SE466754B - Saett att kovalent binda biopolymerer till hydrofila ytor - Google Patents

Description

466 754 <1 idag (se kapitel 4: Principles of Immobilization of Enzymes, Handbook of Enzyme Biotechnology, Second Edition, Ellis Horwood Limited 1985) och 1nan kan binda in en stor mängd protein till ytan med bibehållande av god biologisk aktivitet.

Det har emellertid visat sig att de flesta fasta ytor är så beskaffade, att de spontant adsorberar proteiner och andra biomolekyler. Adsorption i vattenlösning drivs av främst två typer av fysikaliska krafter, elektrostatisk attraktion och hydrofob växelverkan. De flesta ytor är vid normalt pH negativt laddade men innehåller vanligtvis också hydrofoba domäner. Ett protein har vanligtvis både positiva, negativa och hydrofoba säten. Ett protein attraheras därför till de flesta ytor dels genom elektrostatisk attraktion mellan positiva säten och negativt laddade grupper i ytan, dels genom hydrofob växelverkan mellan hydrofoba domäner hos proteinet och hos ytan. Detta är t ex beskrivet i Surface and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers, Ed. J.D. Andrade, Plenum Press 1985, Vol. 2, pp 81.

Denna ospecifika adsorption är för de ovan nämnda applikationerna ett oönskat fenomen. Vid fastfasdiagnostik leder den till en försämrad känslighet och en kortare livs- längd hos det diagnostiska kitet. Vid såväl extrakorporal terapi som bioorganisk syntes leder spontanadsorptionen till försämrad aktivitet och en kortare livslängd hos kitet.

Ett sätt att drastiskt reducera adsorptíon av proteiner och andra biomolekyler på organiska polymerytor är att förse ytorna med ett skikt av en oladdad hydrofil polymer. Poly- etylenglykol är ett exempel på en polymer som har använts för detta ändamål (se C.-G. Gölander: Preparation and Properties of Functionalized Polymer Surfaces, Dissertation, Royal Institute of Technology, Stockholm 1986), men också andra ämnen som polysackarider, t ex dextran, cellulosaetrar och stärkelse; polyvinylalkohol; och neutral silikasol har använts för ändamålet.

Genom att täcka den organiska polymerytan med ett skikt av den oladdade, hydrofila polymeren kan såväl elektrostatisk pa 466 754 attraktion som hydrofob växelverkan undvikas. Spontan- adsorptionen av proteiner till sådana ytor kan på detta sätt reduceras och ibland nästan helt elimineras.

Hydrofiliserade ytor av detta slag är av stort intresse för bl a de ovan nämnda tillämpningarna av immobiliserade proteiner. För att kovalent binda in protein till en sådan yta krävs att man inför reaktiva funktionella grupper i det hydrofila skiktet, vilka kan tjäna som förankringspunkter för proteinet. Det har dock visat sig mycket svårt att åstadkomma kovalent inbindning av biopolymerer, såsom proteiner till väl hydrofiliserade organiska polymerytor, även. on: dessa inne- håller en hög koncentration reaktiva grupper. Den oladdade, hydrofila ytan attraherar inte protein. Den verkar tvärtom avstötande, eftersom det är energetiskt ofördelaktigt för ett protein i vattenlösning att närma sig en sådan yta. Detta medför att mängden immobiliserat protein vanligtvis blir låg, oavsett om det är fråga om en antikropp för fastfasdiagnos- tik, ett immunförsvarsstimulerande ämne för extrakorporal terapi eller ett enzym för bioorganisk syntes. Till hydrofoba polymerytor försedda med ett väl täckande skikt av en hydro- fil, oladdad polymer, t.ex. polyetylenglykol eller en poly- sackarid, har man således svårt att åstadkomma såväl adsorp- tion som kovalent inbindning av proteiner ur vattenlösning.

Situationen är något annorlunda för mineralytor. Ett nyligen publicerat arbete rörande immobilisering av lipas på silika visar att även på silika behandlad med polyetylen- glykol kan avsevärda mängder protein immobiliseras. Kopp- lingen sker till reaktiva grupper på de fria ändarna av polyetylenglykolen (M.-B. Stark och K. Holmberg: Biotech.

Bioeng. âí (1989) 942). I detta arbete har immobilisering av proteinet till den polyetylenglykolmodifierade ytan gjorts såväl ur en vattenlösning som ur en hexanlösning och ur en mikroemulsion innehållande 94% hexan, 5% tensid och 1% vatten. En mikroemulsion är en isotrop och termodynamiskt stabil lösning av en hydrofob komponent, vatten och en ytaktiv komponent. I artikeln visas att nästan identiskt samma mängd lipas binds in till den polyetylenglykolbeklädda silikaytan vid de tre försöken med olika lösningsmedel. .íw 466 754 *f Inbindningsförloppet tycks vara oberoende av lösningsmedlets polaritet.

Det har nu överraskande visat sig att till hydrofoba polymerytor som har belagts med ett skikt av en hydrofil, oladdad polymer, t.ex. polyetylenglykol eller en polysacka- rid, kan biopolymerer immobiliseras i gott utbyte om immobi- liseringsreaktionen utförs i. ett opolärt eller väsentligen opolärt reaktionsmediunn Med "biopolymer" förstås i första hand protein, men även lipider, kolhydrater och lipopoly- sackarider omfattas av uttrycket. Iakttagelsen enligt uppfinningen är synnerligen intressant, då det innebär att den yta, som tack vare hydrofiliseringen har blivit avvisande för proteiner ur vattenlösning, på detta sätt kan funktiona- liseras med proteiner, t.ex. antikroppar och antigener. Efter avslutad reaktion lakas ytan lämpligen i vatten. Det oladdade, hydrofila polymerskiktet återhydratiseras härvid, och resultatet blir att proteinet sitter bundet på en mycket proteinavvisande bakgrund.

Föreliggande uppfinning beskriver således ett nytt sätt att kovalent inbinda biopolymerer till hydrofiliserade organiska polymerytor. Metoden har stor generalitet och kan förväntas få ett brett tillämpningsområde. Principen för uppfinningen är att immobiliseringsreaktionen ej utförs i vatten, vilket är det gängse mediet för reaktioner med biopolymerer, utan i ett opolärt eller väsentligen opolärt reaktionsmedium. Med "väsentligen opolärt reaktionsmedium" avses här, att dess dielektricitetskonstant är mindre än 10%, företrädesvis mindre än 5%, av dielektricitetskonstanten för rent vatten. Det har visat sig att under i övrigt samma betingelser förfarandet enligt uppfinningen ofta ger en mer än 10-faldig ökning av mängden bunden biopolymer.

En speciellt föredragen form av reaktionsmedium utgöres av en mikroemulsion. Mängden vatten i mikroemulsionen utgör l-15 vikt- vanligtvis företrädesvis 0,5-25 viktprocent, procent.

Det opolära reaktionsmediet och den hydrofoba komponen- ten i mikroemulsionen är vanligtvis ett alifatiskt kolväte som hexan eller nonan eller en bredare destillationsfraktion íí" q; _ 466 754 som petroleumeter 60-80. I mikroemulsionen utgör den hydro- foba komponenten vanligtvis 63-98,5 viktprocent.

Den ytaktiva komponenten utgöres vanligtvis av en kombination av en ytaktiv förening och en s k hjälptensid.

Det ytaktiva ämnet kan vara anjoniskt, katjoniskt, amfotärt eller nonjoniskt, medan hjälptensiden vanligtvis är en alkohol eller en lågmolekylär alkylenoxidaddukt. Exempel på vanliga substanser av denna typ är butanol, pentanol, hexanol, etylenglykolmonobutyleter och dietylenglykolmono- butyleter. Mängden ytaktiv komponent är vanligtvis 0,5-20 viktprocent av mikroemulsionens vikt.

Enligt uppfinningen har det visat sig speciellt fördel- aktigt att använda en ytaktiv förening, som kan bilda mikro- emulsioner utan närvaro av hjälptensid. Ytaktiva föreningar- som har denna förmåga är vissa nonjoniska föreningar, vilka som hydrofil grupp har en polyalkylenglykolkedja framställd genom polymerisation av etenoxid eller av kombinationer av etenoxid och propen- och/eller butenoxid, samt vissa joniska föreningar som har den joniska, hydrofila gruppen i en icke-terminal position på kolvätekedjan.

När det gäller nonjoniska tensider är en polyetenglykol- kedja föredragen som hydrofil del och polyetylenglykolkedjans längd är i det mest föredragna fallet mellan 3 och 8 etylen- oxienheter i genomsnitt. Den hydrofoba delen kan härröra från hydroxylföreningar eller karboxylföreningar, vilka innehåller en alkylkedja bestående av 8-20 kolatomer eller av en alkyl- arylgrupp bestående av totalt 9-24 kolatomer. Exempel på sådana föreningar är etylenoxidaddukter av nonylfenol, oktyl- fenol och fettalköholer.

När det gäller joniska tensider är anjoniska grupper såsom sulfonat, sulfat, karboxylat, fosfat och fosfonat föredragna. Sulfonat är speciellt föredraget. Eventuellt kan dessa tensider även innehålla alkylenoxigrupper såsom etylen- oxid som kopplingselement mellan den anjoniska gruppen och den hydrofoba gruppen. Den hydrofoba delen kan utgöras av en alkylkedja bestående av 10-22 kolatomer eller av en alkyl- arylgrupp bestående av totalt 9-24 kolatomer. Enstaka eter-, 466 754 Û. ester- eller amidbindningar kan finnas i den hydrofoba delen.

Exempel på lämpliga joniska föreningar är di(2-etylhexyl)sul- fosuccinat och karboxymetylerade nonylfenoletoxilat inne- hållande l-4 etylenoxigrupper.

För att kovalent binda den hydrofila polymeren vid den fasta polymerytan och kovalent binda biopolymeren vid den hydrofila polymeren införes på konventionellt sätt reaktiva funktionella grupper, vilka kan tjäna som förankringspunkter.

Exempel på reaktiva grupper som kan införas eller finnas på den fasta polymerytan är amino-, karboxyl- eller hydroxyl- grupper, med vilka den hydrofila nonjoniska polymeren eller en aktiverad form därav kan reagera. Den hydrofila polymeren har lämpligen reaktiva grupper, som epoxi-, tresylat-, karbonylimidazol- och acylazidgrupper, vilka kan reagera med reaktiva grupper på den fasta polymerytan och med protein, vilket normalt binds via någon eller flera av dess amino-, tiol- och/eller fenoliska hydroxylgrupper. Sådan immobilise- ringsteknik finns utförligt beskriven bl a i de ovan nämnda referenserna, Surface and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers, Ed. J.D. Andrade, Plenum Press 1985, Vol. 2, pp 81, och C.-G. Gölander: Preparation and Properties of Functional- ized Polymer Surfaces, Dissertation, Royal Institute of Technology, Stockholm 1986, vilka härmed intages som en del av beskrivningen av föreliggande uppfinning. I det fall biopolymeren är glykoprotein, glykolipid eller kolhydrat, kan bindning ske till aldehydgrupper genererade i kolhydratdelen genom oxidation med t ex natriumperjodat. Den hydrofila polymeren kan även förankras vid den fasta polymerytan på känt sätt genomren fysikalisk adsorption.

Den nonjoniska hydrofila polymeren är lämpligen poly- etylenglykol eller slumpvis anlagrade eller blockanlagrade polyalkylenglykoler mellan etylenoxid och alkylenoxider med 3-4 kolatomer eller tetrahydrofuran. Andra grupper av lämp- liga polymerer är addukter av etylenoxid, eventuellt i kombination med högre alkylenoxider eller tetrahydrofuran, med en dihydroxi- eller polyhydroxiförening, såsom glycerol och pentaerytritol. Polysackarider, såsom dextran och stärkelse; cellulosaetrar, såsom metylcellulosa, metyl- . 'Å (ß 2 466 754 hydroxipropylcellulosa eller etylhydroxietylcellulosa; poly- vinylalkohol; och neutral silikasol är andra lämpliga hydro- fila polymerer att användas enligt uppfinningen.

De hydrofila polymererna är vattenlösliga och deras pøiymer-.fikt är vanligtvis från 1.000 till 200.000, företrä- desvis från 2.000 till 100.000. Ûppfinningen belyses ytterligare av nedanstående exempel.

Exempel 1 Immobilisering av IgG-antikropp till hydrofiliserad polystyrenyta En. polystyrenplatta, 2 x 2 cm stor, gjordes karboxyl- funktionell genom att akrylsyra plasmapolymeriserades på' ytan. Den karboxylfunktionella ytan behandlades med en 10%-ig lösning av diaminopropan i vatten i närvaro av vattenlöslig karbodiimid (0,6%) vid pH 4,5-5,0. Plattan sköljdes med destillerat vatten och behandlades med en 10%-ig lösning av diepoxiderad polyetylenglykol med molekylvikten 4.000 vid pH 9,5 under 15 h i rumstemperatur.

Till en mikroemulsion (ca 3% av Vattens dielektri- citetskonstant) innehållande 86% isooktan, 4% natrium-bis(2-etylhexyl)sulfosuccinat och 10% vatten (karbonatbuffert, pH 9,5) sattes 0,05 mg/ml IgG och det hela blandades, varefter den hydrofiliserade plattan behandlades däri under 4 h vid 400C. Parallellt behandlades i vatten- haltig karbonatbuffert pH 9,5 en hydrofiliserad platta (a) enligt ovan och en platta (b) hydrofiliserad med polyetylen- glykol utan epoxidgrupper.

Mängd immobiliserad IgG mättes spektrofotometriskt med enzymkonjugerade antikroppar mot IgG enligt ELISA-teknik.

Mängden adsorberat protein är proportionell mot adsorbansen vid 490 nm. _ Prov OD 495 nm Hydrofiliserad platta (a) med epoxidgrupper 0,20 Hydrofiliserad enligt uppfinningen 2,21 Hydrofiliserad platta (b) utan expoxidgrupper 0,17 466 754 5 Exempel 2 Immobilisering av gamma-interferon till en hydrofiliserad PVC-yta En PVC-platta, 12 x 8 cm stor och avsedd att ingå i en extrakorporal kammare, ympades med krotonsyra under bestrål- ning med UV-ljus av våglängden 320 nm och i närvaro av bensofenon som initiator. Den bildade karboxylfunktionella ytan behandlades med en 10%-ig lösning av polyetylenimin i vatten i närvaro av vattenlöslig karbodiimid (0,6%) vid pH 4,5-5,0. Plattan behandlades sedan med en 10%-ig lösning av polyetylenglykol 4000 dikarbonylimidazol vid pH 8,0 under 3 h vid rumstemperatur. Till en mikroemulsion (ca 3% av Vattens dielektricitetskonstant) innehållande 82% isooktan, 8% pentaetylenglykolmono(n-dodecyleter) och 10% vatten (boratbuffert, pH 8,0) sattes 50.000 gamma-interferon.

Plattan behandlades med denna mikroemulsion under 2 h vid 4o°c.

Perifera mononukleära blodceller isolerades genom gradientcentrifugering på Lymphoprep. Cellerna späddes till l'l06/ml i RPMI 1640, 10% FKS, 1% PEST och inkuberades på den gamma-interferon-immobiliserade plattan i 7 dygn vid 37OC och % C02.

Som referens användes en platta som efter hydrofilise- ringen behandlades med gamma-interferon i vattenhaltig borat- buffert, pH 8.

Neopterin användes som markör för cellstimulering. Det är välkänt att lymfocyter och makrofager utsöndrar neopterin vid stimulering av bl a gamma-interferon.

Neopterin (nmol/l) Immobilisering enligt uppfinningen 67 Referens 5 7 466 75,4 Exempel 3 Jämförelse mellan adsorption och immobilisering på en glasyta och på en polystyrenyta En glasyta, 2 x 6 cm, tvättades först med etanol, sedan med l M HCl och slutligen med 30%-ig väteperoxid. Plattan återloppskokades sedan under 16 h i 150 ml av en 10%-ig lösning av 3-aminopropyltrimetoxisilan i toluen. Till det sålunda aminofunktionaliserade glaset sattes en lösning bestående av 10 g diepoxiderad polyetylenglykol (molekyl- vikt 1.500) i 40 g 0,1 M karbonatbuffert, pH 9,0. Efter 24 h vid 37oC togs glasplattan upp ur lösningen. ESCA-analys visar att ett tätt polyetylenglykolskikt har bildats pà ytan. Till plattan sattes därefter en lösning av 0,05 mg/ml IgG-anti- kropp i 0,1 M karbonatbuffert, pH 9,0. Immobiliseringsreak-- tionen var klar efter 24 h vid 37OC. Motsvarande immobili- sering av IgG till den modifierade glasytan gjordes även ur mikroemulsion, varvid samma mikroemulsionskomposition och samma reaktionsbetingelser som i Exempel 1 användes.

En polystyrenplatta av samma dimension som glasplattan aktiverades med en lösning av KMnO4 i koncentrerad HZSO4 under 30 sek vid ZOOC. Plattan gjordes därefter aminofunk- tionell genom adsorption av polyetylenimin, varefter behand- ling med polyetylenglykolderivat och immobilisering av IgG-antikroppar dels ur vatten, dels ur' mikroemulsion ut- fördes på samma sätt som ovan beskrivits för glasplattan.

Mängd immobiliserad IgG-antikropp bestämdes spektro- fotometriskt med enzymkonjugerade antikroppar mot IgG enligt ELISA-teknik. Ospecifik adsorption av de enzymkonjugerade antikropparna bestämdes också på polyetylenglykolmodifierade plattor, vilka ej hade undergàtt proteinkoppling utan i stället gjorts icke-reaktiva genom behandling med l M HCIO4 under 1 h vid 20oC, varvid epoxidringarna i ändarna på polyetylenglykolkedjorna öppnas.

Mängd kovalent inbunden och adsorberad IgG på de modi- fierade glas- och polystyrenplattorna anges i tabellen nedan.

Mängden adsorberat protein är proportionell mot adsorbansen vid 490 nm. 466 754 iÛ Prov OD 495 nm Hydrofiliserad glasplatta, kovalent inbindning ur vatten 2,30 Hydrofiliserad glasplatta, kovalent inbindning ur mikroemulsion 2,15 Hydrofiliserad glasplatta, adsorption ur vatten 2,05 Hydrofiliserad polystyrenplatta, kovalent inbindning ur vatten 0,25 Hydrofiliserad polystyrenplatta, kovalent inbindning ur mikroemulsion 1,90 Hydrofiliserad polystyrenplatta, adsorption ur vatten 0,15 Resultaten visar att en god immobilisering av proteiner erhålles, när den genomföres i ett reaktionsmedium enligt uppfinningen. I det fall bäraren är ett hydrofilt, oorganiskt material, är reaktionsmediets påverkan på immobiliseringen marginell øch samtidigt erhålles en hög, icke önskvärd adsorption.

Claims (10)

” 466 754 PATENTKRAV

1. Sätt att kovalent binda biopolymerer vid en organisk polymeryta belagd med ett hydrofilt oladdat skikt, varvid den fasta polymeren, vilken tjänstgör som bärare, är belagd med en nonjonisk hydrofil polymer, vilken uppvisar med proteinet reaktiva grupper, k ä n n e t e c k n a t därav, att biopolymeren bringas att reagera med den nonjoniska hydrofila polymerens reaktiva grupper i närvaro av ett reaktionsmedium med en dielektricitetskonstant mindre än 10% av dielektrici- tetskonstanten för rent vatten.

2. Sätt enligt krav 2 k ä n n e t e c k n a t därav, att reaktionen utföres i ett reaktionsmedium med en dielektricitetskonstant mindre än 5% av dielektricitets- konstanten för rent vatten.

3. Sätt enligt krav 2 k ä n n e t e c k n a t därav, att reaktionen utföres i ett reaktionsmediun1 bestående av alifatiska kolväten.

4. Sätt enligt krav 1-2 k ä n n e t e c k n a t därav, att reaktionen utföres i en mikroemulsion, där vattenhalten är 0,5-25 viktprocent.

5. Sätt enligt krav 4 k ä n n e t e c k n a t därav, att reaktionen utföres i en mikroemulsion med en vattenhalt av l-15 viktprocent.

6. Sätt enligt krav 4-5 k ä n n e t e c k n a t därav, att biopolymeren är ett protein, som via minst en av dess amino-, tiol- och fenoliska hydroxylgrupper bindes till en epoxi-, tresylat-, karbonylimidazol- eller acylazidgrupp ingående i den hydrofila polymeren.

7. Sätt enligt krav 4-6 k ä n n e t e c k n a t därav, att proteinet bindes till en polyetylenglykol uppvisande reaktiva grupper.

8. Sätt enligt krav 4-7 k ä n n e t e c k n a t därav, att den ytaktiva komponenten utgöres av en nonjonisk före- ning, där den hydrofila gruppen utgöres av genomsnittligt 3-8 etylenoxidenheter. 466 754 få

9. Sätt enligt krav 4-7 k ä n n e t e c k n a t därav, att den ytaktiva komponenten utgöres av ett sulfonat.

10. Sätt enligt något av kraven 5-9 k ä n n e t e c k - n a t därav, att reaktionen utföres i en mikroemulsion innehållande 0,5-20 viktprocent av en ytaktiv komponent innehållande ett sulfonat och/eller en nonjonisk förening, där den hydrofila gruppen utgöres av genomsnittligt 3-8 etylenoxienheter och 63-98,5 viktprocent av ett eller flera alifatiska kolväten. u;