SE465221B - Saett att kovalent binda proteiner till hydrofila ytor - Google Patents

Description

465 221 2 _Immobilisering av proteiner till såväl organiska som oorganiska ytor är, som ovan nämnts, en väl beprövad teknik idag (se kapitel 4: Principles of Immobilization of Enzymes, Handbook of Enzyme Biotechnology, Second Edition, Ellis Horwood. Limited 1985) och. man kan binda in en stor mängd protein till ytan med bibehållande av god biologisk aktivitet.

Det har emellertid visat sig att de flesta fasta ytor är så beskaffade, att de spontant adsorberar proteiner och andra biomolekyler. Adsorption i vattenlösning drivs av främst två typer av fysikaliska krafter, elektrostatisk attraktion och hydrofob växelverkan. De flesta ytor är vid normalt pH negativt laddade men innehåller vanligtvis också hydrofoba domäner. Ett protein har vanligtvis både positiva, negativa och hydrofoba säten. Ett protein attraheras därför till de flesta ytor dels genom elektrostatisk attraktion mellan positiva säten och negativt laddade grupper i ytan, dels genom hydrofob växelverkan mellan hydrofoba domäner hos proteinet och hos ytan. Detta är t ex beskrivet i Surface and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers, Ed. J.D. Andrade, Plenum Press 1985, Vol. 2, pp 81.

Denna ospecifika adsorption är för de ovan nämnda applikationerna ett oönskat fenomen. Vid fastfasdiagnostik leder den till en försämrad känslighet och en kortare livs- längd hos det diagnostiska kitet. Vid såväl extrakorporal terapi som bioorganisk syntes leder spontanadsorptionen till försämrad aktivitet och en kortare livslängd hos kitet.

Ett sätt att drastiskt reducera adsorption av proteiner och andra biomolekyler på fasta ytor är att förse ytorna med ett skikt av en oladdad hydrofil polymer. Polyetylenglykol är ett exempel på en polymer som har använts för detta ändamål (se C.-G. Gölander: Preparation and Properties of Functional- ized Polymer Surfaces, Dissertation, Royal Institute of Technology, Stockholm 1986), men också andra ämnen som polysackarider, t ex dextran, cellulosaetrar och stärkelse; polyvinylalkohol; och neutral silikasol har använts för ändamålet. 465 221 i Genom att täcka ytan med ett skikt av den oladdade, hydrofila polymeren kan såväl elektrostatisk attraktion som hydrofob växelverkan undvikas. Spontanadsorptionen av pro- teiner kan på detta sätt reduceras och ibland nästan helt elimineras.

Hydrofiliserade ytor av detta slag är av stort intresse för bl a de ovan nämnda tillämpningarna av immobiliserade proteiner. För att kovalent binda in protein till en sådan yta krävs att man inför reaktiva funktionella grupper i det hydrofila skiktet, vilka kan tjäna som förankringspunkter för proteinet. Det har dock visat sig mycket svårt att åstadkomma kovalent inbindning av protein till väl hydrofiliserade ytor, även om dessa innehåller en hög koncentration reaktiva grupper. Den hydrofila ytan attraherar inte proteinet. Den verkar tvärtom avstötande, eftersom det är energetiskt ofördelaktigt för ett protein i vattenlösning att närma sig en sådan yta. Detta medför att mängden immobiliserat protein vanligtvis blir låg, oavsett om det är fråga om en antikropp för fastfasdiagnostik, ett immunförsvarsstimulerande ämne för extrakorporal terapi eller ett enzym för bioorganisk syntes.

Enligt föreliggande uppfinning har det nu visat sig möjligt att immobilisera stora mängder protein till en hydrofil yta. Den med protein immobiliserade hydrofila ytan har låg spontan adsorption av icke önskade produkter. Enligt uppfinningen åstadkommes detta genom att protein bindes till en hydrofil yta, som utgöres av en pà en bärare på i och för sig känt sätt immobiliserad nonjonisk polymer, vilken upp- visar med proteinet reaktiva grupper, varvid den nonjoniska polymeren har en grumlingspunkt av minst 50 över den tempe- ratur, vid vilken slutprodukten skall användas och att proteinet kovalent bindes på i och för sig känt sätt till den nonjoniska polymerens reaktiva grupper i. ett vattenbaserat reaktionsmedium vid en temperatur av över SOC under polymerens grumlingspunkt i reaktionsmediet. Principen för uppfinningen är att utnyttja det ovanliga temperaturberoendet som vissa nonjoniska vattenlösliga polymerer uppvisar.

Sålunda uppvisar polyalkylenglykoler och nonjoniska 465 221 4 cellulosaetrar avtagande vattenlöslighet vid förhöjd tempe- ratur. Mekanismen bakom detta temperaturberoende är fort- farande omdiskuterat men mycket pekar på att etylenoxid- gruppernas konformation ändras i samband med att temperaturen ökar, vilket medför att de får ökad hydrofob karaktär och därmed minskad löslighet i vatten. Vid en viss temperatur är polymerernas vattenlöslighet_sâ låg, att lösningen fassepa- kallas grumlingspunkt. Såväl polyalkylenglykoler som cellulosaetrar rerar. Denna temperatur allmänt för lösningens kan framställas med definierade grumlingspunkter och speciellt lämpliga att använda är de polymerer, som har grumlingspunkter i intervallet 30-100°C, företrädesvis 30-so°c. hyarofila skall hydrofil vid den temperatur, där den med protein belagda ytan Den nonjoniska polymeren vara användes. Den väljes på ett sådant sätt, att grumlingspunkten är minst 5°C, företrädesvis minst l0OC över den belagda ytans användningstemperatur. Föredragen temperatur vid immobilise- ringen av proteinet är från 3°C under den nonjoniska hydro- fila polymerens flockningstemperatur i reaktionsmediet till so°c.

Exempel på lämpliga polyalkylenglykoler är sådana, där etylenoxid och alkylenoxider med 3-4 kolatomer eller tetra- hydrofuran är slumpvis anlagrade eller anlagrade i block.

Speciellt lämpliga är polyalkylenglykoler med en molekylvikt av 2.000-10.000, polyoxipropylen som innehåller en eller flera block av molekylvikt av 300-3.000. Andra typer av lämpliga polyalkylenglykoler är och polyoxietylen med en addukter av etylenoxid i kombination med högre alkylenoxider eller tetrahydrofuran med en dihydroxi- eller polyhydroxi- förening, såsom glycerol eller pentaerytritol.

Cellulosaetrarna har lämpligen en sådan polymerisations- grad, att en 1%-ig vattenlösning därav har en viskositet av 10-10.000 cP, 30-5.000 cP, mätt Brookfield, LV, 12 rpm vid ZOOC. De kan uppvisa hydrofoba företrädesvis enligt kolvätegrupper, såsom metyl-, etyl-, propyl-, butyl-, benzyl- och högre kolvätegrupper med 8-24 kolatomer, eller polära hydroxylgrupper, såsom hydroxietyl, hydroxipropyl och 465 221- hydroxibutyl, eller blandningar av kolvätegrupper och polära grupper. Exempel på lämpliga cellulosaetrar är' metylcellu- losa, etylcellulosa, hydroxietylcellulosa, hydroxipropyl- cellulosa, metylhydroxietylcellulosa, metylhydroxipropyl- cellulosa, etylhydroxietylcellulosa och benzyletylhydroxi- etylcellulosa, Alkylhydroxialkylcellulosa är föredragna cellulosaetrar.

För att kovalent binda den hydrofila polymeren vid bäraren och kovalent binda proteinet vid den hydrofila polymeren införes på konventionellt sätt reaktiva funk- tionella grupper, vilka kan tjäna som förankringspunkt.

Exempel på reaktiva grupper, som kan införas på bäraren, är amino-, karboxyl- eller hydroxylgrupper, med vilka den hydrofila nonjoniska polymeren eller en aktiverad form därav kan reagera. Den hydrofila polymeren har lämpligen reaktiva grupper, såsom epoxy-, tresylat-, karbonylimidazol- och acylazidgrupper, vilka kan reagera med reaktiva grupper på bäraren och med proteinet, vilket normalt bindes via någon eller flera av dess amino-, tiol- och/eller fenoliska hydroxylgrupper. Sådan immobiliseringsteknik finns utförligt beskriven bl a i. de ovan nämnda referenserna, Surface and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers, Ed. J.D. Andrade, Plenum Press 1985, Vol. 2, pp 81 och C.-G. Gölander: Preparation and Properties of Functionalized Polymer Surfaces, Dissertation, Royal Institute of Technology, Stockholm 1986, vilka härmed intages som en del av beskriv- ningen av föreliggande uppfinning. I det fall proteinet är ett glykoprotein kan bindning ske till aldehydgrupper genererade i kolhydratdelen genom oxidation med t ex natrium- perjodat. Den hydrofila polymeren kan även förankras vid den fasta polymerytan pà känt sätt genom fysikalisk adsorption.

Uppfinningen illustreras ytterligare av nedanstående _ utföringsexempel. 465 221 s Exempel 1 Karboxylgrupper infördes på en polystyrenplatta med dimensionerna 2 x 2 cm genom att akrylsyra plasmapolymeri- serades på ytan. Den karboxylfunktionella ytan behandlades därefter med en 10%-ig lösning av diaminopropan i vatten i närvaro av vattenlöslig karbodiimid (0,6%) vid pH 4,5-5,0.

Plattan sköljdes med destillerat vatten och behandlades med en 10%-ig lösning av en diepoxid av en blocksampolymer av etenoxid och propenoxid med en molvikt på 2.000 och en grumlingspunkt på 40°c vid pH 9,5 under 15 h vid 20°c.

En 10%-ig karbonatbuffert, pH 9,5, innehållande 0,5 mg/ml IgG värmdes till 40oC och bringades i kontakt med epoxifunktionella plattor. Reaktionen fick pågå under 2 h vid 40°c.

Som referens användes dels en polystyrenplatta, som hydrofiliserats på samma sätt som ovan men där epoxid- grupperna före kontakten med IgG-lösningen vid 40OC avlägs- nats genom behandling med lut, dels en polystyrenplatta, som hydrofiliserats enligt ovan, men där behandlingen med IgG-lösningen utfördes vid ZOOC i stället för 40°C.

Reaktionstiden var i det senare fallet 2 h alternativt 8 h.

Mängd immobiliserad IgG mättes med enzymkonjugerade antikroppar mot IgG. Utvärdering gjordes med gängse spektroskopisk teknik. grov A 495 nm Yta utan epoxidgrupper, 2 h 0,167 Inbinaning vid z0°c, 2 h 0,380 Inbinaning vid 20°c, s h 0,405 Inbindning vid 40°c, 2 h 2,450 Som framgår av resultaten får man en mycket stor höjning av mängden immobiliserat protein, då inbindningstemperaturen ligger vid grumlingspunkten jämfört med en temperatur 20oC under denna. 465 221- Exempel 2 En PVC-platta med storleken 12 x 8 cm, avsedd att ingå i en extrakorporal kammare, ympades med krotonsyra under bestrålning med UV-ljus av våglängden 320 nm och i närvaro av bensofenon som initator. Den bildade karboxylfunktionella ytan behandlades med en 10%-ig lösning av polyetylenimin i vatten i närvaro av vattenlöslig karbodiimid (0,6%) vid pH 4,5-5,0. Plattan behandlades sedan med en 10%-ig lösning av dikarbonylimidazolderivatet av en blocksampolymer av etenoxid och propenoxid med en molvikt på 4.000 och en grumlingspunkt på 38°C vid pH 8,0 under 3 h vid 20°C.

En 10%-ig karbonatbuffert, pH 8,0, innehållande 50.000 U/ml Ü -Interferon bringades i kontakt med karbonyl- imidazolfunktionella hydrofiliserade PVC-plattor och reaktionen fick pågå under 2 h och 8 h vid temperaturerna 2o°c, 3o°c och 4o°c.

Perifera mononukleära blodceller isolerades genom gradientcentrifugering på Lymphoprop. Cellerna späddes till 1 ' 106/ml i RPMI 1640, 10% FKS, 1% PEST och inkuberades på den Ü -Interferon-immobiliserade plattan i 7 dygn vid 37OC och 5% C02.

Som referens användes även två plattor, som enbart hydrofiliserats enligt ovan. Till den ena sattes fritt X -Interferon direkt i cellkulturen vid inkubationens början.

Neopterin användes som markör för cellstimulering. Det är välkänt att lymfocyter och makrofager utsöndrar neopterin vid stimulering av bl a Ü -Interferon. 465 221 s Prov Neopterin (nmol/l) Hydrofiliserad yta med tillsatt fritt X-Interferon 83 Hydrofiliserad yta utan Ü-Interferon 5 Inbinaning vid 2o°c, 2 h Inbinaning vid 2o°c, a h 11 Inbinaning vid 3o°c, 2 h 15 Inbinaning vid 3o°c, s n zo Inbindning vid 4o°c, 2 h eo Inbindning vid 4o°c, s h 62 Av' resultaten framgår, att Ü -Interferon immobiliserats i väsentligt högre grad när immobiliseringen utfördes enligt uppfinningen än när den utförts vid lägre temperaturer.

Exempel 3 Silica (10 g) återloppskokades över natt i 150 ml av en 10%-ig lösning av 3-aminopropyltrimetoxisilan i toluen. Den framställda aminopropylsilikan tillsattes en lösning bestå- ende av l g perjodatoxiderad etylhydroxietylcellulosa med en grumlingspunkt på 42°C i 40 g vattenlösning av pH 7 i närvaro av 0,5 natriumcyanoborhydrid. Reaktionen fick pågå vid 22°C under skakning i 16 h. Silikan filtrerades av och tvättades försiktigt med vatten.

Till den aldehydfunktionella cellulosabehandlade silikan sattes en 30 g vattenlösning bestående av 33 mg/ml lipas och 0,5 g natriumcyanoborhydrid. Reaktionen fick pågå i 16 h vid pH 7, dels vid 20°C, dels vid 40°C. Därefter tvättades partiklarna omväxlande med karbonatbuffert, pH 9,0, och acetatbuffert, pH 4,0.

Mängd inbundet protein bestämdes till 35 mg/g silika för reaktionen vid 40oC och 4 1ng/g silika för reaktionen vid ZOOC. Aktiviteten av lipaset från 40°C-reaktionen mättes i en transesterifieringsreaktion (inkorporering av stearinsyra i en triglycerid) och bestämdes till 56% av aktiviteten hos fritt lipas.

Claims (7)

465 221 PATENTKRAV

1. Sätt att kovalent binda ett protein till en hydrofil yta, som utgöres av en på en bärare pà i och för sig känt sätt immobiliseradf nonjonisk polymer, vilken uppvisar med proteinet reaktiva grupper, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att den nonjoniska polymeren har en grumlings- punkt av minst 5O över den temperatur, vid vilken slut- produkten skall användas och att proteinet kovalent bindes på i och för sig känt sätt till den nonjoniska polymerens reaktiva grupper i ett vattenbaserat reaktionsmedium vid en temperatur av över 50C under polymerens grumlingspunkt i reaktionsmediet.

2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att den nonjoniska hydrofila polymeren har en grumlingspunkt i intervallet 30-l00°C, företrädesvis 30-SOOC.

3. Sätt enligt krav 1 eller 2, k ä n n_e t e c k n a t d ä r a v , att den nonjoniska hydrofila polymeren utgöres av en polyalkylenglykolförening.

4. Sätt enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att den nonjoniska hydrofila polymeren utgöres av en cellulosaeter.

5. Sättenligtkrav4, kännetecknat d ä r a v , att cellulosaetern är en alkylhydroxialkyl- cellulosa med en viskositet av 30-5.000 cP, mätt enligt Brookfiela, Lv, 12 rpm vid 2o°c.

6. Sätt enligt någon av kraven 1-5, k ä n n e t e c k - n a t d ä r a v , att den nonjoniska hydrofila cellulosa- etern väljes på ett sådant sätt, att dess grumlingspunkt är minst l0°C över den temperatur, vid vilken slutprodukten skall användas.

7. Sätt enligt något av kraven 1-6, k ä n n e t e c k - n a t d ä r a v , att den hydrofila polymeren har epoxi-, tresylat-, karbonolimidazol- eller acylazidgrupper, vilka kan reagera med reaktiva grupper på bärare och med proteinet.