KR20010072025A - 활성화 폴리히드록시폴리머에 의한 고체 표면 코팅 - Google Patents

Abstract

본발명은 수용성 활성화 폴리히드록시폴리머로 코팅된 고체표면을 제조하는 간단하고도 신규한 방법을 제공한다. 상기 방법은 활성화된 폴리히드록시폴리머를 고체 표면에 결합시키기 위하여, 활성화된 폴리히드록시폴리머를 포함하는 코팅용액으로 아민, 이미노, 또는 티올기를 실질적으로 포함하지 않는 고체표면을 접촉시키고, 헹구고, 임의로 고체표면을 건조하는 것으로 이루어진다. 상기 접촉반응은 pH 1.5-10 또는 이온강도 0.1-8을 갖는 수용성 매질중에서 일어나야 한다. 바람직한 폴리히드록시폴리머는 다당류, 특히 덱스트란, 그외에 셀룰로스, 아가로스 및 전분과 같은 알데하이드기가 없는 천연 폴리머이다. 또한 합성 폴리머, 특히 폴리비닐알콜이 바람직하다. 바람직하게는 상기 폴리머의 수용해성은 10mg/ml이상이고, 이의 분자량은 1000이상이다. 상기 폴리머의 활성화는 트레실, 말레이미도,시아노젠브로마이드, 토실, 트리플릴, 펜타플루오로벤젠술포닐 및 비닐술폰기중에서 선택된 작용기로 하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 활성화 폴리히드록시폴리머는 트레실화, 토실화, 또는 말레이미도화 덱스트란이다. 상기 고체표면은 유기 폴리머(예컨대 폴리스티렌), 유리, 세라믹 또는 금속의 표면이 바람직하다. 또한, 본발명은 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 고체표면, 그리고 생분자를 고정화하기 위한 상기 표면의 용도도 제공한다.

Description

활성화 폴리히드록시폴리머에 의한 고체 표면 코팅{COATING OF SOLID SURFACES WITH ACTIVATED POLYHYDROXYPOLYMERS}

친수성 화학기를 고체 표면에 고정화시킴으로써 고체 표면의 물리화학적 특성을 변화시키는 것은 본 기술분야에서 알려져 있다. 종래의 방법은 예컨대 소수성기 또는 전하를 띤 그룹을 사용하여 소수성인 고체표면위에 친수성 기의 흡착을 용이하게 하는 것을 포함한다.

본발명 출원인의 이전 출원, WO 94/03530에는 활성화된 다당류로 고체표면을 처리함으로써 고체표면의 친수성을 변화시키는 기술을 기재하고 있다. 이 개질방법에 있어서, 예컨대 과옥소산염(peridiate)으로 산화된 덱스트란, 또는 트레신 활성화된 덱스트란의 고정화가 용이하도록, 상기 고체표면은 친핵성기, 예컨대 아미노기 또는 티올기을 가지고 있어야 한다.

EP 596315 A2에는, 헹구는 중간단계없이 접촉단계와 가열단계로 이루어지는, 디알데하이드 전분으로 고체표면을 코팅하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 온화한 가열단계(50-100℃)이후에 몇몇 폴리머에 디알데하이드 전분을 거의 비가역적으로부착하는 것이 개시되어 있다. 그러나, 또한 상기 가열단계를 제외하는 경우에는 디알데하이드 전분을 용이하게 헹구어 제거할 수 있다고 기재하고 있다.

WO 91/05817에는 및 WO 90/06954에는 흡착된 폴리아민을 갖는 표면에 다당류를 고정화하는 것이 기재되어 있고, WO 91/09877에는 아미노기를 갖는 표면에 예컨대 과옥소산염으로 산화된 셀룰로스 에스테르를 고정화하는 것이 기재되어 있다.

WO 92/07706에는 폴리이민의 아미노기와 반응가능한 음이온기를 갖는 고체표면에 생폴리머 및 폴리이민의 컨쥬게이트를 고정화하는 것이 기재되어 있다.

WO 92/03732에는 다양한 수용성 화합물을 고체표면에 고정화시키며, 여기서 흡착이 용이하도록 상기 수용성 화합물이 소수성기를 가진다.

놀랍게도, 매우 단순한 방법, 즉 코팅할 표면을 미리 활성화시키지 않고 예컨대 폴리히드록시폴리머중에 알데하이드기, 아미노기 또는 소수성기를 포함시키지 않고서 폴리히드록시 폴리머로 고체 표면을 코팅하는 방법을 알아냈다. 특히, 폴리아민 또는 폴리이민으로 표면을 미리 코팅할 필요없이, 더욱이 폴리이민, 폴리아민, 소수성 리간드, 기타등등으로 폴리히드록시 폴리머을 미리 접합시킬 필요없이, 활성화된 폴리히드록시 폴리머(예, 트레실로 활성화된 덱스트란(TAD) 또는 말레이미도로 활성화된 덱스트란(MAD)로 마이크로농도 판(Plate)(예, 폴리스킬렌 마이크로농도 판)을 코팅할 수 있다는 것을 알았다.

따라서, 본발명은 고체표면은 실질적으로 아민기, 아미노기 또는 티올기를 포함하지 않는, 수용성 활성화된 폴리히드록시 폴리머로 고체 표면을 코팅하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음 단계로 이루어진다:

a) 고체표면에 활성화된 폴리히드록시 폴리머가 결합하도록 pH 1.5-10 및/또는 이온강도 0.1-8을 갖는 수용성 매질중 활성화된 폴리히드록시 폴리머의 코팅용액에 고체표면을 접촉시키는 단계;

b) 부착된 활성화 폴리히드록시 폴리머를 갖는 고체표면을 헹굼 용액으로 헹구는 단계; 및

c) 부착된 활성화 폴리히드록시 폴리머를 갖는 고체표면을 임의로 건조하는 단계.

또한 본발명은 작용기를 다른 작용기를 전환하기 위해서 코팅된 표면의 후처리방법에 관한 것이다. 더욱이, 본발명은 얻어진 고체 표면, 생분자의 고정화를 위한 이의 용도, 그이외에 고정화된 생분자를 포함하는 얻어진 고체 표면에 관한 것이다.

본발명은 활성화 폴리히드록시 폴리머, 예컨대 트레실 또는 말레이미도 활성화된 덱스트린으로 고체 표면을 코팅하는 편리한 방법에 관한 것이다.

도 1은 다른 pH 농도에서 TAD로 코팅된 폴리스티렌 마이크로농도 웰에 대한 펩타이드의 결합을 나타낸다. 상기 산성 pH에서 TAD로 코팅된 웰은 염기성 pH에서 코팅된 웰보다 펩타이드에 더 잘 결합한다. 이러한 효과가 낮은 pH에서 TAD 흡착의 향상으로 인한 것인지 또는 높은 pH에서 트레실기의 가수분해에 의한 것인지는 분명하지 않다.

도 2는 TAD로 코팅된 표면의 화학적 특이성을 나타낸다. 알파-아미노기가 보호된 아미노산은 곁사슬만을 갖는 트레신기에 결합할 수 있었다. 상기 TAD 표면은 라이신 및 시스테인에 대해 명백한 우선성을 나타내며, 즉 화학적 특이성은 아민 과 티올에 제한적이었다.

도 3은 TAD로 코팅된 마이크로농도 판(A) 및 종래의 마이크로농도 판(B, MAXISorp)상에서 수행된 중첩 펩타이드를 이용한 B-세포 에피토페 스캔을 나타낸다. 상기 두가지 다른 유형의 판상에 펩타이드(종양 전이인자 α(TNF α))를 고정화한 후에, TNF α항혈청을 첨가하였다. B-세포 에피토페를 포함하는 펩타이드가 항혈청에 의해서 인지될 것으로 예상되었다. 종래의 판보다 TAD로 코팅된 판상에서 더 많은 펩타이드가 인식되었음이 분명한다.

도 4는 유기 폴리머 이외의 표면상에 TAD코팅을 나타낸다. 실험에 기재된 대로 유리 시험관 및 니켈 스파튤라를 TAD로 처리하고, 펩타이드 바이오틴-MP9에 결합하는 능력을 시험하였다. 대조구(-TAD 코팅)은 시험관 및 스파튤라를 각각 코팅 용매만으로 처리하였다. 비교를 위해서 OD₄₉₀/cm²수치를 계산하였다. 분명히, TAD로 코팅된 표면만이 펩타이드에 결합하였다.

도 5는 폴리스티렌 마이크로농도 판(MAXISorp)상에 MAD로 코팅한 경우에 NaCl의 효과를 나타낸다. NaCl이 존재함으로써 시스테인에 대한 결합이 약 25% 정도 증가하였다. 시스테인 결합의 존재는 바이오틴-NHS의 첨가로 탐지하였다. 라이신으로부터의 신호, 그외에 완충액만을 사용한 대조구로부터의 신호는 매우 낮았다. MAD표면에 결합은 티올 특이적이다.

도 6은 다양한 농도의 MAD로 폴리스티렌 마이크로농도 판(MAXISorp)의 코팅을 나타낸다. 최적 코팅 농도는 0.25-1 mg/ml이다. MAD농도가 감소함에 따라 시스테인 결합도 감소하였다. 모든 MAD농도에서 라이신의 결합은 매우 낮았다.

도 7은 MAD로 코팅된 표면의 화학적 특이성을 나타낸다. 알파-아미노기에서 보호된 아미노산은 곁사슬만을 갖는 말레이미도기에 결합할 수 있었다. MAD표면은 시스테인에 대한 분명한 우선성을 보이고, 즉 화학적 특이성은 티올에 한정되는 것이었다.

도 8은 기능적 카르복시산 그룹으로 표면을 생성하는 것에 관한 것이다. 다양한 조건하에서 실시예 1에 따라 제조된 TAD 표면과 6-아미노 헥사논산(hexanoic acid)와 반응시켰다. EDC 및 NHS에 의한 활성화는 트레실 작용기를 카르복시산 작용기로 특이적으로 전환시켰다.

도 9는 기능적 티올산 기에 의한 표면생성을 나타낸다. 실시예 1에 따라 제조된 TAD표면과 2,2'-디티오-비스(에틸아민)을 반응시켰다. 이어서 TAD표면과 티올-개질된 TAD 표면을 바이오틴-말레이미도 및 바이오틴-MP9과의 반응으로, 상당한 교차-특이성이 없이 TAD표면은 아민에 특이적이고 상기 티올-개질된 표면은 말레이미도에 특이적임을 나타낸다.

상기한 바와 같이, 본발명은 활성화된 폴리히드록시 폴리머, 예컨대 활성화된 다당류에 의한 표면코팅 방법에 관한 것이다.

(폴리머)

폴리히드록시 폴리머는 자연에 존재하는 폴리히드록시 화합물, 예컨대 다당류, 및 합성 폴리히드록시 화합물, 예컨대 합성 유기 폴리머(예, 폴리비닐알콜 및 폴리(히드록시에틸메타크릴레이트)를 포함한다. 상기 화합물의 중요한 공통점은 상대적으로 친수성이어서 수용성이 좋다는 것이다.

자연에 존재하는 폴리히드록시 화합물의 예로는 다당류, 잔탄검, 등이 있다.합성 유기 폴리머의 예로는 폴리비닐알콜, 폴리(히드록시메틸메타크릴레이트), 폴리(히드록시에틸메타크릴레이트), 폴리(히드록시프로필메타크릴레이트) 등과, 이에 상응하는 코폴리머이다.

용어 "다당류"는 이의 일반적인 의미, 즉 "글리코시드 결합에 의해서 서로 연결된 9개 이상의 단당류의 조합"으로 사용되며, 예를 들면 Hawley's Condensed Chemical Dictionary, 11th ed., Sax and Lewis, eds., Van Nostrand Reinhold Co., New York, 1987을 참조. 그러한 다당류의 예로는 덱스트란(예, Dextran 40, Dextran 70, Dextran 75), 아가로스, 셀룰로스 및 전분이 있다.

본발명은 다당류 및 폴리비닐알콜, 특히 덱스트란과 같은 다당류에 적용하는 것으로 여겨진다.

목적 천연 폴리히드록시 폴리머의 평균 분자량(즉 활성화하기전에 )은 일반적으로 적어도 1,000, 예컨대 적어도 2,000, 바람직하게는 2,500-2,000,000, 더욱 바람직하게는 3,000-1,000,000, 특히 5,000-500,000이다. 평균분자량이 10,000-200,000을 갖는 폴리히드록시폴리머가 특히 바람직한 것으로 실시예에 나타냈다.

폴리머의 용해는 고체표면상에 비특이적 흡착에 우세하도록 폴리히드록시 폴리머의용해도는 중요한다. 따라서, 본발명의 전 범위를 벗어나지 않기 위해서, 상기 폴리히드록시 폴리머는 적어도 10mg/ml, 바람직하게는 적어도 25 mg/ml 예컨대 50 mg/ml, 특히 적어도 100mg/ml 예컨대 적어도 150 mg/ml 정도로 수용성인 것이 바람직하다. 본명세서에 기재된 대로 활성화한 경우에 덱스트란은 수용성면에서 상기 조건을 만족시킨다고 알려져 있다.

가장 흠미 있는 폴리히드록시 폴리머류로는, 활성화되지 않는 폴리히드록시 폴리머(즉, 활성화전 천연 폴리히드록시 폴리머)의 C(탄소 원자) 및 OH기(히드록시기)간에 비율이 1.3 - 2.5 예컨대 1.5-2.3, 바람직하게는 1.6-2.1 특히 1.85-2.05이다. 어떠한 구체적인 이론에 구속되지 않고, 활성화되지 않는 폴리히드록시 폴리머의 C/OH 비율은 매우 유리한 수준의 친수성을 나타낸다고 여겨진다. 폴리비닐알콜과 다당류는 이러한 조건을 만족하는 폴리히드록시 폴리머의 예이다. 활서오하된 비율이 더 낮아야 하기 때문에 상기 비율은 활성화된 폴리히드록시 폴리머에 ㄷ9ㅐ해 대충 동일해야 한다.

용어 "천연 폴리히드록시 폴리머" 및 유사 용어는 화학적 변형전의 폴리히드록시 폴리머를 의미한다. 따라서 천연 다당류에 있어서 실질적으로 모든 단당류 단위는 완전하며 인식가능하다.

상기한 바와 같이, 상기 폴리히드록시폴리머는 고체 표면에 두번째 분자(예, 펩타이드, 단백질, 항체, 항원, 핵산 기타등등, 이하 참조)의 고착을 용이하도록 하기 위한 작용기(활성화기)를 가진다. 다양한 범위의 적용가능한 작용기가 본기술분야에 알려져 있으며, 예컨대 트레실(트리풀루오로에틸술포닐), 말레이미도, 시아노젠브로마이드, 토실(p-톨리엔술포닐), 트리플릴(틀리플루오로메탄술포닐), 펜타플루오로벤젠술포닐, 및 비닐술폰기이다. 본발명의 범위내에서 바람직한 작용기로는 트레실, 말레이미도, 토실, 트리플릴, 펜타플루오로벤젠술포닐, 및 비닐술폰기,이며, 이중에서 트레실, 말레이미도, 및 토실기가 특히 관련된다.

본발명에 따라 활성화된 폴리히드록시 폴리머의 작용기는 천연 폴리히드록시폴리머의 히드록시기 부분을 통해서 폴리히드록시폴리머에 결합되어 있는 것이 유리하다고 여겨진다. 따라서, 천연 폴리히드록시 폴리머의 골격은 활성화에 의해서 실질적으로 영향을 받지 않는 것이 바람직하다.

따라서, 두 알데하이드기에 대한 디올의 산화가 폴리히드록시 폴리머의 친수성을 감소시키기 때문에, 또한 알데하이드기, 예컨대 다당류의 과옥소산염으로 산화로부터 생긴 알데하이드기는 활성화된 폴리히드록시 폴리머의 작용기로서 불리하다. 바람직하게는, 천연 다당류의 어떠한(일반적으로 차단된) 알데하이드 작용기이외에는 폴리히드록시 폴리머에 알데하이드기가 실질적으로 포함되지 않는다. 특히 작용기는 다당류를 과량의 과옥소산염(즉, 다당류중 히드록시기몰당 1 몰이상)로 처리하여 생긴 알데하이드 그룹은 포함되어서는 안된다.

게다가, 상기와 같은 이유로, 두 알데하이드에 대한 디올의 산화로부터 나온 탄소원자를 통해 폴리히드록시 폴리머에 다른 작용기가 부착되지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 본발명의 범위내에서 사용된 다당류는 작용기로 활성화되기전에 실질적으로 변형되지 않는 것이 바람직하다.

상기로 부터, 다당류를 고체표면에 고정화시키기 위한 "활성화기"로서 예컨대 폴리-L-라이신 및 다른 (폴리)아민류/(폴리)이민류가 사용되는 알려진 방법에 비해 본발명에 따른 방법이 더 간단하기 때문에, 작용기(활성화기)는 그 자체로는 폴리머가 아닌 것으로 이해되어야 한다. 특히, 상기 작용기들은 폴리에틸렌과 같은 폴리이민류 또는 폴리-L-라이신과 같은 폴리아민류가 아닌 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 아미노(1차, 2차, 3차 사슬 및 방향족 아민), 이미노, 암모늄(사슬 및방향족 암모늄, 예컨대 피리듐 그룹), 및 티올기는 본발명에서 사용되는 경우에 실질적으로 폴리히드록시 폴리머에 포함되지 않아야 한다. 또한, 종래에 방법에서 몇몇 고체표면에 다당류의 고정화를 용이하게 하는 소수성 리간드(예, 페닐, 나프틸, 피리딜 및 피리돈 기)는 본발명의 "활성화기"로서 포함되지 않으며 이러한 특성의 그룹은 상기 폴리히드록시 폴리머에 실질적으로 포함되어서는 안되다는 것으로 이해되어야 한다.

그러나, 상기 작용기는 고체 표면에 폴리히드록시폴리머를 흡착하는데 관련될 수 있다. 즉, 상이한 작용기(트레실 및 말레이미도)를 가진 덱스트란을 코팅하기 위한 최적 조건이 다르다는 것이 한 예이다.

상기 폴리히드록시 폴리머는 일반적으로 본기술분야의 전문가에게 알려진 방법으로 제조된다.

트레실 활성화된 폴리히드록시 폴리머는 실시예 1의 덱스트란 활성화 또는 Gregorius등의 J. Immunol. Meth. 181 (1995) 65-73에 기재된 방법에 따라 트레실 클로라이드을 사용하여 제조된다.

말레이미도 활성화된 폴리히드록시 폴리머는 실시예 3의 덱스트란 활성화방법에 따라 p-말레이미도페닐을 사용하여 제조될 수 있다. 혹은, 과량의 디아민 화합물(일반적으로 H₂H-C_nH_2n-NH₂, 여기서 n은 1-20, 바람직하게는 1-8임), 예컨대 1,3-디아미노프로판으로 트레실 활성화된 폴리히드록시 폴리머(예컨대 트레실 활성화된 덱스트란(TAD))을 유도체화하고, 이어서 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 술포-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1=카르복실레이트(술포-SMCC), 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부틸레이트(SMPB), 술포-숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부틸레이트(술포-SMPB), N-감마-말레이미도부티릴록시-숙신이미드 에스테르(GMBS) 또는 N-감마-말레이미도부틸릴록시-술포숙신이미드 에스테르와 같은 시약으로 TAD에 도입된 아미노기와 반응시킴으로써, 덱스트란과 같은 폴리히드록시 폴리머로 말레이미도기를 도입할 수 있다. 활성화에 다른 시약 및 경로를 이용하는 경우에 활성화가 수행된 모히드록시기의 나머지와 말레이미도 작용기간에 결합면에서 약각 다른 말레이미도 활성화된 산물이 얻어질지라도, 모든 것은 "말레이미도 활성화된 폴리히드록시 폴리머"로 여겨진다.

실시예 2의 덱스트란 활성화에 따라 토실 클로라이드를 이용하여 토실 활성화 폴리히드록시 폴리머가 제조될 수 있다. 예컨대 대응하는 산클로라이드류를 이용하여 토실 또는 토실 활성화된 동족체와 같이 트리플릴 및 펜타플루오로벤젠술포닐 활성화된 폴리히드록시 폴리머를 제조한다.

종래의 방법을 이용하여 시아노젠브로마이드와 폴리히드록시 폴리머를 반응시켜 시아노젠브로마이드 활성화된 폴리히드록시 폴리머를 제조한다. 얻어진 작용기는 일반적으로 폴리히드록시 폴리머의 두 히드록시기와의 시아네이트 에스테르이다.

자유 히드록시기와 활성화기 (즉, 기능적 히드록시기)간의 비율로서 활성화 정도를 표현할 수 있다. 폴리히드록시 폴리머의 반응성과 친수성간의 유리한 균형을 얻기 위해서는 폴리히드록시 폴리머의 자유 히드록시기와 활성화기가의 비율은 250:1 내지 4:1이어야 한다. 바람직한 비율은 100:1 내지 6:1, 더욱 바람직하게는 60:1 내지 8:1, 특히 40:1 내지 10:1이다.

본발명에 따른 방법용으로 특히 흥미로운 활성화 폴리히드록시폴리머는 트레실, 토실 및 말레이미도 활성화 다당류, 특히 트레실 활성화 덱스트린 (TAD), 토실활성화 덱스트란(TosAD), 및 말레이미도 활성화 덱스트란(MAD)이다.

(고체 표면)

폴리히드록시 폴리머가 부착될 고체표면은 분석분야 및 진단분야에서 사용되는 다양한 고체표면중에서 선택될 수 있으나, 종래의 방법에서 활성화된 폴리히드록시 폴리머와 표면의 코팅을 용이한 것으로 여겨지는 화학 작용기(예, 아민,이민 및 티올류)가 없는 것이 상기 고체표면의 일반적인 특징이다. 중요한 유형의 고체표면으로는 유기 폴리머류, 유리류, 세라믹류 및 금속류의 고체표면이다.

유기 폴리머류, 폴리스티렌류, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌글리콜 테레프탈레이트, 폴리비닐아세테이트, 폴리메틸펜텐, 폴리비닐피롤리딘온, 폴리아크릴로니트릴, 폴리메틸메타크릴레이트 및 폴리비닐클로라이드가 예시적인 것이고, 폴리스틸렌과 폴리카보네이트가 특히 흥미있는 예이다.

유리류 및 세라믹류중에서는, 보로실리케이트 유리(Pyrex 유리) 및 소다-석회 유리가 특히 관련있는 예이고, 예컨대 표본 튜브, 바이알, 및 현미경용 슬라이등형태이다. 상기 유리의 표면은 코팅하기전에 산으로 처리할 수 있다.

금속중에서는, 니켈, 철, 구리, 금, 은, 알루미늄, 및 아연이 가장 관련있는예이다. 그러한 표면은 금속산화물을 제거하기 위해서 산화하기 전에 일반적으로 정화한다.

바람직한 고체표면은 폴리스틸렌 본체, 폴리카보네이트 본체, 보로실리케이트 본체 또는 소다-석회 유리 본체의 표면이다. 본체 자체는 일정한 형태르 ㄹ가지거나 특별한 목적의 형태로 고안할 수 있으며, 예컨대 본체는 시트, 필름, 비드, 펠렛, 디스크, 판, 고리, 막대, 망, 필터, 트레이, 마이크로농도 판, 스틱, 또는 다수 판을 가진 스틱일 수 있다. 본발명에 따라 코팅될 특히 흥미있는 본체는 마이크로농도 판, 예컨대 폴리스티렌 마이크로농도 판, 스틱 및 비드류이다.

문제의 본체의 표면은 본발명의 방법에 사용하기전에 화합물로 코팅에 의해서 화학적으로 변형되지 않은 것으로 이해되어야 한다. 특히, 상기 본체의 표면은 아미노, 이미노 또는 티올기가 없다. 그러나, 표면의 화학적 및/또는 물리적 특성을 변화시키기 위해서(일반적으로 산화과정) 상기 표면에 빛을 쪼일 수 있다. 상기 방사는 한가지 경우에는 무관하고(트레실 활성화 덱스트린), 다른 경우(말레이미도 활성화 덱스트린)에는 약간 유리하다.

특히 흥미있는 고체표면은 폴리스티렌 마이크로농도 판, 폴리스티렌 비드, 폴리스티렌 스틱, 폴리카보네이트 마이크로농도 판, 유리, 비드 및 유리판의 표면이다.

(방법)

상기한 바와 같이, 본발명에 따른 방법은 다수의 단계, 즉 접촉단계, 헹굼단계 및 임의의 건조단계를 포함한다. 이들 단계는 다음에서 자세히 설명할 것이다:

a) 접촉단계

활성화된 폴리히드록시 폴리머은 본질적으로 수용성이므로, 활성화된 폴리히드록시 폴리머를 포함하는 코팅용액은 수용성 용액이 바람직하다. 폴리히드록시 폴리머이외에, 예컨대 수용성 용액은 pH 조절제, 및/또는 카오트로픽제(chaotropic agent), 및 임의로 하나이상의 보조성분을 포함한다.

많은 유기 폴리머 물질, 예컨대 폴리스티렌은 디메틸 포름아미드와 아세톤과 같은 다양한 유기 용매류에 의해서 손상을 입기 때문에, 환경문제,경제적 이유로 인해 물이 용매로서 바람직하다. 게다가, 종종 유기용매는 고체상에 물리적, 비고유적 흡착을 방해한다. 따라서 상기 용매는 5% 이하의 유기용매 성분을 포함하며, 더욱 바람직하게는 유기용매 성분을 포함하지 않는다.

코팅용액중 활성화 폴리히드록시 폴리머의 농도는 일반적으로 0.001 mg/ml 내지 5mg/ml, 바람직하게는 0.01-1mg/ml, 특히 0.1-0.5mg/ml이다.

단위면적(처리할 표면의 면적)당 활성화 폴리히드록시 폴리머의 필요량에 대해서, 0.01-500 ㎍/㎤, 바람직하게는 0.06-200 ㎍/㎤, 특히 0.1-50 ㎍/㎤이 일정한 코팅을 얻는데 적합하다.

상기한 바와 같이, 고체표면에 접촉하는 코팅용액의 pH는 1.5-10 및/또는 이온강도는 0.1-8이다.

활성화된 폴리히드록시 폴리머의 용액중 pH조절제를 이용하여 바람직한 범위의 pH를 얻을 수 있다. pH조절제로는 아세트산(예, 0.5% 아세트산 pH 2.6), 시트레이트/포스페이트 완충액(예, 0.035 M 시트레이트, 0.075 M 포스페이트, pH 5.0),또는 포스페이트 완충액 식염수(PBS)(예, 0.01 M 포스페이트, 0.15 M NaCl, pH 7.2), 또는 카보네이트 완충액(예, 0.1 M 카보네이트, pH 9.6)이다. 산성 pH를 원하는 경우에는, 다른 단순한 유기산,예 포름산, 프로피온산, 및 부탄산을 0.1-10% 농도로, 트르플루오로 아세틀산 (0.05-5%), 트리클로로아세트산(0.05-5%), HCl(0.01-1 M), H₂SO₄(0.01-1 M)도 또한 사용될 수 있다. "잔류물"을 건조과정의 증발에 의해서 쉽게 제거할 수 있으므로, 코팅용액의 pH를 조절하기 위해서는, 아세트산 및 HCl이 매우 편리하다.

트레실 활성화 덱스트란으로 고체표면을 코팅하는 경우에는, 도 1에서 알 수 있는 바와 같이 낮은 pH가 바람직하다. 예를 들면, 트레실기의 가수분해를 최소화하위해서 코팅시간을 감소시켜야 하는 경우에 pH 8에서 코팅할 수 있다. 그러나, 대규모 제조에서는, 시간범위가 매우 좁기때문에 불편하며, 트레실 활성화 덱스트린이 예컨대 물중 0.5% 아세틀산(약 pH 2)에서 매우 안정하므로 이러한 시스템이 매우 적합한 용매 조성이다.

활성화 폴리히드록시 폴리머 용액중 카오트로픽제를 사용하여 원하는 이온강도를 얻을 수 있다. 카오트로픽제는 활성화 폴리히드록시 폴리머의활성부위와 반응하거나 고페상에 활성화된 폴리히드록시 폴리머가 흡착하는데 역효과를 초래하는 그룹을 포함해서는 안된다. 물중 0.5 내지 4 M의 NaCl을 사용하면 만족스러운 결과가 얻어졌다. 혹은, 구아니디늄 클로아이드, 소디움 티로술페이트, 및 소디움 티오오시아네이트가 사용될 수도 있다. 더 낮은 농도로 사용할 수 있으나 카오트로픽제의 농도가 감소함에 따라 코팅의 다양성이 증가하는 경향이 있다. 따라서, 폴리히드록시 폴리머 용액의 이온강도는 일반적으로 0.1-8, 바람직하게는 0.5-6, 더욱 바람직하게는 0.8-5, 특히 1.2-4이다.

pH 및 이온강도를 모두 충족시키기 위해서 pH 조절제를 카오트로픽제와 함께 사용할 수도 있다.

또한 코팅용액중 보조제를 포함할 수 있으나, 모든 구성성분은 적어도 건조단계에서 효과적으로 제거되는 것이 바람직하기 때문에 다른 구성성분은 포함하지 않는 것이 바람직하다.

코팅시간은 1분 내지 하룻밤동안, 예컨대 3시간 내지 하룻밤일 수 있으나, 코팅시간은 중요하지 않는 것 같다. 대규모 생산에 있어서, 하룻밤동안의 코팅이 매우 편리하다.

4 내지 56℃에서 일정한 좋은 결과로 코팅을 수행할 수 있다. 그러나, 예컨대 마이크로농도 판에서 가장자리 효과를 초래하는 온도를 감소시키기 위해서 실온에서 하는 것이 매우 편리하며, 그렇지 않은 경우에 가장자리 효과로 인해 마이크로농도 판의 중간웰과 가장자리에 근접한 웰간에 코팅이 달라질 수 있다. 게다가, 높은 온도에 비해, 실온에서 반응이 반응동안 증발이 없거나 적다.

바람직한 조건을 실온에서 하룻밤동안 코팅하는 것이다. 이러한 조건은 말레이미도 활성화 덱스트린(MAD)뿐만 아니라 트레실 활성화 덱스트린(TAD)에도 유리한 것으로 입증되었다.

상기 코팅시간 후에, 고체표면으로부터 코팅용액을 제거하거나 고체표면을고팅용액으로 부터 제거한다(가장 편리함). 마이크로농도 판인 경우에, 코팅용액을 일반적으로 따라내고 피펫으로 제거한다. 코팅수행을 조절할 수 없어서 폴리히드록시 폴리머의일부분이 고체표면에 약학 수동 흡착으로 부착할 것이고 이후 단계에서 효과적으로 헹구어 제거할 수 없기 때문에, 코팅용액을 일반적으로 완전히 증발되지 않는 것으로 이해되어야 한다.

b) 헹굼단계

헹굼용액은 일반적으로 수용성 용액이거나 단순히 물이다. 접촉단계에서 산성 조건이 적용되는 경우에는, 남아있는 폴리히드록시 폴리머 또는 다른 성분의 비특이적 결합이 pH 변화로 인해 일어나는 것을 방지하기 위해서 산성용액을 사용하는 것이 유리하다. 상기 헹굼용액은 활성화된 폴리히드록시 폴리머의 반응부위 (예, 아미노기 또는 티올기)와 반응할수 있거나 코팅을 방해하지 않고, 건조단계에서 쉽게 제거되는 다른 성분을 포함해야 한다. 바람직하게는, 상기 헹굼용액은 단지 약간의 염 또는 다른 비휘발성 성분을 포함한다.

산성조건을 사용한 경우에는 물중 아세트산, 예컨대 0.5%이 헹굼용액으로 적합하다. 왜냐하면, 이들은 pH 수치(약 2.6)가 낮으며 건조단계에서 용이하게 증발하여 제거할 수 있기 때문이다. 카오트로픽제 조건하에서 상기 접촉단계가 수행된 경우에는 물이 적합하다.

c) 건조단계

헹굼단계 이후에, 헹굼용액과 다른 휘발성 성분, 예컨대 아세트산을 제거하기 위해서 상기 표면을 건조한다. 건조는 특히 코팅된 표면의 저장에 중요하고,20-56℃, 바람직하게는 20-45℃에서 행하는 것이 좋은 결과를 얻을 수 있다. 약 37℃ 부근에서 건조하면, 56℃에서 행하는 경우에 비해, 남아있는 헹굼용액을 상대적으로 빨리 증발시킬 수 있고 예컨대 코팅된 마이크로농도 판의 대규모 제조에서 더 유리하다. 감압함으로써 건조시간을 감소시킬 수 있다.

건조후에, 코팅된 표면을 이후 사용을 위해서 저장하거나, 직후에 사용할 수도 있다. 제조한 직후에 코팅표면을 사용하는 경우에, 목적 용도에 사용된 상기 용액과 헹굼용액이 양립가능하다면 상기 건조단계를 행하지 않을 수도 있다.

본발명에 따라 제조된 코팅 표면은 2-3년이상의 저장주기로서 월등한 저장안정성을 갖는다는 것에 주목해야 한다.

따라서, 코팅되지 않은 고체표면 및 문제의 활성화된 폴리히드록시 폴리머로 코팅된 되지 않는 유사한 고체표면에서 시험한 경우에, 아미노산 곁사슬 특이성에 대한 테스트에서 37℃에서 1년간 저장한 후에 대부분 흡수한 아미노산에 대한 흡수 차이는(실시예 6의 TAD에 대한 기술), 최대 25%, 바람직하게는 최대 15%, 더욱 바람직하게는 최대 10%, 특히 최대 5%로 감소한다. 대기압 및 대기 조성 두가지 환경조건이 저장에 영향을 미친다. 본발명의 제조방법에 따라 제조된 본발명의 바람직한 코팅 표면은 심지어 동일한 조건하에서 1년간 50℃에서 저장하더라도 이들 요건을 충족시킨다.

본발명의 바람직한 일예에서, 폴리히드록시 폴리머는 다당류, 특히 덱스트란이다. 다당류(예, 덱스트란)와 관련하여 특히 중요한 작용기는 트레실, 토실 및 말레이미도기이다.

따라서, 본발명의 바람직한 일예에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

a) pH 1.5-7.5 의 수용성 매질중 트레실 활성화 다당류 용액과 폴리스티렌 표면을 접촉하고,

b) 헹굼용액으로 상기 폴리스티렌 표면을 헹구고,

c) 상기 트레실 활성화 다당류로 코팅된 폴리스티렌 표면을 건조한다.

본발명의 또다른 일례에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

a) 이온강도 0.5-6의 수용성 매질중 말레이미도 활성화 다당류 용액과 폴리스티렌 표면을 접촉하고,

b) 헹굼용액으로 상기 폴리스티렌 표면을 헹구고,

c) 말레이미도 활성화 다당류로 코팅된 상기 폴리스티렌 표면을 건조한다.

본발명의 또다른 일례에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

a) pH 1.5-7.5의 수용성 매질중 토실 활성화 다당류 용액과 폴리스티렌 포면을 접촉시키고,

b) 헹굼용액으로 상기 폴리스티렌 표면을 헹구고,

c) 토실 활성화 다당류로 코팅된 상기 폴리스티렌 표면을 건조한다.

이전에 언급한 바람직한 일례에 대해서, 고페 표면과 관련하여 상기 언급한 조건 및 권고사항, 코팅조건 및 폴리히드록시 폴리머도 또한 적용할 수 있다.

(용도)

최종적으로 사용하기 전에, 활성화된 폴리히드록시 폴리머를 갖는 코팅된 고체표면을 추가로 기능화할 수 있거나, 다른 작용기를 형성하도록 활성화된 폴리히드록시 폴리머의 몇몇 또는 모든 작용기를 반응시킬 수도 있다. 이러한 방식으로, 폴리히드록시 폴리머에 의한 고체표면 코팅을 용이하도록 하는 작용기를 최초 과정(단계 a) 내지 c))에서 선택할 수도 있으며 이들 작용기를 이후에 다른 작용기로 전환할 수도 있다. 트레실 및 토실기는 최초 과정에 대한 작용기의 좋은 예이다.

일례로서, 고정화된 카르복시산 작용기화 폴리히드록시폴리머를 형성하기 위해서 트레실 활성화 폴리히드록시 폴리머를 ω-아미노 카르복시산 (일반적으로 H2N-CnH2n-COOH, 여기서 n은 1-20, 바람직하게는 1-8임)과 반응시킬 수도 있다. 이는 실시예 10에서 예시하고 있다.

또다른 변형으로서, 고정화된 아미노 작용기화 폴리히드록시폴리머를 제조하기 위해서, 트레실 활성화 폴리히드록시 폴리머와 α, ω-디아미노-알칼(일반적으로, H₂N-C_nH_2n-COOH, 여기서 n은 1-20, 바람직하게는 1-8임)과 반응시킬 수 있다.

또다른 변형으로서, 고정화된 티올 작용기화 폴리히드록시 폴리머를 제조하기 위해서, 트레실 활성화 폴리히드록시 폴리머를 시스타임 또는 동족체(일반적으로, H₂N-C_nH_2n-S-S-C_nH_2n-NH₂, 여기서, n은 1-10, 바람직하게는 1-4임)와 반응시키고, 이어서 환원시킬 수 있다. 이를 실시예 11에서 예시하고 있다.

더욱이, 알레이미드 시약, 예컨대 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 술포-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1=카르복실레이트(술포-SMCC), 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부틸레이트(SMPB),술포-숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부틸레이트(술포-SMPB), N-감마-말레이미도부티릴록시-숙신이미드 에스테르(GMBS) 또는 N-감마-말레이미도부틸릴록시-술포숙신이미드 에스테르와 고정화된 아미노 작용기 폴리히드록시 폴리머와 반응시킴으로써 고체 표면를 코팅한 후에, 상기한 바와 같이 토실 활성화 폴리히드록시 폴리머를 경유한 말레이미도 작용기화 폴리히드록시 폴리머의 제조를 또한 수행할 수 있다.

또한, 아미노기와 반응가능한 다른 작용기(예, 토실, 트리플릴, 시아노젠브로마이드 부가생성물, 펜타플루오로벤젠술포닐 및 비닐술렌)에도 상기 변형예를 적용할 수 있다.

따라서, 본발명의 흥미있는 일례에서, 상기 방법은 아미노기, 바람직하게는 1차 아미노기를 포함하는 시약과 아미노 반응성 작용기를 반응시킴으로서 활성화된 폴리히드록시폴리머로 코팅된 고체표면의 아미노산 반응성 작용기(예, 카르복시산,아미노, 티올 및 말레이미도중에서 선택됨)를 다른 작용기로 전화하는ㄴ 이후 단계(단계 d)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 아미노 반응성 작용기는 트레실, 토실, 시아노젠브로마이드, 트리플릴, 펜타플루오로벤젠술포닐 및 비닐술폰에서 선택된 작용기일 수 있다. 상기 추가단계의 시약는 상기에서 예시했으며, 조건은(예, 수용성 완충액) 본기술분야의 전문가에게 알려져 있을 것이다.

상기 일례범위내에서 다음 경우가 특히 흥미있다.

a) 여기서, 아미노기를 포함하는 상기 시약은 일반식 H₂N-C_nH_2n-COOH를 가지며,여기서 n은 1-20, 바람직하게는 1-8이며, 이에 의해 고정화된 카르복시산 작용기화 폴리히드록시폴리머가 형성되며,

b) 여기서, 아미노기를 포함하는 상기 시약은 H₂N-C_nH_2n-S-S-C_nH_2n-NH₂을 가지며, 여기서, n은 1-10, 바람직하게는 1-4이며, 형성된 중간체를 이어서 환원시키며, 이에 의해 고정화된 티올기화 폴리히드록시폴리머가 형성되고,

c) 여기서, 아미노기를 포함하는 상기 시약은 H₂N-C_nH_2n-NH₂을 가지며, 여기서, n은 1-0, 바람직하게는 1-8이며, 형성된 중간체를 이어서 환원시키며, 이에 의해 고정화된 아미노기화 폴리히드록시폴리머가 형성된다.

코팅된 고체표면은 그 자체가 신규하기 때문에, 본발명은 또한 활성화된 폴리히드록시폴리머로 코팅된 고체표면에 관한 것이다. 그러한 고체 표면은 본발명의 방법에 따라 제조되는 것이 유리할 수 있으나, 다른 선택적 방법도 또한 적용될 수 있다.

본발명에 따라 제조된 상기 고체표면은 다양한 기원의 분자를 고정화하는데 특히 유용하다. 특히 흥미있는 분자의 예로는 아미노산, 올리고- 및 폴리펩타이드(구체적 예는 PNA), 단백질, 면역글로불린, 헵텐, 효소, 항체(단클론 및 다클론), 항원, 다당류, 올리고- 및 폴리뉴클레오타이드(RNA 및 DNA과 같은 핵산), 미생물, 원핵세포, 진핵세포등과 같은 생분자이다. 트레실 활성화 폴리히드록시 폴리머는 상대적으로 짧은 펩타이드류 및 핵산,예컨대 1-50 또는 1-30 아미노산, 및 1-10 또는 1-20 뉴클레오타이드로 이루어지는 핵산의 고정화에 특히 바람직하다.

따라서, 본발명은 또한 본명세서에 기술된 바와 같이 활성화된 폴리히드록시폴리머로 코팅된 고체표면을 제공하고, 여기서 적어도 일부분의 활성화기를 경유하여 상기 폴리히드록시폴리머에 하나이상의 생분자가 고정화되어 있다. 상기 생분자는 일반적으로 아미노산, 올리고-및 폴리펩타이드, 단백질, 면역글로불린, 헵텐, 효소, 항체, 항원, 다당류, 올릭 및 폴리뉴클레오타이드, 미생물, 원핵세포, 진핵세포중에서 선택된다. 특히 흥미있는 일례에서, 상기 생분자는 1-30 아미노산으로 이루어진 펩타이드(PNA포함) 및 1-20개 뉴클레오타이드로 이루어진 핵산중에서 선택된다. 폴리히드록시폴리머상의 활성화기로서 트레실기는 특히 이들 예에서 바람직하다.

그러한 (생)분자의 고정화조건은 알려져 있다. Hermanson, Mallia and Smith, Immobilized Affinity Ligand Technologies, Academic Press, 1992, Immobilized Enzymes and cells, in Methods in Enzymology, Vol 135, Mosbach, Ed., Academic Press, 1987 and US pat. No. 5,516,673을 참조.

따라서, 본발명은 또한 본발명의 방법에 따라 얻거나 얻어질 수 있는 고페 표면의 생분자 고정화 용도에 관한 것이다.

본발명에 따른 방법의 또다른 흥미로운 일례에서, 어어진 고체표면은 광범위한 생분자를 고정화하기 위해서 두가지 유형의 활성화된 폴리히드록시 폴리머를 가진다. 혹은, 상기 폴리히드록시 폴리머는 하나 이상의 작용기를 가짐으로써 디-활성화된 폴리히드록시폴리머로 작용한다. 접촉단계에서 두가지 다른 활성화된 폴리히드록시 폴리머를 사용하거나, 고체표면상에 이미 코팅된 폴리히드록시 폴리머의작용기를 부분적으로 전환함으로써 이를 달성할 수 있다.

본발명은 다음의 실시례에 의해서 추가로 설명되어질 것이다.

아무런 언급이 없으면 화학물질은 Riedel de-Haen, Seelze, Germany의 분석등급이다.

펩타이드 결합능을 시험하기 위한 일반적인 방법

타이드A general method to test the peptide binding capacity

0.1 M, pH 9.6 카보네이트 완충액에 펩타이드-바이오틴-MP9 (바이오틴-FAQKEPAFLKEYHLL)을 용해하고(0.01 mg/ml), 시험할 웰에 100 ㎕을 첨가하였다. 60분 반응후에, 세척완충액(0.5 M NaCl 및 1% Triton x-100 (Sigma)을 포함하는 PBS)으로 웰을 세척하였다. 1% 소혈청 알부민(BSA, Sigma), 15% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 8000 (Sigma), 및 10 mM 에탄올 아민을 포함하는 카보네이트 완충액으로 잔류 결합자리를 차단하였다. 세척후에, 희석 완충액(1% BSA을 포함하는 세척완충액)중 스트렙타비딘-호스 래디쉬 퍼옥시다제(streptavidin-HRP, Amersham), 및 화화적 기질로서 기질완충액(시트레이트 포스페이트 완충액, pH 5.0)중 1 mg/ml의 O-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(OPD, Sigma)를 사용하여 바이오틴기를 통해 고정화된 펩타이드를 탐지하였다.

실시예 1 트레실 활성화 덱스트린(TAD)의 합성

덱스트린 (덱스트린에 결합된 물을 제거하기 위해서 동결건조시킨 (Sigma, mW 70000) 4.5g을 건조 N-메틸-피롤리딘온(NMP, 225 ml)에서 90-92℃, 자석으로 저으면서 용해시켰다. 40℃로 냉각시킨 후에, 2,2,2-트리플루오로에탄술포닐 클로라이드(트레실 클로라이드) 2764㎕을 첨가하였다. 15분후에, 2020㎕ 건조 피리딘을 첨가하고 가열하여 제거하였다. 실온에서 60분간 저은 후에, 1200ml 찬 에탄올에서 TAD를 침전시켰다. 침전물을 200ml 0.5% 아세트산에 용해시키고, 차단 분자량이 12000-14000 Da를 갖는 투석막에서 3-5배의 0.5% 아세트산으로 투석하였다. 투석후에 TAD를 동결건조하였다.

실시예 2 토실 활성화 덱스트린의 합성(TosAD)

건조 N-메틸-피롤리딘온(NMP, 40 ml)에 덱스트란(덱스트린에 결합된 물을 제거하기 위해서 동결건조시킨 (Sigma, mW 70000) 0.8g을 90-92℃에서 자석으로 저으면서 용해하였다. 60℃로 냉각시킨 후에, 건조 NMP중에 용해된 p=톨루엔술포닐(토실)클로라이드 2.8g을 첨가하였다. 1분후에, 2ml 건조 피리딘을 첨가하였다. 60분후에, 상등액을 따르고 침전물을 얻고, 10ml NMP 및 이어서 10ml 에탄올(99.0%)로 침전물을 세척하였다. 침전물을 5ml 물로 세척하고, 30ml 에탄올(9.95)로 침전하였다. 이어서 침전물을 5 ml 물에 용해시키고 동결건조하였다. 280 nm에서 UV를 사용하여 덱스트란에 토실의 도입여부를 탐지할 수 있다.

실시예 3 말레이미도 활성화 덱스트린의 합성(MAD)

덱스트린 (덱스트린에 결합된 물을 제거하기 위해서 동결건조시킨 (Sigma,mW 70000) 100 mg을 건조 1-메틸-피롤리딘온(5 ml)에서 90-92℃, 자석으로 저으면서 용해시켰다. 실온으로 냉각한 후에, 1 ml의 건조 디메틸 술폭사이드에 용해된 p-말레이미도페닐 이소시아네이트(PMPI, Bioaffinity Systems, Roscoe, II, USA) 50 mg을 첨가하였다. 하룻밤 반응시킨 후에, 산물을 20 ml 에탄올(99.9%)로 침전시키고, 물 5ml에 용해하고, 동결건조하였다.

실시예 4 고체표면상 TAD 코팅에 미치는 pH의 영향

pH 2.6 내지 9.6을 포함하는 여러가지 완충액에서 TAD를 용해시킴으로써, 활성화된 폴리히드록시폴리머,예컨대 TAD에 대한 pH의 영향을 조사하였다. 0.5% 아세트산(pH 2.6), 시트레이트/포스페이트 완충액 (0.035 M 시트레이트, 0.075 M 포스페이트, pH 5.0), PBS ( 0.01 M 포스페이트, 0.15 M NaCl, pH 7.2) 또는 카보네이트 완충액 (0.1 M 카보네이트, pH 9.6)에 TAD를 용해시켜 최종 농도가 0.5mg TAD/ml완충액가 되도록 하였다. 폴리스티렌 마이크로농도 웰(Polysorp, Nunc, Denmark)에 150 ㎕/ml 상기 용액을 분배하고, 실온에서 하룻밤동안 반응시켰다. 0.5% 아세트산으로 상기 웰을 2회 세척하고, 37℃에서 하룻밤동안 건조하였다. "펩타이드 결합능을 시험하기 위한 일반적인 방법"에 따라 상기 판을 테스트하고 도 1에 그 결과를 나타냈따. pH 2.6 및 5.0에서 코팅한 경우에 가장 높은 펩타이드 결합능을 갖는 표면이 얻어졌다. pH 7.2에서 코팅한 경우에 약 15% 정도로 펩타이드 결합의 신호를 감소시켰다. pH 9.6에서 코팅한 경우에 약 70% 정도 신호가 감소하였다. 이러한 결과로 부터, 고체위에 TAD을 직접 코팅하는 것은 산성조건, 예컨대 0.5% 아세트산 또는 중성조건하에서 이루어져야 한다는 것을 설명한다.

실시예 5: 여러가지 물질로 된 고체상에 TAD코팅

0.5% 아세트산중 TAD, 0.5 mg/ml를 니켈 스파튤라, 유리시험관, 폴리카보네이트 마이크로농도 판 및 폴리스티렌 마이크로농도 판과 같은 여러가지 물질의 표면에 첨가하고, 실온에서 하룻밤동안 반응시켰다. 0.5% 아세트산으로 세척하고 37℃에서 하룻밤동안 건조한 후에, TAD 코팅된 물질을 "펩타이드 결합능을 시험하는 일반적인 방법"에 따라 테스트하였다. 각 물질의 코팅된 샘플상에서가 아니라 코팅된 TAD상에서 상기 펩타이드 결합 테스트를 수행하였고, 얻어진 결과를 도 4에 나타냈다. TAD 코팅으로 인해 본 실험에서 테스트한 물질들이 코팅되지 않은 물질보다 펩타이드에 더욱 잘 결합할 수 있음이 명백하다.

실시예 6: 말레이미도 활성화 덱스트란(MAD)에 의한 코팅 및 MAD 코팅된 표면의 화학적 특이성 확인

다양한 양의 MAD로 코팅된 마이크로농도 판에 대한 시스테인의 결합. 수용액중 4M NaCl에서 1 mg/ml로 시작하는 일련의 희석농도로 MAD를 마이크로농도 판(MAXISorp)에 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 물로 세척한 후에, 상기 판을 37℃에서 하룻밤동안 건조하였다. pH 7.2, PBS중 0.01 mg/ml로 시스테인과 라이신을 첨가하였다. 1시간동안 반응한 후에, 상기 판을 세척하고, 0.1% 트윈 20, pH 7.2인 PBS중 0.05mg/ml의 바이오틴-NHS을 첨가하였다. 실온에서 1시간동안 반응한 후에, 상기 웰을 세척완충액으로 세척하고, (1% BSA를 포함하는 세척 완충액, pH 7.2)중 스트렙타비딘-HRP을 첨가하였다. 마지막으로, 기질 완충액중 OPD 1mg/ml을 첨가하였다. 2N H2SO4을 사용하여 상기 반응을 중단시키고, MRX ELISA판독기(Dynex Technologies)로 490 nm에서 상기 웰을 분석하였다. 도 6은 그 결과를 나타내며 시스테인의 결합은 MAD에 의한 표면 전코팅에 의존적임이 명백하다. 더욱이, 이러한 실험으로부터, 라이신(세모 표시)을 사용한 경우에 아무런 결합이 없었기 때문에, 시스테인(동그라미표시) 결합은 티올기을 통해 일어난다는 것을 알 수 있다. 또한 시스테인, 라이신, 글루탐산 및 글라이신을 이용한 간단한 실험에서 특이성을 검사하였다(도 7). PBS, 0.01mg/ml, pH 7.2중 MAD코팅된 마이크로농도판에 상기 아미노산를 첨가하고 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 상기한 대로 바이오틴-NHS로 고정화된 아미노산을 탐지하였다.

실시예 7. 마이크로농도 판상에 MAD를 코팅한 경우에 고염(high salt) 이온강도의 효과

스톡 용액(20 mg/ml물)로 MAD를 희석하여 0-4 M NaCl 용액중 0.5 mg/ml로 하고, 마이크로농도 판(MAXISorp)에 첨가하였다. 3시간동안 반응시킨 후에, 물로 상기 판을 세척하고, 37℃에서 하룻밤동안 건조하였다. 시스테인 및 라이신, 0.01 mg/ml (또는 대조구로 완충액만을 사용)을 PBS에 첨가하여 녹이고, 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 세척한 후에, 실시예 6에서 언급한 대로 바이오틴-NHS로 시스테인 또는 라이신의 고정화를 분석하였다. 그 결과를 표 5에 나타냈으며, 이에 의하면 MAD 코팅의 경우에 이온강도의 증가로 티올을 포함하는 분자의 결합이 증가하며, 이 실험에서는 시스테인을 예로 들었다.

실시예 8. TAD 코팅된 표면의 아미노산 곁사슬 특이성에 대한 시험

알파-아미노기에 t-부톡시카르보닐(Boc)을 가즌 아미노산의 기판을 TAD코팅된 폴리스티렌 마이크로농도 판의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 물로 상기 웰을 세척한 후에, 실온에서 30분간 물중 95% 트리플루오로아세트산(TFA)의 처리(도 2중 검은 막대), 또는 대조구로서 물만 처리(도 2중 흰색 막대)함으로써 Boc 그룹을 고정화된 아미노산으로부터 분리시켰다. 물로 상기 웰을 세척하고, 바이오틴-N-히드록시숙신이미드(바이오틴-NHS) pH 7.2, 0.1% 트윈 20을 포함하는 PBS중 0.05 mg/ml을 첨가하였다. 실온에서 1시간동안 반응시킨 후에, 세척 완충액으로 상기 웰을 세척하고, 희석 완충액(1% BSA를 포함하는 세척 완충액, pH 7.2)중 스트렙타비딘-HRP을 첨가하였다. 마지막으로 기질 완충액중 OPD, 1mg/ml을 첨가하였다. 2 N H2SO4을 사용하여 상기 반응을 중단하고, MRX ELISA판독기(Dynex Technologies)로 490nm에서 상기 웰을 판독하였다. 도 2로부터, TAD 코팅된 표면은 라이신 및 시스테인 곁사슬, 즉 1차 아민 및 티올에 우선성을 가짐이 명백하다. 이는 상기 이론과도 일치한다.

실시에 9. TAD 코팅딘 마이크로농도 판에 공유결합된 펩타이드를 사용한 B-세포 에피토페의 확인

5 아미노산 중복을 갖는 15개 아미노산을 갖는 펩타이드로서 쥐의 괴사인자α(mTNFα)의 전장서열을 포함하는 펩타이드를 합성하였다. TAD 코팅된 마이크로농도 판 및 높은 결합제 유형의 종래 마이크로농도 판(MAXISorp)상에 이들 펩타이드를 고정화시켰다(카보네이트 완충액중 0.05 mg/ml, 실온에서 2시간). 세척 및 차단후에(펩타이드 결합능 시험하기 위한 일반적인 방법에 기재된 대로), 항-TNFα항-혈청을 첨가하였다. 그런 후에 B-세포 에피토페를 포함하는 펩타이드는 항-혈청에의해 인식될 것으로 예상되었다. 도 2은 상기 B-세포 에피토페 확인 분석의 결과를 나타낸다. 공유결합으로 고정화된 펩타이드(A)가 비-공유적으로 고정화된 펩타이드(B)에 비해 더 잘 인식할 것이다. 따라서, TAD 코팅판에서는 행하지 않고 종래의 판에서만 실험을 수행한다면, TNFα분자의 N-말단부에 B-세포 에피토페에 대한 정보을 얻을 수 없었을 것이다. 종래의 판(B)에서 수행한 실험부분은 TAD코팅된 판(A)에서 얻어질 수 없는 정보를 제공하지 못한다.

실시예 10. 플랫포옴처럼 TAD 코팅된 표면을 사용하여 기능적 카로복시산을 갖는 표면 형성

TAD 코팅된 마이크로농도 판에 카보네이트 완충액중 6-아미노 헥사논산(hexanoic acid(시그마)) 1 mg/ml을 첨가하고 실온에서 2시간 반응시켰다. 상기 판을 세척하고, 카르복시기의 활성화 및 이어서 표지된 펩타이드의 결합으로 표면상에 기능적 카르복시산의 존제를 테스트하였다. 1-(3-디아미노프로필)-3-에틸카르보디이미도(EDC, 물중에서 0.18 mg/ml) 및 N-히드록시 숙신이미드 (NHS, 물중에서 1.23 mg/ml)의 새로운 용액을 첨가하여 상기 카르복시기를 활성화하였다. 대조구로서, EDC 및 NHS를 모두, 단독으로, 물과 함께 또는 물만 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시켰다. 물로 세척한 후에, 바이오틴화된 펩타이드(바이오틴-FAQKEPAFLKEYHLL) 0.2% 트윈20을 포함하는 pbs중 0.01 mg/ml을 첨가하였다. 상기 결과를 도 8에 나타냈다. 분명히, 활성화시키기 위해서 EDC와 NHS를 모두 사용한 경우에만 펩타이드의 적합한 결합을 볼 수 있었다. 단지 EDC만을 사용한 경우에는 카르복시기을 갖는 반응성 에스테르를 생성하였으나 물에서 매우 불안정하였다.NHS 단독으로 사용한 경우에 반응성 산물을 생성하지 못했으나, 만약 EDC와 NHS가 동시에 존재하는 경우에, EDC에스테르는 NHS와 빠르게 반응하여 안정한 NHS 에스테르를 형성한다.

실시예 11. 플랫폼으로서 TAD 코팅된 표면을 사용하여 기능적 티올기를 갖는 표면의 형성

카보네이트 완충액중 1mg/ml 의 2.2'-디티오-비스(에틸아민)(시스타민, 시그마)을 TAD 코팅된 표면에 첨가하고, 실온에서 2시간동안 반응시켰다. 물로 세척한 후에, 물중 소디움 디티오니트(시그마사) 2mg/ml을 첨가하고 실온에서 3시간동안 반응시켰다. 상기 판을 물로 세척하고, 티올기에 특이적으로 반응하는 바이오틴-말레이미도(시그마, PBS중 0.05 mg/ml)를 첨가하여 생성된 티올기를 탐지하고, 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 잔여 아민 결합능(잔여 트레실기)을 시험하기 위해서, pH 9.6, 카보네이트 완충액중 0.01 mg/ml의 펩타이드 바이오틴-MR9(바이오틴-FAQKEPAFLKEYHLL)를 첨가하였다. 색원성 기질로서 희석 완충액(1% BSA를 포함하는 세척 완충액)중 접합된 스트렙타비딘-호스 래디쉬 퍼옥시다제(스트렙타비딘-HRP, Amersham), 및 기질 완충액(시트레이트 포스페이트 완충액 pH 5.0)중 O-페닐렌디아민 디히드로클로라이드을 사용하여 고정화된 바이오틴기(바이오틴-MP9 또는 바이오틴-말레이미도중에서 유래)를 탐지하였다. 도 9는 첫번째 두개 막대에서 TAD 코팅 표면이 어떻게 바이오틴-말레이미도(TAD/바이오틴-말) 또는 펩타이드 바이오틴-MP9(TAD/바이오틴-MP9)에 결합하는지를 보여준다. 세번째 막대는 티올이 많은 표면에(티올/바이오틴-말) 말레이미드 그룹이 결합하는 것이고 마지막 막대는 티올이많은 표면에 바이오틴-MP9(티올/바이오틴-MP9)이 결합하는 것이다. 명백히, 시스타민 및 소디움 디티오니트를 처리한 TAD 코팅 표면은 펩타이드 바이오틴-MP9에 결합하는 능력을 잃게 되나, 바이오틴-말레이미드로서 티올 특이적 시약에는 결합하는 능력을 얻는다.

Claims (48)

1. a) 고체표면에 활성화 폴리히드록시폴리머를 결합시키기 위해서, pH 1.5-10 및/또는 이온강도 0.1-8 을 갖는 수용성 매질중에 활성화 폴리히드록시 폴리머의 코팅용액과 고체표면을 접촉시키고,

   b) 활성화 폴리히드록시폴리머가 부착된 고체표면을 헹굼용액으로 헹구고,

   c) 활성화 폴리히드록시폴리머가 부착된 고체표면을 임의로 건조시키는 것을 포함하며, 상기 고체표면이 아미노기, 이미노기, 또는 티올기가 실질적으로 포함되지 않는, 수용성 활성화 폴리히드록시폴리머로 고체표면을 코팅하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 활성화 폴리히드록시폴리머가 실질적으로 아미노기, 암모늄기, 티올기, 페닐기, 나프틸기, 피리딜기, 또는 피리돈기를 포함하지 않는 방법.
3. 전항중 어느 한항에 있어서, 상기 폴리히드록시폴리머가 천연 폴리히드록시 화합물 및 합성 히드록시화합물중에서 선택되는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 폴리히드록시폴리머가 다당류인 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 다당류가 덱스트란, 셀룰로스, 아가로스, 및 전분중에서 선택되며, 바람직하게는 덱스트란인 방법.
6. 제 3 항에 있어서, 상기 폴리히드록시폴리머가 폴리비닐알콜, 폴리(히드록시메틸메타크릴레이트), 폴리(히드록시에틸메타크릴레이트), 폴리(히드록시프로필메타크릴레이트), 및 이들의 공중합체중에서 선택되는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 폴리히드록시폴리머가 폴리비닐알콜인 방법.
8. 전항중 어느 한항에 있어서, 활성화하기전에 폴리히드록시폴리머의 평균 분자량(질량)이 2,000이상과 같은 1,000이상, 바람직하게는 2,500-2000,000, 더욱 바람직하게는 3,000-1,000,000, 특히 5,000-500,000인 방법.
9. 전항중 어느 한항에 있어서, 상기 폴리히드록시폴리머는 10 mg/ml이상, 바람직하게는 50 mg/ml이상과 같은 25 mg/ml이상, 특히 150 mg/ml이상과 같은 100 mg/ml이상인 방법.
10. 전한중 어느 한항에 있어서, 활성화되기 전에 상기 폴리히드록시폴리머의 C(탄소원자) 및 OH기(히드록시기)간의 비율이 1.5-2.3과 같은 1.3-2.5, 바람직하게는 1.6-2.1, 특히 1.85-2.05인 방법.
11. 전항중 어느 한항에 있어서, 상기 폴리히드록시폴리머는 트레실(트리플루오로에틸술포닐), 말레이미도, 시아노젠브로마이드, 토실(p-톨루엔술포닐), 트리플릴(트리플루오로메탄술포닐), 펜타플루오로벤젠술포닐, 및 비닐 술폰기중에서 선택되고, 바람직하게는 트레실, 말레이미도, 토실, 트리플릴, 펜타플루오로벤젠술포닐 및 비닐술폰기중에서 선택되며, 특히 트레실, 말레이미도 및 토실기중에서 선택되는 작용기로 활성화되는 방법.
12. 전항중 어느 한항에 있어서, 활성화 폴리히드록시폴리머의 작용기가 상기 폴리히드록시폴리머의 일부의 히드록시기를 퉁해 폴리히드록시폴리머에 결합하는 방법.
13. 전항중 어느 한항에 있어서, 상기 폴리히드록시폴리머의 골격은 활성화에 의해서 실질적으로 영향을 받지 않는 방법.
14. 전항중 어느 한항에 있어서, 알데하이드기가 상기 폴리히드록시폴리머에 실질적으로 포함되지 않는 방법.
15. 전항중 어느 한항에 있어서, 상기 활성화 폴리히드록시폴리머가 트레실 활성화 덱스트란인 방법.
16. 제 1항 내지 14항중 어느 한항에 있어서, 상기 활성화 폴리히드록시폴리머가 말레이미도 활성화 덱스트란인 방법.
17. 제 1항 내지 14항중 어느 한항에 있어서, 상기 활성화 폴리히드록시폴리머가 토실 활성화 덱스트란인 방법.
18. 전항중 어느 한항에 있어서, 상기 고체 표면이 유기 폴리머류, 유리류, 세라믹류 또는 금속류 본체의 표면인 방법.
19. 제 18 항에 있어서, 상기 유기 폴리머가 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌글리콜 테레프탈레이트, 폴리비닐아세테이트, 폴리메틸펜텐, 폴리비닐피롤리딘온, 폴리아크릴로니트릴, 폴리메틸메타크릴레이트, 및 폴리비닐클로라이드중에서 선택되고, 바람직하게는 폴리스티렌 및 폴리카보네이트중에서 선택되는 방법.
20. 제 18 항에 있어서, 상기 유리는 보로실리케이트 유리 및 소다-석회 유리중에서 선택되는 방법.
21. 제 18 항에 있어서, 상기 금속은 니켈, 철, 구리,금, 은, 알루미늄 및 아연중에서 선택되는 방법.
22. 제 1항 내지 18항중 어느 한항에 있어서, 상기 고체표면은 폴리스티렌 본체, 폴리카보네이트 본체, 보로실리케이트 유리 본체, 또는 소다석회 유리 본체의 표면인 방법.
23. 제 18항 내지 22항중 어느 한항에 있어서, 상기 본체는 시트,필름, 비드, 펠렛, 디스크, 판, 고리, 막대, 망, 필터, 트레이, 마이크로농도 판, 스틱, 또는 다수개의 날이 있는 스틱의 형태이고, 바람직하게는 마이크로농도 판, 스틱 또는 비드 형태인 방법.
24. 전항중 어느 한항에 있어서, 상기 고체표면은 폴리스티렌 마이크로농도 판의 표면, 폴리스티렌 비드의 표면, 폴리스티렌 스틱의 표면, 폴리카보네이트 마이크로농도 판의 표면, 유리 비드의 표,면 및 유리판의 표면중에서 선택되는 방법.
25. 전항중 어느 한항에 있어서, 상기 단계 a)에서 사용된 코팅용액은 폴리히드록시 폴리머이외에 pH조절제 및/또는 카오트로픽제(chaotropic agent)을 포함하고, 임의로 하나이상의 보조성분을 포함하는 방법.
26. 전항중 어느 한항에 있어서, 코팅용액중 활성화 폴리히드록시폴리머의 농도는 0.001 내지 5 ㎍/ml, 전형적으로 0.01-1 ㎍/ml, 특히 0.1-50 ㎍/ml인 방법.
27. 전항중 어느 한항에 있어서, 코팅될 표면의 단위면적당 사용된 활성화 폴리히드록시폴리머의 양은 0.01-500 ㎍/㎠, 바람직하게는 0.06-200 ㎍/㎠, 특히 0.1-50㎍/㎠인 방법.
28. 전항중 어느 한항에 있어서, 코팅용액중 pH는 1.5-10, 바람직하게는 2.0-7.5, 더욱 바람직하게는 2.0-5.5인 방법.
29. 전항중 어느 한항에 있어서, 폴리히드록시폴리머를 포함하는 코팅용액의 이온강도가 0.1-8, 바람직하게는 0.5-6, 더욱 바람직하게는 0.8-5, 특히 1.2-4인 방법.
30. 전항중 어느 한항에 있어서, 단계 d)의 건조단계는 20-56℃, 바람직하게는 20-45℃에서 수행하는 방법.
31. 전항중 어느 한항에 있어서, 상기 코팅 표면의 안정성이, 37℃에서 1년간 저장한 후에 코팅되지 않는 고체표면 및 본발명의 활성화 폴리히드록시 폴리머로 코팅된 유사한 고체표면상에서 시험을 한 경우에, 아미노산 곁사슬의 특이성에 대한 시험에서 대부분 흡수 아미노산에 대한 흡광도 차이는 25%이하, 바람직하게는 15%이하, 더욱 바람직하게는 10%이하, 특히 5%이하로 감소하는 것인 방법.
32. 전항중 어느 한항에 있어서,

    a) pH 1.5-7.5의 수용성 매질중 트레실 활성화 다당류 용액과 폴리스티렌 표면을 접촉시키고,

    b) 헹굼용액으로 상기 폴리스티렌 표면을 헹구고,

    c) 트레실 활성화 다당류로 코팅된 폴리스티렌 표면을 건조하는 것으로 이루어지는 방법.
33. 제 1항 내지 31항중 어느 한항에 있어서,

    a) 이온강도 0.5-6의 수용성 매질중 말레이미도 활성화 다당류의 용액과 폴리스티렌 표면을 접촉시키고,

    b) 헹굼용액으로 상기 폴리스티렌 표면을 헹구고,

    c) 말레이미도 활성화 다당류로 코팅된 폴리스티렌 표면을 건조하는 것으로 이루어지는 방법.
34. 제 1항 내지 31항중 어느 한항에 있어서,

    a) pH 1.5-7.5의 수용성 매질중 토실 활성화 다당류 용액에 폴리스티렌 표면을 접촉시키고,

    b) 헹굼용액으로 상기 폴리스티렌 표면을 헹구고,

    c) 토실 활성화 다당류로 코팅된 폴리스티렌 표면을 건조하는 것으로 이루어지는 방법.
35. 전항중 어느 한항에 있어서, 이어서

    d) 아미노 반응성 작용기를 아미노기를 포함하는 시약과 반응시킴으로써, 활성화 폴리히드록시폴리머로 코팅된 고체표면의 아미노 반응성 작용기를 다른 작용기로 전환하는 단계를 포함하는 방법.
36. 제 35 항에 있어서, 아미노기를 포함하는 시약은 H₂N-C_nH_2n-COOH의 일반식을 가지고 여기서 n은 1-20, 바람직하게는 1-48며, 형성된 중간체를 이어서 환원시킴으로써 고정화된 카르복시산 작용기화 폴리히드록시폴리머가 형성되는 방법.
37. 제 35 항에 있어서, 아미노기를 포함하는 시약은 H₂N-C_nH_2n-S-S-C_nH_2n-NH₂을 가지고, 여기서 n은 1-10, 바람직하게는 1-4이며, 형성된 중간체를 이어서 환원시킴으로써, 고정화된 티올 작용기화 폴리히드록시폴리머가 형성되는 방법.
38. 제 35 항에 있어서, 아미노기를 포함하는 상기 시약은 일반식 H₂N-C_nH_2n-NH₂를 가지며, 여기서 n은 1-20, 바람직하게는 1-8이며, 이에 의해 고정화된 아미노 작용기화 폴리히드록시폴리머가 형성되는 방법.
39. 제 38 항에 있어서, 말레이미도 시약과 상기 고정화된 아미노 작용기화 폴리히드록시폴리머를 반응시킴으로써, 고정화된 말레이미도 작용기화 폴리히드록시폴리머가 형성되는 방법.
40. 제 35항 내지 39항중 어느 한항에 있어서, 아미노 반응성 작용기중 단지 일부분이 반응함으로써, 두가지 다른 유형의 작용기가 고정화된 폴리히드록시폴리머에 포함되는 방법.
41. 전항중 어느 한항에 있어서, 단계 c)가 포함되지 않은 방법.
42. 전항중 어느 한항에 있어서, 단계 c)가 포함된 방법.
43. 제 1항 내지 42항중 어느 한항에 기재된 방법에 의해 얻어질 수 있는, 활성화 폴리히드록시폴리머로 코팅된 고체표면.
44. 제 1항 내지 42항중 어느 한항에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 활성화 폴리히드록시폴리머로 코팅된 고체표면으로서, 적어도 일부분의 활성화기를 통해 하나 이상의 생분자가 상기 폴리히드록시폴리머에 고정된, 고체표면.
45. 제 44 항에 있어서, 상기 생분자는 아미노산, 올리고- 및 폴리펩타이드, 단백질, 면역글로불린, 헵텐, 효소, 항체, 항원, 다당류, 올리고 및 폴리뉴클레오타이드, 미생물, 원핵세포 및 진핵세포중에서 선택되는 것인 고체표면.
46. 제 44항 또는 45항에 있어서, 상기 폴리히드록시폴리머가 다당류이고, 상기 생분자가 1-30 아미노산으로 이루어진 펩타이드류 및 1-20 뉴클레오타이드로 이루어진 핵산류중에서 선택되는 고체표면.
47. 제 44항 내지 46항중 어느 한항에 있어서, 상기 활성화 폴리히드록시폴리머가 트레실기에 의해 활성화된 것인 고체표면.
48. 생분자의 고정화를 위한, 제 1항 내지 42항중 어느 한항에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 활성화 폴리히드록시폴리머로 코팅된 고체표면의 용도.