JP4503293B2 - 機能化材料およびそのライブラリー - Google Patents

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Description

発明の分野
本願発明は化合物を分離、精製、濃縮、固定化、および合成するための機能化材料およびそれについてのライブラリー、ならびにその同等物を使用した用途に関する。
発明の背景
標的分子の研究および使用にはその分子の単離および精製が必要条件である。例えば、疾患を引き起こす微生物を単離、同定する能力は、正確な診断および疾患状態の治療をもたらし、あるいは、核酸の単離は、ポリヌクレオチドもしくは核酸にコードされるポリペプチドの配列シーケンシング、またはタンパク質の結晶構造決定の第1段階である。分子を単離、精製、濃縮するには多くの方法があるが、これらの方法を行う組成物は広範囲には適用されず、通常、特定分子の精製に応用されうる。従って、化合物および分子の単離・濃縮方法を改善する技術は依然として必要である。
発明の概要
本発明は、全般に、特定の材料が、特有な性質（例えば長さ、厚み、形態、および密度）をもつ側鎖または高分子「ブラシ」を有する組成物中に加工されうるといった発見に基づく。これらの材料は、化合物を三次元的に分離、精製、濃縮および/または固定化するために、ならびに固定化された化合物を修飾または合成するために大変有効である。本発明の組成物は、材料に対流かつ高速で流す必要がある用途に有用であり、苛酷な化学反応または極度な温度変化に曝されることを目的としている。
ある局面では、本発明は、少なくとも第一表面および第二表面にポリマーブラシを有する基質材料を含む。ここでは、第一表面にあるポリマーブラシは電荷をもつ第一セットの官能基をさらに含む、および第二表面にあるポリマーブラシは第一セットの官能基に対して反対の電荷をもつ第二セットの官能基をさらに含む。ある態様において、ポリマーブラシは基質材料のラジカル誘導重合によって形成されるおよびポリマーブラシのグラフト率は15％以上である。別の態様において、ポリマーブラシのグラフト率は85％以上である。別の態様において、材料はバイポーラであり、電圧をかけるとき、水をH＋及びOH-に解離することができる。
別の局面では、本発明は、バイポーラデバイスを作製する方法を提供する。材料を得て、少なくともなくとも第一表面および第二表面にグラフト誘導重合によってポリマーブラシを形成する。第一表面のポリマーブラシに第一官能基を固定化して第一官能基は電荷をもつこと、および第二表面のポリマーブラシに第二官能基を固定化して、第二官能基は第一官能基の逆の電荷をもつことである。ある態様において、ポリマーブラシのグラフト率は15％以上である。また別の態様において、ポリマーブラシのグラフト率は85％以上である。別の局面では、本発明は、バイポーラデバイスを用いて、化合物（例えば、サリチル酸）を生産する方法を含む。ある態様において、本発明は、塩溶液から酸およびアルカリを生産するため、バイポーラ材料を使用する方法を含む。別の態様において、材料は電気透析反応に使用される。
別の局面では、本発明は、複数の機能化材料を有するデバイスを含む、少なくとも一つの表面に形成されたポリマーブラシを有する基質材料をさらに含む。ポリマーブラシは複数のドメインおよび一つまたは複数の官能基を示す。官能基は一つまたは複数のドメインにあるポリマーブラシに固定される。ある態様において、複数のドメインにあるポリマーブラシは異なる形態及び長さをもつ。別の態様において、複数のドメインにあるポリマーブラシは一つまたは複数の反応性モノマーによって形成される。また別の態様において。複数のドメインにあるポリマーブラシは約10％から500％までのグラフト率を有する。別の態様において、少なくとも一つの官能基が各ドメインに固定化される。別の態様において、少なくとも二つの官能基が各ドメインに固定化される。ある態様において、ポリマーブラシに固定化された官能基は、一つまたは複数のターゲットと結合する。ターゲットはポリヌクレオチド、ポリペプチド、多糖、脂質、細胞小器官、細胞膜と細胞を含む、動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、真菌細胞、ウイルス細胞と微生物細胞をさらに含む、Staphylococcus、Clostridium、Bacillusと類似ものの病原性微生物菌株をさらに含む。ある態様において。官能基は免疫グロブリンまたは抗原結合フラグメントを含む。別の態様において、官能基は少なくとも一つの表面に一つまたは複数のターゲットを固定化する。別の態様において、官能基はターゲットに伴う反応を触媒作用する。ある態様において、官能基は荷電される。別の態様において、官能基は酵素（例えば制限酵素、プロテアーゼ、キナーゼまたはホスファターゼ）である。別の態様において、官能基は化合物を有するマイクロデリバリー（microdelivery）官能基である。この態様において、ターゲット細胞を一つまたは複数のドメインにあるマイクロデリバリー官能基と接触させ、ターゲット細胞がマイクロデリバリー官能基にある化合物を吸収するようにする。マイクロデリバリー官能基によってデリバリーできる化合物は、限定されないが例えば、short interfering RNA（siRNA）、アンチセンス核酸、運べる元素と同様の統合配列をもつ核酸、ベクター、タンパク質と薬、およびその他である。
別の局面では、本発明は、機能化材料のライブラリーを作製する方法を含む。ここでは、基質材料を得て、複数のドメインでポリマーブラシを材料に形成させ、および少なくとも一つの官能基を一つまたは複数のドメインにあるポリマーブラシに固定化する。ある態様において、複数のドメインにあるポリマーブラシは異なる形態または長さをもつ。別の態様において、複数のドメインにあるポリマーブラシは一つまたは複数の反応性モノマーから形成される。別の態様において、複数のドメインにあるポリマーブラシは約10％から500％までのグラフト率を有する。また別の態様において、少なくとも一つの官能基を各ドメインに固定化される。別の態様において、少なくとも二つの官能基を各ドメインに固定化される。ある態様において、ポリマーブラシに固定化された官能基は、一つまたは複数のターゲットと結合する。ターゲットはポリヌクレオチド、ポリペプチド、多糖、脂質、細胞小器官、細胞膜と細胞を含む、動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、真菌細胞、ウイルス細胞と微生物細胞をさらに含む、Staphylococcus、Clostridium、Bacillusと類似ものの病原性微生物菌株をさらに含む。ある態様において、官能基は免疫グロブリンまたは抗原結合フラグメントを含む。別の態様において、官能基は少なくとも一つの表面に一つまたは複数のターゲットを固定化する。別の態様において、官能基はターゲットに伴う反応を触媒作用する。ある態様において、官能基は荷電される。別の態様において、官能基は酵素（例えば制限酵素、プロテアーゼ、キナーゼまたはホスファターゼ）である。別の態様において、官能基は化合物を有するマイクロデリバリー官能基である。この態様において、ターゲット細胞を一つまたは複数のドメインにあるマイクロデリバリー官能基と接触させ、ターゲット細胞がマイクロデリバリー官能基にある化合物を吸収するようにする。
ある局面では、本発明は、ターゲットに化合物を導入するデバイスを使用する方法を含む。ある態様において、官能基は化合物を有するマイクロデリバリー官能基からなる。別の態様において、化合物は核酸であり、そしてターゲット細胞は一つまたは複数のドメインと接触することによって、核酸が細胞内へ運ばれる。別の態様において、化合物はポリペプチドであり、そしてターゲット細胞は一つまたは複数のドメインと接触することによって、ポリペプチドが細胞内へ運ばれる。別の態様において、化合物は薬であり、そしてターゲット細胞は一つまたは複数のドメインと接触することによって、薬が細胞内へ運ばれる。ある態様において、複数のドメインにあるポリマーブラシは異なる形態または長さをもち、約10％から500％までのグラフト率を有する。ある態様において、本発明は、ターゲットを有する溶液をライブラリーのドメインと接触させることおよび一つまたは複数のドメインにおけるターゲットとの相互作用を検出することを含む。ある態様において、ターゲットとドメインの相互作用はドメインにおける放射性物質放出の測定によって検出される。ある態様において、ターゲットとドメインの相互作用はドメインにおけるルミネセンス測定によって検出される。ある態様において、ターゲットとドメインの相互作用はドメインにおける蛍光測定によって検出される。別の態様において、測定する蛍光は蛍光共鳴エネルギー転移ペアによって発生される。
別の局面では、本発明は、一つまたは複数のメモリー装置と通信するプロセッサーを有するシステム、形成されたポリマーブラシを有する少なくとも一つの表面を有する基質材料を含む材料ライブラリー、プロセッサーと通信できる読み取りデバイス、少なくとも一つのメモリーデバイスにインストールされる使用説明セット、使用説明セットがプロセッサーと相互反応できること、メモリーデバイスに情報を入力できるユーザー制御インプットデバイス、およびプロセッサーやメモリーデバイスと通信できるアウトプットデバイスを含む。ポリマーブラシは複数のドメインおよび一つまたは複数の官能基を示す。官能基は一つまたは複数のドメインにあるポリマーブラシに固定される。ある態様において、官能基はポリペプチド配列である。ある態様において、官能基はポリヌクレオチド配列である。ある態様において、官能基は免疫グロブリンまたは抗原結合フラグメントである。別の態様において、免疫グロブリンの濃度は、各ドメインにおいて、ドメイン表面積当りに約0.1fg/mm2の固定化抗体から約100mg/mm2の固定化抗体までに変化する。別の態様において、システムは、ヒト細胞、ウイルス細胞、または微生物細胞という官能基を含む。ある態様において、システムはマイクロフルイディックデバイスを含む。ここでは、ライブラリーはマイクロフルイディックデバイスの反応チャンバーにある。ある態様において、プロセッサーは、マイクロフルイディックデバイスの一つまたは複数のマイクロフルイディックポートと通信する。ある態様において、システムは、実験室情報マネージメントプログラムを含む。
別の局面では、本発明は、形成されたポリマーブラシを有する複数のドメインをさらに含む基質材料を有する材料ライブラリーを含む。一つまたは複数のドメインにおけるポリマーブラシに複数のポリペプチド官能基が固定化される。別の局面では、本発明は、形成されたポリマーブラシを有する複数のドメインをさらに含む基質材料を有する材料ライブラリーを含む。一つまたは複数のドメインにおけるポリマーブラシに複数の細胞が固定化される。ある態様において、細胞はヒト細胞である。ある態様において、細胞はヒト癌細胞である。ある態様において、細胞はウイルス感染細胞である。別の態様において、細胞はウイルス細胞である。ある態様において、細胞は微生物細胞（例えば病原性微生物株）である。別の局面では、本発明は、形成されたポリマーブラシを有する複数のドメインをさらに含む基質材料を有する材料ライブラリーを含む。一つまたは複数のドメインにおけるポリマーブラシに複数の免疫グロブリン分子が固定化される。ある局面では、本発明は、形成されたポリマーブラシを有する複数のドメインをさらに含む基質材料を有する材料ライブラリーを含む。一つまたは複数のドメインにおけるポリマーブラシに複数のポリペプチド官能基が固定化される。ポリペプチド官能基は一つまたは複数のターゲットと相互作用できる。ある態様において、ターゲットはタンパク質（例えば細胞溶解物）である。別の態様において、細胞溶解物は、物質標識細胞から導く溶解性フラクションを含む。別の態様において、細胞はヒト細胞である。別の態様において、ポリペプチド官能基は、長さ約5merから約50merまでのランダムペプチドを含む。ある態様において、ターゲットと一つまたは複数のドメインにある官能基との相互作用が検出される。別の態様において、相互作用の検出は、ヒトの病気から一つまたは複数のマーカーの検出を含む。
本発明の他の特色と利点は詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
本発明の詳細な説明
定義
別途に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的専門用語は、当業者に一般に理解されるものと同様の意味をもつ。しかしながら、下記の用語は以下に特定する意味を有する。
本明細書中で使用される「材料」という用語は、一つまたは複数の表面を提供する基質を指す。その表面に、ポリマーブラシを形成でき、またはポリマーブラシをグラフトもしくは付与できる。したがって、材料は二つ以上の異なる材料を含む。材料を使う特定な用途に合わせて、材料を任意の形状に製作または成型することができる。例えば、材料は実質的に硬性のものである。これは次の用途に適性である。例えば、材料をバイアル、ピペットチップ、細胞培養用もしくはELISA用のシャーレ、スライド、もしくはアレイや材料マトリックスを形成するための他の基質に成型する。材料は一つまたは複数の平面に実質的に長い、例えば繊維もしくは膜であってもよく、または材料は粉末、微結晶製剤または微粒子懸濁液の形状であってもよい。材料は延長と柔軟性とが具体化されていてもよく、例えばチューブまたはピペットチップのような管腔を定義しうる。それぞれが本明細書に参照として組み入れられる米国特許第6,009,739号、第5,783,608号、第5,743,940号、第5,738,775号、第5,648,400号、第5,641,482号、第5,506,188号、第5,425,866号、第5,364,638号、第5,344,560号、第5,308,467号、第5,075,342号、第5,071,880号、第5,064,866号、第4,980,335号、第4,897,433号、第4,622,366号、第4,539,277号、第4,407,846号、第4,379,200号、第4,376,794号、第4,288,467号、第4,287,272号、第4,283,442号、第4,273,840号、第4,137,137号、および第4,129,617号に説明されるとともに本明細書で開示する膜組成物および方法には、多様な材料が適用される。
本明細書中で使用される「ブラシ」および「ポリマーブラシ」という用語は、ラジカル重合可能な末端基を有する重合基質から形成された高分子側鎖を指す。その重合可能な基質は材料であるか、または材料にグラフトもしくは付与でき、実質的に材料の形状をとる。側鎖はいずれのポリマーであってもよく、容易に機能性をもたせうる反応性ポリビニルポリマーが現状では好ましい。例えば、繰り返しユニット毎に一つの反応性エポキシ基をもつポリ(グリシジルメタクリレート)がある。以下に説明するラジカル重合によってポリマーブラシは形成される。ブラシは第1の方向への重合度と関連する、特定の大きさで延長した形状、つまりその「長さ」をもつとともに、第1の方向と直角する第2の方向への重合度に関連する、断面の直径または厚み、つまりその「幅」をもつ。ブラシは、コイル状、または密集形態、または伸長形態をとることができる。ブラシの幅はその長さに沿って可変である。それに加えて、以下に説明するように、枝状のポリマーブラシ構造の作製、ならびにブラシの密度、つまり材料の単位表面積また単位重量当りのブラシの数、の増減を重合反応により制御することができる。本明細書における記述および当技術分野で既知の方法によって、本発明のポリマーブラシの長さ、幅、枝、および全体的な形態を、所望の末端の使用または目的に合わせて変化させることができる。
本明細書中で使用される「反応性モノマー」という用語は、ラジカル誘導グラフト反応に寄与できる化合物を指す。反応性モノマーは、上記および本明細書中に説明するようにポリマーを形成できるいずれの材料であってもよく、限定されないが、例えばグリシジルメタクリレート（GMA）、またはエチレンがある。材料と反応性モノマーとが同一の化合物から構成されていてもよく、例えば、ポリエチレン材料はグラフト反応において、エチレンモノマーまたはポリマーが利用されうる。それぞれが本明細書に参照として組み入れられる米国特許第6,009,739号、第5,783,608号、第5,743,940号、第5,738,775号、第5,648,400号、第5,641,482号、第5,506,188号、第5,425,866号、第5,364,638号、第5,344,560号、第5,308,467号、第5,075,342号、第5,071,880号、第5,064,866号、第4,980,335号、第4,897,433号、第4,622,366号、第4,539,277号、第4,407,846号、第4,379,200号、第4,376,794号、第4,288,467号、第4,287,272号、第4,283,442号、第4,273,840号、第4,137,137号、および第4,129,617号に説明されるとともに本明細書で開示する膜組成物および方法には、多様な反応性モノマーが適用される。
本明細書中で使用される「重合度」という用語は、ラジカル重合可能な末端基をもつ重合可能な基質と一つまたは複数の反応性モノマーとのラジカル誘導重合の程度を指す。この重合反応によってポリマーブラシが形成される。従って、重合度は全体的なブラシ表面の特徴を決定する。その高分子側鎖は、例えば、モノマー、オリゴマー、または約数百から数万モノマーユニットに相当する約10nmから約2000nmの平均長を有し、またはもっと長く、例えば5000nm以上となる。重合度は、例えば重合可能基質の結晶化度、ラジカル誘起程度、反応時間、そして重合可能な基質の性質、つまり強度または硬さに依存する。（参照として組み入れられるLeeら、(1999), Chem. Mater., 11, 3091-3095を参照）。
本明細書中で使用される「グラフト率」または「DG」という用語は、ブラシの密度、つまり材料の単位表面積当りの側鎖の数を指す。側鎖数が約1.0x108から約1.0x1030の間では、いかなる側鎖数も材料の単位重量当りまたは単位表面積当りのパーセントで示すことができ、例えば、側鎖約1.0x1016から1.0x1020は、グラフト率にして約10%〜約500%を表す。グラフト率は本質的に、材料の初期重量と付加したポリマーブラシ構造の重量との比である（Leeら、(1999)を参照）。
本明細書中で使用される「官能基」という用語は、化学的性質、リガンドに対する生物活性または親和性、または特定の構造をもつ物質を指す。官能基は、材料にグラフトされたポリマーブラシに、固定化、結合、捕捉、架橋、または実質的に付与される。本発明の膜組成物および方法には、ブラシにこれらの機能性を与えるため、多様な官能基が適用される。多機能化材料が望まれるとき、官能基の組み合わせが好まれる。官能基は、ポリマーブラシへ固定化するおよびターゲットを結合する能力をもつ分子や複合分子であってもよい。望ましく、ターゲットを特異的に結合する官能基。したがって、官能基は、例えば抗体やレセプターのように他のタンパク質を特異的に結合する細胞の元の機能をもつターゲットの可能性もある。その他に、官能基はターゲットを特異的の結合する部分合成または全合成あるいは組み換え体ポリペプチドであってもよい。その他に、官能基は、ターゲットへの結合親和性によって、突然変異化、無作為化、または完全に無作為化および合成ラブラリーからin vitro選択したポリペプチドであってもよい。使用する選択方法は、リボソームディスプレイまたはファージディスプレイのようなディスプレイ方法であってもよい。その他に、in vitro選択によって得られた官能基は、ターゲットのタンパク質を特異的に結合するDNAまたはRNAアプタマーであってもよい（例えば、参照として組み入れられるPotyrailoら、Anal.Chem.、70:3419-25、1998；Cohenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95：14272-7、1998；Fukudaら、Nucleic Acids Symp. Ser.、（37）:237-8、1997）。その他に、in vitro選択した官能基は、ポリペプチドであっても良い（参照として組み入れられるRobertsとSzostak、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、94：12297-302、1997）。別の態様において、官能基は、有機体から単離またはコンビナトリアルケミストリーライブラリーから選択した低分子であってもよい。官能基は、ターゲットを結合するまたは生物的な反応を触媒作用する能力によって、選択されてもよい。適する官能基は限定されないが、例えば、共存親水基または共存疎水基（GMAまたは他の疎水性基のような非イオン基）を有するまたは有さない陰イオン性解離基（例えば、1級、2級、3級または4級アミン）、陽イオン性解離基（例えば、酸基）、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、タンパク質またはその活性部位、エピトープイオンおよび親和性タグ、核酸、リボ核酸、ポリペプチド、グリコポリペプチド、ムコ多糖、リポタンパク質、リポ多糖、炭水化物、酵素または補酵素、ホルモン、ケモカイン、リンフォカイン、抗体、リボザイム、アプタマー、インターフェロン、SpA、SpG、TNF、v-Ras、c-Ras、逆転写酵素、Gタンパク質共役受容体（GPCR）、FcRn、FcγR、FcεR、ニコチニコイド受容体（ニコチン受容体、GABAAおよびGABAC受容体、グリシン受容体、5-HT3受容体、ならびに一部のグルタミン酸作動性陰イオンチャネル）、ATP開口型チャネル（P2Xプリン受容体も指す）、グルタミン酸作動性陽イオンチャネル（NMDA受容体、AMPA受容体、カイニン酸受容体など）、血球凝集素（HA）、受容体型チロシンキナーゼ（RTK）、例えばEGF、PDGF、NGF、およびインシュリン受容体チロシンキナーゼ、SH2-ドメインタンパク質、PLC-γ、c-Ras関連GTPase活性化タンパク質（RasGAP）、ホスファチジリノシトール-3-キナーゼ（PI-3K）およびタンパク質ホスファターゼ1C（PT1C）、ならびに細胞内タンパク質チロシンキナーゼ（PTK）、例えばチロシンキナーゼSrcファミリー、グルタミン酸作動性陽イオンチャネル（NMDA受容体、AMPA受容体、カイニン酸受容体など）、タンパク質チロシンホスファターゼ、例えば受容体チロシンホスファターゼrho、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体J、受容体型チロシンホスファターゼD30、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体C型ポリペプチド関連タンパク質、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体T型、受容体チロシンホスファターゼγ、白血球関連Ig様受容体1Dイソフォーム、LAIR-1D、LAIR-1C、MAPキナーゼ、ノイラミニダーゼ（NA）、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、セリン／トレオニンキナーゼ、二次メッセンジャー、抗原性または腫瘍形成マーカー、転写因子、および他の重要な代謝構築阻害または制御因子、GFPのような蛍光ポリペプチドまたは蛍光標識したポリペプチド、成長因子レセプター、ホルモンレセプター、神経伝達因子レセプター、カテクロラミンレセプター、アミノ酸誘導レセプター、サイトカインレセプター、細胞外マトリックスレセプター、レキシチン、セルピン、ヒドロラーゼ、ステロイドホルモンレセプター、転写因子、熱ショック転写因子、DNA結合タンパク質、ジンフィンガータンパク質、ロイシンジッパータンパク質、ホメオドメインタンパク質、細胞間シグナル伝達モジュレターとエフェクター、アポトシス関連ファクター、DNA合成ファクター、DNA組み換えファクター、細胞表面抗原、病マーカー、C型肝炎ウイルス（HCV）プロテアーゼ、またはHIVプロテアーゼを含む。ここに説明したように、官能基の選択及び利用は、希望の応用に依存する。
本明細書中で使用される「陰イオン解離性官能基」という用語は、対イオンが陰イオンであるイオン交換基を意味する。陰イオン解離性官能基は、化学反応の触媒作用をもち、標的化合物または他の官能基を吸着および/または固定化し、そして、広範囲にわたって効率よく酸性物質を除去するために、硫化水素またはメルカプタンのような酸性物質との中和反応を引き起こすことが可能である。
本明細書中で使用される「陽イオン解離性官能基」という用語は、対イオンが陽イオンであるイオン交換基を意味する。典型的な陽イオン解離性官能基は酸基である。陽イオン解離性官能基は化学反応の触媒作用をもち、標的化合物または他の官能基を吸着および/または固定化し、プロトン（水素イオン）を放出することによって、アンモニアまたはアミンのような塩基性物質との中和反応を引き起こすことができる。従って、このような官能基は、広範囲にわたって塩基性物質との使用に提供される。
本明細書中で使用される「親水性官能基」という用語は、水に対して親和性をもつが水との接触によって極端にイオン性解離しない官能基を指す。親水性官能基は水和殻または反応性表面を提供することによって、化学反応を触媒し、標的化合物または他の官能基を吸着および/または固定化することができる。そのような基の一例としては、限定されないが、ヒドロキシル基がある。
本明細書中で使用される「疎水性官能基」という用語は、水に対して親和性をもたない官能基を指す。疎水性官能基は水を排除して、または疎水性相互作用のための表面もしくは反応性表面を提供することによって、化学反応を触媒し、標的化合物または他の官能基を吸着および/または固定化することができる。そのような官能基の一例としては、限定されないが、非イオン基、エステル基、スクシンイミド基、またはエポキシ基がある。
本発明の詳細な説明
本発明は一つまたは複数の材料にグラフトしたポリマーブラシに官能基を固定化する組成物および方法を提供する。固定化する方法は、捕捉、ゲル化、物理的保持もしくは吸着、イオン性結合、共有結合、または架橋を含む（それぞれが参照として組み入れられるBiotechnol. Bioeng., 22: 735-756, 1980、Chem. Eng. Prog., 86: 81-89,1990、J. Am. Chem. Soc., 117: 2732-2737,1995、Enzyme Microb. Technol., 14: 426-446,1997、Trends Biotechnol., 13: 468-473,1997、Nat. Biotechnol., 15: 789-793,1997を参照）。その固定化法ならびに用いる官能基の量および種類によって本発明の組成物の活性を決める。得られた固定化官能基の活性は物質移動の効果によって低減されることが多い（それぞれ参照として組み入れられるMethods Enzymol., 44: 397-413,1976、J. Am. Chem. Soc., 114: 7314-7316, 1992、Trends Biotechnol., 14: 223-229,1996、Angew. Chem., 109: 746-748, 1997を参照）。固定化後の活性は、官能基の有効性が減少することでさらに低減されるうる。例えば、立体障害によって、またはブラシ内、空孔内、もしくは材料の他の構造内での捕捉によって、または官能基の拡散が緩徐であることによって低減されうる。このような制限は低効率をもたらす。従って、高容量の官能基を固定化した材料を提供することが本発明の目的である。
本発明は多様な材料、すなわち全ての高分子プラスチックを利用することができる。例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリエステル、ポリエーテルブロックアミド、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリオルガノシロキサン、ポリオレフィン、ポリスルホン、ポリイソプレン、ポリクロロプレン、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、対応するコポリマーおよび混合物、ならびに天然ゴムおよび合成ゴム、金属、ガラス、または木材がある。組成物は多機能性の性質をもち、物質の分離、除去、精製、合成、濃縮、および固定化に使用でき、極度の温度または圧力、化学濃度、電気的荷電などの工業用プロセスでの過酷な操作環境に特に適している。
一般に、所望の標的化合物は試料溶液中に存在しており、ろ過膜、チューブ、ピペットチップまたはクロマトグラフィーマトリックスにおけるように、直接、溶液を組成物に透過することができる。細胞または他の大きい不溶粒子を含む液体は、より小さい可溶粒子から大きい粒子を分離するために前処理を必要とする可能性がある。しかしながら、物理的なろ過の度合いはポリマーブラシのサイズおよびブラシ密度によりもたらされ、適当であれば、ろ過装置に組成物を織り込むまたは組み立てることができる。試料水溶液の記載が多いが、当業者であれば、ガス性試料にも適用できることを理解することと思われる。ガス流におけるガス性物質を吸着するためのフィルター要素の例は、例えば、本明細書に参照として組み入れられる2002年1月10日に公開されたGentilcoreらの米国特許出願第20020002904号A1に説明されている。それに加えて、膜または繊維の記載が多いが、以下に示す本発明の組成物は、本明細書に記載のように他の形状を含みうる。従って、以下は実例となっているが、本発明の実施例を制限することを意図しない。
本発明における有用な材料
一般的には、本発明の材料は特定のタイプに制限されることはなく、ポリマーブラシがグラフトまたは付与できる基質であれば、適当な材料である。重合反応にとって、元の材料が不十分であれば、材料表面を処理してもよい。このようなケースにおいて、例えば、本発明に従う表面処理は、高分子材料からなるコーティングであってもよい。本発明に有用な材料は広範囲に得られる。例えば、ポリエチレンとポリプロピレンとを含むポリオレフィン（低密度または高密度）、セルロース（Radiat. Phys. Chem. 1990, 36: 581; J. Membr. Sci. 1993, 85: 71を参照）、ポリ(イソブチレンオキサイド)（Radiat. Phys. Chem. 1987, 30: 151を参照）、 エチレンテトラエチレンフルオロコポリマー（J. Electrochem. Soc. 1996, 143: 2795を参照）、エチレンプロピレンジエンタールポリマー（Radiat. Phys. Chem. 1991, 37: 83を参照）、エチレン-プロピレンゴム（Nippon Gensiryoku Gakkaishi, 1977,19: 340を参照）、クロロスルホン化ポリエチレン（Radiat. Phys. Chem. 1991, 37: 83を参照）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）（React. Polym. 1993, 21: 187; Radiat. Phys. Chem. 1989, 33: 539を参照）、テトラフルオロエチレンヘキサフルオロプロピレンコポリマー（Radiat. Phys. Chem. 1988, 32: 193を参照）、ポリ(ビニルクロライド)（Radiat. Phys. Chem. 1978, 11: 327を参照）、シリコンゴム（Radiat. Phys. Chem. 1988, 32: 605を参照）、ポリウレタン（Radiat. Phys. Chem. 1981, 18: 323）、ポリエステル（Radiat. Phys. Chem. 1988, 31: 579を参照）、ブタジエン-スチレンコポリマー（Radiat. Phys. Chem. 1990, 35: 132を参照）、天然ゴムおよびニトリルゴム（Radiat. Phys. Chem. 1989, 33: 87を参照）、酢酸セルロースとプロピオン酸塩（Radiat. Phys. Chem. 1990, 36: 581を参照）、) デンプンおよび綿繊維（Zhurn, Vsesoyuz. Khim. Ob-va im. D. I. Mendeleeva. 1981, 26: 401を参照）、ポリエステル-セルロース繊維（Radiat. Phys. Chem. 1981, 18: 253を参照）、天然皮（Radiat. Phys. Chem. 1980, 16: 411を参照）、ならびに医療用ガーゼ（Zhurn. Vsesoyuz. Khim. Ob- va im. D. I. Mendeleeva. 1981, 26: 401を参照）、親水性ポリウレタン、ポリウレア、オレフィン、アクリル、ならびに他の親水性構成材がある。特殊な材料はポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールコポリマー、および他のポロキサマー、ヘテロサイクリックモノマー（Applied Radiation Chemistry: Radiation Processing, Robert J. Woods and Alexei K. Pikaev, John Wiley & Sons, Inc., 1994 (ISBN 0-471-54452-3)を参照）、ポリ(エチレングリコール)メタクリレートまたはジメタクリレート（J. Appl. Polym. Sci., 1996, 61: 2373-2382を参照）、ポリアミン（例えばポリエチレンイミン）、ポリ(エチレンオキサイド)およびスチレンを含む。これらのコーティングは好ましくは処理した表面に共有結合的に結合する。高分子材料を表面に吸着させ、UV照射、RFエネルギー、X線照射、γ線照射、電子線、化学開始重合などに曝して、表面に高分子材料を共有結合的に付与する段階を含む、コーティング形成法には多くの方法がある。
材料は複数の表面を提供し、材料自体が、ラジカル重合可能な末端基をもつ重合可能な基質であり、例えば、セルロース、ポリオレフィン、ポリアクリルニトリル、ポリエステル、例えばPETおよびPBT、ポリアミド、例えばナイロン6およびナイロン66、ならびにこれらの組み合わせがある。適する材料は、材料自体が重合可能でなくてもよく、ポリマーブラシは非重合可能材料にグラフト、付与または粘着することが可能である。
炭水化物ポリマー、例えばセルロースもしくはリグニンまたは類似の材料を材料として使用可能である。本明細書に参照として組み入れられるAntalらの2002年3月7日に公開された米国特許出願第20020026992号A1には、製紙において、添加物の保持力の促進と強化に使うため、ペンダント3-アミノ-2-ヒドロキシプロピル基を有するグラフト炭水化物ポリマーの組成物とその製法の例とが説明された。本明細書に参照として組み入れられるYamagishiら、(1993)、 J. Membr. Sci., 85, 71-80にはセルロースの放射線グラフト重合法が説明された。
炭水化物ポリマーが木材パルプの構成要素であるとき、得られる化学修飾の木材パルプは非修飾した木材パルプと組み合わせて、その特性を保持および強化されうる。特にセルロースを材料として使用できる典型的な炭水化物の資源は、紙パルプおよび木材チップのような木材セルロースを含む。これらのセルロースに加えて、葉繊維セルロース、幹繊維セルロース、およびシードトメントースまたは軟毛繊維セルロースを使用することが可能である。これらのセルロースの例は、靭皮繊維（例えば麻、亜麻、ラミー、およびマニラ麻）および綿を含む。所望であれば、イネわら、コーヒー豆の殻、使用済みの茶葉、大豆パルプおよび他の廃棄物を再利用してセルロースとして使用することが可能である。このような廃棄物は特殊な前処理を必要としないので、使うには便利である。本発明に使うセルロースの一つの資源としては、紙パルプがある。
本明細書に参照として組み入れられるKimらの2001年11月1日に公開された米国特許出願第20010037144号A1には、生物活性物質を金属系材料にグラフト可能であること、例えば、金属材料に金または銀薄層をメッキして表面修飾した医療用金属材料が説明されている。
繊維、髪、および皮のような動物組織は材料として使用可能である。当業者は、動物製品によって、材料として使用できる所望の特性がもたらされるかどうかを決めることができる。例えば、所望の発明が機械的なろ過に使用される場合は、例えば繊維を膜組成物またはシートのような他の形状に織り込むまたは組み立てることができる。材料として使用できる繊維または動物の毛の例は、ウール、ラクダの毛、アルパカ、カシミヤ、モヘア、ヤギの毛、ウサギの毛、および絹を含む。材料として使用できる天然皮の例はウシの皮、ヤギの皮、および爬虫類の皮または皮膚を含む。材料として使用できる合成皮の例はCORFAM(登録商標)（デュポン）、CLARINO(登録商標)（クラレ）とECSAINE(登録商標)（東レ）を含む。
材料としてポリオレフィンも使用可能である（Applied Radiation Chemistry: Radiation Processing, Robert J. WoodsおよびAlexei K. Pikaev, John Wiley & Sons, Inc., 1994 (ISBN 0-471-54452-3), Introduction to Radiation Chemistry 第3版, J. W. T. SpinksおよびR. J. Woods, John Wiley & Sons, Inc., 1990 (ISBN 0-471-61403-3)、 Radiation Chemistry of Polymeric Systems, A. Chapiro, Interscience, New York, 1962、 Atomic Radiation and Polymers, A Charlesby, Pergamon Press, 1960、 Radiat. Phys. Chem. 1991, 37: 175-192、ならびにProg. Polym. Sci. 2000, 25: 371-401を参照（全てが本明細書に参照として組み入れられる））。ポリオレフィンは多くの形状および型に組み立てることができる。これらは、鋳型であったり、熱成形されたり、注入されたり、よく知られるプロセスによって成形されうる。例えば、既存の溶融メルトスピンプロセスによる繊維や細糸の形成がある。それに加えて、ポリオレフィン化合物は他の産業にも有用であり、主として生物工学産業には、ポリオレフィン製品は、実験室の試薬による化学的な分解に対して抵抗をもち、耐久性をもつとともに再利用でき、化学的不活性であり、安価と使い捨てできるものである。ポリオレフィン化合物はこれらの特性を示すこととそれに加えて、ラジカル重合可能の末端基を有する重合可能基質を提供するので、一般的に材料として望まれる。オレフィンモノマーまたはポリマーは材料にも、反応性モノマーにもなるといった2つの点から、本発明のグラフト技術に非常に適している。例えば、ポリオレフィンの例はポリエチレンおよびポロプロピレンを含む。所望であれば、例えば、これらの材料は塩素、フッ素または臭素のようなハロゲンで修飾することによって、ポリテトラフルオロエチレンのようなハロゲン化ポリオレフィンになりうる。他の修飾としては、ポリマーにヒドロキシル基を導入することも適切である。平均分子量20,000から750,000ダルトンを有するポリオレフィンポリマーは本発明に適している。当業者は、特定の目的に合う適切な分子量について周知である。例えば、約50,000ダルトンから約500,000ダルトンの分子量をもつポリオレフィンは、繊維や細糸の生産に適していて、官能基の組み合わせをもつブラシを含有するポリオレフィン細糸または繊維（上記）を含む膜に応用することである。ポリオレフィンの分子量が約500,000ダルトンを超えると、得られるポリオレフィンの流動性が低くなるので、既存のメルトスピンプロセスによるポリオレフィンから細糸への形成は難しくなる。しかしながら、約500,000ダルトン以上のポリオレフィンの構造的硬直さは、例えば、容器、細胞の凍結バイアルなどの高密度用途に適している。逆に、約50,000ダルトン以下の分子量をもつポリオレフィンは、ポリマーの強度と硬直さは低下し、そしてそれによって形成される細糸は十分な張力をもたない。しかしながら、約50,000ダルトン以下のポリオレフィンの構造的硬直さは、例えば、粉体またはミクロ結晶体組成物に適している。本明細書に参照として組み入れられるValligyらの2002年2月14日に公開された米国特許出願第20020019487号A1には、熱成形におけるフリーフローによって柔軟性をもつコーティングの生産を目的とした、粉末の形での、重合グラフトおよび架橋しうる熱可塑性ポリオレフィン粉末組成物の例が説明される。本明細書に参照として組み入れられる欧州特許第0409992号には、もう一つの重合したグラフトと架橋した熱可塑性ポリオレフィン粉末組成物の例があり、架橋可能の熱可塑性ポリオレフィンポリマーの粒子を合成するためのプロセスを指し、それによると、上述の粒子は固体の形態で、特にミネラルオイルのような架橋剤と接触させる。
材料の形状には特に制限はなく、繊維、フィルム、薄片、粉末、シート、マット、および球体の各種の形状から選択して使用することができる。本発明の材料はポリマーブラシを支持する構造的なメンバーとしての機能をもつ。吸着および/または固定化する面積の最大化、吸着および/または固定化効率の向上という観点から、繊維状材料の使用は有利である。多孔性中空糸膜の形状または織布または作製されたシート状におけるグラフト繊維は、ブラシ表面積を実質上増大させる二つの例である。管腔内表面をもつ材料は、管腔表面が非規則性またはプロジェクッションを有するような材料の生産によって、ブラシ表面を増大するために適応しても良い。この態様の類似絵は、小腸を例として、絨毛プロジェクッション（すなわち表面の非規則性）をもつ粘膜表面および各絨毛に数千のマイクロ絨毛（すなわちポリマーブラシ）、生理学に見つけられる。
本発明に適する織繊維のサイズは約10nmから約100,000nmまでである。約1000nmから約50,000nmまでの繊維直径を有する織繊維状材料の使用は特に有利である。繊維状材料が有利である一つの理由は、簡単に所望の形状、例えば布、にするまたは織ることができ、そして、装置に組み立てることができる。それに加えて、繊維状材料は一般的に環境に微粒子または粉末を放出するおそれがないので、半導体および他の精密機器製作に使用できる。繊維状材料が使用される場合は、繊維または細糸の束にすることができる。この繊維束を織布または不織布に加工することができる。本発明の膜において繊維状基質が使用される場合は、他の繊維状材料と混合してもよい。従って、異なる官能基を含む繊維の組み合わせによって作製でき、単一の膜組成物に多機能な特性が提供される。
繊維は不織基質として作製された多孔性中空糸であってもよい。本明細書に記載のように、市販される多孔性中空糸の例は旭化成株式会社が生産するものである。これらは空孔率の範囲が広く、例えばろ過装置に組み立てることができる。それに加えて、空孔率と繊維組成との組み合わせによって、物理的および分子的固定化、ろ過または濃縮を提供する。繊維状材料を球状の形にして使用する場合は、取り扱いやすさの観点から、その直径を約2〜20mmの間に調節するのが有利である。本発明の材料の空孔率は、所望の機能活性と透過性との観点から、平均孔経約0.1nmから約50,000nmを有し、好ましくは約1nmから5000nm、さらに好ましくは10nmから1000nmである。当業者ならば、特定な応用に対して、最適の組成と空孔率を決めることができる。平均孔径が極小のとき、膜組成物の透過性は低下する。平均孔径が極大のとき、所望の物質は多孔性材料のブラシ表面にうまく吸着されない。その代わりに、ブラシ表面と官能基とを接触させずに、目的の試料を多孔性材料の空孔に通過させて、所望の官能基の活性に到達しないようにする。本発明の多孔性材料の空孔率は、好ましくは20%から90%の範囲にあり、さらに好ましくは50%から90%の範囲にある。空孔率の程度は使用した材料の物理的特性に依存する。空孔率および孔サイズの測定は一般的によく知られる、例えば、バブルポイント法、水銀圧力法、走査型電子顕微鏡法（SEM）またはトンネル電子顕微鏡法（TEM）、または窒素吸着法（本明細書に参照として組み入れられるASTM F316,1970; Pharmaceutical Tech., 1978,2: 65- 75; Filtration in the Pharmaceutical Industry, Marcel Dekker, 1987を参照）。
ラジカルを発生させる作用物質
ラジカル部位をつくることのできるラジカル発生作用物質は、有機過酸化物またはパーエステルであり、例えば、tert-ブチルパーオキシ3,5,5-トリメチルヘキサノエート、2,5-ジメチル-2,5-ジ(ベンゾイルパーオキシ)ヘキサン、tert-ブチルパーオキシ2-エチルヘキシルカルボネート、tert-ブチルパーオキシアセテート、tert-アミルパーオキシベンゾエート、tert-ブチルパーオキシベンゾエート、2,2-ジ(tert-ブチルパーオキシ)ブタン、n-ブチル4,4-ジ(tert-ブチルパーオキシ)バレレート、エチル3,3-ジ(tert-ブチルパーオキシ)ブチレート、ジクミルパーオキサイド、tert-ブチルクミルパーオキサイド、ジ-tert-アミルパーオキサイド、ジ(2-tert-ブチルパーオキシイソプロピル)ベンゼン、2,5-ジメチル-2,6-ジ(tert-ブチルパーオキシ)ヘキサン、ジ-tert-ブチルパーオキサイド、2,5-ジメチル-2,5-ジ-tert-ブチルパーオキシ-3-ヘキシン、3,3,6,6,9,9-ヘキサメチル-1,2,4,5-テトラオキサシクロノナン、tert-ブチルヒドロパーオキサイド、3,4-ジメチル-3,4-ジフェニルヘキサン、2,3-ジメチル-2,3-ジフェニルブタンおよびtert-ブチルパーベンゾエート、ならびにアゾ化合物、例えば、アゾビスイソブチロニトリルおよびジメチルアゾジイソブチレートがあり、上記作用物質は、好ましくはジクミルパーオキサイド、tert-ブチルクミルパーオキサイド、ジ-tert-アミルパーオキサイド、ジ-tert-ブチルパーオキサイドおよび2,5-ジメチル-2,5-ジ(tert-ブチルパーオキシ)-3-ヘキシンからなる群より選択される。
放射線誘導グラフト重合
グラフト重合は、化学的または誘導可能な重合開始剤の存在における重合、熱重合、イオン化放射線（例えば、α線、β線、γ線、加速電子線、X線または紫外線）を用いた放射線誘導グラフト重合によって行うことができる。γ線または加速電子線が誘導する重合により、都合のよいグラフト重合法が提供される。
反応性モノマーの材料へのグラフト重合法にはいくつかの方法が存在する。材料は定形部材であってもよいし、また、重合後に製品化または装置化してもよい。最終用途または目的に応じて、本発明には、定形部材を直接に液体反応性モノマーと反応させる液相重合法と、定形部材をガスまたは気体状の反応性モノマーに接触させるガスまたは気相重合法との2つの重合法が有利である。気相グラフトは本明細書に参照として組み入れられるJ. Membr. Sci. 1993, 85: 71-80、Chem. Mater. 1991, 3: 987-989、Chem. Mater. 1990, 2: 705-708、およびAIChE J. 1996, 42: 1095-1100に説明される。
材料への反応性モノマーのグラフト重合が行われる。グラフトは3つの方法で行う。（a）前照射、（b）過酸化、および（c）相互照射法である。前照射法においては、ラジカルを形成するため、幹ポリマーは真空中または不活性ガスの存在下で照射される。照射されたポリマー基質は次に、液相もしくは気相のモノマー、または適当な溶媒に溶解したモノマーで処理する。しかしながら、過酸化グラフト法において、幹ポリマーは空気または酸素の存在下で高エネルギー放射線に曝される。従って、重合骨格と照射条件によって、ヒドロパーオキサイドまたはジパーオキサイドが形成される。その安定なパーオキシ産物は次に高温においてモノマー処理し、パーオキサイドが分解してラジカルになり、そしてグラフトを開始する。この方法の利点は、中間体のパーオキシ産物が、グラフト段階を行う前に、長期間において保存できることである。一方、相互照射法においては、ポリマーとモノマーは同時に照射されてラジカルが形成され、したがって付加が生じる。前照射法ではモノマーが放射線に曝されないため、この方法の明らかな利点は、同時照射法で発生するホモポリマー形成の問題から比較的免れることである。しかしながら、前照射法の短所には、直接照射による材料ポリマーの切断があり、グラフトコポリマーよりブロックコポリマーの形成を支配的に生ずる。
この方法では、材料基質表面は反応性モノマーを含む溶液、例えば、tert-ブチルアミノエチルメタクリレート中で、浸漬、噴霧、またはブラッシングのような既知の方法でコーティングされる。tert-ブチルアミノエチルメタクリレートを溶かす力が十分であれば他の溶媒も使用できるが、適当な溶媒は、水および水/エタノール混合液であることが立証されており、材料基質表面は適当な溶媒で完全に湿らせる。反応性モノマー含有量が0.1重量%〜10重量%、例えば約5重量%の溶液が実用的に適していることが立証される。一般的には、基質表面を被うように連続的にコーティングを行い、コーティング厚みが1回で約0.1μmより厚くなることもあり得る。2つ、3つまたはそれ以上の異なる反応性モノマーを材料に共グラフトすることができる。本明細書に参照として組み入れられるChem. Mater. 1999,11: 1986-1989、J. Membr. Sci. 1993, 81: 295-305、J. Electrochem. Soc. 1995, 142: 3659-3663、およびReact. Polym. 1993, 21: 187-191を参照。
反応性モノマーとは、ラジカル誘導グラフト重合反応に参加できるいかなる化合物である。したがって反応性モノマーは側鎖の反応に組み入れられ、ポリマーブラシを形成する。本発明では、材料との重合反応に関わる前に、オリゴマーは反応性モノマー間の副反応で形成されるので、簡単にする都合上、モノマーという用語を使う。このようなオリゴマーまたはポリマーも本発明に有用である。前述のように、複数の官能基（例えば、単一モノマーブラシ上の3つの官能基）をもつモノマー側鎖ブラシが得られる。
材料と反応性ポリマーは同様な化合物であることもあり得る。例えば、ポリエチレン材料は、グラフト反応にエチレンモノマーまたはポリマーを利用することは可能である。本発明に使用できる反応性モノマーは、例えば、ビニルモノマーとヘテロサイクリックモノマーを含む。適する反応性モノマーの他の特別な例は、グリシジル基を有するビニルモノマー、例えば、グリシジルメタクリレート、グリシジルアクリレート、グリシジルメチリタコネート、エチルグリシジルマレエートとグリシジルビニルスルホネート、ならびにシアノ基を含むビニルモノマー、例えば、アクリルにトリル、ビニリデン、シアナイド、クロトノニトリル、メタクリロニトリル、クロロアクリロニトリル、2-シアノエチルメタクリレート、および2-シアノエチルアクリレートを含む。これらは官能基の固定化のためにエポキシド基を有し、反応性重合部位を提供するビニル基を有するため、反応性モノマーとして有用である。開環反応、すなわちポリGMAブラシのエポキシ基をジオール基に転化する反応は、本明細書に参照として組み入れられるJ. Membr. Sci. 1996, 117: 33-38に説明されている。
反応性モノマーは重合反応によって材料に共有的に結合するか、または、別個に形成して材料に付与もしくは粘着する。反応性モノマーは、材料にグラフトしたポリマーブラシを形成する。グラフト率は材料および反応性モノマーの選択、重合法、所望のブラシの長さおよび幅によって決められる。場合によっては、得られた本発明のポリマーブラシは生物活性を有し、例えば、製品または器具の表面にあるtert-ブチルアミノエチルメタクリレートは抗菌活性を示す。
修飾またはグラフトした材料の測定は、例えばグラフト率、厚みまたは重さの測定、含水率、IR法（FTIR-ATRなど）、イオン交換基の中和測定、ゼタ電位、ドーナン法、原子間力顕微鏡（AFM）、走査型電子顕微鏡（SEM）、接触角の測定、XPS（X線、フォトエレクトロン光度計）およびSIMS（二次イオン質量分析）によって決定できる。
活性化した表面に適用する反応性モノマーのグラフト共重合は、同じくラジカル誘導重合に影響され、可視範囲にある短波長放射線またはUV範囲にある長波長の電磁放射線によって開始される。UVエキシマの250nmから500nm波長の放射線、好ましくは290nmから320nmの波長が特に適している。前述した範囲で十分な放射線を発するならば、水銀灯も適している。曝露時間は一般的に10秒から30分、好ましくは2分から15分の範囲である。適する放射線源は、例えば、UVエキシマ機器（HERAEUS Noblelight, Hanau, Germany）である。しかしながら、水銀灯も、前述した範囲で十分な放射線を発するならば、適している。曝露時間は一般的に0.1秒から20分、好ましくは1秒から10分である。
UV放射線を用いる反応性モノマーと材料との活性化は光増感剤の添加によって、さらに増加することができる。適する光増感剤は、例えばベンゾフェノン、基質の表面につけて照射する。ここでは、照射は水銀灯を用いて、0.1秒から20分、好ましくは1秒から10分の曝露時間で行うことができる。
本発明によると、活性化は空気中または窒素中またはアルゴン雰囲気下で、高周波数またはミクロ波のプラズマ（Hexagon, Technics Plasma, 85551 Kirchheim, Germany）によって達することができる。曝露時間は一般的に30秒から30分の範囲、好ましくは2分から10分である。実験室機器のエネルギー出力は100Wから500W、好ましくは200Wから300Wである。
例えば、コロナ機器（SOFTAL, Hamburg, Germany）はポリマーの活性化のために使用される。この場合では規定として、曝露時間は1分から10分、好ましくは1秒から60秒間である。
表面の燃焼も同じく反応性モノマーと材料との活性化を導く。適する器具、特に防護火炎面（barrier flame front）を有するものを、簡単に構築または得ることができる。例えば、ARCOTEC, 71297 Monsheim, Germanyがある。その器具は炭化水素または水素を可燃性ガスとして利用できる。全てのケースにおいて、材料の有害な過度の加熱は避けるべきである。燃焼する面に向けない基質の表面を冷やした鉄の表面と親密に接触させることによって達成できる。したがって、燃焼による活性化は比較的に薄くて平らな材料に限る。曝露時間は一般的に0.1秒から1分の範囲で、好ましくは0.5から2秒の範囲である。火炎は例外なく非発光のものであり、外側火炎面（outer flame front）と基質表面との距離は0.2cmから5cmの範囲で、好ましくは0.5cmから2cmである。
イオン化放射線開始重合の場合、前述の紫外放射線に加えて、電子線、X線、α線、β線、γ線などが使用できる。グラフト重合の条件は、材料ポリマーの結晶と非晶構造、溶媒またはガスの影響、温度、pH、材料の親疎水性、反応性モノマー、照射線量および曝露の間隔、ならびに照射によって発生するラジカルの種類によって変わる。当業者ならば、これらの変数を知り、それによって、例えば電子線またはコバルト60源からのγ線による活性化には、一般に約0.1秒から約60秒の短い曝露時間、約1kGyから約500kGyの照射線量が割り当てられるように、実験条件を調節する。このようは高エネルギー放射線源は、一つまたは複数の材料の内部表面にラジカル誘導重合反応を望まれるように開始する用途に適している。
ポリマーブラシの作製には複数のグラフト段階が使用されうる。材料にラジカルを発生させる、例えばポリマーをグラフトするためのラジカルをつくるには、ポリマー材料を室温、窒素雰囲気下で照射する。このような現行の好ましい態様においては、電子線加速器を用いて照射を行う。反応性モノマーのグラフト重合（例えば液相グラフト重合）は、ポリマーブラシの形成のため、材料に行う。したがって、グラフトポリマー#1が得られる。上記のプロセスを繰り返して、グラフトポリマー#2、グラフトポリマー#3等々が得られる。さらに、所望のブラシ構造の集合によって、グラフトプロセスはいかなる段階でも止めることができる。各グラフト段階に異なる反応性モノマーを使用してもよく、多数の官能基または生物活性分子を固定化するための複数のブラシ組成物が提供される。このプロセスは、官能基の固定化後に行う追加グラフト反応を含む。
機能化ポリマーブラシ
本発明は、材料のラジカル誘導重合またはそれによって形成されるポリマーブラシを材料へグラフトをするための方法および組成物を提供し、そして、複数のポリマーブラシ構造を有する材料を提供する。これらのポリマーブラシ自体は、例えば、ポリマーブラシのサイズ、ブラシ密度、およびブラシの形態による物理的特性をもつ。しかしながら、本発明は、さらに固定化された官能基を有するポリマーブラシを提供する。官能基を固定化する方法は周知であり、ブラシへの官能基の固定化に適している（本明細書に参照として組み入れられるJ. Membr. Sci. 1993, 76: 209-218を参照）。一種類以上の官能基をブラシに固定化することができ、所望の機能性によって、1つ、2つ、3つ、4つまたは5つまたはそれ以上の異なる種類の官能基が固定されうる。
ブラシへ官能基を結合するための薬剤
本発明でのポリマーブラシ構造は、ブラシ表面での反応性基を含み、機能性または多機能性ポリマーブラシが許容される。官能基を固定化するための各種の方法は、例えば物理的吸着（イオン結合および水素結合のような非共有ブリッジ、疎水性相互作用、ならびにファン・デル・ワールス力）、反応基による固定化、アミノプロピルトリエトキシシラン・ブリッジ、グルタルアルデヒド、またはビス(スルホサクシンイミドイル)スベレートによる活性化、またはアルデヒド基、ホスホロアミダイト基、ペプチド基、ビオチンまたはアビジンによる結合、プロテインAまたはG、金属を有する媒体による付与、例えばキレート形成イミノジアセテート基、銅イオン、ニッケルイオン、第二鉄イオンまたは第一鉄イオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオンまたは錯体を含む同様な荷電種、酸化基による共有結合、例えば、抗体Fc領域の炭水化物の部分を過ヨウ素酸で酸化してアルデヒド基を形成したあと、アガロース、シリカ、アクリル系コポリマー、およびセルロースのようなヒドラジド活性化した固相支持体に化学的な結合を含む。核酸を固定化する方法は、例えば、（i）電気化学的吸着：正荷電の固相支持体と負荷電のオリゴヌクレオチドとの静電的相互作用、（ii）配列特異的ハイブリッド形成のための電気化学的吸着したオリゴヌクレオチドとその相補的標的とのハイブリッド形成、アビジン-ビオチン錯体化、といった吸着と、（i）カルボジイミド法を用いたデオキシグアノシン基（別称、カルボン酸基（-COOH））、（ii）アミノ基（-NH2）、リン酸基による共有結合とを含む。有機合成（またはペプチド合成）はポリマーブラシ上で直接にまたは固定化した官能基上で行うことができる（本明細書に参照として組み入れられる米国特許第6,306,975号を参照）。他のカップリング化学法は当業者に周知であり、そして、グラフト重合法を用いることによって、複数の官能基を有する固相支持体を合成することができる（本明細書にすべて参照として組み入れられるJ. Biochem. Biophys. Methods 2001,49: 467-480, Radiat. Phys. Chem. 1987,30: 263-270, Biosens. Bioelectron. 2000,15: 291-303, Analytica Chimica Acta 1997,346: 259-275, Chem. Rev. 2000,100: 2091-2157, Tetrahedron 1998,54: 15383-15443, Radiat. Phys. Chem. 1986,27: 265-273, and Solid-Phase Synthesis and Combinatorial Technologies by Pierfausto Seneci, John Wiley & Sons, Inc., 2000を参照）。
ブラシ表面へ分子の固定化するもう一つの方法は、限定されないが式SiX3-Rのシランである。式中のXはメチル基または塩素のようなハロゲン分子であり、およびRは本明細書に記載のコーティング材料となりうる官能基またはコーティング材料と反応できる基である。特定のシラン末端化合物は、ビニルシラン、シラン末端アクリル酸、シラン末端ポリエチレングリコール（PEG）、シラン末端イソシアン酸、およびシラン末端アルコールを含む。当業者はシランを表面と反応させる種々の方法を周知である。例えば、エタノール水溶液中に存在する表面をジクロロメチルビニルシランと反応させることは可能である。これで、--O--Si結合によって表面に強く結合または直接シリコン分子に結合する。そして、シランのビニル基を、適当かつ当技術分野において周知の化学法により、本明細書に記載の高分子材料と反応させることが可能である。例えば、メタクリレート末端を有するPEGは、シランのビニル基と反応することによって、本装置の表面に共有結合するPEGが得られる。
それに加えて、当技術分野で周知のように、官能基または生物活性分子の活性を改善また結合を促進するために、スぺーサー分子を官能基とポリマーブラシの間に挿入することは可能である。ブラシの伸長した形態はスペーサーとして機能させてもよく、または別の化学スペーサーを追加して使用してもよい。枝のようなグラフトブラシ構造は、大きめな官能基または大きめな同種のターゲットの最適な立体の配置付けをよく提供する。
これらの官能基は本発明の組成物に特定の性質を付与する。例えば、官能基は有効なまたは活性を持つ表面積を変化するにつれて、結合容量を変える。ある形態においては、特定のブラシ形状を提供する。他の形態においては、特定の強度、化学耐久性、酵素特性、生物活性分子または他の官能基に対する親和性を付与して、または組成物に他の有効な機能性を提供する。例えば、反応を触媒作用するまたは細胞へ化合物をデリバリーする能力である。
本発明の組成物のブラシに固定化する適当な官能基は、例えば、イオン交換基、すなわち陰イオン性解離基および陽イオン性解離基、親水性官能基、ならびに他の官能基を含み、他の分子を吸着および/または固定化する能力をもつ、もしくは単独でまたはポリマーブラシ構造の機械的または物理的特性の組合わせで触媒反応を引き起こす、すなわち、ブラシの密度及び携帯を調整することによって、表面積上の荷電基を最適化する、または触媒部位の活性を増加させる、または固定化した官能基の結合部位を立体的に最適化することによって、特定なリガンドやターゲットとの結合を最適化する。
一つまたは複数の陰イオン性解離基をポリマーブラシによって固定化することができる。適当な陰イオン性解離基の例は、第4級アンモニウム塩基、ならびに第1級、第2級、および第3級アミノ基またはアミド基を含む。特定の例は、アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、およびジエチルアミノ基を含む。好ましい陰イオン性解離基はアミノ基および第4級アンモニウム塩基を含む。本発明に有用かつ陰イオン性解離基を含む反応性モノマーは、例えば、ビニルベンジルトリメチルアンモニウム塩、ジエチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルアクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジエチルアミノエチルアクリレート、ジエチルアミノメチルメタクリレート、3級ブチルアミノエチルアクリレート、3級ブチルアミノエチルメタクリレートとジメチルアミノプロピルアクリルアミドを含む。陰イオン性解離基に転化できるエポキシド基を有する反応性モノマーも本発明に有用である。このような反応性モノマーの一例として、グリシジルメタクリレートがある。エポキシド基を陰イオン性解離基に転化するアミンの一例としてジエチルアミンがある。
一つまたは複数の陽イオン性解離基をポリマーブラシによって固定化することができる。陽イオン性解離基の例は、例えば、カルボン酸基、スルホン基、リン酸基、スルホエチル基、ホスホメチル基、カルボメチル基を含む。望ましい陽イオン性解離基はスルホン基およびカルボン酸基を含む。本発明に有用かつ陽イオン性解離基を有する反応性モノマーは、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、スチレンスルホン酸およびその関連の塩、ならびに2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸を含む。
一つまたは複数の親水基をポリマーブラシによって固定化することができる。親水基は空気中の水分子を捕捉して、本発明の膜の表面に吸着水層を形成することができる。親水基は空気中と同じく水中でも同様な働きをする。適当な親水基の例は、例えば、ヒドロキシル基、ヒドロキシアルキル基（ここでのアルキル基は低級アルキル基が好ましい）、アミノ基およびピロリドニル基を含む。望ましい親水基は、ヒドロキシル基、ヒドロキシアルキル基とピロリドニル基を含む。一つまたは複数の親水基をポリマーブラシに固定化することができる。本発明に有用かつ親水基を有する反応性モノマーは、例えば、エタノールアミン、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ビニルピロリドン、ジメチルアクリルアミド、エチレングリコールモノメタクリレート、エチレングリコールモノアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、およびトリエチレングリコールメタクリレートを含む。よって、ポリマーブラシ自体が官能基を含んでいてもよく、またはブラシに官能基を固定化してもよい。
一つまたは複数の官能基をポリマーブラシに固定化することができる。これらの官能基を組合わせて、または独立した多層に固定化することができ、組成物に追加の機能性を付与する。例えば、本発明は、ターゲットのポリペプチド基質をリン酸化または脱リン酸化する能力、消化する能力（制限部位における核酸、またはポリペプチドの加水分解）、I125、I131、P32、S35、Cr51及び他の放射性ニュクライドを用いたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを放射性標識する能力、生物的反応や化学的反応を触媒作用する能力という酵素活性を有する材料を提供する。例えば、ポリマーブラシに固定化するまたはポリマーブラシで単離される酵素官能基、および利用可能な酵素には、制限されないがアスコルビン酸オキシダーゼ（例えば血液、尿または他の試料の診断試験でアスコルビン酸の干渉を避けるため）、アスパルターゼ（例えばL-アスパラギン酸をフマル酸へ転化するため）、アミノアシラーゼ（例えばアセチル-D,L-アミノ酸をL-アミノ酸へ転化するため）、チロシナーゼ（例えばフェノール、ピルビン酸、およびアンモニアからチロシンを合成するため）、リパーゼ（例えばシアノエステルをイブプロフェンへ加水分解するまたはジルチアゼム前駆体を加水分解するため）、ペニシリンアミダーゼ（例えばアンピシリンおよびアモキシシリンの生産のため）、ヒダントイナーゼおよびカルバミラーゼ（例えば5-p-HP-ヒダントインをd-p-HPグリシンへ加水分解するため）、DNAase（例えばDNAをオリゴヌクレオチドへ加水分解するため）、ウシ肝臓カタラーゼ（例えば過酸化水素の加水分解のため）、トリプシンおよびキモトリプシン（例えばホエータンパク質の加水分解のため）、アルギナーゼおよびアスパルギナーゼ（例えばアルギンおよびアスパラギンの加水分解のため）、プロテアーゼ（例えば繊維から有機汚れを除去するため）、リパーゼ（例えば繊維から油性汚れを除去するため）、アミラーゼ（例えば繊維からデンプン食残物を除去するため）、セルラーゼ（例えば布の繊維の滑らかな表面および元の色を回復するため）、プロテアーゼとリパーゼ（例えば風味の強化および食べ物の熟成プロセスを促進するため）、ラクターゼ（例えば規定食の要件のための低ラクトースミルクおよび関連製品の生産）、β-グルカナーゼ（例えばワインの浄化プロセスを促進するため）、セルラーゼ（ワイン作りにおいて細胞壁の分解を促進するため）、セルラーゼとペクチナーゼ（例えばワインの浄化と保存安定性を改善するため）、ペクチナーゼ（例えば果汁の抽出および果汁の粘度低下を改善するため）、セルラーゼ（例えば果汁の収率および色を改善するため）、リパーゼ（脂肪および油の加水分解、または脂肪酸、グリセリン、脂肪酸（薬品、風味、香水および化粧品の生産に使用）の生産のため）、α-アミラーゼ（例えばデンプンの液化またはゼラチン化デンプンの断片化のため）、アミノグルコシダーゼ（例えば糖化、またはデンプンおよびデキストリンのグルコースへの完全分解のため）、グルコアミラーゼおよびプルラナーゼ（例えば糖化のため）、グルコースイソメラーゼ（例えばグルコースの異性化のため）、α-アミラーゼ（例えばデンプンをフルクトースへ転化するため）β-グルカナーゼ（例えばβ-グルカンの還元のため）、β-グルカナーゼ（例えばβ-グルカンおよびペントサンの還元のため）、リパーゼ、アミダーゼ、およびニトリラーゼ（例えば薬品および農薬の鏡像異性体の製造のため）、リパーゼ（例えば皮産業における脱脂プロセスでの脂肪除去のため）、アミラーゼおよびセルラーゼ（例えば繊維産業における低価値の未加工材料から繊維を製造するため）、キシラナーゼ（例えば製紙のための漂白したパルプの生産における前処理時の漂白触媒として）、β-ガラクトシダーゼ（例えばラクトースをグルコースに加水分解するため）、トリプシンおよびキモトリプシン（例えばミルクにある高分子量タンパク質の加水分解のため）、α-ガラクトシダーゼとインベルターゼ（例えばラフィノースの加水分解のため）、α-アミラーゼ、β-アミラーゼおよびプルラナーゼ（例えばデンプンをマルトースへ加水分解するため）、ペクチナーゼ（例えばペクチンの加水分解のため）、エンドペプチダーゼ（例えばk-カゼインの加水分解のため）、プロテアーゼおよびパパイン（例えばコラーゲンおよび筋肉タンパク質の加水分解のため）、グルコースオキシダーゼおよびカタラーゼ（例えばグルコースをグルコン酸へ転化するため）、リパーゼ（例えばトリグリセライドを脂肪酸およびグリセロールへ加水分解するため、オリーブオイルトリグリセライドを加水分解するため、大豆オイル、バターオイルグリセライド、およびミルク脂肪を加水分解するため）、セルラーゼおよびβ-グルコシダーゼ（例えばセルロースをセロビオースおよびグルコースへ加水分解するため）、ならびにフマラーゼ（例えばフマル酸を1-リンゴ酸へ加水分解するため）を含む。代わりになるものとして、微生物またはそのフラグメントが官能基になりうる。例えば、シュードモナス・ダクンハエ(dacunhae)（例えばL-アスパラギン酸のL-アラニンへの転化のため）、クルブラリア・ルナータ/単純カンジダ（例えばコルテキソロンをヒドロコルチソンおよびプレドニゾロンへ転化するため）、または酵母および他の酵母（例えば糖の発酵および嫌気性発酵のため）があり、全てがポリマーブラシに固定化できる。
官能基は、全ての親水基、陰イオン性解離基または陽イオン性解離基、ならびに酵素を含む。さらに具体的には、ポリマーブラシは複数の官能基（例えば陰イオン性解離基と親水基、または陽イオン性解離基と親水基）、または3種の官能基（例えば親水基、陰イオン性解離基、および陽イオン性解離基）、またはそれ以上の官能基（例えば親水基、陰イオン性解離基、陽イオン性解離基、酵素、SpA、および一つまたは複数のFv抗体フラグメント）を有しうる。本発明に適当な官能基の組み合わせは、例えば、イオン基と非イオン基、すなわちアミン基と共存する親水基を含む。好ましい態様には、上記の第1の官能基に組み合わせて第2の官能基をさらに含む。現行の好ましい態様において、第1、第2、第3、および第4の官能基はポリマーブラシに多層に固定化される。したがって、本発明の主な特徴の一つとして、試料溶液中に存在する親水性ドメイン（非イオン性）を有する各種の分子は、イオン性ドメイン（陰イオンまたは陽イオン）を有する分子、あるいはリン酸化状態を有する分子、または結合部位またはヌクレオチドもしくはポリペプチド配列を有する分子が回収、精製、濃縮・単離、修飾、合成でき、またはそれを本発明の組成物と共に使用できることである。基質生物活性分子の結合を変化させるために官能基を変えてもよく、それによって、インビボでの解離速度を調節して、結合した基質生物活性分子の放出が制御される。このような改変または化学的修飾は、本発明の組成物において達成してもよく、またはポリマーブラシ表面に固定化する前に達成してもよい。
官能基は抗体またはその関連ドメインもしくはフラグメントを含みうる。例えば、ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ライシン残基により本組成物に抗体を固定化する方法を提供する。上記の炭水化物部分は、ポリマーブラシまたは官能基へ固定化するためのもう一つのソースを提供する。抗体の基本構造ユニットがテトラマーを含むことは周知である。それぞれのテトラマーはポリペプチド鎖対の2組（同一）からなり、各対は1つの軽鎖（約25kDa）と1つの重鎖（約50〜70kDa）とを有する。各鎖のアミノ末端部分は、基本的に抗原認識のための約100から110個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を有する。各鎖のカルボキシ末端部分は、基本的にエフェクター機能のために働く不変領域を有する。ヒト軽鎖はκおよびλ軽鎖に分類される。重鎖はμ、δ、γ、α、またはεに分類され、それぞれ、IgM、IgD、IgA、およびIgE抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖および重鎖において、可変および不変領域は約12個またはそれ以上のアミノ酸を有する「J」領域によって結合し、重鎖は約10個以上のアミノ酸を有する「D」領域を含む。一般に、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W.編、第2版、Raven Press, N. Y. (1989))を参照（全体が本明細書に参照として組み入れられる）。それぞれの軽/重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって、完全な抗体は2つの結合部位を有する。二機能性または二重特異性抗体以外は、その2つの結合部位は同様である。それらの鎖は、同様の一般構造である比較的保存されたフレームワーク領域（FR）を示し、その構造は過度に可変な領域（相補性決定領域またはCDRとも呼ばれる）に結合している。フレームワーク領域によって、各対の2つの鎖のCDRが整列し、特定なエピトープとの結合が可能になる。N末端からC末端にかけて、軽鎖と重鎖の両方は、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4ドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987および1991))、またはChothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)、Chothiaら、Nature 342: 878-883 (1989)の定義による。これら全てのドメインまたはフラグメントもしくは配列は、本明細書に記載の方法によってポリマーブラシに固定化できる。
二重特異性または二機能性抗体は異なる2つの重/軽鎖対と結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab'フラグメントの連結を含む各種の方法によって作られる。例えば、Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol., 148: 1547-1553 (1992)を参照。従来の抗体の生産に比べて、二重特異性抗体の生産は労働集約的なプロセスであり、収率も純度も一般的に低い。二重特異性抗体は、単一結合部位（例えばFab、Fab'、およびFv）を有するフラグメントの形では存在しないが、上記に説明したように固定化できるので、ポリマーブラシに追加の機能性特性（すなわちリガンドに対する追加の特異性）を与える。本明細書に記載の方法によって、ポリマーブラシに、複数のアイソタイプ、種、およびエピトープ認識特性を付与することができる。
ヒト化抗体またはキメラ抗体も適当である。これらを作製するためのアプローチは、1990年1月20日に出願した米国特許07/466,008号、1990年11月8日に出願した米国特許07/610,515号、1992年7月24日に出願した米国特許07/919,297号、1992年7月30日に出願した米国特許第07/922,649号、1993年3月15日に出願した米国特許第08/031,801号、1993年8月27日に出願した米国特許第08/112,848号、1994年4月28日に出願した米国特許第08/234,145号、1995年1月20日に出願した米国特許第08/376,279号、1995年4月27日に出願した米国特許第08/430,938号、1995年6月5日に出願した米国特許第08/464,584号、1995年6月5日に出願した米国特許第08/464,582号、1995年6月5日に出願した米国特許第08/463,191号、1995年6月5日に出願した米国特許第08/462,837号、1995年6月5日に出願した米国特許第08/486,853号、1995年6月5日に出願した米国特許第08/486,857号、1995年6月5日に出願した米国特許第08/486,859号、1995年6月5日に出願した米国特許第08/462,513号、1996年10月2日に出願した米国特許第08/724,752号、および1996年12月3日に出願した米国特許第08/759,620号、ならびに米国特許第6,162,963号、第6,150,584号、第6,114,598号、第6,075,181、および第5,939,598号、ならびに日本特許第3 068 180号B2、第3 068 506号B2、および第3 068 507号B2に詳しく議論され、説明される。Mendezら、Nature Genetics 15: 146-156 (1997)、ならびにGreenおよびJakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998)も参照。1996年6月12日に公開された欧州特許第0 463 151号B1、1994年2月3日に公開された国際公開公報第94/02602号、1996年10月31日に公開された国際公開公報第96/34096号、1998年6月11日に公開された国際公開公報第98/24893号、2000年12月21日に公開された国際公開公報第00/76310号も参照。上記引用した特許、特許出願、文献の開示は本明細書にすべて参照として組み入れられる。説明のように、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、またはその関連ドメインもしくはフラグメントをポリマーブラシに固定化できる。
リポゾーム、マイクロスポンジおよびマイクロスフェアは、機能性マイクロデリバリー基としての役を演じ、本明細書に記載の材料に固定化できる。これらは、マイクロデリバリデバイス内にある化合物をターゲット細胞へデリバリーするために有用である。ここでは、細胞を、化合物を固定化したリポゾーム、マイクロスポンジおよびマイクロスフェアを有する機能化材料と接触させる。リポソームは、水溶性区分と膜質の内部区分を定義する典型的に球状の形につくられる脂質分子である。リポソームは内部区分に薬剤を捕捉することができて、そして細胞内の所望の部位へ薬剤を輸送することができる。リポソームに捕捉された薬剤はリポソームによって放出され、例えば、細胞膜を形成する脂質二重層に類似している利点から細胞内に取り込まれる。ネクスター製薬（NeXstar Pharmaceuticals）またはリポソーム社（Liposome, Inc）から得られるリポソームを含み、本明細書に記載の方法によって機能化すれば、各種の適当なリポソームを使用することができる。リポソームをポリマーブラシへ固定化する方法は幾つかあり、例えば、疎水性ポリマーブラシまたは官能基、例えば脂肪酸官能基との相互作用による方法がある。
マイクロスポンジは化合物を捕捉できる空孔網を有する表面積の広い高分子スフェアである。マイクロスポンジは典型的にはビニルとアクリルモノマーとを用い、水系懸濁重合によって合成される。形状を安定させるため、重合したスフェアを架橋できるようにモノマーは単一または二機能性ともなりうる。空孔の体積および溶媒に対する膨潤性を制御するためにプロセスの条件およびモノマーの選択は可変である。そして、平均直径の範囲が制御されたマイクロスポンジを合成でき、直径約2マイクロメートル以下の小さいものも含まれる。標準のビーズ組成はスチレンとジビニルベンゼン（DVB）のコポリマーである。機械的ストレスもしくは温度的ストレス、または超音波処理によって、高分子マイクロスポンジに捕捉された薬剤は徐々に放出される。アドバンスドポリマーシステムズ（Advanced Polymer Systems）から市販されているマイクロスポンジを含み、本明細書に記載の方法によって機能化すれば、各種の適当なマイクロスポンジを使用することができる。これら自身は高分子であるため、ポリマーブラシへグラフトするか、または本明細書に記載の開示を考慮して、当技術分野で周知の標準的な化学技術によって固定化することができる。このようなマイクロスポンジを有する機能化材料の利用は、機能化材料にさらすことによって、ターゲット細胞に生物活性分子または化合物をマイクロスポンジで導入することを含む。
バイポーラ機能化材料
ここで開示した技術は、バイポーラ特性をもつ材料の開発に応用できる。こえらのバイポーラ機能化材料は、例えば、一つの領域または表面に荷電された官能基およびもう一つの領域または表面に逆の荷電された官能基を有する材料を含む。実施例1はバイポーラ膜の合成および応用を説明するが、他の態様も可能である。そしえ、本発明によると、デバイスの形態は、機能化膜の合成に制限されない。他の材料も使用可能、およびステップごとのグラフトとマスキング技術によって、本発明の選択的グラフトと反対荷電官能基の固定化および他の官能基を含んで、開発できる。
実施例1のバイポーラ膜は実質上平面であり、一つの表面に陽イオン交換基が固定化され、反対側の表面に陰イオン交換基が固定化される。このバイポーラ膜の特徴は、電圧をかけるとき、膜の中心層で二つの官能基が水をH+とOH-に分解することである。原理に制限されなく、水分解メカニズムを説明できる二つの仮説がある。一つは、第二ウィン効果によると、膜の中心層で発生する電圧は電気的に水をH+とOH-に分解する。もう一つは、化学反応によると、固定化された官能基と水との反応で、水をH+とOH-に分解することを導く（参照として組み入れられるR. Simons, J. Membr. Sci., 78, 13(1993)とH. Strathmannら, J. Membr. Sci., 125, 123(1997)に参照）。
このようなバイポーラ機能化膜の応用は多数ある。例えば、ポリペプチドのハイスループット単離およびそれに継ぐ等電位分離のため、親和性精製官能基と荷電官能基をもつグラフト重合ブラシを有する基質が利用可能である。一つの局面では、製薬業とバイオテクノロジー業に使う化合物（例えばサリチル酸）を生産するために、基質を使用する。他の応用は、制限されなく、電気透析、廃棄物処理から塩のリサイクル、濃縮した海水から酸とアルカリの生産を含む。
バイポーラ機能化膜の作製方法は、張り合わせ、キャスティングおよびプラズマグラフト重合法を含む（参照として組み入れられるIwamotoら, Nihon Kagaku Kaishi, No.6, 425(1997) in Japanese, G.S.Trivediら, React. Funct. Polym. 28, 243(1996), Y.Yokoyamaら, J. Membr. Sci., 43, 165(1989)に参照）。当業者に知られるそれぞれは各自の利点をもつ。本発明に説明した実施例1のデバイスは、キャスティングした電気分離デバイスと同等の電気分解性能を示すが、製造と制御に使いやすいことおよびよりコスト効率がよいことが信じられる。
機能化材料への細胞および微生物の固定化
本発明の材料は、核酸、有機と無機分子と化合物、酵素とマルチサブユニットポリペプチドおよびその類似ものを含む、広範囲の生物的および化学的ターゲットとの相互作用が可能である。ある局面では、機能化材料は、これらのターゲットと相互作用して、ある反応を触媒作用する。別の局面では、材料はターゲットを結合する。これらの小さい化合物に加えて、機能化材料は、例えば、マルチサブユニット酵素、有機体、膜レセプターと膜のポリペプチド錯体のような大き目のターゲット構造にも有効である。別の局面では、本発明の材料とデバイスは、制限されないが、ヒトと動物細胞、細菌、ウイルスと真菌のようなそのままの細胞ターゲットと相互作用することが可能である。これらのターゲットは、次にポリマーブラシへの固定化が可能であり、官能基として使われ、材料に追加の機能を提供する。
マルチサブユニットポリペプチド、有機体、細胞と微生物を含む大きい構造物の固定化は、本発明に開示される複数タイプの官能基で実現できる。荷電官能基は、例えば3級アミノ官能基、溶液から最低限のタンパク質除去しながら、ウイルスとウイルス粒子を捕捉するとても有効なフィルターとして、使える（参照として組み入れられる米国特許申請番号:20010034055、Leeらに参照）。実施例2は、第4級アンモニウム塩基を利用した、液相培養液から黄色ブドウ状球菌の固定化を説明した。この細菌は、次にその表面にあるProtein Aを利用して、免疫グロブリン分子固定化あるいは他の目的に使うことができる。溶液から細菌を単離する応用はたくさんあり、精製技術を含む。本発明におけるデバイスへの細菌の固定化は、組み換え遺伝子とポリペプチドのクローニングと発現の分野への応用をも含む。たとえば、バイポーラ官能基をさらに含む、細菌と核酸を固定化できる膜からなるデバイスは、1ステップの核酸による細菌のトランスフォーメーションとエレクトポレーションに使用可能である。別の応用は、哺乳類細胞の固定化および感染であり、たとえばセルライン、ハイブリドマとトランスジェニック有機体をつくる感染において、デバイスは、細胞と核酸の固定化のための官能基をもつポリマーブラシからなり、細胞によるポリヌクレオチドの吸収には、化学感染法が使われる。
細胞膜表面のたくさんの荷電分子は、荷電官能基による固定化のターゲットとなる。多糖、グリコタンパク質とグリコ脂質に取り入れられるものを含む酸性糖類は、陰イオン交換官能基のポテンシャルターゲットであり、N-アセチルニュラミニック酸（シアリック酸）またはN-アセチルムラミック酸に制限されない。例えば、シアリック酸は、赤血球を含むたくさんのヒト細胞に見つけられ、本発明の材料の固定化ターゲットとなる。陽イオン交換官能基は、表面多糖アミノ糖類を有する細胞や微生物の単離に有用であり、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、ガラクトサミンとマンノサミンに制限されない。他の化合物、例えば、ペプチドグリカン、グリコサミノグリカン（すなわちその中にはコンドロイチン、ケラチンとヒアルロン酸）とプロテオグリカンは、すべてマイナス荷電をディスプレイして、陰イオン交換官能基のターゲットとして供給して、本発明の材料への細胞の固定化を許す。細菌を固定化する他のターゲットはリポポリサッカライド（LPS）であり、たとえば、O抗原とH抗原はグラム陰性病原性細菌（例えば、E.coliとSalmonella typhimurium）の細胞膜の主な組成物である。他の病原性細菌は、例えば、Staphylococcus、Streptmyces、Clostridium、YersiniaとBacillusは、同じく本発明の材料によって、簡単に単離でき、説明したように、その病原性を評価する。
細胞と微生物の固定化は、ポリマーブラシ上の荷電官能基への荷電ターゲットの結合だけに基づくことはない。例えば、多糖は、水素結合を形成する能力を有するターゲットとしてのたくさんのヒドロキシル基をもつ。それに加えて、脂質と脂肪酸は、生体膜の主な組成物であり、非極性官能基および脂質アンカーをもつ官能基（すなわちグリコホスフォイノシタール、ホスファチジルセリン、スフィンゴマイエリン、ホスファチジルクロリンとホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシタール、その他）に固定化されることができる。また、特異な表面レセプター、細胞膜全体のタンパク質、末梢タンパク質、アンネシンとイオンチャンネルは、親和性精製官能基のためにターゲットを提供して、細胞を固定化できる。ある望ましい局面では、これらの親和性精製官能基は、免疫グロブリンまたはフラグメントを含み、細胞上のターゲットへ特異的に結合することができる。例えば、ヘマグルチニン（HA）とオーソマイソウイルス上のニュラミニダーゼまたはパラマイソウイルスビリオンは、anti-HAとanti-ニュラミニダーゼ抗体のターゲットとなり、VP1はピコルナンウイルスの固定化のためのターゲットであり、およびgp120はanti-gp120抗体をつかったHIVビリオンの固定化のためのターゲットである。特に被膜ウイルスは、ここで開示した技術で、ターゲットした分離へ従順できる。特に、ポックスウイルスビリオンを囲むリポタンパク質膜のポリペプチド（すなわちバリオラとバッシニア）は、親和性に基づく方法でのビリオンの固定化のためにターゲットを提供して、フェノタイピック決定と同定のためのマーカーにもなる。細菌、ウイルスと真菌の表面抗原の完全リストは、それぞれ、すなわち、ここに参照として組み入れられるBergy's Manual of Systematic Bacteriology、Field's VirologyとAtlas of Clinical Fungi G.S.De Hoogらからみつけることができる。他の哺乳類、特にヒト細胞上の表面抗原は、医療およびバイオテクノロジー分野に良く知られている（参照として組み入れられるAltered Glycosylation in Tumor Cells (UCLA Symposiaon Molecular and Cellular Biology, Vol 79), Christopher L. Reading (Editor), Immune Complexes and Human Cancer (Contemporary Topics in Immunology, Vol 15), Fernando A. Salinas, Michael G., Jr. Hanna (Editor), Tumor Markers: Biology and Clinical Applications (Cancer Research Monographs, Vol 4), Nasser Javadpour (Editor)とオンラインのhhtp://ww.atcc.orgにあるAmerican Type Culture Collection カタログに参照）。本発明によると、これらの表面抗原は固定化のためのターゲットに有用である。つまり、表面抗原への抗体の親和性に基づく、または弱い共有結合相互作用、または他の物理的特性に基づく。細胞を固定化するための特別な官能基の選択は、望む細胞または有機体上に発現したターゲット、ここで提供した教授の観点において、当業者にとってのルーチンと言われる。例えば、Bacillus anthracesスポアバイオマーカーは、サンプル混合物からBacillusを単離するターゲットとして使える。供給水または洋服、または有機体の組織からサンプルを得る。サンプルを、スポアマーカーに対する親和性をもつ官能基を有する材料に導入して、単離した有機体の病原性を評価する、例えば、単離した有機体のアントラックス毒素組成物 PA（保護抗原）、LF（致死ファクター）とEF（浮腫ファクター）の発現レベルを決定すること。有機体の単離とマトリックスアッシストレザー脱着/イオン化飛行時間質量分析計（MALDI-TOFMS）による測定を詳しく書く、参照として組み入れられるElhanany E.ら、Rapid Commun Mass Spectrom 2001;15(22):2110-6に参照。この局面では、B. anthracesスポアは、材料に固定化され、マトリックスへのシナピニック酸またはアルファシアノ4-ヒドロキシシンナミック酸の固定化をさらに含む、材料に直線モード分析に連れる。
ポリペプチドまたはオリゴサッカライドマーカーは、細胞ターゲットであり、それに対する親和性を有する官能基は、細胞の材料への固定化に使う。ある局面では、材料は、表面抗原性決定因子の存在に基づく幹細胞を単離するために使い、細胞が特定の系統へのコミットを表し、または分化した未熟の細胞（すなわち一つまたは複数のマーカーCD10+, CD19+, CD34, +PAX5, E2A, EBF, ATM, PDGFRA, SIAH1, PIM2, C/EBPB, WNT16とTCL1を有する臍帯血または骨髄からのヘマタポエティック幹細胞）、それぞれはB細胞成熟時おける所定時期に発現される。参照として組み入れられるMuschenら, Proc Natl Acad Sci USA 2002 Jul 23; 99(15):10014-9に参照。これらは、細胞ラインを創製する、細胞成長をキャラクタリゼーションする、および単離細胞を必要とする他の応用に、有用である。別の局面では、材料は病気状態のマーカーとしてのターゲットに対して親和性を持つ。例えば、CBF1応答遺伝子の転写は、B細胞慢性リンパ球性白血病のマーカー、CD23の過剰発現を導く。この態様において単離細胞は、つぎの検査に使われ、またはマーカーの異常発現にキャラクタライズされた病気の治療における治療エンドポイントをモニターする。たとえば、細胞が固定化され、およびマーカーの存在/不在が決定され、病気状態の存在または不在へ相関する。医療業には、これらの病気状態のマーカーがたくさん知られている。望ましい局面では、このようなマーカーターゲットに対して親和性をもつ適当な官能基によって、本発明の材料へヒト細胞を固定化する。ルーチンアッセイでの単離細胞の利用は、単離細胞のフェノタイプおよびジェノタイプを決定でき、病気状態の情報と相関できる。
本発明の材料は各種の薬品と環境に対して不活性である。例えば、ポリエチレンとポリプロピレンは、酸とアルカリ、およびたくさんの溶媒と変性剤、例えば尿素、クロロホーム、ホルムアルデヒドとジメチルスルホサイド（DMSO）に抵抗をもつ。本発明の利点は、固定化細胞から抽出した炭水化物、脂質またはタンパク質フラクションの応用を含む。それに加えて、材料は、加熱および特に冷凍による過度の温度に対応できる。したがって、材料は、溶離ステップを必要としなく、望まれる細胞を固定化して、次に冷凍することに特に有利である。たとえば、E. coli細胞は固定化されて、10％DMSOを有するメディアで処理され、直接に材料上で、適当な極低温栄養溶液で-80℃で保存される。原理に制限されなく、ポリマーブラシはそれ自身の表面で多次元で細胞を固定化して、細胞膜を実質上に変形することがないので、固定化された細胞の生存が促進されると言われている。
機能化材料ライブラリー
現段階のグラフト重合材料は、直接のプロセスで生産されていて、それぞれをカスタムメードして、特定なバイオテクノロジーの応用に評価される。この方法は成功するが、プロセスが面倒で時間かかるので、新製品を生産する能力を制限する。ディスカバリープロセスを加速するためには、機能化材料ライブラリーが必要とされ、各種の特性をもち、例えば、両方のxとy次元に広範囲の物理的および機能性特性を変化するそれぞれ小さな面積（つまり約1平方ミクロン〜約2cm2）として提供する複数のポリマーブラシドメイン（図20に参照）をもつ。ここでの「ライブラリー」または「材料ライブラリー」は、複数の機能化材料を有する一つまたは複数の表面を含む基質を意味する。ここでの「ドメイン」は、特定の機能化材料の独立領域を意味する。同様な機能化材料は、一つまたは複数のドメインに使われてもよい。したがって、ライブラリーの重複を提供する。あるドメインは、別のドメインに直ぐ近接することもあり、および接触する、またはドメインは物理的なコンタクトではなく、液状のコミュニケーションであり、またはドメインは隔離されている。ここでの「アドレス」または「ドメインアドレス」は、ライブラリーにおけるドメインの領域または場所を意味して、場所は、ある空間説明を提供するCartesian座標または他の方法で説明できる。したがって、ライブラリーは、それぞれのアドレスを有する複数のドメインを含む。
有望な薬候補を同定するために、コンビナトリアルケミストリー会社によって作られたライブラリーのコンセプトと同じく、ライブラリーは迅速に作られ、新規な材料の開発を最適化するまたは既存のものの最適化のために、迅速にスクリーニングできる。変化させるパラメーターは、基材の化学組成物、ブラシを形成するモノマーの種類、ブラシ密度、ブラシ長さ、およびポリマーブラシの化学的機能化の種類と程度を含む。ライブラリーのポテンシャルな複雑さを描くため、ここで開示したグラフト技術をつかって、ポリマーブラシ構造の形成に適する市販の異なる反応性モノマーは1000以上ある。それに加えて、これらのモノマーは各種のブレンドに使える、および各固定化化学と官能基によって、機能化でき、広範囲の機能性をもつユニックな材料の莫大なライブラリーを作ることができる。また、本発明に基づく材料ライブラリーの生産およびスクリーニングプロセスは、ミニチュア化および自動化に適している。
さらに、これらのライブラリーは、マイクロフルイディックデバイスに入れることができ、ターゲット分子と相互作用する候補材料のドメインを同定するハイスループット法によって、ライブラリーの迅速スクリーニングを促進できる（図21）。例えば、治療用タンパク質を精製する膜が望まれる。この特定なターゲットタンパク質を結合する機能化材料のドメインのため、候補材料は、ライブラリーのハイスループットスクーリングに基づいて、まず選択される。このスクリーニングは、ライブラリーの一つまたは複数のドメインへのターゲットの結合に基づいて、材料の最適な組成（すなわち、材料、ブラシ組成物、ブラシ密度/長さおよび官能基密度）を同定できる。それに加えて、このスリーニングは、ターゲットタンパク質の最適な吸着および溶出のために必要とする適当な環境の条件（すなわち、塩濃度、温度、コファクターなど）も決定できる。したがって、ハイスループットスクリーニングを行うことによって、ライブラリーは、コマーシャルに重要なタンパク質または生物ターゲットを結合するユニックな材料を同定するだけではなく、材料の最適な利用および性能のための条件も同定している。
ライブラリーを創製するには、それぞれの物理的または機能性特性を変化する機能化材料の複数のドメインを提供して、または少なくとも基質の一つの表面に形成させる。ここで開示した一つまたは複数の材料は、基質としての利用に適している。例えば、ガラス表面にコーティングした有機薄膜は、適当な基質を提供して、ポリマーブラシがグラフトされることおよび引き続きの機能化ができる。別の選択性には、機能化材料は先に作られ、あとに基質に貼り付けることも可能である。
基質にグラフトまたは別の方法で張り合わせた機能化材料またはポリマーブラシは、基質の表面にある独立ドメインとして表した。ここで説明した技術を通じて、ブラシ密度とブラシ長さおよび形態を変化できる。また、スタンダードのマスキング技術も応用でき、選択したドメインに関するコントロールされたグラフトプロセスを許す。本発明のライブラリーは、少なくとも二つのドメインを含み、および望ましく10、50、100、1000または10,000ドメインである。現に望む態様において、そのアレイは、約105ドメインを含む。各ドメインは、約0.25mm2以下の基質平均表面積をカバーする。望ましく、各ドメインにカバーされる基質表面の面積は、約1mm2〜約10,000mm2の間である。特に望む態様において、各ドメインにカバーされる基質表面の面積は、約100mm2〜約2,500mm2の間である。アレイのドメインはどんな幾何学的な形状でも良い。例えば、ドメインは四方形、長方形、または円形でもよい。アレイのドメインは不規則の形状でも良い。ドメインは、下敷きの基質の中間の平面から随意に高められる。アレイのドメインを分離する距離は変化できる。望ましく、アレイのドメインは、隣のドメインから約1mm2〜約5000mm2に離れる。典型的に、ドメイン同士を離す距離は、もしドメインは約10mm2以上の次元をもつならば、アレイのドメインの横の長さまたは直径にだいたい比例する。ドメインのサイズが小さければ、ドメイン同士を離す距離は、典型的にドメインの次元より大きくなる。各ドメインは、基質の上に、独立の場所またはドメインアドレスをもつ。現に望む態様において、ドメインは2次元のマトリックスフォーマットで表して、および各ドメインのアドレスは、(x)と(y)の値を有するCartesian座標によって説明される。各ドメインは、一つまたは複数の官能基を固定化したポリマーブラシをもつ。官能基は望ましく、単位面積当りに約0.001fg/mm2〜約100g/mm2の濃度変化で、ポリマーブラシに直接的にまたは間接的に共有結合的に固定化される。望まれる応用に応じて、ドメインアドレスに固定化される異なる官能基の数は変化する。異なる官能基を用いて、多機能化ドメインを創製することができる。例えば、あるポリペプチドの復元および元のポリペプチドを認識する官能基への結合は、ある特定のドメインに、折りたたんだポリペプチドを結合する官能基に加えて、尿素を加水分解できる官能基を導入することによって、達成できる。それに加えて、異なる尿素活性レベルを、ドメインアドレスのシリーズで、創製できる。そして、各ドメインアドレスにおけるタンパク質結合の検出で、ポリペプチド結合に必要とする復元の程度が決定できる。機能化材料の同様なアレンジメントで、他の変数である生物的な機能を実行するまたは結合するターゲットの能力を評価できる。例えば、制限されないが、ある範囲のpH値またはある範囲の塩濃度、またはある範囲のコファクターの濃度（例えば金属イオン、燐酸塩、または抗酸化剤）、またはある範囲の拮抗薬または薬の濃度。例えば、各ドメインのポリマーブラシに固定化するHIVタンパク質gp120に対する抗体を、ユニバーサルの官能基として使い、ウイルスを捕捉できる。ライブラリーに、各ドメインにおいて、濃度を変化しながら、二つの拮抗薬の結合サイトの候補を導入する。蛍光標識したCD4をライブラリー導入する。レセプター拮抗薬の組合わせに対するウイルスへのCD4結合の定量化は、各ドメインアドレスの蛍光の検出で、評価した。これは拮抗薬活性の程度に関係する、つまり各ドメインアドレスに知られる拮抗薬の濃度に関係する。したがって、最適な拮抗薬濃度が決定される。
材料ライブラリーの創製に、機能化材料のたくさんの組み合わせは可能である。例えば、単一の材料ライブラリーにおいて、各ドメインは異なる機能化材料でもよい、すなわち異なる官能基からなる。つまり、それぞれ一つのユニックな官能基を有する100の異なる機能化材料からなる100ドメインを有する材料ライブラリー。同様に、それぞれ他のドメインアドレスに使われない3つの官能基を有する10,000度メインからなる10,000の異なる機能化材料の材料ライブラリーで、全般的の複雑さの30,000の異なる官能基をもつライブラリーに導く。逆に、単一の材料ライブラリーにおいて、各ドメインは異なる機能化材料であるが、部分的に他のドメインと共通の機能を共有しない、それぞれのドメインは、同じおよび異なる官能基の組合せを含む、すなわち100ドメインを有する材料ライブラリーは、100の異なる機能化材料を含む、それぞれユニックな第一官能基を有するが、半分以上のドメインは共通の第二官能基を共有するおよび残りの半分は九通の第三官能基を共有する、すなわち、ライブラリーは3000ドメインを有するが、それぞれ異なる官能基は、3つの共通ドメインに固定化されるので、1000の異なる機能化材料しか含まない。現に望む態様において、複数のドメインは、共通の官能基を有するが、各ドメインはまだ異なる機能化材料である。なぜならば、それぞれは、ポリマーブラシ密度、ブラシ長さとブラシ形態で変わる。
材料ライブラリーの創製に使われる機能化材料のタイプおよびドメインの数はライブラリーの将来の用途に依存する。例えば、患者のがんまたは他の病気組織の状態を評価する検査ツールとして使うライブラリーであれば、病気状態を含まない知られる発現のターゲットマーカータンパク質に特異性をもつ官能基を有する5つのドメイン、および病気状態を指示する知られる発現のターゲットマーカータンパク質に特異性をもつ官能基を有する5つのドメイン、約10の異なる機能化材料からなるライブラリーでもよい。しかしながら、もし、ライブラリーが、細胞の主な溶解性タンパク質の内容を測定するならば、そのライブラリーは望ましく、少なくとも10,000の異なる機能化材料を含む。別に、ある程度制限されるプロテオミクス研究、例えばさまざまなヒト転写ファクターの過剰を調べる研究において、約100の異なる機能化材料しか必要としないかもしれない。
機能化材料の種類に依存しながら、材料ライブラリーは広範囲の応用に有用である。これらは、特定のターゲット（たとえば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、膜、有機体、微生物、ウイルス、プリオンまたは細胞、特にヒト細胞）を結合するための捕捉役として、有用である。これを達成するために、機能化材料は、核酸、ポリペプチド、ポリペプチドの錯体、レセプター、レセプターリガンド、オリゴ多糖と多糖、脂質、プリオン、微生物細胞、ウイルス、カビ、および細胞を結合する官能基から選択される。ライブラリーは、ターゲットの化学的または物理的特性を評価するため、またはターゲットを関与しながら反応を行うためにも有用である。機能化材料は、特定のターゲットを関与する反応のための触媒作用役という官能基を有するものから選択される。例えば、ターゲット核酸の制限消化、ターゲットポリペプチドのタンパク質分解のせん断、およびターゲット脂質または多糖を関与する他の触媒反応。ある態様において、ターゲットは、単一の有機体の細胞または集団の発現する産物またはそのフラグメントというタンパク質である。発現産物は、各種のサイズまたは機能のペプチドを含むタンパク質でもよい。これらは細胞内または細胞外のタンパク質でもよい。発現産物は、単一細胞または複数の有機体細胞からでもよい。有機体は、植物または動物でもよい。本発明のある望む態様において、結合するパートナーはヒト発現産物またはそのフラグメントである。ある態様において、ターゲットは、すべてのタンパク質の無作為的に選んだサブセットを含む、単一細胞または特定の有機体の集団細胞の発現する、またはタンパク質のすべてのフラグメントのサブセットの、ペプチドを含む。ライブラリー上のずべての機能化材料のまたは一部のターゲットは既知でなくてもよい。例えば、ライブラリーの異なる機能性材料は、一緒に単一細胞タイプからの広範囲の細胞タンパク質を結合する。中にはたくさんのタンパク質が未知のアイデンティティーおよび/または機能を有する。別の態様において、機能性材料のターゲットは関連タンパク質である。機能性材料に結合される異なるタンパク質は選択的に同じタンパク質ファミリーのメンバーである。機能性材料の異なるターゲットは、機能性的にまたは機能性的に疑われるものでもよい。機能性材料に結合される異なるタンパク質は、同様な構造または配列を共有するまたは単に同様な構造または配列を共有する疑いのものでもよい。同じくそのままの細胞は、特定な機能性材料のターゲットになってもよい。例えば、制限されないが、望む表面抗原を発現する細胞を単離できる、すなわち、CD4＋細胞またはガンマーカーを発現する細胞。これらは、患者の組織サンプルから単離した特定のフェノタイプ細胞の検出を提供する、すなわち、免疫妥協された患者のT細胞カウントの評価、または腫瘍組織から悪性細胞の同定。
ある局面では、材料ライブラリーはマイクロフルイディックデバイスに使われる。提示したライブラリーを有する基質を反応チャンバーに置く。反応チャンバーは、基質を入れるデバイスを含み、環境を規定する。反応チャンバーへの試薬の供給（および除去）および反応チャンバーの環境（すなわち、温度および酸化性環境）を規定する方法が既知の技術によって、反応チャンバーに取り入れる。この技術の例は、参照として組み入れられるKricka, Clinical Chem. 44:2008-2014(1998); 米国特許第5,846,727号に説明されている。例えば、基質を反応チャンバーに置いて、試薬とバッファーおよびターゲット溶液が反応チャンバーにポンプで反応チャンバーの各側のマイクロフルイディックポートを流入および流出する。ある態様において、複数のドメインと通信するため、基質はエッチングされるチャンネルを有する。よって、マイクロフルイディックポートと望む基質の機能化材料と溶液交流を許す。完全の溶液交換は迅速に行われることもできる、すなわち、約1秒以内、およびマイクロフルイディックポートへの溶液の流れを制御する電子コントロールバルブとポンプによって調停される。操作者主導システム、望ましく自動化システムによって、類似もののコントロールを実現する。流体のマイクロタイタープレート、遺伝子およびプロテオミクスチップまたはアレイへの機械的な導入は、一般的に試薬の迅速な混合および実験のスループットの促進のために行われ、本発明はこれらのロボティックシステムに適応できる。最近、微量の流体液量をはイスループット的に混合・アッセイするマイクロスケールのデバイスが開発された（例えば、参照として組み入れられる米国特許第6,046,056）。一般的に、マイクロフルイディックデバイスは、酵素を含む生物種および化学種と、それらの基質、リガンドとリガンドバインダー、レセプターとリガンド、抗体と抗体リガンド、との相互作用に関連するアッセイおよび他の複数のアッセイに適している。デバイスが、単一の連続プロセスで、試薬の混合および混合結果のアッセイをする能力を提供するため、微量の試薬をアッセイできるため、これらのマイクロスケールデバイスは、最先端実験科学の基礎の代表となる。
本発明によると、マイクロフルイディックデバイスを含む統合マイクロフルイディックシステムに、基質が置かれる。デバイスは、少なくとも最初の反応チャンネルおよび少なくとも第一試薬の導入チャンネル、典型的にエッチング、機械化、プリント、または材料ライブラリーを有する基質をもつデバイスの表面上またはデバイス内に作製するものを有する。選択的に、デバイスは、第二反応チャンネルおよび/または試薬導入チャンネル、第三反応チャンネルおよび/または試薬導入チャンネルまたはその類似物、数百または数千までの反応チャンネルおよび/または試薬導入チャンネルを含んでもよい。反応チャンネルと試薬導入チャンネルは、流体交流であり、すなわち、流体は選択された条件下でチャンネルの間を流す。デバイスは、反応チャンネルと試薬導入チャンネルの間を通す材料の移動を制御するため、材料移動システムをもつ。例えば、材料移動システムは、移動のコントロールと流体の混合を許すために、エレクトキネティック、エレクトオスモティっク、エレクトフォレティックまたは他の流体を制御するもの（マイクロポンプとマイクロバルブ、流体スイッチ、流体ゲートなど）を含んでもよい。デバイスは、試薬導入チャンネルと流体交流するフルイディックインターフェースも含む。このようなフルイディックインターフェースは、流体を動かすために、選択的に、キャピラリー、チャンネル、ピン、ピペッター、エレクトピペッター、またはその類似物を含む。また選択的に、マイクロスコピック、スペクトロスコピック、流体分室または他のものをさらに含む。フルイディックインターフェースは、複数の試薬または混合物ソースから複数の試薬または試薬混合物をサンプリングして、試薬導入チャンネルに試薬または試薬混合物を導入する。したがって、流体は、基質のドメインに導かれる。例えば、基質にある一つまたは複数のチャンネルによって一つまたは複数のドメインと交流する。本質的に、望む応用に依存しながら、どんな数の試薬または試薬混合物も、フルイディックインターフェースによって、基質に導入することができる。マイクロフルイディック制御が、部分的にまたは完全に封した環境で行われるため、システムのコンタミおよび流体の揮発を最低限にされる。
複数の試薬または試薬混合物ソースから第一試薬を選んだ。第一の試薬または試薬混合物（例えばターゲット化合物とバッファー溶液を含む）が、第一反応チャネルに導入され、つぎにライブラリーの第一ドメインに導入される。ここで、第一の試薬または試薬混合物が、第一ドメインの材料のポリマーブラシに固定化した官能基と反応する。この反応は、試薬の種類に依存しながら、異なる形式で行われる。例えば、試薬がお互いに結合するところで、試薬は抗体または細胞レセプターおよびリガンド、または核酸および結合リガンドであり、反応は結合したリガンドのような結合化合物の結果を導く。試薬がシケンシング試薬ならば、反応は、プライマー拡大生産物の結果を導く。試薬が酵素と酵素ターゲット（基質）を含む場合、修飾した酵素ターゲットが典型的に結果となる。機能化材料へ二つの反応性化学薬品の導入ならば、応用したドメインに、第三の化学品が典型的に結果となる。別の局面では、一つまたは複数のドメインにおける反応からの反応生産物が分析される。この分析は、応用に依存しながら、どんな形式にもなる。例えば、生産物がプリマー拡大生産物ならば、分析は、サイズによる反応物の分離、特定サイズの反応物の検出、および核酸テンプレートの配列を決めるための結果情報の翻訳、という形式をとる。同様に、本発明のマイクロスケールフルイディックデバイスが選択的に反応の加熱および冷却に適しているので、PCR試薬を用いたPCR反応（熱安定ポリメラーゼ、ヌクレオチド、テンプレート、プライマー、バッファーおよび類似物）は、行われる、そして、アンプリコンが検出される。第一ドメインから得られた増幅または転写核酸は、つぎのプロセスのために、第二ドメインへ移動させることができる。たとえば、単一のヌクレオチドポリモーフィズムまたはラジオラベリングまたはハイブリダイゼーションの存在または不在を決定する制限消化。新たな生産物を形成形成する反応結果ならば、例えば酵素-基質生産物、化学種、または免疫化合物（結合したリガンド）、生産物は典型的に、オートラジオグラフィー、化学ルミネセンス顕微鏡、スペクトロスコピー、またはその類似物のような多様な検出技術のいずれによって、検出される。
上記説明のように、反応生産物に基づき、第二の試薬または試薬混合物が選ばれ、第一ドメインまたは一つまたは複数のドメインに導入される。第二の反応生産物は同様にアクセスされる。例えば、生産物がDNA配列ならば、既存の配列情報の拡大のために、シケンシングプライマーおよび/またはテンプレートが選ばれる。生産物が上記のような生産物ならば、適する第二ドメインは、酵素、リガンド、抗体、レセプター分子、化学品、または類似物のような化合物を含んでもよい。選ばれたものを用いて、第一または第二反応生産物の結合または反応の特徴をさらにテストする。第二試薬または試薬混合物は、第一反応チャンネルから、または選択的に第二チャンネル（または第三または第四・・・または第n）から、適当のドメインへ導入される。いずれの反応生産物の分析結果は、追加の反応物とドメインの選択および分析および次の同じまたは異なる機能化材料への導入、の基礎として使われる。例えば、単一タイプのDNAテンプレートが、選択的にいくつかの連続反応にシケンスされる。他の選択として、上記説明のように、第一シケンシング反応を終わらせて、追加のテンプレートを選択するための基礎として働く（すなわち、オバーラッピングクローン、PCRアンプリコン、または類似物、参照として組み入れられる米国特許番号第6,403,338号に参照）。
ライブラリーとターゲットとの相互作用の分析
材料ライブラリー内の特定なドメインでのターゲットと官能基との相互作用の検出は、酵素的または機能的活動の検出または結合を含む、数々の既知技術によって達成できる。核酸またはポリペプチド官能基を固定化するための核酸のハイブリダイゼーション、または一つまたは複数のドメインの官能基へのポリペプチドターゲットの結合は、標識したターゲット、標識した官能基、同じものに導入する検出可能標識をもつ試薬、または、これらの組み合わせを用いて、検出できる。検出可能標識は、制限されないが、フロオレシンのようなルミネセント化合物、クロモフォー、蛍光化合物、放射性アイソトープまたは類似物を有する基、または酵素、また染色体、触媒、プロモターまたは触媒のコードするポリヌクレオチド、セイヨワサビパオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ、ルミノールのケミルミネセサー、コエンザイム、酵素基質、のようなノンアイソトピック標識、放射性基、低分子有機分子、増幅可能ポリヌクレオチド配列、炭素またはラテックス粒子のような粒子、金属、結晶体、リポソーム、細胞などを含む。これらをさらに、染料、触媒または他の検出可能グループ、N-（ヒドロキシエチル）エチレンジアミントリ酢酸のようなタールビウムキーレター、標識化できるまたはできないもので、遅延蛍光またはその類似ものによって検出可能である。検出可能標識は、直接にまたは間接的にポリペプチドまたはポリヌクレオチドターゲットへリンクしてもよい。すなわち、ターゲットと反応するまたはターゲットを結合するパートナー分子への存在。例えば、HRPコンジュゲートした抗体。このようなラベリングはよく知られている。一般的には、どんな検出可能標識でも使える。したがって、検出可能標識は、例えば制限されないが、（i）シグナルを発生することによって直接に検出可能の標識、（ii）一つまたは複数の検出可能標識をもつ官能基またはターゲットまたは両方のものにおいて、官能基へターゲットを結合させることで、間接的に検出可能の特異結合ペアメンバーを含む。
ある局面では、検出可能標識は、蛍光、例えば制限されないが、蛍光共鳴エネルギー転移ペア、である。これらは、ドナーフルオロフォーおよびアセプターフルオロフォーからなるフルオロフォーのペアを参考する。ドナーフルオロフォーは、アセプターフルオロフォーに、共鳴エネルギーを伝えることができる。別の言葉で説明すると、ドナーフルオロフォーの放出スペクトラムは、アセプターフルオロフォーの吸収スペクトラムと重ねる。望む蛍光共鳴エネルギー転移ペアにおいて、ドナーフルオロフォーの吸収スペクトラムは、実質的のアセプターフルオロフォーの吸収スペクトラムと重ねない。適する可視光フルオロフォー（約350nm以上のドナーの最大励起）は、フルオシン、ルシファーイエロー、アクリディンオレンジ、ロダミンおよびその誘導体、例えばテトラメチルロダミン、テキサスレッドおよびフロオレセントキレートまたはユーロピウムのクリプテートを含む。望ましいフルオロフォーはフロオロシンである。検出可能標識のための適当なエネルギー転移ペアは、参照として組み入れられる、例えば、Appilcations of Fluoroscence in Immunoassays (I.A.Hmmila, Wiley Interscience, 1991)およびMolecular Probes: Handbook of Fluoroscent Probes and Research Chemicals -Richard P. Haughland (Molecular Probes Inc.)に見つけられ、エネルギー転移原理に基づく当業者にデバイス化されることができる（例えば、J.R.Lakowicz, Principles of Fluoroscence Spectroscopy, Plenum, 1983に説明される）。検出可能標識と使う場合、フルオロフォーは、一般的に、ポリペプチド鎖のアミノ酸の側鎖またはN-末端またはC-末端によって、ポリペプチドにつける。アミノ基と標識する便利な試薬は、ドナー/アセプター誘導のイソチオシアネート、活性エステール（例えばスッシニミジルエステール）、カルボン酸またはスルホニルハライドを含む。これらは普通、中間のアルカリpHにおいて、標識したい化合物（ターゲットまたは官能基または類似物）より過剰の存在下で、反応する。チオル基を標識する適当な市販試薬は、ドナー/アセプター誘導のマレイミドまたはハロアセチル基を含む。それらのスペクトラ物性に基づき、GFPの二つの誘導体が、FRETスタンダードに有用である。Lossauら（Chem. Phys. 213:1-16,1996）が、F66M/Y66H突然変異を有するコンビナトリアル突然変異生成を用いて、突然変異体BFP11を作った。BFP11は青シフト励起とワイルドタイプGFPと比較して励起マクシマを有する。F64M/S65G/Q69L突然変異を有するコンビナトリアル突然変異生成を用いて、突然変異体RSGFP4（Delagraveら, Bio/Technology, 13:151-154, 1995）をつくった。Heimらの報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12501-12504, 1994）によると、RSGFP4はS65T突然変異体と同じスペクトラ物性をもつ。FRETペアのアセプターとして、両方のS65TとRSGFP4は、他の赤シフト励起突然変異体（RSGFP8（F64L＋S65T））より優れている。なぜならば、後者の突然変異体は紫に示差的の励起を有するからである。
ターゲットを一つまたは複数のドメインに導入して、未反応のまたは非選択的結合したターゲットのオプションの洗浄後、全ライブラリーまたは特定なドメインアドレスにおいて、特定なドメインとの相互作用につぐターゲットの特性が決められる。検出の平均値は、使用した検出可能の標識に依存する。例えば、放射性的に標識したターゲットについて、ドメインアドレスでの活性は、アドレス上の放射性物質放出の検出によって、測定される。そして、さらに、他のドメインアドレスにある参考スタンダードに対して、測定を行い、材料ライブラリーとターゲットの相互作用に関する定量的な情報を提供する。蛍光標識したターゲットについて、ドメインアドレスでの検出は、色スペクトラおよび強度の定量化を含み、例えば、走査コンフォーカル顕微鏡を用いて、フォトンカウンティングモードにて、決定する。コンフォーカル顕微鏡のための適当なスキャンイングデバイスは、参照として組み入れられるTrulsonら、米国特許番号第5,578,832号およびSternら、米国特許番号第5,631,734号に説明される。特定な標識の追加例およびその検出は、米国特許番号第5,508,178号に見つけられる。
一つまたは複数のドメインでのターゲットと官能基との相互作用を評価するおよび標識を検出するためには、たくさんのシステムが使われる。例えば、制限されないが、電気磁気放射線、X線または粒子放出の検出による、またはオプティカル検査による。本発明に取り入れられる検出システムは、参照として組み入れられる米国特許第5,508,178号に記載のものを含む。現に望む標識を検出するおよびドメインの反応を定量する方法は、参照として組み入れられるYouvanら、米国特許第6,456,734号に詳細説明されたFRETを用いたエピフロレセンス顕微鏡に基づく。この特許には、イメージングハードウェア、ソフトウェア、較正器、およびドナーとアセプターの標識の間の蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）の画像化と定量化する方法を開示している。ドナーとアセプターの標識をターゲットと官能基または上記説明した試薬につけるとき、このような検出システムを本発明のライブラリーに応用できる。
カラーメトリックまたは光子ベースの検出可能標識を使うとき、ライブラリーを読み取るために、オプティカルリーダーまたは他の類似イメージングデバイスが使われる。適当なオプティカルイメージングデバイスは、空間的に共登録電子イメージを得る方法を提供して、各ドメインの標識の検出値を決定する。選択的に、オプティカルイメージングデバイスは、ライブラリーの印象（すなわちライブラリーのドメインのオートラジオグラフまたは化学ルミネセントイメージ）を読み取る方法を提供する。例えば、オプティカルイメージングデバイスは、顕微鏡とデジタルカメラを含む。顕微鏡は、定常ステート、波長スキャンイング蛍光顕微鏡（すなわち時間解決システムでないまたはインターフェロメターベースシステムでない）であってもよい。オプティカルイメージングデバイスは、バックグラウンド校正、スペクトラ重ね校正および、赤、青と緑のプライマリー色によって定義する色スペースにセットした3つのチャンネルから得たデータの変換を提供する。標識はまずドメインアドレスに検出され、イメージングデバイスによって、イメージとして譲渡する。このように、促進したイメージをつくるための延長プロセスになってもよい。例えば、FRET、アセプターとドナーのピクセルが、より正確に区別できるおよび仮染色できるイメージ。オプティカルイメージングデバイスは、ライブラリーのイルミネーションのためおよび検出可能標識の励起のための、光源を含む。望むならば、他のライトソースも使えるが、例えば、75ワット石英タングステンハロゲン（QTH）ライトソースは、蛍光顕微鏡に直接にカップリングすることができる。本発明の方法は、エピフロレセンス顕微鏡に制限されない。マクロスコピックベースシステムも、クロスコピックの観測から検出および定量化を達成するために、顕微鏡の目的の代わりに使える。この場合、ライブラリーが大きいまたは各自のドメインが簡単に画像化できること。
材料ライブラリーを評価するシステム
材料ライブラリーへ応用するターゲットと試薬をコントロールするため、そして機能化材料とターゲットの相互作用を検出・定量化するため、ドメインアドレスへ相互作用を関係付けるために、コンピュータシステムが使われる。それに加えて、材料ライブラリーによって得られた情報を解釈するため、およびライブラリーの使用と展開をコントロール・ガイドするため、コンピュータシステムは一つまたは複数のインフォーマティックスプログラムを含む。ライブラリーの特定のドメインに使われる各材料の機能性と物理特性および組成をカタログすることに加えて、インフォーマティックスプログラムは、特定の材料の全ての使用から得たターゲットの検出データを追跡する。これらの情報は、ディスカバリープロセスを加速するため、同様な機能および組成のドメインまたはターゲット分子に関連する将来のアッセイの方向性を決めるために、使われる。それに加えて、これらのデータセットは、ライブラリーの拡大（すなわち特定な物性をもつ材料の展開）のために新たな方向もガイドできる。例えば、ハイスループットスクリーンは、特定濃度のイオン官能基および免疫特異（抗原性）官能基をもつモノマーの特定ブレンドを有するドメイン上に起こる特定のポリクロナール抗体と狭い範囲のブラシ密度または長さをもつ材料との最適な結合/溶離条件を決めることもできる。したがって、ライブラリーは、抗原に対する特定な親和性範囲を有する免疫グロブリンの単離する最適な材料を指示するために使われる。最後に、インフォーマティックスプログラムは、ブラシ組成、密度、長さと機能のようなクリティカル因子の考慮を入れるブラシ構造/機能をシミュレートするポリマーブラシの繊細な分子モデルの開発に使われる。ターゲットスクリーンから得たデータセットと組みあわせると、これらの分子モデルは、ポリマーブラシの結合特性の予測を助け、ディスカバリープロセスを加速して、およびライブラリーの新規な機能化材料の連続拡大をガイドする。
ある局面では、本発明のシステムは、ライブラリードメインのデジタルプロフィルのイメージを比較する統合コンピュータプログラムを提供して、一つまたは複数のアドレスを選択するようにシステムを引き起こさせ、およびドメインから反応産物を単離するようにロボティックデバイスを指示するための使用説をつくる。ある態様において、システムは、これらの反応産物を第二のドメインへ導入するように、ロボティックデバイスを指示する、および薬品を第二のドメインに導入するようにマイクロフルイディックデイバスを指示する。別の態様において、システムは、使用したライブラリー中の材料を追跡するおよびターゲットに関わるデータ（例えば臨床データ）、ターゲットに行った操作、およびターゲットと材料との反応分析から得たデータを追跡するようなライブラリー情報マネージメントシステムを含む。
本発明によると、上記の説明のように、ターゲットは、アドレスをもつドメインとして表す機能化材料からなるライブラリーへ、導入される。ターゲットと官能基との相互作用が検出され、説明したようなオプティカルイメージングデバイスのような読み取り値によって評価される。したがって、読み取り値は、コンピュータシステムと通信するライブラリーのドメインアドレスでの標識の検出を通じて、ターゲットと官能基の相互作用の定量および定性的な両情報を提供する。このシステムは、下記を有する指導セットを含む、データマネージメントモジュール（すなわちデータ入力法、データ貯蓄法、データ回収法、関連するデータベース、およびデータ出力法）、およびデータ分析アルゴリズム（すなわちレベルの検出および定量）からなる指導セット。指導セットは、コントロールモジュール（すなわちロボティックまたはマイクロフルイディックデバイスのコントロール）をさらに含んでもよい。システムの指導セットを実行できる適当なプロセッサーは、いずれの適当な言語に書かれる指導セットを認識できる能力をもつプロセッサーであり、例えば制限されないが、パワーPCベースのアップルコンピュータ、ペンチウムまたは同様なPCタイプコンピュータ、SUNまたはシリコングラフィックスワークステーション、またはLINUXまたはUNIXを走るシステム。指導セットは、適当なコンピュータ読み取り可能の言語で書かれるプログラムとして、コンピュータ読み取り可能の媒体に貯蓄されるデータ分析用のコンピュータ読み取り可能のアルゴリズムを含む。例えば、C、C＋＋、UNIX、FORTRAN、BASIC、PASCALまたは類似もの。プログラムは、プロセッサーに、入力したデータの計算を行う指導を提供する、および一つまたは複数のモジュールまたはサブルーチン（すなわち関連データベース能力、サーチ機能、および他のユーザー定義機能）に入る他の機能エレメントを提供する。プログラムは、コンピュータ読み取り可能のフォーマットでシステムに入力のためのインプットモジュール、および入力したデータを選択・読み取りするようにシステムを指導する選択モジュールを含む。ある局面では、システムはインプットモジュールを含む。システムのユーザーは、コンピュータ読み取り可能のフォーマットでデータをシステムに入力する。データはROMまたはRAMまたはディスクやテープドライブのようなもっと永久の貯蓄メディアに貯蓄可能である。インプットモジュールを通して入力した情報は次にシステムプロセッサーにアクセス可能である。システムはアウトプットモジュールをさらに含む。コンピュータシステムのアウトプットは、ディスプレイやモニターに表示でき、例えばWordPerfectとMicrosoft Wordのような市販のソフトウェアにフォーマットできる文章処理テキストファイルとして、またはDB2、Sybase、Oracleやその類似もののようなデータベースアプリケーションに貯蓄するASCIIファイルの形として、代表される。当業者ならば、本発明の記録した発現情報を有するコンピュータ読み取り可能媒体を得るため、データプロセッサー構築フォーマット（すなわちテキストファイルまたはデータベース）の数々の適応ができる。
コンピュータ補助データ分析は、最低限に標識の検出および各ドメインアドレスのシグナルの感度の決定、ドメインアドレスのイメージを与える、およびアドレスがさらに二次元Cartesian座標の一セットとして供給されるものを含む。多数の検出可能標識を使う場合（すなわちFRETのため）、各チャンネル（ドナー、アセプター、とFRET）から、3つのイメージのセットは、モノクロム波長に対応する3つの色空間座標を有する各ピクセルにおいて、シングルのイメージとして扱われるまたは3つの空間的に共登録イメージとして、プロセスできる。ある態様において、本発明の定量化法は、定量的なFRET測定と分析を行う。FRETイメージのデータは、蛍光顕微鏡を用いて、スタンダードのフィルターセットで、得て、および上記の説明のようにプロセスした。プログラムに特定なデータ分析アルゴリズムのデザインに有効な定量FRETのための数式は、参照として組み入れられるGordonら、Quantitative Fluorescence Resonance Energy Measurements Using Fluorescence Microscopy, Biophysical Journal, Vol 74, May 1998 2702:2713に提供される。望む態様において、データ分析は、材料および発生する反応に関する情報、各ドメインの場所で検出した情報、すなわち官能基の数とタイプ、ポリマーブラシ密度と形態、および反応条件（例えば流量、ターゲット濃度、塩濃度、バッファーの組成、イオン強度、温度、pH、と時間、結合と親和性または触媒作用の活性をさらに含む。もっと望む態様において、データ分析は、ある貯蓄データベースから得られた情報、つまりターゲットに関する情報（例えばそれらのソースおよび単離方法、および病気状態への相関）を含む。
したがって、本発明は、複数の反応条件から比較的に多量の複数の検出したターゲット生物分子の同定を代表して、コンピュータ生成デジタルプロフィルを提供する。そして、複数の材料のための複数のターゲットサンプルからのプロフィルのコンピュータ介在比較を許す。このような、生物ターゲットをスクリーニングするおよびそれらのプロフィルを比較する自動化技術は、興味の病気または状況にかかわる個別のターゲットの存在、不在または変化した発現の迅速かつ有効な同定を許す。これらのターゲットは、治療用薬剤、治療介入ターゲットとしてのポテンシャルの評価およびデザインに、検査、予測および治療に対する応答の評価のため、マーカーとして、有用である。この技術は、興味の病気または状況にかかわる発現パターンをもつ各種セットのターゲットの迅速かつ有効な同定を許す。これらのセットのターゲットは、検査、予測および治療に対する応答の評価のために、マーカーの群を提供する。
当業者も認識するように、ここで説明した本発明は、いずれの一つまたは複数のコンピュータ技術及びスタンダードへ適応するおよび/または応ずるために、修飾できる。それに加えて、本発明の請求範囲から離れることなく、当業者には、ここで説明したもの変化、修飾、および他の実行が起こりうる。また、ソフトウェア、ハードウェアまたはハードウェアとソフトウェアの組み合わせで、実質上に本発明のどんな態様の局面をも実行できる。
実施例1-バイポーラ膜を生産する方法およびプロセス
下記の例は、バイポーラ機能化膜を合成する新規な方法を説明する。ここでは、膜の形状に作製する。ここ方法を利用して、1ステップによって、陽イオン交換および陰イオン交換官能基を有するポリマーブラシを各相反する表面に導入する。グラフトする材料として、電子線処理した高密度ポリエチレンフィルム（HDPE）を使った。フィルムを、スルホン酸基を有するモノマー溶液と第4級アンモニウム塩基を有するモノマー溶液の間に挟んだ。X線マイクロアナリシス（XMA）を用いて、膜厚方向の硫黄と塩素の分布、すなわちそれぞれ陽イオン交換基と陰イオン交換基の分布を測定した。NaCl溶液からHClとNaOHを再生する電気透析にバイポーラ膜を使った。このバイポーラ膜は、一般の方法で作製したバイポーラ膜と、同様な電気分解ポテンシャルを示した。
バイポーラ膜の合成とその特徴
バイポーラ膜を合成する条件を決めるため、図1に示すイオン交換膜を合成した。グラフトするための高分子基底膜として、厚み50ミクロンの非多孔性高密度ポリエチレンフィルム（HDPE）を使った。基底膜を全照射線量200kGyの電子線で照射した。図2に示すように、電子線処理したHDPEフィルムは、内径約4cmの二つの同様な円形セルに挟んだ。
スチレンスルホン酸ナトリウム（CH2=CHC6H4SO3Na；SSS）と2-ヒドロキシエチルメタクリレート（CH2=CCH3COOCH2CH2OH；HEMA）を電子線処理した基底膜に共グラフトして、陽イオン交換膜を形成した（参照として組み入れられるS.Tsunedaら, J. Electrochem. Soc., 142, 3659(1995)に参照）。同じく、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド（CH2=CHC6H4CH2N(CH3)3Cl; VBTAC）とHEMAを基底膜に共グラフトして、陰イオン交換膜を形成した（参照として組み入れられるW.Leeら, J. Membr. Sci., 81, 295(1993)に参照）。全ての反応条件は下の表1に示す。共グラフト率は以下のように定義した：
共グラフト率（dg）＝
（グラフトポリマーブラシの重さ）/（基底膜の重さ）x100％
（表１）バイポーライオン交換膜の合成条件
Figure 0004503293
塩分解容量測定法によって、合成した膜のスルホン酸基（-SO3H）密度と第4級アンモニウム塩基（-N(CH3)3 +Cl-）密度を決定した。そして、ヒドロキシル基密度は全官能基密度からイオン交換基密度を引く計算で、決めた。電子プローブX線マイクロアナリシス（XMA）を用いて、作製した膜の厚み方向におけるスルホン酸基の硫黄と第4級アンモニウム塩基の塩素の分布を測定した。バイポーラの電気抵抗を測定するため、有効膜面積約7cm2をもつ二つ同様な円形セルの間に、膜を挟み、第4級アンモニウム塩基が陽電極、スルホン酸基が陰電極に面するようにセットした。電圧15V、298K で、0.1M NaCl溶液を透過する電流を測定した。
バイポーラ膜を用いた電気透析
図3に示すように、電気透析チャンバーの電極の間に、バイポーラ膜が真ん中、市販の陽イオン交換膜と陰イオン交換膜（膜2枚ずつ）を設置した。バイポーラ膜の第4級アンモニウム塩基側は陽電極に面した。電圧5Vをかけた。表2に電気透析の操作条件をまとめた。全ての有効膜面積は10cm2である。伝導性の測定によって、塩チャンバー（2と5）のNaCl濃度を測定した。酸とアルカリの滴定によって、酸チャンバー（3）のHCl濃度とアルカリチャンバー（4）のNaOH濃度を測定した。電気透析前後のナトリウム、塩素とスルホン酸イオンの濃度は、イオンクロマトグラフィーで測定した。電気パワーユニットは下記の方式で決めた：
電気パワーユニット（Wh/kg）＝o Vi dt/w
ここでは、V、I、tとwはそれぞれ電圧（V）、電流（A）、時間（h）と除去したNaClの重さ（kg）である。
（表２）電気透析の測定条件
Figure 0004503293
図4には、電子線処理したHDPE基底膜へのSSS/HEMAとVBTAC/HEMAの共グラフト率及び膜厚変化と共グラフト時間との関係を示す。反応時間の上昇とともに共グラフト率も上昇した。合成した陽イオン交換膜（Na型）と陰イオン交換膜（Cl型）の膜厚はそれぞれ最大1.8倍と1.4倍に増加した。図5には、共グラフト率（dg）とともに、陽イオン交換膜のスルホン酸基とヒドロキシル基の密度、陰イオン交換膜の第4級アンモニウム塩基とヒドロキシル基の密度も上昇した。9時間の反応時間において、スルホン酸基と4級アンモニウム塩基の密度はそれぞれ2.3と0.81 mmol/g-productに達成した。XMAによって、膜厚方向のスルホン酸基のプロフィル（硫黄の測定）と第4級アンモニウム塩基のプロフィル（塩素の測定）を測定した（図6）。X-線感度分布からの表面積比率を、塩分解容量測定からの官能基密度の比率と比較した（図7）。最大の比率まで、両方の比率は一致した。これは、定量化するにはXMAを用いてもよい。反応時間の上昇とともに、すなわち、共グラフト率（dg）の上昇、スルホン酸基または第4級アンモニウム塩基を有するブラシは、膜の両側から攻めて、中心に至った。
反応時間に伴う合成したバイポーラ膜の共グラフト率と膜厚の上昇を図8aに示す。官能基密度はdgの上昇とともに増加した（図8b）。dg16％〜86％の範囲内では、スルホン酸基の密度は、第4級アンモニウム塩基密度の約2倍である。例えば、dg=86％において、スルホン酸基密度と第4級アンモニウム塩基密度はそれぞれ1.0と0.57 mmol/g-productである。dg=16％とdg=86％の膜厚方向の官能基密度プロフィルを比較した(図9)。両方の膜は、膜の左からスルホン酸基の攻め、膜の右から第4級アンモニウム塩基の攻めを示した。dg=16%において、両方の官能基は膜の中心に到達しなかった。しかしながら、電子線走査顕微鏡（SEM）から、ポリHEMAブラシは既に膜の中心に到達した結果を示した。逆に、dg=86％において、両方の官能基はバイポーラ膜の中心で交差して、中性の領域を形成した。合成したバイポーラ膜の電圧-電流特性を図10に示す。dg=16%において、電圧の増加にも関わらず、電流の流れは観測しなかった。これは、官能基の交差がないXMAの結果と対応する。
塩溶液から酸とアルカリの再生
電気透析するため、dg＝16％とdg＝86％のバイポーラ膜を使った。図11に時間に伴うNaCl（塩チャンバー）、HCl（酸チャンバー）とNaCl（アルカリチャンバー）の濃度変化を示す。5時間の電気透析において、1M NaCl溶液からMモルのHClとMモルのNaOHが再生された。共グラフト型バイポーラ膜（dg＝86％）による電気透析前後の全てのイオンの物質収支を表3にまとめた。Na+とSO4 -のモル数は、電気透析前後の値と一致した。しかしながら、電気透析前のCl-のモル数は、お互いと一致しなかった。原理に制限されなく、これは電極の反応によるのと言われている。Faraday法則による計算から、3.40x10-3 molのCl-が電極反応に必要とされる。この値は、電気透析前後に不足した3.25x10-3 molのCl-に一致した。
（表３）共グラフト型バイポーラ膜（dg＝86％）による電気透
析前後のイオンの物質収支
Figure 0004503293
操作時間に伴う電気透析の電圧と電流は、電流が最初の0.07Aから0.02Aに減少したことを示した（図12）。上記の方式で、計算した図11と図12の電気パワーユニットを図13に示す。電気パワーユニットは2.2〜2.6 kWh/kgの範囲内にあった。表4には、放射線グラフト重合で作製した膜の電気パワーユニットと、貼りあわせ法、またはグラフト法を使って作製した既往の研究の膜との比較をまとめた（参照として組み入れられるJ. Kassotisら, J. Electrochem. Soc., 131, 2810(1984), S.K.Adhikaryら, React. Polym., 1, 197(1983), F.Alvarezら, J. Membr. Sci., 123, 61(1997)とG.S.Trivediら, React. Funct. Polym., 32, 209(1997)に参照）。合成したバイポーラ膜の電気パワーユニットは、キャスティング法によって作製した膜のものと同様なオーダー（1.6〜2.6 kWh/kg）を示した。
（表４）バイポーラ膜の既往の研究
Figure 0004503293
実施例2-グラフト重合材料による微生物の固定化
GMA-DEA-BC膜の合成
この実施例は、ポリエチレン中空糸膜からなる材料への微生物、特に黄色ブドウ状球菌、の固定化を説明する。内径と外径それぞれ1.9と3.2 mm、空孔率70％、および孔径0.34ミクロンの膜を使った。合成経路を図14に示す。電子線グラフト重合法によって、ビニルモノマーのグリシジルメタクリレート（GMA、CH2=CCH3COOCH2CHOCH2）をPE膜にグラフトした。室温で、電子線の照射線量200kGyでPE膜を照射した。照射した膜をGMA溶液（メタノール中10vol％）に浸して、313Kで反応した。膜の骨格にグラフトしたGMAの量は、下記の数式によって、グラフト率（dg）として、計算した。
GMAグラフト膜をジエチルアミン（DEA、HN(C2H5)2）と反応して、ベンジルクロライド（BC、C6H5CH2Cl）で4級化した。作製した強塩基性陰イオン交換膜を、GMA-DEA-BC（dg/Xt/Xq）で示し、括弧内のdg、XtとXqはそれぞれグラフト率、3級アミンの転化率とそれに次ぐ4級化率である。重さの変化からdg、XtとXqを以下のように計算した。
dg=100((W1-W0)/W0)[%]
Xt=100(((W2-W1)/73)/(W1-W0)/142))[%]
Xq=100(((W3-W2)/127)/(W2-W1)/173)[%]
ここでは、W0、W1、W2とW3はそれぞれ開始材料、GMAグラフト膜、DEA導入膜と4級化膜の重さである。142、73と127と言う値はそれぞれGMA、DEAとBCの分子量である。
微生物の培養
大阪発酵研究所（日本大阪）から黄色ブドウ状球菌株IFO 12732を得て、微生物固定化研究のモデル微生物として使った。一環の細菌を10mLの培養液（ポリペプトン1.0％、酵母エキス0.2％、MgSO4・7H2O 0.01％、pH7.0）に入れて、試験管シェカー（100ストロック/分）で、305Kで、18-24時間培養した。15分間、277Kの冷却温度（細胞が分化せずに定常期にある）で遠心分離（5600xg）して、細胞培養液から細胞を回収して、滅菌した純水で2回洗浄した。細胞を新たな滅菌水に再懸濁して最終液量を10mLにした。細胞を、合成した膜と接触させる前に、希望の濃度まで、連続的に滅菌水で希釈した（約105〜106細胞/mL）。
グラフト型GMA-DEA=BC膜への微生物の吸着
作製した細胞懸濁液40mLを100mLのフラスコに加えた。そして、合成したGMA-DEAとGMA-DEA-BC膜を細胞と接触させ、フラスコを130rpmで、298Kで震とうさせた。長さ10cmのGMA-DEAとGMA-DEA-BC膜（1cmずつにカットしてさらに縦に半分切った）を使った。所定時間に、フラスコの接触懸濁液から0.1mLをピペットで採取して、9.9mLの滅菌水に加えて、連続的に滅菌水で希釈した。希釈した懸濁液から0.1mLを取って、培地をもつ寒天プレートに広げた。プレートを310Kで、18-20時間培養した。懸濁液中の生存する細胞の数は、プレートに形成するコロニ数から計算した。
生存する自由な細胞数の減少から、両方のGMA-DEAとGMA-DEA-BC膜による微生物細胞の吸着速度を調べた。微生物細胞の捕捉の活動の接触面積を考慮した吸着速度定数の値は、接触時間に対する生存細胞数（CFU/mL；コロニ形成数）のlogのプロットの傾きから決定した。各DEA-EO膜とDEAビーズの吸着速度定数、kは以下のように定義した。
V(dC/dt)=-kAC
ここでのkは下記の条件、最初条件t＝0のとき、C=C0で導くことができ、吸着速度定数は下のように定義する
k＝-(V/A)(1/t)ln(C/C0) [m/s]
ここでは、V、A、t、CとC0はそれぞれ生存細胞懸濁液の容量、接触面積、接触時間、t接触時間における生存細胞数と初期生存細胞数である。
膜の孔径は0.3ミクロンなので、平均直径約1ミクロンの黄色ブドウ状球菌は、膜のポアに入ることはできない。したがって、接触面積は、ポア内の面積を除く外側の面積だけで計算した。この実験、kを計算するために過剰の膜面積を与えた（最大細胞被覆率1％）。図15には、グラフト型GMA-DEA-BC膜の4級化の転化率を示す。図16には、BCの転化率と、グラフト型GMA-DEA-BC膜に吸着した塩素イオンのX線マイクロアナリシス（XMA）プロフィルとの関係を示す。XMA測定する前に、膜をCl型に転化した。図17には。黄色ブドウ状球菌に対するグラフト型GMA-DEA-BC膜の吸着実験を示す。図18には、グラフト型GMA-DEA-BC膜の官能基密度と吸着速度定数との関係を示す。図19には、グラフト型GMA-DEA-BC膜を黄色ブドウ状球菌と接触するときのCFU/mLとpHの変化を示す。
上記の開示した材料および方法は、微生物とウイルスライブラリーの創製にも応用できる、例えば、変異株を異なるドメインに固定化する。このようなライブラリーは、微生物サンプルの検出とキャラクタリゼーションに有用である。すなわち、病原性菌株の同定。それ加えて、あるドメインにおいて、微生物と接触する異なる希釈の抗生物質の有効性を決める。
実施例3-検査アッセイに使う細胞のライブラリー
一つまたは複数の異なる組織ソースまたはタイプからの細胞ライブラリーを創製した。これは、例えば、サンプル組織における病因マーカーのレベルを決定するため、または環境におけるターゲットを検出する毒性アッセイのために、使われる。この実施例は子宮ガンの検査のために、ヒト子宮細胞ライブラリーの作製及び利用を説明する。
ライブラリーの作製
グラフトの基材として、膜厚約0.5ミクロンの高密度ポリエチレンフィルム（HDPE）をコーティングしたガラススライドを使った。キャスケード型加速器を用いて、基質を照射線量200kGyの電子線で窒素雰囲気下で照射した。基質を10vol/vol％ GMA/1-ブタノール溶液に浸して、グラフト反応温度313Kにおいて、グリシジルメタクリレート（GMA）をHDPEフィルムにグラフトして、ポリマーブラシを形成した。10分後、基質を取り出して、残存GMAとポリ-GMAホモポリマーを洗浄・除去した。グラフト率を説明したように算出して、約200％と決定した。グラフトをする前の基質のマスキングは、100ドメインのポリマーブラシの形成を許して、それぞれは約2mm2で、5x20マトリックスパターンを示した。
MUC1は子宮ガン細胞の表面に発現されている。MUC1の9つの異なる接合変異株は既に説明されている。Obermairら（参照として組み入れられるInt J Cancer 2002 Jul 10;100(2):166-71）は、悪性及び良性子宮腫瘍のMUC1接合変異体の発現パターンを比較した。この研究には、良性子宮腫瘍を持つ患者（n＝34）および手術した子宮腫瘍を持つプライマリー（n=47）または再発（n=8）の患者から、子宮組織サンプルを採取した。MUC1接合変異体A、B、C、D、X、Y、Z、REPとSECのRT-PCRを行い、これらの発現を臨床と組織病理学のパラメーターと比較した。良性腫瘍より悪性腫瘍の方が、変異体A、D、X、YとZを頻繁に発現した。全てのプライマリー子宮ガンケースは変異体REPにプラスの結果を示したが、変異体SECにはマイナスの結果を示した。MUC1接合変異体A、D、X、Y、ZとREPは、悪性腫瘍の存在に関係するが、MUC1/SECは悪性腫瘍の不在に関係する。
Goodheartら（参照として組み入れられるGynecol Oncol 2002 Jul:86(1):85-90）は、CD31no染色および他の組織病理因子から、子宮ガンp53突然変異が腫瘍微細血管密度に関係することを示した。この研究には、Mantel相関統計を用いて、CD31染色に関連する組織病理学と突然変異のデータを比較した。微細血管密度のスコアは、平均カウントより3-ハイパワー（200x）領域であった。CD31染色（血管/HPF）による各FIGOステージと突然変異タイプの中間微細血管密度カウントは次のようである：ステージI（10.2）、ステージII（10.7）、ステージIII（13.8）、ステージIV（22.0）、ワイルドタイプp53（9.3）、missense p53突然変異（14.4）およびnull p53突然変異（23.1）であり、微細血管密度カウントとFIGOステージ（P＝0．026）、グレード（P＝0．04）とp53突然変異タイプとよい相関を示した。
Lindgrenら（参照として組み入れられるInt J Oncol 2002 Sep;21(3):583良性と悪性子宮腫瘍の血漿中および組織中のエストラジオールとプロゲステロンのパターンが異なることを示した。子宮ガンによる両方のエストラジオールとプロゲステロンの生産を立証するおよび検出することができる。この研究において、更年期前後の女性の子宮組織、子宮腫瘍胆嚢液、子宮静脈サンプルと末梢血漿のエストラジオールとプロゲステロンの濃度を、平常子宮、良性、境界および悪性子宮腫瘍というグループに分けて、定量した。子宮組織の両方のエストラジオールとプロゲステロンの濃度は、血漿のより100倍も高かった。FIGOステージ1と2よりステージ3と4の患者の子宮ガン組織、子宮腫瘍胆嚢液と末梢血漿には、プロゲステロンではなく、エストラジオールの濃度が低かった。子宮組織から血漿の両方のエストラジオールとプロゲステロンの大きな違いの発見は、ガン生物学における子宮組織濃度の重要な役割を示して、子宮ガンをもつ女性のアンチホルモン治療法を影響する可能性を示す。
組織の生検から得た子宮細胞を、各ドメインに一定の細胞数で固定化した。参考組織はATCCから得て、開示された検出可能のマーカーの観点から、コントロール細胞を選んだ。患者の細胞と参考組織を、脂質に富む官能基で、各ドメインのポリマーブラシに固定化した。Takeuchiらの方法（参照として組み入れられるImmunol Methods 2002 Dec 15;270(2):199）使って、MUC1イソフォームA、D、X、Y、Z、REPとSECに対する特異性の免疫グロブリンを開発した。Anti-CD31、anti-bcl-2、抗エストラジオールおよび抗プロゲステロン免疫グロブリンのモノクロナール作製は市販のものから得た。免疫グロブリンは蛍光標識され、約0.001mg-protein/ml〜約10mg-protein/mlの濃度範囲で、各ドメインの細胞に使った。コンフォーカル顕微鏡をもちいて、各ドメインの標識したターゲットを検出した。
抗エストラジオールおよび抗プロゲステロン免疫グロブリンを、0.025M borate buffer（pH約10）で連続的に希釈して、抗体濃度を15mg/ml〜1.5ng/mlの範囲にした。各希釈液から10mLをライブラリーの個別ドメイン（それぞれ約1mm2の中間面積を有する）に入れて、GMAグラフトブラシのエポキシ基と室温で24時間反応させ、非結合抗体を洗浄によって除去した。患者からの子宮細胞と参考組織を35Sでパルスレベルして、細胞溶解液をライブラリーのドメインと接触させた。ドメインを洗浄して、各ドメインアドレスから発生するベタ放出をカウントすることによってドメインごとの活性をアッセイした。標準ELISAコンピュータアルゴリズムで、データを解釈した。二つのライブリーから得たデータを、参考スタンダードおよび医学文献にあるこれらのマーカーの予測値と、比較した。このような情報をもって検査を行う。
実施例4-無作為化ペプチドのライブラリー
説明したように、約10,000ドメインを有するライブラリーを開発した。マイクロマイクロフルイディックチャンバーのために適用する基質に、ライブラリーを作製した。各ドメインにグリシンをポリマーブラシに固定化して、非結合のグリシンを洗浄によって除去した。基質を自動化マイクロフルイディックデバイスににセットして、ランダムの6merポリペプチドが各ドメイン上で合成され、各ペプチド配列をコンピュータコントロールシステムによって、モニターされる。説明したように、得られたペプチドライブラリーは、パルス標識した細胞溶解物のスクリーニングに使用した。各ドメインアドレスで発生するベタ放出をカウントすることによって、相互作用を検出する。ドメインアドレスに決したターゲットを回収して、MALDI-TOF分析計によって同定する。実験室情報マネージメントシステム（LIMS）によって、ターゲットの同定および相互作用に適するデータを追跡した。
等価物
上述の本発明の特定な態様の詳細な説明から、官能基を多層に固定化したグラフト重合材料を含む固有の組成物、ならびにその作製法および使用法を説明したことは明らかな筈である。本明細書において特定の態様を詳しく開示したが、これは実施例を示すことのみを目的とし、添付の特許請求の範囲を制限することを意図しない。特許請求の範囲に定義した本発明の範囲と趣旨から逸脱することなく、本発明に対して代用、変更、および修飾が可能であることは発明者によって熟慮される。例えば、官能基の組み合わせの数および種類、またはこれらの組成物の特定な装置への使用は、本明細書に記載の態様の知識を有する当業者にとって日常的なことと思われる。
陽イオン及び陰イオン交換基を有する材料の合成経路。 陽イオン及び陰イオン交換基を照射した高密度ポリエチレン（HDPE）フィルムの相反表面に導入して、グラフト合成バイポーラ材料を作製する装置。 グラフト合成バイポーラ材料（BP）、陰イオン交換材料（A）と陽イオン交換材料（C）を用いた電気透析。 共グラフト反応時間による材料の厚みの変化と共グラフト率との関係。（a）SSS/HEMA（sodium styrene sulfonate/hydroxyethyl methacrylate）陽イオン交換材料および（b）VBTAC/HEMA（vinyl benzyl trimethyl ammonium chloride/ hydroxyethyl methacrylate）陰イオン交換材料。 共グラフト率による（a）陽イオン交換材料におけるスルホン酸基とヒドロキシル基密度、及び（b）陰イオン交換材料における第4級アンモニウム塩基とヒドロキシル基密度の増加。 スルホン酸基と第4級アンモニウム塩基の分布。X線マイクロ分析（XMA）によって、両方の材料の膜厚方向におけるそれぞれの硫黄と塩素の測定。 塩分解容量の滴定および線マイクロ分析（XMA）を用いてそれぞれ測定した（a）硫黄と（b）塩素官能基のX線強度分布の面積から測定した官能基密度の関係。 （a）反応時間および（b）グラフト率（DG）による作製したバイポーラ材料の共グラフト率および材料の厚みの増加。 DG16％およびDG86％をもつ膜の厚み方向における官能基密度の分布。 共グラフト型バイポーラ材料の電圧-電流の特徴。 NaCl（塩チャンバー）、HCl（酸チャンバー）とNaOH（アルカリチャンバー）の濃度変化の測定から、（a）DG16％および（b）DG86％をもつ膜による電気透析の経時変化。 DG16％およびDG86％をもつ共グラフト型バイポーラ材料を用いた電気透析の操作時間における電圧及び電流の減少。 共グラフト型バイポーラ材料の電気透析の効率。 ベンジルクロライド（BC）によって四級化したジエチルアミン（DEA）という官能基とグリシジルメタクリレート（GMA）高分子からなるポリマーブラシ、およびポリエチレン（PE）材料を有するグラフト型GMA-DEA-BC繊維の化学構造。 グラフト型GMA-DEA-BC材料の四級化転化率の経時変化。 グラフト型GMA-DEA-BC材料に吸着した塩素イオンのXMA分布とBCの転化率との関係。 異なる四級化率をもつ3種類のグラフト型GMA-DEA-BC材料の黄色ブドウ状球菌の吸着。 黄色ブドウ状球菌の吸着定数（k）とグラフト型GMA-DEA-BC材料の官能基密度との関係。 黄色ブドウ状球菌とグラフト型GMA-DEA-BC材料との接触による溶液中のCFU/mL（コロニ形成数）とpHの変化。 アレイまたはマトリックスフォーマットに作製した機能化ドメインからなる材料ライブラリー。ここでは、ドメインはポリマーブラシおよび官能基密度の変化を示す。 図20の材料ライブラリー。ここでは、マイクロフルイディックデバイスによって、ターゲット化合物をライブラリーにおける一つまたは複数のドメインへ導入する。ターゲットを有するインプット溶液の組成を変化することができる。ここでは、一つまたは複数のドメインへのターゲットの結合は最適結合条件を示す。すなわち、特定なインプット溶液にある化合物を単離するためのブラシの長さおよび官能基密度である。

Claims (5)

  1. ラジカル誘導グラフト重合によって反応性モノマーがグラフトされることによって形成され、陰イオン性解離基が固定化されているポリマーブラシを表面に有する分子量５０，０００〜５００，０００ダルトンのポリオレフィンから構成されるポリオレフィン繊維からなる、平均孔径が１０ｎｍ〜５０，０００ｎｍであり、空孔率が５０〜９０％である多孔性膜を備え、溶液を透過させて該溶液に含まれる、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、多糖、脂質、免疫グロブリン、抗体結合フラグメント、酵素、および細胞から選択されるターゲットを該多孔性膜に吸着させ、該溶液をろ過するためのろ過装置であって、
    該多孔性膜が、次の工程：
    工程1：ポリエチレン中空糸膜にグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）を約１０％から約５００％のグラフト率でグラフト重合し、ＧＭＡグラフト膜を製造する工程；
    工程２：ＧＭＡグラフト膜をジエチルアミン（ＤＥＡ）と反応させ、ＧＭＡのエポキシ基をアミノ基に転化する工程；および
    工程３：ベンジルクロライド（ＢＣ）でＤＥＡのアミノ基を３５〜７３％の４級化率で４級化する工程；
    により製造されるＧＭＡ−ＤＥＡ−ＢＣ膜である、ろ過装置。
  2. 前記ターゲットが、マイナス電荷を有する細胞である、請求項１に記載のろ過装置。
  3. 前記マイナス荷電を有する細胞が微生物細胞である、請求項２に記載のろ過装置。
  4. 前記微生物細胞が、病原性株である、請求項３に記載のろ過装置。
  5. 前記微生物細胞が、ブドウ球菌細胞である、請求項３に記載のろ過装置。
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