94: 519-524).
AMY117 je nově objevený protein v lézích podobných povlakům v mozku lidí trpících AD, který se zdá být hojný, široce rozšířený a „vysoce specifický při chorobě. Očekává se, že • · · · ·· ·· ·· ···· • · · · · • · · · · · · · · · · ·
protein AMY117 může hrát klíčovou roli při vývoji a progresi AD tvorbou těchto povlaků. Je zajímavé, že AMY117 obsahuje povlaky, které nejsou umístněny vedle povlaků obsahujících Αβ a tak je možno definovat nové charakteristické rysy projevu AD k dosud dobře známým povlakům obsahujícím Αβ a zámotkům obsahujícím Tau. AMY117 pozitivní povlaky byly zjištěny v hojném počtu v mozcích v sporadických případech AD a v mozcích lidí trpících Downovým syndromem ale „velmi zřídka nebo vůbec nebyly zjištěny v mozcích kontrolní skupiny nebo u jiných neurodegenerativních chorob (Am. J. Pathol. 1997, 151: 69, 80) .
Bax: Monoklonální protilátky detekovaly Bax jako komponent senilních povlaků v AD mozcích. Bax je také nadexpresován v dystrofických neuritech (Acta Neuropathol. 1998, 95: 407412) .
Bcl-2 má nejasnou úlohu. Je nadexpresován v gliálních buňkách obklopujících povlaky (Acta Neuropathol. 1998, 95: 407-412).
Bleomycin hydroláza je asi beta-sekretáza. Byla zjištěna antibleomycin hydrolázová imunoreaktivita v SP u AD (Brain Res. 1999, 830: 200-202). Určitý bleomycinový hydrolázový genotyp je v určitých případech spojený se zvýšeným rizikem vývoje AD, zatímco u jiných chorob nebyly nalezeny žádné korelace (Ann. Neurol. 1998, 44: 808-811 a Ann. Neurol. 1999, 46: 136-137).
BRI/ABRI: ABRI je 4 kD fragment putativního transmembránového proteinu, kódovaného BRI genem na chromosomu 13, který byl nalezen v amyloidových povlacích lidí trpících britskou demencí (FBD). Tyto pacienti mají mutaci v stop kodonu BRI genu, který tvoří delší otevřený čítači rámec. Uvolnění 34 • · · · • · · · karboxy terminálních aminokyselin pozměněného proteinu tvoří ABRI amyloidovou podjednotku. Protilátky proti ABRI rozpoznávají parenchymální i vaskulární léze v mozku FBD pacientů. ABRI peptid je uložen jako amyloidová vlákna a o výsledných povlacích se předpokládá, že způsobují neuronální dysfunkci a demenci, která charakterizuje FBD (Vídal, R. et al., 1999, Nátuře 399).
Chromogranin A byl zjištěn v některých rozptýlených amyloidových ložiscích a dystrofických neuritech, které je obklopují (Brain Res. 1991, 539: 143-50).
Clusterin/apoJ je gen často v laboratořích izolovaný pomocí rozdílných testů v různých oblastech molekulární biologie, protože je nadexpresován v řade případů degenerativních chorob jako je AD a scarpie (Biochem. J. 1997., 15 nov.; 328(1):4550, Michel D, Chatelain G, North S, Brun G).
CRF (kortikotropin uvolňující faktor) vázající protein váže 41 aa CRF peptid, který je důležitý regulační faktor u stresových reakcí v mozku. Vzhledem k tomu, že většina CRF je vázána CRF vázajícím proteinem, odstranění CRF vázajícího proteinu (imunoterapií) by mohlo vést k zvýšení hladiny volného CRF, což, jak se očekává, by mělo mít pozitivní efekt na AD (Behan, 1997, J. Neurochemistry, 68: 2053-2060).
EDTF (od endothelia odvozený toxický faktor): protein produkovaný mikrocévami u AD pacientů. Je specificky toxický pro neuronové buňky (WO 99/24468).
Proteoglykany heparansulfátu: bylo zjištěno, že jsou umístěny spolu s Αβ u SP. Studie na krysách ukazují, že heparansulfát
• · ·· ·· · · · · » · 0 · · · • · ··· 0 0 · glykosaminoglykan je potřebný při tvorbě amyloidových vláken (Neuron, 1994, 12:219-234 a Acta Neuropathol. 1998, 96:62836) .
Lidský collapsin reakční mediátorový protein-2 je 65kDa protein nalezený v neurofibrilárních zámotcích monoklonální protilátkou. Inkorporace do zámotků může vést k odčerpání rozpustných proteinů a k tvorbě abnormálních neuritických výrůstků a tak k urychlení neuronální degradace (JBC, 1998, 273:9761-8).
Huntingtin (protein Huntigtonovy choroby) U HD je protein Huntingtin N-terminálně rozšířen polyglutaminem. Tato forma Huntingtinu je také nalezena u NFT v AD mozcích a u Pickovy choroby (Exp. Neurol, 1988, 150:213-222).
ICAM-I je akumulován u SP (Acta Neuropathol. 1998, 96:628-36 a Am. J. Pathol. 1994, 144:104-16).
IL 6 je spojen s neurofibrilárními změnami a nachází se
v centru povlaků. Předpokládá se, že je to spouštěč AD. Je
silně znásoben v astrocytech aktivním peptidem 25-35 v Αβ
(Brain Res. 1997, 777:223-227 a Behav. Brain Res. 1996, 78: 37-
41) .
S lysozymem spojený antigen CD68 byl nalezen protilátkou KP-1 u NFT a SP. Lysozymy tak mohou hrát určitou roli při tvorbě zámotků a povlaků (Dement. Geriatr. Cogn. Disord., 1998, 9:1319) .
• · · ·· ·
P21 ras je zapojen jako primární stupeň při rozvoji růstových faktorů a mitogenů pozorovatelných v časném stádiu rozvoje AD (Neuroscience, 1999, 91:1-5).
PLC-delta 1 (fosfolipázový C isoenzym delta 1) se abnormálně akumuluje u NFT a vrstvách povlaků obklopujících neurity. Je intracelulární (Alzheimer Dis. Assoc. Disord, 1995, 9:15-22).
Sérový amyloidový P komponent (SAP) je normální plazmový konstituent, který je přítomen ve všech typech amyloidových ložisek, i v ložiscích, které se objevují u AD (JBC, 1995, 270:26041-4). Je pozorován u SP i u NFT. V některých studiích bylo ukázáno, že podporuje agregaci Αβ a brání proteolýze fibrilů (Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995, 211:349v-53 a PNAS, 1995, 92:4299-4303), zatímco v jiné studii je ukázáno, že SAP inhibuje tvorbu Αβ vláken (JBC, 1995, 270:26041-4).
Synaptophisin byl objeven v některých rozptýlených amyloidových ložiscích a v dystrofických neuritech, které je obklopují (Brain Res. 1991, 539:143-50).
Synuclein (alpha-synuclein nebo NACP): non-A beta komponent AD amyloidu (NAC) byl identifikován biochemicky jako druhý hlavní komponent v amyloidu purifikovaném z mozkových tkání pacientů trpících AD. NAC pochází z jeho 140 aminokyselin dlouhého prekursoru, NACP je dlouhý přinejmenším 35 aminokyselin (NAC35), i když jeho amino konec není definitivně určen. NAC monoklonální protilátky imuno-barví SP v AD mozcích, ale nereagují s NACP (Biochemistry 34 (32):10139-10145 (15. srpen, 1995) Iwai A, Yoshimoto M, Masliah E, Saitoh T). V přítomnosti Αβ tvoří NAC vlastní oligomery. Nová data ukazují na potenciální roli těchto molekul při synaptickém poškození ···· ·· ·· ·· ··· ·
a neurotoxicity prostřednictvím tvorby amyloidům podobných vláken a mitochondriálních dysfunkcí (Brain Pathol. 1999 Oct; 9(4):707-20. FEBS Lett. 1998, 42173-76. Část NACP má vysokou homologii s C-terminálním amyloidovým fragmentem APP a s oblastí scarpie prion protein (PrPSc). Synuclein je hlavní faktor způsobující Parkinsonismus (Chem. Biol. 1995, 2:163-9).
TGF-bl (transformační růstový faktor bl) : Nadexprese TGF-bl mutantním APP u TG myši urychluje ukládání Αβ. O TGF-bl se tak předpokládá, že je zahrnut do iniciace nebo rozvoje tvorby amyloidových povlaků (Wyss-Coray, 1997, Nátuře 389).
Jiné amyloidové choroby a proteiny s nimi spojené
Kromě shora uvedených proteinů, které jsou potenciálně přítomné u AD a AD podobných chorob (Huntigtonova choroba, Parkinsonova choroba, FBD a jiné formy demencí), existuje relativně široká škála nemocí, jiných než AD, kde tvorba amyloidů je zahrnuta při spouštění chorob nebo tvoří symptomy chorob. Bez ohledu na to, že se proteiny mající vztah k těmto chorobám liší v původu, vyznačují se stejnými charakteristickými rysy, které vymezují (definují) amyloid; viz shora uvedený text. Následující tabulka předkládá souhrn těchto amyloidových poruch a proteinů, které je způsobují.
Různorodost amyloidových fibrilárních proteinů
Klinický syndrom
Fibrilární subjednotka Struktura prekursoru
Αβ Všechno β
Cerebrální amyloidová angiopatie (CAA) • 9
• · · • 9 9 • 9 9 9·
9 9 9 9 9
9 9 9 9 ♦ « 99
Mokolonální proteinová systemická (AL) amyloidóza V doména IG lehké řetězce s plnou délkou nebo její fragmenty Všechno
Reaktivní systemická (AA) amyloidóza 76-zbytkový N-terminální fragment amyloidového A proteinu α/β
Familiální amyloidotická polyneuropathie Transtyretinové varianty s plnou délkou nebo jeho fragmenty Všechno
Dědičná ApoAl amyloidóza N-terminální fragmenty («90 zbytků) ApoAl variant (α/β)
Dědičná lysozymová amyloidóza Lysozymové varianty s plnou délkou α + β
Diabetes mellitus typ II 37-zbytkový fragment ostrůvkového amyloidového polypeptidů Neznámá
S insulinom spojený amyloid Divoký typ insulinu s plnou délkou α + β
Transmisní spongioformní encephalophatie Prionový protein s plnou délkou nebo jeho fragmenty a + β
Modulární karcinom tyroidu Fragmenty calcitoninu Neznámá
Senilní systemická amyloidóza Transtyretin s plnou délkou nebo jeho fragmenty Všechno
Amyloidóza spojená s hemodialýzou Divoký typ β-2 mikroglobulinu s plnou délkou Všechno
Izolované atrialní amyloidózy Atrialní natriuretický faktor Neznámá
Dědičná cerebrální amyloidová angiopathie 110-zbytkový fragment varianty cistatinu α + β
Finská dědičná amyloidóza 71-zbytkový fragment variant gelsolinu α/β
Dědičná fibrinogenní a-řetězcová amyloidóza Fragmenty fibrinogenních a-řetězcových variant α/β
·· 0 00 0
0 0 00 0 • 0 0 • · · 4 · • · · · • 0 0 • 0 40« • · 0 0 0 • ··· · · 0 • 0 · 0 4 0 0 • · · 0 0 0 0 ·· 00 00
Tyto proteiny jsou, jako proteiny mající vztah k AD, všechny potenciálními cíly pro imunizační strategii zde navrhovanou.
Očekává se, že většina metod imunizace proti amyloidogenním polypeptidům by měla být omezena na imunizaci, která vyvolává tvorbu protilátek, které křížově reagují s přirozenými amyloidogenními polypeptidy. Nicméně v některých případech bude našim zájmem vyvolat buněčnou imunitu ve formě CTL reakcí proti buňkám, které poskytují MHC třída I epitopy z amyloidgenních polypeptidů - to bude prospěšné v těch případech, kdy redukce počtu buněk produkujících amyloidogenní polypeptidy nemá vážný nepříznivý účinek. V takových případech, kde jsou CTL reakce požadovány, má přednost využití poznatků z přihlášky PCT/DK99/00525 (odpovídající 09/413 186). Poznatky těchto dvou dokumentů jsou do textu vloženy formou citace.
V následujících příkladech, které nijak neomezují rozsah vynálezu, je hlavní důraz kladen na vývoj autovakcíny založené na Αβ proti Alzheimerově chorobě. Principy zde představené jsou však stejně tak použitelné pro jakýkoliv amyloidový protein.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Autovakcinace za účelem imunizace proti AD
Skutečnost, že Αβ protein, který poráží myši, nevykazuje jakékoliv abnormality nebo nepříznivé vedlejší účinky,
4499 • · • 449 • 4
4
4««
4· 44 •• 4 9 4 9
4 444 4 4 4 • ·4 499 9 e • ·4 4 9 99 9 • 4 94 99 99
4449 potvrzuje, že odstranění nebo snížení obsahu Αβ bude bezpečné (Zheng H. 1996).
Publikované pokusy, v kterých jsou transgenní živočiši imunizováni proti transgennímu lidskému Αβ proteinu, podporují domněnku, že kdyby bylo možno zlomit autotoleranci snížením obsahu Αβ, bylo by možno získat autoreaktivní protilátky. Tyto experimenty navíc dovolují očekávat, že taková regulace obsahu Αβ by mohla potenciálně zabránit tvorbě povlaků a dokonce čistit již vytvořené povlaky Αβ z mozku, viz Schenk et al (1999). Avšak obvykle nelze vyvolat tvorbu protilátek proti sobě vlastním proteinům.
Publikované údaje tak neposkytují informace o rozrušení skutečné sobě vlastní tolerance proti skutečným vlastním proteinům. Žádná data neposkytují informace o tom, jak zajistit imunitní reakci namířenou pouze proti nebo hlavně proti Αβ ložiskům, a ne proti buněčným membránám vázajícím Αβ prekursorový protein (APP), když se to považuje za nezbytné. Imunitní reakce vyvolaná použitím existujících technologií by mohla být pravděpodobně vyvolána proti vlastním proteinům neregulovaným způsobem, tak že by se vyvolala nechtěná a nadměrná autoreaktivita proti části Αβ proteinů. Avšak použití existujících imunizačních strategií by většinou bylo nevhodné pro vyvolání silné imunitní reakce vůči sobě vlastním proteinům a navíc by bylo nebezpečné vzhledem k potenciálně silné křížové reaktivitě proti na membrány vázaným APP, které jsou přítomny ve velkém počtu buněk u CNS.
Ve světle uvedených faktů, lze předpovídat, že AD, choroba, která je předurčena k ochromení systému zdravotní
0 0
0400 • 0 4 • 0 000
0 0
0 0
000 •4 4004 • 0 0 • 0 «
0 0 • 0 0 0
00 péče v následujícím století, by mohla být léčena, nebo také že vakcíny, jak jsou zde popsány, by mohli přinejmenším vytvořit efektivní terapeutický nástroj pro ošetřování symptomů a vývoje této nemoci.
Tato technika představuje zcela nový imunologický postup pro blokaci ukládání amyloidů u AD a jiných neurologických chorob.
V následující tabulce je uvedeno 35 zamýšlených konstruktů. Všechny pozice dané v tabulce jsou vztaženy k startovacímu metioninu APP (první aminokyselina v SEQ ID NO:2) a zahrnují startovací a koncovou aminokyselinu 672 a 714. Startovací a koncové pozice pro P2 a P30 označují, že epitop nahrazuje část fragmentu APP v označených pozicích (obě pozice zahrnuté v substituci) ve většině konstruktů zavedené epitopy nahrazují fragment s délkou epitopů. Hvězdička má v tabulce následující význam:
*) Jen jedna pozice pro P2 a P30 označuje, že epitop byl vložen do APP derivátu v označené pozici (epitop začíná u aminokyseliny C-terminálně přiléhající k dané pozici).
**) Konstrukce 34 obsahuje tři identické APP fragmenty oddělené P30 resp. P2.
***) Konstrukce 35 obsahuje devět identických APP fragmentů oddělených střídavě P30 a P2 epitopy.
··* · ···· • · • ·<
» · • ··· • · , • · « *· rt) σ, rt; O) ° 2 qi ω ω m tt) ft) rtj Π rt) rt) rt) ω θ', σι σ. I? tc ffi ω co + + , 2 φ φ io in r· r-r-r > to to to to in in m m ~t P >1 iP
P
Aí
0)
A
O
S (A p A ft < O
P r-t
H (A (0 Φ (0 o (0 n ň (A '<0 ω ρ o Φ •H >N N <Ú O P A N >
co σ> σι <J)
lO LQ 00
LQ LQ CN
ω CD I r-
1 LQ l iQ 1
CQ CQ x—1
CD CD r-
rx—I tH
-X * * X -X
CQ ca CN CN
CN CN γ- X—1 r-
Γ Γ- ιο Γ— co
LQ O LQ O
σ\ O O x—1
ID r- r- Γ-
I t I I
LQ o IQ O
r- 00 CO <5Ί
CD CD CD CD
•X -X -X 4« 4c X X •X
O O o o o o o o
00 σ\ o x—1 00 CTx o x-H
CD CD Γ- Γ— CD CD r- r-
X X cn * *
» cq a
φ x M o <q
CM >1
-P
AJ
P
P p
(fl fi o
AJ
O
P >
O
-P
P (Al
A <
tt) rt!
tt) tí 'rt) tí
Φ >N rtí
P
N >
o O σι co σι CQ X
Γ- Γ- CN CQ CQ O O x—1 X
CD ΙΟ r- Γ- X -X -X X X CD r r- Γ— X -X -X * 4« X 4c X ca
1 I CQ CQ CN I O O O O o o O o O
1 1 1 J CN CN r- X—l χ—1 1 CO CQ O x—1 00 CQ O x—1 Pj »N
CD CD LQ XJ1 Γ- t— CD Γ- r- o LQ o LQ CD CD Γ- r- CD CD r- Γ— fl) M
LQ LQ CQ —1 co CO σ» CQ CQ
CD CD r- r- CD CD CD CD o
CM
Ο'^11θσ0ΟΟΟ’ίΙ1*:ίί'χί1’^*'*:ϊ,’Φ'Φ’?ί1,^3,’,;ΦΜ:Φ’!5,’;ί1’';ί,’!ί,':Φ'Φ'Φ,*ϊΙ<’?ί1·^ί1’^'=ί1'^31
Γ- i—I Γ- Γ— t Γ- Γ— Γ- x—I ,—I i—I x—1 x-1 x—I τΗ x-4 x—i x—I χ-4 x-4 τ—I x~1 x*H x—l x—I x—I r—i t—I x—1 x—I x—1 x—1 x—1 x—l x—I γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ^γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ-γ- r- r~ r— r-
o O CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN
CQ CQ r- r- γ- r- Γ— Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- r- Γ- Γ- r— Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ-
CD CD CD CD ιο CD CD ΙΟ CD CD ΙΟ CD CD ΙΟ ΙΟ CD CD CD CD ιο ΙΟ ΙΟ ιο ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ
>O <x, iri m /τι o ’-ι ν ω vr ld r- co <l o η n m lo > ω ch o η ν (η in (N ( i u) ι ω ui H H H H H H d d H H N cq rQ co
9999 • 9 9
9 999 •9 9
9 9
999
99
9 «
9 999
9 9 9 9
9 9 9
99
9999
9 9
9 9
9 9 9
9 9 9
99
Část APP, proti které je nejzajimavější vyvolat reakci, je aminokyselinový Αβ jaderný peptid (Αβ-43, odpovídající SEQ
ID N0:2, zbytky 672-714), který je hlavní stavebný prvek amyloidových povlaků v AD mozcích. Tento APP fragment tvoří součást všech konstruktů uvedených shora.
Varianty 1 a 2 obsahují část APP proti Αβ-43, kde byly umístěny modelové epitopy P2 a P30. Varianty 1 a 3-8 všechny obsahují C-100 fragment, o kterém se zjistilo, že je neurotoxický - C-100 fragment odpovídá aminokyselinovým zbytkům 714-770 SEQ ID NO:2. Ve variantách 3-5 epitopy nahrazují část C-100 fragmentu, zatímco ve variantách 6-8 byly epitopy vloženy do C-100 fragmentu.
Varianty 9-35 obsahují jen jaderný Αβ-43 protein. Ve variantách 9-13 jsou P2 a P3 sloučeny do konce Αβ-43; ve variantách 14-21 nahrazují P2 a P3 část Αβ-43; ve variantách 22-33 jsou P2 a P30 vloženy do Αβ-43; Varianta 34 obsahuje tři identické Αβ-43 fragmenty proložené P30 resp. P2; Varianta 35 obsahuje 9 Αβ-43 . opakovaně proložených střídavě P2 a P30 epitopy.
Za účelem získání větších podrobností viz obr. 1 a shora uvedená tabulka.
Zvláštní přednost má ještě jeden další typ konstruktu. Protože jedním cílem předkládaného vynálezu je se vyhnout destrukci buněk produkujících APP, zatímco se požaduje odstranění Αβ, zdá se proveditelné připravit autovakcínové konstrukty, skládající se jen z částí Αβ, které nejsou vystaveny extracelulární fázi, když jsou přítomny v APP.
·· ««·· •
• · ··· • · · *· · to· tototo • * ·· ·· · to ··* · · · • to · · · · · ·· · · ·· · ·· ·· ·· • to toto· to
Takové konstrukty by potřebovaly obsahovat přinejmenším jeden B-buňkový epitop odvozený z aminokyselinového fragmentu definováného aminokyselinami 700-714 v SEQ ID NO:2. Protože se o takovém krátkém polypeptidovém fragmentu předpokládá, že by byl jen slabě imunogenní, preferuje se, aby se takový autovakcínový konstrukt skládal z několika kopií B-buňkového epitopů, např. ve formě konstruktu majícího strukturu ukázanou ve vzorci I detailně diskutovaném shora. V oné verzi vzorce I jsou termíny amyloidei-amyloidex x B-buňkový epitop obsahující aminokyselinové sekvence odvozené z aminokyselin 700-714 SEQ ID NO:2. Přednostní alternativou je shora podrobně popsaná možnost svázání amyloidogenního (póly)peptidu a vybraného cizího T-pomocného epitopů prostřednictvím amidové vazby k polysacharidové nosičové molekule - tímto způsobem je možno znásobené poskytnout „slabý epitop tvořený aminokyselinami 700-714 SEQ ID NO: 2 a umožnit vybrat optimální poměr mezi Bbuňkovými a T-buňkovými epitopy.
Příklad 2
Imunizace transgénni myší v souladu s vynálezem
Αβ a modifikovanými proteiny
Konstrukce hAB43+-34 kódujícího DNA hAB43+-34 gen byl konstruován v několika stupních. První PCR fragment byl vytvořen s primery ME#801 (SEQ ID NO:10) a ME#802 (SEQ ID NO:11) za použití primerů ME#800 (SEQ ID: 9) jako templátu. ME#800 kóduje lidský Αβ-43 fragment s E. coli optimizovanými kodony. ME#801 a 802 přidávají do fragmentu vhodné restrikční místa.
• 9 99 · · · « · ·
•9 ·*·· • 9 9 • 9 9·«
9 9 99
PCR fragmenty byly vyčištěny, natráveny Ncol a Hindlll, opětovně přečištěny a klonovány do Ncol-Hindlll, natráveny a byl přečištěn pET28b+ E. coli expresní vektor. Výsledný plasmid kódující divoký typ lidského Αβ-43 byl nazván jako pABl.
V následujícím stupni se T-pomocný epitop P2 přidá k Ckonci molekuly. Primer ME#806 (SEQ ID NO:12) obsahuje sekvenci kódující P2 epitop a tak se vytvoří fúze P2 a Αβ-43 PCR reakcí.
Klonování bylo provedeno vytvořením PCR fragmentu primery ME#178 (SEQ ID NO: 8) a ME#806 za použití pABl ako templátu. Fragment byl přečištěn, natráven Ncol a Hindlll, opětovně přečištěn a klonován do Ncol-Hindlll, natráven a vektor pET28b+ byl přečištěn. Vzniklý plasmid byl nazván jako pAB2.
Analogickým způsobem byl vytvořen další plasmid za získání Αβ-43 kódující sekvence s dalším T-pomocným epitopem P30 přidaným do N-konce. To bylo provedeno vytvořením PCR fragmentu s primery ME#105 (SEQ ID NO: 7) a ME#807 (SEQ ID NO:13) za použití pABl jako templátu.
Fragment byl přečištěn, natráven Ncol a Hindlll, opětovně přečištěn a klonován do Ncol-Hindlll, natráven a vektor pET28b+ byl přečištěn. Vzniklý plasmid byl nazván jako pAB3.
V třetím stupni bylo druhé Αβ-43 opakování přidáno Cterminálně do P2 epitopů plasmidu pAB2 primerem ME#809 (SEQ ID NO:14). ME#809 současně tvoří BamHI místo bezprostředně za Αβ43 opakováním. PCR fragment byl vytvořen s primery ME#178 a ME#809 za použití pAB2 jako templátu. Fragment byl natráven ·· ·♦*· * · ♦ ··» ·· • · ««
Ncol a HindlII, přečištěn a klonován do NcoI-HindlII, natráven a vektor pET28b+ byl přečištěn. Tento plasmid byl nazván jako pAB4.
Závěrem byl P30 epitop - Αβ-43 opakovaná sekvence z pAB3 klonován do pAB4 plasmidu. To bylo provedeno vytvořením PCR fragmentu s primery ME#811 (SEQ ID NO:16) a ME#105 za použití pAB3 jako templátu. Fragment byl přečištěn a použit jako primer v následující PCR reakci s ME#810 (SEQ ID NO:15) za použití pAB3 ako templátu. Vzniklý fragment byl přečištěn, natráven BamHI a HindlII a klonován do BamHI-HindlII, natráven a plasmid pAB4 bol přečištěn. Výsledný plasmid pAB5 kóduje hAB43+-34 molekulu.
Všechny PCR a klonovací materiály byly vytvořeny v podstatě podle způsobů popsaných v Sambrook, J., Fritsch, E.
P. & Maniatis, T. 1989 „Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.
Pro všechna klonování byly použity producentské buňky E. coli K-12, kmen Top-10 F' (Stratagene, USA) . Vektor pET28b+ byl získán od Novagen, USA. Všechny primery byly syntetizovány v DNA Technology, Dánsko.
Exprese a purifikace hAB43+-34 hAB43+-34 protein kódovaný pAB5 byl expresován v BL21-Gold (Novagen) E. coli buňkách, jak je popsáno dodavatelem pET28b+ systému (Novagen).
Expresovaný hAB43+-34 protein byl přečištěn na víc než 85% čistotu promytím inklusních tělísek a následovala kationtová výměnná chromatografie za použití BioCad purifikační jednotky ·· ···· ·· ·· «· ··· • · · · · · · v * · 0·· · · ··· 0 0 · • · ί*· ·· · · 0 ·
9« ·· (PerSeptive Biosystems, USA) v přítomnosti 6 M močoviny.
Močovina byla pak odstraněna stupňovitou dialýzou proti roztoku obsahujícímu snižující se množství močoviny. Koncový pufr byl 10 mM Tris, pH 8,5.
Imunizační studie
Pro studii byly použity myši transgenní pro lidský APP (Alzheimerův prekursorový protein). Tyto myši, nazvané
TgRND8+, expresují mutantní formu APP, což má za následek vysokou koncentraci Αβ-40 a Αβ-42 v mozcích myší (Janus, C. et al.) .
Myši (8-10 myší ve skupině) byly imunizovány buď Abeta-42 (SEQ ID NO:2, zbytky 673-714, syntetizovány prostřednictvím standardní Fmoc strategie) nebo hAB43+-34 variantou (konstrukt 34 z tabulky v příkladě 1, vytvořen rekombinantně) v době dvou týdenních intervalů. Dávky byly stanoveny buď 100 mg pro Αβ nebo 50 mg pro hAB43+-34. Ve dni 43 (po třech injekcích) a po dni 52 (po čtyřech injekcích) byla z myší odebrána krev a séra byla použita na stanovení hladiny anti-Ap-42 specifických titrů použitých pro přímou Αβ-42 ELISA.
Následující tabulka ukazuje průměrné relativní anti-Abeta42 titry.
Imunogen Den 43 (po 3 imunizacích) Den 52 (po 4 imunizacích)
Αβ-42 4000 3000
HAB43+-34 16000 23000
Jak je jasné z tabulky, titry protilátek získané imunizací hAB43+-34 Αβ variantou jsou přibližně 4 krát a 7,5 krát vyšší po 3 a 4 imunizacích než titry získané nezměněným divokým typem Αβ-42 jako imunogenem. Tento fakt je perspektivní, když se uváží, že množství varianty použité pro imunizaci tvořilo jen 50% množství sekvence divokého typu použité pro imunizaci.
Příklad 3
Syntéza Αβ peptidové kompolymerové vakciny za použití aktivovaného polyhydroxypolymeru jako zesítěného činidla
Úvod
Tradiční konjugátová vakcina se skládá z (póly)peptidu vázaného kovalentně na nosičový protein. Peptidy obsahují Bbuňkoyý epitop(y) a nosičový protein zajišťující T-pomocné epitopy. Avšak většina nosičových proteinů je běžně nevhodná jako zdroj pro T-pomocné epitopy, protože pouze malá část celkové sekvence obsahuje vhodné T-pomocné epitopy. Takové epitopy mohou být definovány a syntetizovány jako peptidy s např. 12-15 aminokyselinami. Když jsou tyto epitopy připojeny kovalentně na peptidy obsahující B-buňkové epitopy, např. prostřednictvím multivalentných aktivovaných polyhydroxypolymerů, může být získána molekula vakciny, která obsahuje pouze odpovídající části. Je dále možno vytvořit vakcínový konjugát, který obsahuje optimalizovaný poměr mezi B-buňkovými a T-buňkovými epitopy.
Syntéza aktivovaného polyhydroxypolymeru
Polyhydroxypolymery jako je dextran, škrob, agarosa apod.
mohou být aktivovány 2,2,2-trifluorethansulfonylchloridem (tresylchloridem) buď prostřednictvím homogenní syntézy (dextran rozpuštěný v N-metylpyrrolidinonu (NMP) nebo heterogenní syntézou (škrob, zesítěný dextran) například v acetonu.
225 ml suchého N-metylpyprolidinonu se přidá v suchých podmínkách k vymraženému, ve vodě rozpustnému dextranu (4,5 g, 83 mmol, klinická čistota, Mw(průměrně) 78000) v 500ml nádobě s kulatým dnem vybavené magnetickým míchadlem. Nádoba se uloží při 60°C do olejové lázně opatřené magnetickým míchadlem.
Teplota se zvýší na 92°C na dobu 20 minut. Když se dextran
rozpustí , nádoba se okamžitě vyjme z olej ové lázně a teplota
v lázni se sníží na 40°C. Nádoba se potom vloží do míchané
olejové lázně- a po kapkách se přidá tresylchiorid (2,764 mi, 25 mmol). Po 15 minutách se přikapá pyridin (bezvodý, 2,020 ml, 25 mmol). Nádoba se vyjme z olejové lázně a míchá ještě 1 hodinu za teploty místnosti. Produkt (tresylový aktivovaný dextran, TAD) se vysráží v 1200 ml chladného ethanolu (99,9%). Supernatant se dekantuje a sraženina se sklidí v 50 ml polypropylénových zkumavkách centrifugací při 2000 otáčkách/min. Sraženina se rozpustí v 50 ml 0,5% kyselině octové, dialyzuje 2 krát proti 5000 ml 0,5% kyseliny octové a vymrazí. TAD může být skladován jako vymražený prášek při -20°C.
Nerozpustný polyhydroxypolymer jako je agarosa nebo zesítěný dextran mohou být aktivovány tresylem vytvořením suspenze polyhydroxylpolymeru například v acetonu a provedením syntézy jako je syntéza na pevné fázi. Aktivovaný polyhydroxypolymer může být sebrán filtrací. Vhodné metody jsou popsány např. v Nilsson K. a Mosbach K. (1987) Methods in Enzymology 135, str. 67 a v Hermansson G.T. et al. (1992) a v „Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academie Press, lne., str. 87 .
• · ·
Syntéza A beta peptidových kopolymerových vakcín
TAD (10 mg) se rozpustí v 100 μΐ H2O a 1000 μΐ uhličitanového pufru, pH 9,6, obsahujícího 5 mg Αβ-42 (SEQ ID N0:2, zbytky 673-714) a přidají se 2,5 mg P2 (SEQ ID NO:4) a 2,5 mg P30 (SEQ ID NO:6). Αβ-42 a P2 a P30 peptidy obsahují chráněné lysinové skupiny: ty jsou ve formě 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyklohex-l-yliden)ethylu (Dde) chráněných lysinových skupin. Peptidy se připraví prostřednictvím standardního Fmoc postupu, kde běžný Fmoc-Lys(Boc)-OH je substituován FmocLys(Dde)-OH (získán od Novabiochem, kat. č. 04-12-1121), tzn. že ε-aminoskupina v lysinu je chráněna Dde namísto Boc.
Hodnota pH se měří a upravuje na 9,6 použitím 1 M HCl. Po 2,5 hodinách se za teploty místnosti přidá hydrazin z 80% roztoku do konečné koncentrace 8% a roztok se inkubuje dalších 30 minut za teploty místnosti a pak ihned vymrazuje. Vymražený produkt se rozpustí v Hro a dialyzuje proti H2O před konečným vymrazováním.
Poměr mezi B-buňkovými epitopy (Αβ) a T-pomocnými epitopy (P2 a P30) ve finálním produktu se může měnit použitím různých koncentrací těchto peptidů v tomto stupni syntézy. Navíc může být finální produkt označen např. manosou (jako cíle konjugace k APC) přidáním aminované manosy k uhličitanovému pufru v syntetickém stupni.
Když je pro epitop a T-pomocný polyhydroxypolymer, syntézou na pevné promytím a filtrací.
slučování peptidů obsahujících B-buňkový epitop použit nerozpustný aktivovaný připojení polymeru může být realizováno fázi a koncový produkt se sbírá a čistí • · ·· ···
Seznam literatury
Brookmeyer,' R.; Gray, S.; Kawas, C. (1998). Projections of Alzheimer’s
Disease in the United States and the Public Health Impact of Delaying
Disease Onset. American Journal of Public Health, 88(9), 1337-1342.
Buttini, M-; .Orth, M..; Bellosta, S.; Akeefe,· H.; Pitas,' R.E.; Wyss-Coray, . T.; Mucke, lZ; -Mahley, R.W. ' (1999) . Expression, pf Human. Apolipoprotein E3 or E4 in the Brains of Apoe-/- Mice.: 'Isof orm-Specific Effects on Neurodegeneration. Journal of Neuroscience, 19, 4867-4880.
Clark, L.N.,; Poorkaj, P.; Wszolek, Z.; Geschwind, D.H.; Nasreddine, Z.S.; Miller,'B.; Li, D. ; Payami, H. ; Awert, F.; Markopoulou, K. Andreadis, A.; D'Souza, I.; Lee, V.M.; Reed, L.; Trojanowski, J.Q.; Zhukareva, V.; Bird,
T.; Schellenberg, G.; Wilhelmsen, K.C. (1998). Pathogenic Implications of Mutations in the Tau Gene in Pallido-Ponto-Nigral Degeneration and Related Neurodegenerative Disorders Linked to Chrompsome 17. Proceedings of the National Academy óf Sciences U.S.A., 95(22), 13103-13107.
Gupta, R. K. et. ai (1998), Dev Biol Stand. 92: 63-78........ - Hsiao K. et al. (1998) Transgenic mice expressing Alzheimer amyloid precursor proteins, Exp. Gerontol. 33 (7-8), 883-889 ,·
Hutton, M.; Lendon, C.L.; Rizzu, P.; Baker, M.; Froelich, S-; Houlden, H.; Pickering-Brown, S.; Chakraverty, S.'; Isaacs, A.; Grover, A.; Hackett,· J.·; Adamson, J-; Lincoln, S.; Dickson, D.; Dávies, P.; Petersen, R.C.; Stevens, M,; de Graaff, ,E.; Wauters, E. ; van Baren, J.,- Hillebrand, M.; Joosse, M. Kwon, J.M.; Nowotny, P.; Che, L.K.; Norton, J.; Morris, J.C.; Reed, L.E. ;
Trojanowski, J.; Basun, H.; Lannfelt, Ls ; Neystat., M. ; Fahn, S.; Dark, F. ;·
Tannenberg, T. ; Dodd, P.; Hayward, N.; Kwok, J.B.J.; Schofield, P.R. ;
' Andreadis, A.,· Snowden, J.; Craufurd, D.; Neary, D.; Owen, F.; Oostra, B.A.;'Hardy, J. ; Goate, A.,- van Swieten, J.; Mann, D.; Lynch, T.; Heutink, : P. (1998) . Association of Missense and 5'-Splice-Site Mutations in Tau with the Inherited Dementia FTDP-17. Nátuře, 393, 702-705.
Janus, C. et. al. (2000), Nátuře 408: 979 - 982.
' Kas, H.S. (1997) J Microencapsul 14: .689-711
Leon, J.·; Cheng, C.K.; Neumann, P.J. (1998). Alzheiraer's Disease Care:
Costs and Potehtial Savings. Health Affairs, 17(6), 206-216.
' I
Lippa C. F. et al. (1999) Ab-42 deposition precedes other changes in PS-1 Z Alzheinver’ s disdase, Lancet .352, 1117-1118
Luo, J.-J.; Wallace, W.; Riccioni, T.; Ingram, D.K.; Roth,.G.S.; Kusiak,
J.W. (199-9) . Death of PC12 Cells and Hippocampal Neur.ons Induced by Adenoviral-Media.ted_FAD Human Amyloid Precursor Protein Gene Expression. Journal of Neuroscience Research, 55(5), 629-642.
Naruse, S. ; Thinakaran, G.; Luo, J.-J,; Kusiak, J.W.; Tomita, T.'; Xwatsubo,
T.; Qian, X.; Ginty/ D.D.;-Price, D.L.; Borchelt, -D.R.; Wong, P.C.;
Sisodia, S.S. (1998). Effects of PSI Deficiency on Membrane Protein : Trafficking in. Neurons. Neuron, 21(5), 1213-1231.
• · · · · • · • · · · • · ·
National Institute on Aging. Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999, NIH· Publication No. 99-4664.
Pietrobon, P.J. (1995), Pharm Biotechnol. '6: 347-61Poorkaj, P.; Bird, TLD.; Wijsmah, E.; Nemens, E./ Garruto, R.M.; Anderson, L.; Andreadis, A.; Wiedérhold, W.C.; Raskind, M. ; Schellenberg, G.D. (199S). Tau ls a Čandidate Gene for Chromosome 17 Frontotemporal Dementia. Annals of Neurology, 43, 815-825.
Schenk, D.; Barbour, R-; Du-nn, W.; Gordon, G-; Grajeda, H. ; Guido, T-; Hu,
K.; Huang, J. ; Uohnson-Wood, · K. ; Khan, K.; Kholodenko, D.; Lee,, M.; Liao,
Z.; Lieberburg, I.; Motter, R.; Mutter', L.; Soriano, F. ; Shopp, G.;
Vasquez) N.;' Vandevert, C,; Walker, S.Wogulis, M.; Yednock, T. ; Games,
D. ; Seubert, P. (1999). Inununization with A-beta Attenuates Alzheimer's .Disease-Like Pathology in the PDAPP Mouše. Nátuře, 400(6740), 173-177.
Shekunov, B. et. al. (1999), J. Crystal Growth 198/199: 1345 - 1351.
Spíllarítini, M.G.; Murrell, O.R..; Goedert, M.; Farlow, M.R.; Klug, A. ; Gnetti, B. (1990). Mutation in the Tau Gene in.Familial Multiple System Tauopathy with Presenile Dementia. Proceedings of the National A.cademy of .. Sciences U.S.A., 95(13)., 7737-7741.
Strittmatter,· W.J.; Sabnders, A.M.; Schmechel, D.; Pericak-Vance, M.; Enghild, <T.; Salvesen, G.S.; Roses, A.D. (1993).· Apolipoprotein E: High-Avidity Binding to Αβ and Increased Frequency of Type 4 Allele inLate-Onset Familial Alzheimer Disease. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 90,1977-1981,
Vídal, R.; Frangione, B.,- Rostagno, A.; Mead, S.; Revesz, T.; Plant,' G. ; Ghiso, D. (1999). A Stop-Codon Mutation in the BRI Gene Associated with Familial British Dementia. Nátuře, 399: 776-781..
Zheng H. (1996) Mice deficient for the amyloid precur.sor protein gene.
Άηη. N Y.Acad. Sci., 777, 421-426.
York, P. (1999), PSTT 11: .430-440 • · · · « · · · · * • · ··· · · · • · · · · · · · • · · • · · ·· « · ·· ··*
Seznam sekvencí <110> M&E Biotech A/S <120> Nová metoda regulace obsahu amyloidů <130> P1009PC1 <140>
<141>
ř <160> 16 <170>.Patentln Ver. 3.0 <210> 1 <211> 2313 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(2313) <220>
<221> různá charakteristika <222> (2098)..(2169) <223> Nukleotidy kódující transmembránový region <220>
<221> různá charakteristika <222> (2014)..(2313) <223> Nukleotidy kódující C-100 <220>
<221> různá charakteristika <222> (2016) . . (2144) <223> Abeta 42/43 <220>
99 9
9999 <221> různá charakteristika <222> (2014) .. (2142) <223> Abeta 42/43 <400> 1
atg' Met 1 ctg Leu CCC Pro ggt Gly ttg Len 5 gca Ala ctg Leu ctc Leu ctg Leu ctg gcc Leu Ala 10 gcc Ala tgg Trp acg gct cgg Thr-Ala Arg 15 48 '
gcg ctg gag gta ccc· act gat ggt aat gct ggc ctg ctg gct gaa ccc 96
Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro
20 25 30
cag att gcc atg ttc tgt ggc aga ctg aac atg cac atg aat gtc cag/ 14 4
Gin: Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gin
35 40 45
aat ggg aag tgg gat tca gat cca tca ggg acc aaa acc tgc att gat 192
Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp
50 55 60
acc aag gaa ggc atc ctg cag tat tgc caa gaa gtc tac cct gaa ctg 240'
Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gin Tyr Cys Gin Glu Val Tyr Pro Glu Leu
65 70 75 80
cag atc acc aat gtg gta gaa gcc aac caa cca gtg acc atc cag aac 288
Gin Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gin Pro Val Thr Ile Gin Asn
·· 85 90 95
tgg tgc aag cgg ggc cgc aag cag tgc aag acc cat CCC cac ttt gtg 336
•Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gin Cys Lys Thr His Pro His Phe Val
“ίσο 103 110 -
att ccc tac cgc tgc tta gtt ggt gag ttt gta agt gat gcc ctt ctc 384
Ile Pro Tyr Arg cys Leu Val Qiy Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu
115 120 125
gtt cct gac aag tgc aaa ttc tta cac cag gag agg atg gat gtt tgc 432
Val .Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gin Glu Arg Met Asp Val cys
130 135 140
I ·· • · • ·♦· » · « • · ·· ···· > · · • · ·· ·» · ·· · gaa act cat. ctt cac tgg cac acc gtc gcc aaa gag aca tgc agt gag Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160
480
aag agt acc aac ttg cat gac tac ggc atg‘ ttg ctg CCC tgc gga att
Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Tle
165 170 175
gac aag ttc ega ggg;·. gta gag ttt gtg tgt tgc cca ctg gct gaa gaa
Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu
180 185 190
agt gac aat gtg gat tet gct gat gcg gag gag gat gac tcg gat gtc
Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val
195 200 205
tgg tgg ggc gga gca gac aca gac tat gca gat ggg agt gaa gac aaa ·
Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys
210 215 220
gta gta gaa gta gca gag gag gaa gaa gtg gct gag gtg gaa -gaa gaa
Val Val Glu Val' Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu
225 230 235 240
gaa gcc gat gat gac gag gac gat gag gat ggt gat gag gta gag gaa
Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu
.A 245 250 255
gag gct gag gaa ccc tac gaa gaa gcc aca gag aga acc acc age att
Glu Ala Glu ‘Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile
-2-6©-- -- -· - -2-6-5- •2-7©--
gcc acc acc acc acc acc acc aca gag tet gtg gaa gag gtg-gtt ega
Ala Thr Thr .Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg
275 280 285
gag gtg tgc tet gaa caa gcc •gag acg ggg ccg tgc ega gca atg atc
Glu Val Cys Ser Glu Gin Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile
290
295
300
528
6
624
672
720
768
816
864
912 • · • ·· ·
9
999
9 ’ ···· • 9 ♦ 999
tcc cgc tgg · tac ttt gat gtg act gaa 4 ggg aag tgt gcc cca ttc ttt 960
Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe
305 310 315 320
tac ggc 'gga tgt ggc ggc aac cgg aac aac ttt gac aca gaa gag tac 1008
Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe As.p Thr Glu. Glu Tyr
325 330 335
tgc atg gcc gtg tgt, ggc age gcc atg tcc esa agt tta ctc aag act 1056'
Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gin Ser Leu Leu Lys Thr
340 345 350
acc •cag gaa cct ctt gcc ega gat cct gtt aaa ctt cct aca aca gca'. 1104
Thr Gin GlU Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala
355 360 365 •
gcc agt acc cct gat gcc gtt gac aag tat ctc gag aca cct ggg gat 1152
Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val' Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp
370 375 380
gag aat gaa cat gcc cat ttc cag aaa gcc aaa gag agg ctt gag gcc 1200
Glu Asn Glu His Ala His Phe Gin Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala .
385 390 395 400
aag cac ega gag aga atg tcc cag gtc atg aga gáa tgg gaa gag gca 1248
Lys Bis Arg Glu Arg Met Ser Gin Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala
• 405 410 415
gaa cgt caa gca aag aac ttg cct aaa gct gat aag aag gca gtt atc 1296
Glu Arg Gin Ala Lys Asn Léu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile
·- . ... <L2Q. - -4.25 . .... .. _ • 430-
cag cat ttc cag gag aaa gtg gaa tet ttg gaa cag gaa gca gcc . aac 1344
Gin His Phe Gin Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gin Glu Ala Ala Asn
435 440 445
gag aga cag cag ctg gtg gag aca cac atg gcc aga gtg gaa gcc atg 1392
Glu Arg Gin Gin Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met
450 .4 55 460
•V • ··· • · * » ···· • · ··♦ ·» · ·· ·
ctc aat gac Asp cgc Arg cgc Arg cgc ctg Arg Leu 470 gcc Ala ctg Leu gag aac tac atc acc gct Ala ctg Leu 480 1440
Leu 4 65 Asn Glu Asn 475 Tyr Ile Thr
cag gct gtt cct cct cgg cct cgt cac gtg ttc aat atg cta aag aag 1486
Gin Ála Val Pro. Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu •Lys Lys
485 490 4 95
tat gtc cgc gca gaa·. cag aag gac aga cag cac acc cta aag cat ttc 1536
Tyr Val. Arg Ala G1U Gin Lys Asp Arg Gin His Thr Leu Lys His Phe
500 505 510
'ga? cat gtg cgc atg gtg gat ccc aag aaa gcc gct cag atc cgg tcc . 158 4
Glu' His Val Arg Meť Val· Asp Přó Lys Lys Ala Ala Gin Ile Arg Ser
515 520 525
cag gtt atg aca cac ctc cgt gtg att tat gag cgc atg aat cag tet 1632
Gin Val Met Thr His Leu Arg Vál Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gin Ser
530 535 540
ctc tcc ctg ctc. tac aac gtg cct gca gtg .gcc gag gag att cag gat 1680
Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gin Asp
545 550 555 560
gaa gtt gat gag ctg ctt cag aaa gag caa aac tat tea gat gac gtc 1728
Glu Val Asp Glu Leu Leu Gin Lys Glu Gin Asn Tyr Ser Asp Asp Val
565 570 575
ttg gcc aac atg att agt gaa cca agg atc agt tac gga aac gat gct 1776
Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala
533. 535- 59Ό-
ctc. atg cca tet ttg acc gaa acg aaa acc acc gtg gag ctc ctt CCC 1824
Leu Met Pro Se.r Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro
595 600 605
gtg aat gga gag ttc age ctg gac gat ctc cag ccg tgg cat tet ttt 1872
Val Asn •Gly Glu . Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gin Pro Trp His Ser Phe
610 615 620
·· ··♦« • · • ··♦ • · ·· ·· *· ·· • * • » ·
• · ♦ · ·♦
ggg gct gac tet gtg cca gcc aac aca gaa aac gaa gtt gag c ct gtt 1920
Gly Ala Asp Ser val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val
625 630 635 640
gat gcc cgc cct gct gcc gac ega gga ctg acc act ega cca ggt tet 1968
Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr- Thr 'Arg Pro Gly Ser
645 650 655
ggg ttg' aca aat atc’. aag acg gag gag atc tet gaa gtg aag atg gat 2016
Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Tle Ser Glu Val Lys Met Asp
660 665 670
gca gaa ttc ega cat gac tea gga tat gaa gtt cat cat caa aaa ttg • 2064
Ala Glu Phe Arg His Asp Ser ciy Tyr' Glu Val His His Gin Lys Leu
675 680 685
gtg ttc ttt gca gaa gat gtg ggt tea aac aaa ggt gca atc att gga 2112
Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly
690 695 700
ctc atg gtg ggc ggt gtt gtc ata gcg aca gtg atc gtc atc acc ttg 2160
Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu
705 710 715 720
gtg atg ctg aag aag áaa cag tac aca tcc att cat cat ggt gtg gtg 2208
Val Met Leu Lys Lys lys Gin Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val
725 730 735
' gag gtt gac gcc gct gtc acc cca gag gag cgc cac ctg tcc aag atg 2256
Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met
- -7-4Θ—· . 6M-5- - - -•7-5-6 -
cag cag aac ggc tac gaa aat cca acc tac aag ttc ttt gag cag atg . 2304
Gin Gin Asn Gly Tyr Glu Asn· Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gin Met
755 7 60 7 65
cag aac tag Gin Asn
770
2313 ·« ·· ( · ·
I · ··»
I · · <
*· ·*«· ·* · ·♦ · </· ’α • « • ··« ·« ··♦ ··
<210> 2
<211> 770
<212> PRT
<213> Hómo sapiens
<400>'2
Met 1 Leu' Pro Gly Leu 5-, Ala Leu Leu Leu
Ala Leu Glu Val /θ Pro Thr Asp Gly Asn 25
Gin Ile Ala 35 Met Phe Cys Gly’ Árg 40 Leu
Asn Gly 50 Lys Trp Asp Ser Asp 55 Pro Ser
Thr 65 Lys Glu dy Ile Leu 70 Gin Tyr Cy.s
Gin Ile Thr Asn Val 85 Val Glu Ala Asn
Trp Cys Lys Arg 100 Gly Arg Lys Gin Cys 105
Ile Pro Tyr 115 Arg Cys Leu Val Gly 120 Glu
Val Pro 130 Asp Lys Cys •Lys Phe 135 Leu His
Glu 145 Thr His Leu His Trp 150 His Thr Val
Lys Ser Thr Asn Leu 165 His Asp Tyr Gly
Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 10 15
Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 30
Asn Meť His Met Asn Val Gin 45
Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp .60
Gin Glu Val Tyr Pro Glu Leu 75 80
Gin Pro Val Thr Ile Gin Asn 90 · 95
Lys -Thr His Pro His Phe Val 110
Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 125
Gin Glu Arg Met Asp Val Cys 140
Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 155 160
Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile 17.0 175
9111
9 9 · · ··
1 · * • 9 .·
111 ·ι
11
1111
1 1 · 1 11 · ♦9 *· «9 *
111
9 · ·
9 9 · ιι ιι
Asp' Lys •Phe Arg 180 Gly Val Glu Phe Val 185 Cys Cys Pro Leu Ala 190 Glu Glu
Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val
195· 20.0 205
Trp Trp' Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys
210 215 220
Val Val. Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu
225 230 235 240
Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu
245- 250 255
Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile
260 265 270
Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr· Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg
275 280 285
Glu Val cys Ser Glu Gin Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile
290 295 300
Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys cys Ala Pro Phe Phe
305 310 315 320
Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr
325 330 335
CystMet—Ala. -Val. -Cya. .-Gly- .Ser-flla. Mř>+- Ssr -Gin. .Ser Leň .Leu T,y<? -Thr.
340 345 350
Thr Gin Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Lpu Pro Thr Thr Ala
'355 360 365
Ale Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp
370 375 380
• to • · • · • · toto • toto· • toto • · ♦ toto' • to
• to ·*♦ • · • · • to to to* to to* to • «
Glu Asn Glu His Ala His Phe Gin Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala
385 390 395 400
Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gin Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala
405 410, 415
Glu Arg Gin Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Tle
4-20 425 430
Gin His. Phe Gin Glu' Lys Val Glu Ser Leu Glu Gin Glu Ala Ala Asn
435 440 445
Glu Arg Gin G.ln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met
450 4 55 4 60
Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu
4 65 470 4 75 48 0
Gin. Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys
485 490 4 95
Tyr Val Arg Ala Glu Gin Lys Asp Arg Gin His Thr Leu Lys His Phe
500 505 510
Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gin Tle Arg Ser
515 520 52.5
GÍn Val Met Thr ' His Leu Arg Val Tle Tyr Glu Arg Met Asn Gin Ser
530 535 540 . —Lgu-Sec-Le»-J->eu Ty r-Asn..Val.Pro-Ala Val Ala Gin Glň
545· 550 555 560
Glu Val Asp Glu Leu Leu Gin Lys Glu Gin Asn Tyr Ser Asp Asp Val
565 570 575
Leu Ala Asn Met Tle Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala
580 585 590
«· ·«·· »·· • <
Leu Met Pro 595 10
Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro
600 605
Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gin Pro Trp His Ser Phe
610 615 Λ 620
.Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val
•625 * . 630 635 64 0
Asp Ala Arg Pro Ala' Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser
645 650 655
Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp
660 665 670
Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu
675 680 685
Val Phe Phe Ala Glu Asp Val •Gly Ser Asn Lys Gly Ala ile Ile Gly
690 695 700
Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu
705 710 715 720
Val Met Leu Lys Lys Lys Gin Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val
725 730 735
Glu Val Asp Ala 'Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met
740 745 750
-G-ln Gla—Asn—G-l-y—Tyr-Gl-u- Asn—Ego—Thr—Tyr—Lys—gha—Ehe-Glui-GI n. M<=»r .755 760 765
Gin Asn 770 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Clostridiura tetani *· ·*·· *· ««»· ·· ·· « · · · · · • ·.·· · ·«·· • · « · · · .· • · · ·. · · ·· ··«' »· ·· <220>
<221> CDS <222> (1)..(45) <223> DNA kódující P2 epitop <400> 3
cag tac atc a-aa get aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg
Gin Tyr Ile Lys Ala, Asn S-er Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
•1 5' 10 15
<210> 4 <211> 15 ....... ........ · .....
<212> PRT <213> Clostridiuin tetani <400> 4
Gin Tyr ile lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1· 5 10 15 <210> 5 <211> 63 <212> DNA <213> Clostridiuin tetani :<220>
<221> CDS <222> (1). . (63) <223> DNA kódující P30 epitop •<400> 5 ttc aac aac ttc acc gta age ttc tgg ctg cgt gtt ccg aaa gtt age -48 phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 «««·
Φ* ·» ♦*··
Φ · ··· · · ··· « · 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9
9 99 99 99 get age cac ctg gaa Ala Ser.His Leu Glu <2l'0> 6.
<211> 21 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 6
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro'Lys Val'Ser 1 5 10 15
Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 7 <211> 21 <212> . DNA <213> Syntetická <400> 7 caactcagct tcctttcggg c <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Syntetická · _e_ . ...... __ _ agatetegat cccgcgaaat t <210> 9 <211> 135 <212> DNA <213> Syntetická <400> 9 atggatgcag aattccgtca cgactccggt tacgaagttc accaccagaa actggttttc »· ·«·· ·· ·» ·· ··»« «·· »· »· » • · ··· · « «·· » · · »· · · » a ·· * · * · * • · « ·*·· · · · · ·· ··« ·· ·· . ♦· »· ttcgcagaag atgttggttc caacaaaggt gcaatcatcg gtctgatggt tggcggtgtt gttatcgcga cctag
120
135 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Syntetická
39
DNA
Syntetická <400> -10 gccggccatg gatgcagaat tccgtcacga c 31 <210>
<211>
<212>
<213>
<400>
gccggaagct tctaggtcgc gataacaaga ccgccaacc 39 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Syntetická <400> 12 ccggcaagct tctacagctc ggtgataccg atgaatttgg agttagcttt gatgtactgg. 60 gtcgcgataa caa'caccgcc aacc 84
-1-9-1-........
DNA áyhtetická <21.0>
<212>
<213>
<400> 13 gccggccatg ggtttcaaca acttcaccgt tagcttctgg ctgcgtgttc cgaaagttag cgcgagccac ctggaagatg cagaattccg tcacgactcc g
101 <210> .14 <211> ' 172 ·« flflflfl • · · • · flflfl fl · .· • · · flfl flflfl flfl flfl • flfl • fl flflfl • · flfl · • · · fl • fl flfl • fl flfl·· * fl · • · · • flfl · • flfl · • fl flfl
<212> DNA
<213> Syntetická
<400> 14
gggccaagct tggatccggt cgcgataaca acaccgccaa ccatcagacc gatgattgca .60
cctttgttgg aaccaacatc ttctgcgaag aaaaccagtt tctggtggtg aacttcgtaa 120
ccggagtcgt. gacggaactc tgcatccagc tcggtgatac cgatgaattt gg 172
<210> 15
<211> .30
<212> DNA
<213> Syntetická
<400> 15
ctggaagatg cagagttccg tcacgactcc 30
<210> 16
<211> 35 . -
<212> DNA
<213> Syntetická
<4O0> 16
gcgccggatc cttcaacaac ttcaccgtta gcttc

Claims (41)

1. Použití
a) alespoň jednoho analogu autologního Αβ nebo APP polypeptidů živočicha, do něhož je zaveden alespoň jeden isolovaný cizí T helper epitop (Th epitop) prostřednictvím inserce, adice, delece nebo substituce aminokyseliny, přičemž cizí Th epitop se zavede do autologního Αβ nebo APP polypeptidů tak, jak je to schematicky znázorněno pro P2 a P30 epitopy na obr. 1,
b) alespoň jednoho polyhydroxypolymerového nosičového hlavního řetězce, k němuž je odděleně kopulován alespoň jeden izolovaný cizí Th epitop a alespoň jeden peptid odvozený od autologního Αβ nebo APP peptidu živočicha,
c) sekvence nukleové kyseliny kódující alespoň jeden analog definovaný v odstavci a) nebo
d) nepathogenního mikroorganismu nebo viru nesoucího fragment nukleové kyseliny definovaný v odstavci c) pro výrobu léčiva pro negativní regulaci Αβ nebo APP peptidu u živočicha, v němž je Αβ nebo APP peptid autologní.
2. Použití podle nároku 1, kde zavedení má za následek, že se zachová podstatný podíl epitopů Αβ nebo APP polypeptidů B-buňky a že
- se zavede alespoň jeden první zbytek, který vyvolá zaměření analogu na buňku prezentující antigen (APC) nebo B-lymfocyt a/nebo
- se zavede alespoň jeden druhý zbytek, který stimuluje imunitní systém a/nebo
- se zavede alespoň jeden třetí zbytek, který optimalizuje prezentaci analogu imunitnímu systému.
04 0000
0 0 0 • 0 000
0 0 4
04 040
000 000
0 0 0 4
00 ·0
3. Použití podle nároku 2, kde analog se modifikuje zavedením prvního a/nebo druhého a/nebo třetího zbytku připojením ke vhodné chemické skupině v Αβ, APP polypeptidu nebo jeho subsekvenci prostřednictvím kovalentní nebo nekovalentní vazby.
4. Použití podle některého z předchozích nároků, kde zavedení substituce a/nebo delece a/nebo inserce a/nebo adice aminokyseliny má za následek podstatné zachování celkové terciární struktury Αβ nebo APP polypeptidu.
5. Použití podle některého z předchozích nároků, kde analog zahrnuje duplikaci alespoň jednoho epitopu B-buňky Αβ nebo APP polypeptidu a/nebo zavedení haptenu.
6. Použití podle některého z předchozích nároků, kde cizí T-buněčný epitop je v živočichovi imunodominantní.
7. Použití podle některého z předchozích nároků, kde cizí T-buněčný epitop je promiskuitní, jako je tomu u cizího T-buněčného epitopu zvoleného z přírodního promiskuitního T-buněčného epitopu a umělé MHC-II vazebné peptidové sekvence.
8. Použití podle nároku 7, kde přírodní T-buněčný epitop je zvolen z toxoidního epitopu tetanu, jako je P2 nebo P30, toxoidního epitopu záškrtu, hemagluttininového epitopu chřipkového viru a CS epitopu P.falciparum.
9. Použití podle některého z nároků 2 až 8, kde první zbytek je v podstatě specifickým vazebným partnerem pro B-lymfocyt specifický povrchový antigen nebo pro APC specifický povrchový ······ · · ·· ···· • · · ·· ·· ·· · ····· · · ·· · antigen, jako je hapten nebo sacharid, pro nějž existuje receptor v B-lymfocytu nebo APC.
10. Použití podle některého z nároků 2 až 9, kde druhý zbytek je zvolen z cytokinů, jako je interferon gamma (IFN-gamma) nebo jejich účinná část, Flt3L nebo jeho účinná část, interleukin 1 (IL-1) nebo jeho účinná část, interleukin 2 (IL-2) nebo jeho účinná část, interleukin 4 (IL-4) nebo jeho účinná část, interleukin 6 (IL-6) nebo jeho účinná část, interleukin 12 (IL-12) nebo jeho účinná část, interleukin 13 (IL-13) nebo jeho účinná část, interleukin 15 (IL-15) nebo jeho účinná část, faktor stimulující granulocyt - makrofágové kolonie (GM-CSF) nebo jeho účinná část, hormon, protein tepelného šoku, jako je HSP70 nebo jeho účinná část, HSP90 nebo jeho účinná část, HSC70 nebo jeho účinná Část, GRP94 nebo jeho účinná část a kalretikulin (CRT) nebo jeho účinná část.
11. Použití podle některého z nároků 2 až 10, kde třetí zbytek má lipidickou povahu, jako palmitoylskupina, myristylskupina, farnesylskupina, geranyl-geranylskupina, GPI-kotevní skupina, N-acyldiglyceridová skupina nebo kde třetím zbytkem je polyhydroxypolymer, jako polysacharid.
12. Použití podle nároku 11, kde polysacharid slouží jako nosičový hlavní řetězec, k němuž je odděleně připojen Αβ odvozený nebo APP odvozený peptid a cizí T-buněčný epitop.
13. Použití podle nároku 12, kde Αβ nebo APP odvozený peptid nebo cizí T-buněčný epitop jsou vázány amidovou vazbou k polysacharidů.
14. Použití podle některého z předchozích· nároků, kde autologní Αβ nebo APP polypeptid je modifikován tak, aby zachoval B-buněčné epitopy, které nejsou exponovány extracelulární fázi, když jsou přítomny ve formě vázané k buňce autologního APP.
15. Použití podle nároku 14, kde Αβ nebo APP polypeptid je modifikován tak, aby ztratil alespoň jeden B-buněčný epitop, který je exponován extracelulární fázi, když je přítomný ve formě vázané k buňce autologního APP polypeptidů.
16. Použití podle některého z předchozích nároků, kde je substituována alespoň jedna aminokyselinová sekvence v autologním Αβ nebo APP polypeptidů aminokyselinovou sekvencí o stejné nebo odlišné délce vyvolávající vznik cizího Th epitopu v analogu.
17. Použití podle některého z předchozích nároků, kde analog obsahuje aminokyselinovou sekvenci odpovídající aminokyselinám 672 až 714 ze SEQ ID NO: 2, přičemž je vložena aminokyselinová sekvence vyvolávající vznik cizího TH epitopu v analogu nebo kde analog obsahuje aminokyselinovou sekvenci odpovídající aminokyselinám 672 až 714 v SEQ ID NO: 2, kde alespoň jedna aminokyselinová sekvence je nahrazena aminokyselinovou sekvencí o stejné nebo odlišné délce, aby přitom vznikl cizí Th epitop.
18. Použití podle některého z předchozích nároků, kde jsou k nosičové molekule schopné zajistit presentaci více kopií antigenních determinantů vázány alespoň dvě kopie analogu prostřednictvím kovalentní nebo nekovalentní vazby.
• · · · fc · • fcfc fc fcfcfcfc
19. Použití podle některého z předchozích nároků, kde analog je formulován s adjuvantem, který umožňuje zrušit autotoleranci vůči autoantigenům.
20. Použití podle některého z předchozích nároků, kde se živočichovi podá účinné množství analogu cestou zvolenou z parenterální, jako intrakutánní, subkutánní a intramuskulární cesty; peritoneální cesty; perorální cesty; bukální cesty; sublinguální cesty; epidurální cesty; spinální cesty; anální cesty a intrakraniální cesty.
21. Použití podle nároku 20, kde účinné množství činí 0,5 až 2000 pg.
22. Použití podle nároku 20 nebo 21, kde analog je obsažen v zařízení virtuální lymfatické uzliny (VLN).
23. Použití podle některého z nároků 1 až 17, kde negativní regulace zahrnuje zavedení nukleové kyseliny nebo nukleových kyselin kódujících analog do buněk živočicha a tím dosažení in vivo exprese této nukleové kyseliny nebo těchto nukleových kyselin buňkami.
24. Použití podle nároku 23, kde nukleová kyselina nebo nukleové kyseliny se zvolí ze souboru sestávajícího z prosté DNA, DNA formulované s nabitými nebo nenabitými lipidy, DNA formulované v liposomech, DNA obsažené ve virovém vektoru, DNA formulované s proteinem nebo polypeptidem umožňujícím transfekci, DNA formulované se směrovacím proteinem nebo polypeptidem, DNA formulované s činidly srážejícími vápník, DNA kopulované s inertní nosičovou molekulou, DNA zapouzdřené v chitinu nebo chitosanu a DNA formulované s adjuvantem.
• « · ·
97 • · · · · · • · · • · · · · • · · • · · · · • · • · · · • · • · •·· ··· 25. Použití podle nároku 24, kde nukleová kyselina nebo nukleové kyseliny jsou obsaženy v zařízení VLN. 26. Použití podle některého z nároků 20 až 25, které zahrnuje
alespoň jedno podání/zavedení za rok, jako alespoň 2, alespoň 3, alespoň 4, alespoň 6 nebo alespoň 12 podání/zavedení za rok.
27. Použití podle některého z nároků 1 až 26 pro léčení a/nebo prevenci a/nebo zlepšování stavu při Alzheimerově chorobě nebo jiných chorobách nebo stavech charakterizovaných Αβ depozity.
28. Analog amyloidogenního polypeptidu, který je odvozen od autologního Αβ nebo APP polypeptidu živočicha,
a) do něhož je zaveden alespoň jeden cizí Th epitop, jak je to schematicky znázorněno pro epitopy P2 a P30 na obr. 1, nebo
b) v němž je alespoň jeden cizí Th epitop kopulován k polyhydroxypolymernímu nosičovému hlavnímu řetězci, který také nese peptidové sekvence pocházející z Αβ nebo APP polypeptidu. tak, aby imunizace živočicha analogem indukovala produkci protilátek proti amyloidogennímu polypeptidu.
29. Analog podle nároku 28, kde modifikace je definována v některém z nároků 2 až 17.
30. Imunogenní kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje imunogenicky účinné množství analogu podle nároku 28 nebo 29, přičemž kompozice dále obsahuje farmaceuticky a imunologicky vhodný nosič a/nebo vehikulum a popřípadě adjuvans.
• · nároku nároku nároku
000000 • 0 0 • · 0 · ·
0 0 0 0 0 0
98 .....
31. Fragment nukleové kyseliny kódující analog podle 28 varianty a) nebo 29, v provedení, že nárok 29 je závislý na 28 variantě a).
32. Vektor nesoucí fragment nukleové kyseliny podle 31, jako vektor, který je schopen autonomní replikace.
33. Vektor podle nároku 32 zvolený ze souboru sestávajícího z plasmidů, fágu, kosmidu, minichromosomu a viru.
34. Vektor podle nároku 32 nebo 33 obsahující ve směru 5’—> 3’ a v operabilním spojení promotor pohánějící expresi fragmentu nukleové kyseliny podle nároku 31, popřípadě sekvenci nukleové kyseliny kódující vedoucí peptid umožňující sekreci polypeptidového fragmentu nebo jeho integraci do membrány, fragment nukleové kyseliny podle nároku 31 a popřípadě terminátor.
35. Vektor podle některého z nároků 32 až 34, který po zavedení do hostitelské buňky je nebo není schopen se integrovat do genomu hostitelské buňky.
36. Vektor podle nároku 34 nebo 35, kde promotor pohání expresi v eukaryontní buňce a/nebo prokaryontní buňce.
37. Transformovaná buňka nesoucí vektor podle některého z nároků 32 až 36, jako transformovaná buňka, která je schopna replikovat fragment nukleové kyseliny podle nároku 31.
38. Transformovaná buňka podle nároku 37, kterou je mikroorganismus zvolený z bakterie, kvasinky, prvoka nebo buňka pocházející z vícebuněčného organismu zvolená z buňky houby, hmyzí buňky, jako buňky S2 nebo SF, rostlinné buňky a savčí buňky.
• · · · · 9 * · · » · · · ·
39. Transformovaná buňka podle nároku 37 nebo 38 exprimující fragment nukleové kyseliny podle nároku 31, jako je transformovaná buňka, která sekretuje nebo na svém povrchu nese analog podle nároku 28 nebo 29.
40. Použití podle některého z nároků 1 až 17, kde negativní regulace zahrnuje podávání nepatogenního mikroorganismu nebo viru, který nese fragment nukleové kyseliny kódující nebo exprimující analog.
41. Kompozice pro indukci produkce protilátek proti Αβ nebo APP proteinu v živočichovi, vůči kterému jsou tyto proteiny autologní, vyznačující se tím, že zahrnuje
-fragment nukleové kyseliny podle nároku 31 nebo vektor podle některého z nároků 32 až 36 a
- farmaceuticky nebo imunologicky vhodný nosič a/nebo vehikulum a/nebo adjuvans.
42. Stabilní buněčná linie nesoucí vektor podle některého z nároků 32 až 36 exprimující fragment nukleové kyseliny podle nároku 31, která popřípadě sekretuje nebo nese na svém povrchu analog podle nároku 28 nebo 29.
43. Způsob přípravy buňky podle některého z nároků 37 až 39, vyznačující se tím, že se hostitelská buňka transformuje fragmentem nukleové kyseliny podle nároku 31 nebo vektorem podle některého z nároků 32 až 36.
CZ20022748A 2000-02-21 2001-02-19 Nová metoda regulace obsahu amyloidu CZ20022748A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200000265 2000-02-21
US18629500P 2000-03-01 2000-03-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20022748A3 true CZ20022748A3 (cs) 2004-03-17

Family

ID=26068772

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20022748A CZ20022748A3 (cs) 2000-02-21 2001-02-19 Nová metoda regulace obsahu amyloidu

Country Status (7)

Country Link
US (2) US7135181B2 (cs)
KR (2) KR20080017471A (cs)
AU (1) AU783144B2 (cs)
CA (1) CA2400838C (cs)
CZ (1) CZ20022748A3 (cs)
HR (1) HRP20020721B1 (cs)
MX (1) MXPA02007796A (cs)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6913745B1 (en) 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US6743427B1 (en) * 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7799535B1 (en) 1997-12-09 2010-09-21 Arch Development Corporation Methods for identifying factors that control the folding of amyloid proteins of diverse origin
US20030147882A1 (en) 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
US6689753B1 (en) * 1999-11-05 2004-02-10 Axonyx, Inc. β sheet breaker peptide analogs that inhibit β pleated sheet formation in amyloid β-peptide
AU783144B2 (en) * 2000-02-21 2005-09-29 H. Lundbeck A/S Novel method for down-regulation of amyloid
EA008762B1 (ru) * 2000-02-21 2007-08-31 Фармекса А/С АНАЛОГ АУТОЛОГИЧНОГО Аβ ИЛИ АРР ЖИВОТНОГО И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
JP4853936B2 (ja) * 2000-08-21 2012-01-11 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 神経変性状態の診断方法
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
US7320793B2 (en) * 2001-01-19 2008-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
ATE532874T1 (de) * 2001-02-15 2011-11-15 Univ Chicago Verfahren zum nachweis in hefe für mittels die proteinfaltung beeinflussen
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
EP1820806A1 (en) * 2006-02-16 2007-08-22 Crossbeta Biosciences B.V. Affinity regions
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20070003552A1 (en) * 2002-07-09 2007-01-04 Gebbink Martijn F B Cross-beta structure comprising amyloid binding proteins and methods for detection of the cross-beta structure, for modulating cross-beta structures fibril formation and for modulating cross-beta structure-mediated toxicity and method for interfering with blood coagulation
EP1380290A1 (en) * 2002-07-09 2004-01-14 Universitair Medisch Centrum Utrecht Cross-beta structure pathway and its therapeutic relevance
WO2010011999A2 (en) * 2008-07-25 2010-01-28 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for eliciting an amyloid-selective immune response
US8506959B2 (en) * 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
WO2008103472A2 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8697082B2 (en) * 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
TW200509968A (en) * 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US20080014194A1 (en) * 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
US9034337B2 (en) * 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US20050064548A1 (en) * 2003-04-16 2005-03-24 Lindquist Susan L. Yeast ectopically expressing abnormally processed proteins and uses therefor
US7358331B2 (en) * 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
US8685718B2 (en) * 2003-05-20 2014-04-01 New York University Mucosal immunization to prevent prion infection
WO2005019412A2 (en) * 2003-05-20 2005-03-03 New York University Mucosal immunization to prevent prion infection
TWI306458B (en) 2003-05-30 2009-02-21 Elan Pharma Int Ltd Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7674599B2 (en) 2003-11-08 2010-03-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of using antibodies to detect alpha-synuclein in fluid samples
NZ578727A (en) * 2004-06-25 2011-03-31 Brigham & Womens Hospital Proteosome compositions and methods for treating neurological disorders
JP2008523815A (ja) 2004-12-15 2008-07-10 エラン ファーマ インターナショナル リミテッド 認知の改善における使用のためのヒト化アミロイドβ抗体
US20090202980A1 (en) * 2005-03-21 2009-08-13 Crossbeta Biosciences B.V. Cross-Beta Structure Comprising Amyloid Binding Proteins and Methods for Detection of the Cross-Beta Structure, for Modulating Cross-Beta Structures Fibril Formation and for Modulating Cross-Beta Structure-Mediated Toxicity and Method for Interfering With Blood Coagulation
CA2615078A1 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Crossbeta Biosciences B.V. Methods for determining the effect of a treatment on the cross-.beta. structure content of a protein; selection of treatments and uses thereof
US20070015133A1 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Umc Utrecht Holding B.V. Method for detecting and/or removing protein and/or peptide comprising a cross-beta structure from an aqueous solution comprising a protein
BRPI0613525A2 (pt) * 2005-07-13 2011-05-31 Crossbeta Biosciences Bv métodos para produzir uma composição imunogênica, para melhorar a imunogenicidade de uma composição, para intensificar a imunogenicidade de uma composição de vacina, e para determinar a quantidade de estruturas beta-cruzadas em uma composição de vacina, usos de estruturas beta-cruzadas, e de uma composição imunogênica, vacina de subunidade, e, composição imunogênica
US8114832B2 (en) * 2005-07-13 2012-02-14 Crossbeta Biosciences B.V. Method for detecting and/or removing a protein comprising a cross-beta structure from a pharmaceutical composition
WO2007008072A2 (en) 2005-07-13 2007-01-18 Crossbeta Biosciences B.V. CROSS-ß STRUCTURE BINDING COMPOUNDS
PL1954718T3 (pl) 2005-11-30 2015-04-30 Abbvie Inc Przeciwciała skierowane przeciwko A globulomerowi, ich reszty wiążące antygeny, odpowiednie hybrydomy, kwasy nukleinowe, wektory, komórki gospodarze, sposoby wytwarzania tych przeciwciał, kompozycje zawierające te przeciwciała, zastosowania tych przeciwciał i sposoby stosowania tych przeciwciał
US8497072B2 (en) 2005-11-30 2013-07-30 Abbott Laboratories Amyloid-beta globulomer antibodies
WO2007108675A1 (en) * 2006-03-17 2007-09-27 Crossbeta Biosciences B.V. Methods of binding of cross-beta structures by chaperones
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
US8188046B2 (en) 2006-10-16 2012-05-29 University Of South Florida Amyloid beta peptides and methods of use
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
US8147833B2 (en) * 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
EP2486928A1 (en) 2007-02-27 2012-08-15 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
WO2008106657A2 (en) * 2007-03-01 2008-09-04 Intezyne Technologies, Inc. Encapsulated amyloid-beta peptides
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
ES2498040T3 (es) 2007-07-27 2014-09-24 Janssen Alzheimer Immunotherapy Tratamiento de enfermedades amiloidogénicas con anticuerpos anti-beta humanizados
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
EP2058000A1 (en) * 2007-11-08 2009-05-13 Crossbeta Biosciences B.V. Immunogenic compositions capable of activating T cells
EP2058001A1 (en) * 2007-11-08 2009-05-13 Crossbeta Biosciences B.V. Enhancement of immunogenicity of antigens
MX2010013647A (es) * 2008-06-12 2011-04-05 Affiris Ag Compuestos para tratar sintomas asociados con la enfermedad de parkinson.
EP2149380A1 (en) * 2008-07-29 2010-02-03 Medivet Pharma, S.L. Veterinary immunotherapy compositions for the Aged Related Cognitive Dysfunction.
US20100136584A1 (en) * 2008-09-22 2010-06-03 Icb International, Inc. Methods for using antibodies and analogs thereof
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
US8987419B2 (en) 2010-04-15 2015-03-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
WO2012024187A1 (en) 2010-08-14 2012-02-23 Abbott Laboratories Amyloid-beta binding proteins
US20120328605A1 (en) * 2010-10-27 2012-12-27 Daniel Larocque Compositions and uses
KR101766393B1 (ko) * 2010-11-30 2017-08-10 (주)아모레퍼시픽 블레오마이신 하이드로라제를 이용한 건조 피부 개선물질 스크리닝 방법

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4596792A (en) 1981-09-04 1986-06-24 The Regents Of The University Of California Safe vaccine for hepatitis containing polymerized serum albumin
JPS5938877A (ja) 1982-08-30 1984-03-02 Musashi Eng Kk 紙葉判別方法
US4599231A (en) 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4599230A (en) 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4608251A (en) 1984-11-09 1986-08-26 Pitman-Moore, Inc. LHRH analogues useful in stimulating anti-LHRH antibodies and vaccines containing such analogues
US4601903A (en) 1985-05-01 1986-07-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease
US5223482A (en) 1986-11-17 1993-06-29 Scios Nova Inc. Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use
US5278056A (en) * 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
US5192688A (en) 1988-08-15 1993-03-09 Switzer Iii Robert C Histological analysis method
DE4012743C1 (cs) * 1990-04-21 1992-01-09 Hans-Peter Dr. 5132 Uebach-Palenberg De Call
US5753624A (en) * 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
US5200339A (en) 1990-08-17 1993-04-06 Abraham Carmela R Proteases causing abnormal degradation of amyloid β-protein precursor
US5780587A (en) * 1990-08-24 1998-07-14 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity
US5780036A (en) * 1991-08-26 1998-07-14 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepattis B virus
NZ249704A (en) 1992-02-11 1996-11-26 Jackson H M Found Military Med A two carrier immunogenic construct comprising a 70+ kd molecule conjugated to at least 1 t-dependent antigen, preparation, compositions containing the construct
AU4377793A (en) 1992-05-20 1993-12-13 Johns Hopkins University, The Alternative receptor therapy
US5958883A (en) * 1992-09-23 1999-09-28 Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology Animal models of human amyloidoses
US5747323A (en) * 1992-12-31 1998-05-05 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Retroviral vectors comprising a VL30-derived psi region
DK96493D0 (da) 1993-08-26 1993-08-26 Mouritsen Og Elsner Aps Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden
DK0735893T3 (da) * 1993-09-14 2009-03-09 Pharmexa Inc PAN DR-bindende peptider til styrkelse af immunsvaret
AUPM411994A0 (en) 1994-02-25 1994-03-24 Deakin Research Limited Epitopes
US5709995A (en) * 1994-03-17 1998-01-20 The Scripps Research Institute Hepatitis C virus-derived peptides capable of inducing cytotoxic T lymphocyte responses
US5573916A (en) * 1994-05-19 1996-11-12 Coretech, Inc. Immunogenic constructs comprising b-cell and t-cell epitopes on common carrier
IL115743A0 (en) 1994-10-28 1996-01-19 American Nat Red Cross A mammal with cells containing a transgene and its production
US5589154A (en) * 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
US6319498B1 (en) * 1995-03-14 2001-11-20 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of amyloid aggregation
US5874469A (en) 1996-01-05 1999-02-23 Alcon Laboratories, Inc. Fluoroalkyl hydrocarbons for administering water insoluble or unstable drugs
AUPO390396A0 (en) 1996-11-29 1996-12-19 Csl Limited Novel promiscuous T helper cell epitopes
WO1998026747A2 (en) * 1996-12-17 1998-06-25 Terman David S Superantigen based methods and compositions for treatment of diseases
WO1999024468A1 (en) 1997-11-11 1999-05-20 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma An alzheimer-related, endothelium-derived toxic factor and methods for its use
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US6787523B1 (en) * 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US20040062802A1 (en) 1998-04-02 2004-04-01 Hermelin Victor M. Maximizing effectiveness of substances used to improve health and well being
KR20010072025A (ko) 1998-07-21 2001-07-31 추후제출 활성화 폴리히드록시폴리머에 의한 고체 표면 코팅
PL196790B1 (pl) * 1998-09-15 2008-01-31 Pharmexa As Zastosowanie zwierzęcego polipeptydu OPGL lub jego podsekwencji, lub analogu OPGL, zastosowanie fragmentu kwasu nukleinowego, zastosowanie wektora przenoszącego fragment kwasu nukleinowego, zastosowanie niepatogennej transformowanej komórki, zastosowanie kompozycji zawierającej taki fragment lub wektor, sposób identyfikacji zmodyfikowanego polipeptydu OPGL, sposób wytwarzania kompozycji immunogennej
WO2000020027A2 (en) 1998-10-05 2000-04-13 M & E Biotech A/S Methods for therapeutic vaccination
ATE276758T1 (de) * 1999-04-19 2004-10-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Adjuvans-zusammensetzung, enthaltend saponin und ein immunstimulatorisches oligonukleotid
US6787637B1 (en) * 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
KR20020073341A (ko) * 1999-11-29 2002-09-23 뉴로켐, 인크. 알츠하이머 및 아밀로이드 관련 질병의 예방 및 치료용 백신
WO2001042306A2 (en) 1999-12-08 2001-06-14 Mindset Biopharmaceuticals (Usa), Inc. Chimeric peptides (short b-cell epitope joined to a t-cell epitope) and their use for immunization
EA008762B1 (ru) * 2000-02-21 2007-08-31 Фармекса А/С АНАЛОГ АУТОЛОГИЧНОГО Аβ ИЛИ АРР ЖИВОТНОГО И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
AU783144B2 (en) 2000-02-21 2005-09-29 H. Lundbeck A/S Novel method for down-regulation of amyloid
GB0004530D0 (en) 2000-02-25 2000-04-19 Univ Nottingham Adjuvants
IL152625A0 (en) * 2000-05-22 2003-06-24 Univ New York SYNTHETIC IMMUNOGENIC BUT NON-AMYLOIDOGENIC PEPTIDES HOMOLOGOUS TO AMYLOID beta FOR INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE TO AMYLOID beta AND AMYLOID DEPOSITS
IT1319277B1 (it) * 2000-10-24 2003-09-26 Chiesi Farma Spa Proteine di fusione utili per il trattamento di immunizzazione dellamalattia di alzheimer.
US7097837B2 (en) * 2001-02-19 2006-08-29 Pharmexa A/S Synthetic vaccine agents
US6906169B2 (en) * 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
US20030185845A1 (en) * 2001-11-16 2003-10-02 Steen Klysner Novel immunogenic mimetics of multimer proteins
US6841118B2 (en) * 2002-02-11 2005-01-11 Salflex Polymers Ltd. Mold assembly for blow molding plastic articles and method of use
AU2003208314A1 (en) * 2002-03-11 2003-09-22 Pharmexa A/S Novel application of vaccination against tnf-alpha
EP1575529A4 (en) * 2002-07-17 2007-08-08 Intellect Neurosciences Inc PEPTIDES AND METHOD FOR THE INVESTIGATION OF IMMUNOGENOUS PEPTIDE VACCINES AGAINST ALZHEIMER DISEASE

Also Published As

Publication number Publication date
KR20030001365A (ko) 2003-01-06
HRP20020721B1 (en) 2012-04-30
MXPA02007796A (es) 2003-12-08
HRP20020721A2 (en) 2005-04-30
KR20080017471A (ko) 2008-02-26
KR100879810B1 (ko) 2009-01-22
US20090092579A1 (en) 2009-04-09
US7135181B2 (en) 2006-11-14
US20020187157A1 (en) 2002-12-12
CA2400838A1 (en) 2001-08-30
CA2400838C (en) 2013-04-23
AU3362001A (en) 2001-09-03
AU783144B2 (en) 2005-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2400838C (en) Novel method for down-regulation of amyloid
JP5025871B2 (ja) アミロイドの新規なダウン−レギュレート方法
EP1420815B1 (en) Beta-amyloid-analogue - t-cell epitop vaccine
AU2002325199A1 (en) Beta-amyloid-analogue-T-cell epitop vaccine