CN101010334A - 分级装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有以下任一个特征的蛋白质和/或肽的分级装置。所述特征为:(1)蛋白质等接触的基材表面的至少一部分,在与牛血清清蛋白溶液接触时,牛血清清蛋白向该基材表面的吸附量为50ng/cm2以下。(2)蛋白质等接触的基材表面的至少一部分,在人β2-微球蛋白和牛血清清蛋白形成的蛋白质水溶液与该基材表面接触时,人β2-微球蛋白相对于该基材的吸附量为3ng/cm2以下。(3)具备供给含有蛋白质等的溶液的供给构件、从溶液中分离蛋白质等的构件、以及将溶液中的蛋白质等浓缩的构件,在分级装置中蛋白质等接触的基材表面的至少一部分,接枝有亲水性高分子。通过上述构成的装置,蛋白质向基材的非特异吸附少,能够容易地得到除去高分子量的蛋白质的有利于分析的试样。
Description
技术领域
本发明涉及用于从含有蛋白质和/或肽的溶液,特别是从血浆、尿等的体液分离蛋白质和/或肽等的生物体成分,并且调制分析用溶液的分级装置。
背景技术
近年来,作为后基因组学研究,蛋白质组学分析研究(蛋白质组学:proteomics)开始受到关注。由于作为基因产物的蛋白质被认为比基因更加直接地与疾病的症状相关,所以人们期待着对蛋白质进行系统研究的蛋白质组学分析的研究成果能够在诊断和治疗中广泛应用。而且在蛋白质组学分析中发现多种在基因组解析中未能找到的病因蛋白质和疾病相关因子的可能性相当高。
蛋白质组学分析之所以能够高速发展,与技术上可以采用质谱分析装置(mass spectrometer:MS)进行高速结构分析是密不可分的,由于MALDI-TOF-MS(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flightmass spectrometry)等的实用化,多肽的高通量超微量分析成为可能,甚至可确认以往检测不到的微量蛋白质,成为探索疾病相关因子的强有力的工具。
蛋白质组学分析的临床应用的首要目的,是发现由疾病诱导或消失的生物标志物(bio-maker)蛋白质,由于生物标志物的活动与病症相关,所以除了可以作为诊断的标志物之外,作为药物开发靶点的可能性也很高。即,蛋白质组学分析的成果,由于比特定基因更有可能作为诊断标志物和药物开发靶点,所以称为后基因组时代的诊断和治疗的关键(evidence)技术,而由于确认的生物标志物与患者的药物反应性评价或副作用的发现预测等的患者可以享受到的利益直接相关,因此可以说对个体化医疗(结合个人基因进行给药治疗的技术)的推进起到很大作用。
在临床研究中导入蛋白质组学分析(临床蛋白质组学)时,要求迅速、准确地解析大量被检测物,而且由于临床检测物微量而且贵重,所以必须迅速地进行高分解能·高灵敏度·高机能的测定。针对此情况的巨大推动力是质谱分析(mass spectrometry),质谱分析装置具有的超高灵敏度对高通量的特性具有很大贡献。但是,虽然此类方法和仪器正在快速的改良之中,但还未能达到使蛋白质组学分析在临床现场中简便且迅速地实施的状况。
据推测,人类蛋白质有10万种以上,而仅血清中含有的蛋白质就达到约1万种,其总量在血清中的浓度约为60~80mg/mL。血清中的高含量蛋白质是清蛋白(分子量66kDa)、免疫球蛋白(150~1000kDa)、运铁蛋白(80kDa)、触珠蛋白(>85kDa)、脂蛋白(几百kDa)等,任一种均大量(>mg/mL)存在。另一方面,被认为是病症的生物标志物或疾病相关因子的肽类激素、白细胞介素、细胞因子等生理活性蛋白质中的多数仅以极微量(<ng/mL)存在。其含量比与高分子的高含量成分相比,实际上是nano(10-9)到pico(10-6)的水平。就蛋白质的大小而言,蛋白质的全部种类的70%以上的分子量为60kDa以下,上述极微量的生物标志物蛋白质中的任一种基本都包含在该区域中(例如非专利文献1)。由于这些蛋白质通过肾脏、使一部分从尿中排出,所以不仅可以以血液,并且也可以以尿作为检体进行测定。
在一般的血清中的蛋白质的蛋白质组学分析中,首先必须除去妨害检测与疾病相关的微量成分的分子量为6万以上的高分子成分,进而需要尽量多的回收分子量小于6万的成分。
作为该高分子量蛋白质的分离方法,有高效液相色谱(liquidchromatography:LC)、二维电泳(2dimensional-polyacrylamide geleletrophoresis:2D-PAGE)。作为以清蛋白作主要对象物质,已经实用化的制品或公开的技术,有固定了蓝色色素等亲和配体的载体(例如,日本ミリポア社:“MontageAlbumin Deplete Kit”,日本バイオ·ラツド社:AffiGel Blue凝胶)、通过离心分离过滤将高分子量成分进行分级的离心管形式的装置(例如,日本ミリポア社:“アミコンウルトラ”)、在特表2002-542163号公报(专利文献1)中公开的利用电泳原理进行分级的方法(例如,グラデイポア社:“Gradiflow”系统)、Cohn的乙醇沉淀等传统的沉淀方法、通过色谱进行分级的方法(例如,非专利文献2)等。一般将这些技术作为质谱解析的前处理操作来进行。
在处理蛋白质时,蛋白质向基材表面上的非特异吸附常常成为问题。该向基材表面上的非特异吸附,由于蛋白质的减少不仅造成分析结果的不均一,而且造成分析对象蛋白质损失等重大问题,所以必须防止非特异性吸附。一般由蛋白质的非特异吸附造成的蛋白质的减少率依赖于溶液中的蛋白质的总浓度,蛋白质的总浓度越低,蛋白质的减少率越大。特别是在上述那样的蛋白质组学分析中用质谱分析来分析疾病相关的微量成分时,由于现有的前处理装置中没有实施抑制非特异吸附的处理部分,所以,除去阻碍检测的成分之后得到的分级液的蛋白质的总浓度非常低,微量生物标志物蛋白质由非特异吸附造成的减少和损失已成为问题。
对于由这样的蛋白质和肽的吸附造成的损失问题,有大致被分成2种的对策。一种是在生物体成分溶液中添加抑制吸附的化合物的方法,另外一种是基材表面的生物体成分非吸附处理。作为前者的代表性的方法,有添加阻断剂的方法。阻断剂是清蛋白或酪蛋白的溶液,是通过竞争吸附来抑制有用生物体成分的吸附的方法。为了利于竞争吸附,一般阻断剂浓度比有用生物体成分的浓度高。因此,在分析用途中,存在阻断剂阻碍分析、或即使少量添加存在造成生物体成分的结构变化的危险性。除了阻断剂以外,还有添加表面活性剂、有机溶剂的方法,但这些与阻断剂一样,存在阻碍分析体系、伴随生物体成分结构变化的改性成为问题。
作为基材表面的非吸附处理,一般是基材表面的亲水化处理。亲水化处理有几种方法。例如,在专利文献2中记载了通过涂布处理向基材导入亲水性化合物,例如,2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱共聚体(以下简称为MPC)的方法,在专利文献3、专利文献4中记载的通过接枝处理导入亲水性化合物的方法。还有象反应离子蚀刻处理、等离子体处理、团簇离子束处理那样在基材表面上直接生成亲水性官能团的方法。
然而,用以往的基材表面处理方法处理的基材,虽然在与高浓度的蛋白质或肽的溶液接触时发现具有抑制生物体成分吸附的效果,但在与含有低浓度的生物体成分的溶液接触时,仍然出现由吸附造成的生物体成分的减少或损失,因而还没有达到可以说充分解决课题的水平。
进而,通过涂布亲水性高分子来进行处理的方法,对于被处理的基材进而接触亲水性高分子溶液中使用的溶剂时,可能出现涂布剥离等,有可能使亲水性低下。另外,在分析、分离等的处理装置中,溶出的亲水性高分子可能成为后面分析的阻碍因素。
虽然通过接枝亲水性高分子的亲水化,亲水性与接枝量成比例的提高,但处理的亲水性高分子溶液的浓度变高时,亲水性高分子之间会出现三维交联,所以亲水性高分子的运动性低下,结果存在抑制生物体成分吸附的效果变低的问题。
另外,虽然反应离子蚀刻处理、等离子体处理、团簇离子束处理可以简便地对基材的外表面或板状基材的一个面等进行亲水化,但难以对成为等离子体、团簇离子束等的阴影部分进行亲水化,所以不适于对板状基材的两面或中空形状基材内外表面等多个面用一次处理进行亲水化。另外,基材的生物体成分的吸附特性,依赖于与生物体成分接触部分的表面状态,一般表面亲水性越高,进而被固定在表面上的亲水性分子的运动性越高,越能抑制生物体成分向基材表面上的吸附。运动性高的亲水性高分子,被认为是通过其分子运动来排除蛋白质、血小板等的生物体成分的。通过反应离子蚀刻处理、等离子体处理、团簇离子束处理进行的亲水化是通过在基材表面上生成羟基等亲水性官能团进行亲水化的,因而与通过向基材表面上导入亲水性高分子的亲水化相比,亲水性分子的运动性低,所以抑制生物体成分吸附的效果低,所以不优选。进而,由于在处理中有时变为高温,造成基材改性,所以不优选。
这样,由于抑制吸附处理的技术还未确立,所以在将蛋白质和/或肽分级的装置中仍然没有实施了抑制吸附处理的装置。
专利文献1:特表2002-542163号公报
专利文献2:特开2003-130882号公报
专利文献3:特开昭58-40323号公报
专利文献4:特许第3297707号公报
非专利文献1:安德森·NL(Anderson NL),安德森·NG(Anderson,NG)著,《人血浆蛋白质组学:历史、特征、诊断前景(The human plasmaproteome:history,character,and diagnostic prospects)》,(分子和细胞蛋白质组学:Molecular&Cellular Proteomics),(美国),美国生物化学与分子生物学协会,有限公司(The American Society forBiochemistry and Molecular Biology,Inc.),2002年,第1卷,p845-867。
非专利文献2:日本生化学会编,《新生化学试验讲座(第1卷)蛋白质(1)分离·精制·性质》,东京化学同人,1990年
发明内容
如上所述,在临床蛋白质组学分析时,除去妨害质谱分析的高分子量蛋白质的前处理操作是必要的。在蛋白质组学分析时,由于可作为分析对象的蛋白质是微量的,并且通过前处理总蛋白质浓度是低下的,所以存在相对于基材的非特异性吸附导致分析对象蛋白质损失、使蛋白质组学分析不能稳定进行等问题。为了进行稳定的蛋白质组学分析,在上述前处理中抑制蛋白质的非特异吸附是重要的,因而,本发明的课题在于提供蛋白质向基材的非特异吸附少、并且能够容易地调制高分子量蛋白质被除去的有利的分析用溶液的装置。
为了解决上述课题,在本发明中采用以下方法。
(1)一种蛋白质和/或肽的分级装置,蛋白质和/或肽接触的基材表面的至少一部分,在与1000μg/ml的牛血清清蛋白溶液接触时,牛血清清蛋白向该基材表面的吸附量为50ng/cm2以下。
(2)一种蛋白质和/或肽的分级装置,蛋白质和/或肽接触的基材表面的至少一部分,在浓度为200ng/ml的人β2-微球蛋白和浓度为10μg/ml的牛血清清蛋白形成的蛋白质水溶液与该基材表面接触时,人β2-微球蛋白相对于该基材的吸附量为3ng/cm2以下。
(3)一种蛋白质和/或肽的分级装置,具备供给含有蛋白质和/或肽的溶液的供给构件、从溶液中分离蛋白质和/或肽的构件、以及将溶液中的蛋白质和/或肽浓缩的构件,在分级装置中蛋白质和/或肽接触的基材表面的至少一部分,被亲水性高分子接枝。
通过采取以上构成,经过分级操作能够将作为分析目标的蛋白质在损失少的情况下回收。
附图说明
[图1]是本发明的实施例A1中使用的分级装置的简图。另外,图中符号的意思如下。
符号说明
100注入泵
101三向阀
102第1阶段溶液循环回路(管道回路)
103第1阶段泵
104第1阶段的膜分离单元的处理液的回收口
105第1分离膜组件
201三向阀
202第2阶段溶液循环回路(管道回路)
203第2阶段泵
204第2阶段的膜分离单元的处理液的回收口
205第2分离膜组件
301三向阀
302第3阶段溶液循环回路(管道回路)
303第3阶段泵
304第3阶段的膜分离单元的处理液的回收口
305第3分离膜组件
401三向阀
402第4阶段溶液循环回路(管道回路)
403第4阶段泵
404浓缩膜单元的处理液的回收口
405浓缩膜组件
406回收用三向阀
407回收容器
具体实施方式
本发明中所谓的蛋白质和/或肽的分级装置,是指按照分子量区别或按照蛋白质或肽具有的特性的区别将它们分离的装置。作为其方法,可以使用分子量、离子相互作用、疏水性相互作用、抗体代表的生物学的相互作用等。一般是具备供给蛋白质或肽试样的供给构件、和进行分离的分离构件的装置。如果将以血清、血浆、尿等为代表的体液、和人为调制的含有蛋白质或肽的溶液、和通过细胞培养产生的培养上清液等的检测体以原有的浓度、或被pH缓冲溶液等稀释后投入供给构件,则检测体通过移动相被搬运,被设置在移动相的流路中的具备膜、凝胶、吸附体的分离构件分离。通过本发明的分级装置被分离的含有目标蛋白质或肽的溶液,根据需要通过紫外线吸收、荧光、比色等进行定量,或通过除去与蛋白质或肽一起含有的水分来进行浓缩,按照各一定量来分取或回收。用于定量、浓缩、分取、回收的工序的构件不必要与分离工序的构件一体化,但优选分离构件与定量、浓缩、分取、回收中的至少一个构件进一步连接的装置。应分离蛋白质或肽进而回收、然后进行分析的装置的要求,在需要调制高浓度的蛋白质或肽溶液的情况下,优选分离构件之后接着浓缩构件的装置。对使用移动相搬运蛋白质或肽的构件没有特殊限定,可以列举例如,由管、管道、沟槽等与管泵、齿轮泵、隔膜泵、注射泵等形成的流路。
特别是在用作用于得到蛋白质组学分析前处理用试样的装置时,要从生物体来源的溶液调制成大量含有分析目标微量成分的溶液。该机能是,除去高分子量(例如分子量为6万以上)的蛋白质,另一方面回收可作为蛋白质组学分析对象的低分子量(例如分子量小于1.5万)的蛋白质。另外,这样的目的装置优选含有选自分离蛋白质构件、浓缩蛋白质构件、和回收通过分级得到的蛋白质的构件中的构件,进一步含有输送蛋白质溶液的构件。
这里所谓的分子量为6万以上的蛋白质是指,如果是血液,则相当于清蛋白、免疫球蛋白、运铁蛋白等。在血液的情况下,这样的蛋白质相对于全部蛋白质成分以高含有率存在。作为本发明的分级装置的机能评价,这里以分子量接近6万的牛血清清蛋白为指标。另外,所谓的分子量小于1.5万的蛋白质,是在蛋白质中分子量比较小的蛋白质,如果是血液,虽然相对于蛋白质的存在比例低,但种类非常多。
在本发明的分级装置具备分离构件的情况下,有时含有蛋白质或肽的溶液在进行分离工序时被稀释。例如,在通过膜来分离检测体的情况下,通常溶剂也减少。如果蛋白质或肽的浓度变高,则在膜表面上堆积物叠层,造成孔眼堵塞,使分离效率低下。为了避免这种情况,有时加入稀释液以使蛋白质浓度不增加。
然而,在即使除去成为分析障碍的蛋白质后作为目标蛋白质的浓度仍很低的情况下,有时其浓度恐怕在分析装置的检出限度以下。因此,在分离后的含有目标成分的溶液浓度低的情况下,优选分离构件之后具有浓缩构件,进行浓缩操作。另外,由于仅将溶剂除去时可能使溶液中的盐浓度过度增加,结果使蛋白质改性,所以优选溶剂与盐同时除去。作为主要的浓缩操作,可以列举通过加热、减压使溶剂蒸发或冷冻干燥的方法、使用优先透过溶剂分子的分离膜通过过滤、透析来除去溶剂的方法、用吸水凝胶等吸收溶剂来除去的方法、利用分子筛效果、离子相互作用、疏水相互作用、氢键、亲和性等特异结合通过色谱浓缩的方法、电泳、离心分离等,也可组合这些操作。在本发明的分级装置中,优选含有进行这些操作中的任一个的构件。
作为本发明的蛋白质或肽接触的基材,可以列举,在进行供给含有蛋白质或肽的试样的构件、以及进行分离、吸附、定量、浓缩、分取、回收中的任一个处理的任一构件中含有蛋白质或肽的溶液所接触的构成原材料。在本发明的装置中,优选检测体所接触的基材表面的至少一部分被亲水化处理,最优选尽量全部的基材表面被亲水化处理。
对构成基材的原材料没有特殊限定,优选易于化学加工或表面修饰、可通过挤出成型、注射成型等价廉地大量生产的高分子材料。作为高分子材料的例子,可以列举,聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚砜、聚醚砜、聚氨酯、聚氯乙烯、聚1,1-偏二氯乙烯、聚丙烯腈、纤维素、乙酸纤维素、三乙酸纤维素、聚酰胺、聚酰亚胺、聚四氟乙烯、乙烯醇·乙烯共聚物、硅橡胶、环氧树脂、酚树脂等,但不限定于这些。
在本发明的分级装置中,通过在与蛋白质或肽接触的基材表面的至少一部分上设置蛋白质或肽难以附着的表面,不仅能够抑制吸附损失,而且作为进一步的作用,可抑制由蛋白质或肽的吸附·堆积·孔眼堵塞造成的分离性能低下,从这一点出发是重要的。作为其结果,可达到高回收率。达到该效果的表面特性是,在基材表面的0.01cm2~10cm2的范围内接触100μg/ml的牛血清清蛋白溶液时,牛血清清蛋白向该基材表面的吸附量为50ng/cm2。另外,基材表面与浓度为200ng/ml的人β2-微球蛋白和浓度为10μg/ml的牛血清清蛋白形成的蛋白质水溶液接触时,人β2-微球蛋白对该基材的吸附量为3ng/cm2以下。可按照以下方法评价这样的表面特性。
关于对基材表面的蛋白质的吸附评价,对使用比较廉价的通用蛋白质牛血清清蛋白(以下简称BSA)的溶液进行评价的情况予以说明。所谓的BSA溶液,使用为了抑制杂质等造成的吸附不均匀将BSA(SIGMA制ALBUMIN,BOVINE(A-7906))溶解于磷酸缓冲生理食盐水(将9.6g的日水制药(株)制PBS(-)粉末(162-21112)溶解于大制药出售的注射用水(2069)中调制成1升的溶液,以下简称PBS)中使其浓度为1000μg/ml的BSA溶液。另外,如果使BSA溶液相对于基材的接触面积过小,则可能不能正确分析,相反,如果过大,则使用蛋白质质量过多,结果效率变差,所以决定在0.01cm2~10cm2的范围进行。更加优选在0.1cm2~5cm2的范围进行。
与BSA溶液接触的面实际上是按照在蛋白质的前处理中基材与蛋白质溶液接触的面来进行评价,例如,在含有基材的剖面等的情况下,不评价BSA向剖面等上的吸附。对于表面积,在基材不是分离膜或浓缩膜的情况下,在基材表面的中心线平均粗度小于0.1μm时,不考虑由表面凹凸带来的增加面积,但在基材表面的中心线的平均粗度为0.1μm以上时,考虑由表面凹凸带来的增加面积。中心线平均粗度的测定按照JIS-B0601附带的说明书2记载的方法来进行。考虑表面凹凸的表面积,可使用通过B.E.T.法等的气体吸附法或利用キ一エンス社的超深度显微镜“VK9500”等的通过三维形状测定显微镜来测定。
另一方面,在基材是中空丝分离膜或中空丝浓缩膜时,膜面积可按照以下那样来算出。在37℃、调整pH至7.2的5重量%的BSA水溶液中,在溶液流量为200ml/min、过滤流量为15ml/min的使用条件下,使用填充了1.5m2对象膜的组件进行过滤,在过滤开始30分钟后的BSA的筛分系数为0.1以上时,BSA与膜的内表面接触,在透过膜后,在与膜的外表面接触的同时进行移动,所以将膜的细孔内表面积和外表面积作为表面积。另一方面,BSA的筛分系数小于0.1时,BSA几乎不能透过膜,只接触膜内表面,所以将膜内表面积作为表面积。
BSA的筛分系数按照以下的数学式算出。
(a)=2×(b)/((c)+(d))
这里(a)是BSA的筛分系数、(b)是过滤液的BSA浓度,(c)是膜分离前的原液侧的BSA浓度,(d)是膜分离后的原液侧的BSA浓度。
接触时间如果过短,则可能未达到吸附平衡,另一方面,如果过长,则蛋白质有变性的危险性,所以接触进行2小时。另外,如果BSA溶液量过少,则蛋白质的绝对量变少,所以按照每1cm2膜面积为50μl以上来进行。另外,吸附量受温度影响大,所以BSA溶液与基材接触时需要在25℃下进行。
作为将被吸附的BSA的吸附量定量的方法,可列举以下方法。即将基材在50ml的PBS中浸渍10秒2次,洗净,然后在1ml~30ml范围的50体积%的乙酸水溶液中室温浸渍12小时,冷冻干燥醋酸水溶液。为了不使干燥的BSA再次吸附在壁上,将干燥的BSA溶解于含有阻断剂的水溶液中,定量使用该溶液。溶液中BSA的定量可用BETHYL公司的BovineAlbumin ELISA Quantitaion Kit(E10-113)或它的同等物来进行。
将蛋白质溶解于水中时,亲水性的区域存在于蛋白质分子的表面,疏水性区域存在于蛋白质的内部。在蛋白质与疏水性的基材接触时,可以认为内部的疏水性区域露出表面,通过疏水性相互作用吸附在基材上。因此,基材表面的亲水化能够有效用于抑制蛋白质的吸附。特别是,如果在基材表面上接枝高分子,除了亲水性高分子带来的亲水化效果,可期待蛋白质溶液中伸展的亲水性高分子链的微布朗运动带来的体积排斥效果来抑制蛋白质吸附的效果,所以优选。
亲水化处理是指赋予基材表面亲水性的处理,有在基材原料中混入亲水性化合物的方法、用化学反应、放射线照射等在基材表面上生成亲水性官能团的方法、通过化学反应、放射线照射接枝亲水性高分子的方法等,其中优选接枝亲水性高分子的方法。其中,通过放射线照射接枝亲水性高分子的方法能够通过选择亲水性高分子的种类、分子量等来容易地控制亲水性,并且副产物少,同时可进行杀菌,所以优选。
所谓的亲水性的官能团,是指可通过静电相互作用、氢键等与水分子生成弱的结合的官能团。可以列举例如,羟基、羧基、氨基、硝基、醛基、巯基、磺酸基、硫酸基、硫酸酰胺基等,但不限定于这些。其中,羟基与作为非离子性官能团的具有强表面电荷的蛋白质的相互作用小,并且氧化还原能力也小,因此蛋白质的变性也小,所以优选。
所谓的亲水性高分子是指可溶于水的高分子、和不溶于水但通过静电相互作用、氢键可与水分子弱相互作用的高分子。可以列举例如,聚乙烯醇、聚烯丙醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、糖化合物等、以及它们和其他单体的共聚物、接枝物等,但不限定于这些。其中聚乙烯醇或聚乙烯醇共聚物的效果好,所以特别优选。作为聚乙烯醇的共聚物,作为构成聚合物的分子中的单体重复单元,优选相对于全部单体重复单元数含有10%以上且小于100%的乙烯醇单元数的聚合物。
作为聚乙烯醇共聚物,优选使用分子中含有式(1)化学结构式所示的单体重复单元和式(2)化学结构式所示的单体重复单元的共聚物。另外,也可含有其他的共聚成分。另外,皂化度是指通过数学式(2)求出的数值。如果皂化度低,则存在亲水性变低、对水的溶解性低下的趋势,所以作为水溶液难以对基材进行表面处理,因此皂化度优选为0.70以上,进一步优选0.74以上,更加优选0.78以上,并且小于1。皂化度为1时共聚物变为聚乙烯醇,如上所述,这也是优选方案。
化1
式(1)
化2
(k)=(m)/((n)+(m)) 数学式(1)
(数学式1)中的符号如下所述。
(k):皂化度
(m):聚乙烯醇共聚物中的式(1)所示的单体重复单元数
(n):聚乙烯醇共聚物中的式(2)所示的单体重复单元数
另外,共聚物可以是无规共聚、交替共聚、嵌段共聚、接枝共聚中的任一种,也可以是它们的组合。
由于在亲水性高分子的分子量小时,亲水性高分子的分子运动性变小,所以重均分子量优选为1000以上,进一步优选为5000以上,更加优选为10000以上。
作为将亲水性高分子导入基材的方法,也可以使用向表面涂布,但向基材的接枝溶出少,所以优选。使用放射线的接枝副产物也少,所以特别优选。另外,可使基材与含有羟基的亲水性高分子溶液,优选与水溶液接触,然后通过放射线进行接枝。放射线可以使用α线、β线、γ线、X线、紫外线、电子束等。在长期保存分级装置时,有可能生菌,导致性能低下。特别是具有分离或浓缩构件的分级装置,在这些构件中虽然可含有水,但含水状态下菌增殖的风险变大,所以优选杀菌。近年来,从简便的观点出发,多使用放射线杀菌法,特别优选使用γ线等电磁波线、电子束。即,通过使用利用放射线的方法,能够同时完成杀菌和亲水化处理,所以优选。在需要杀菌时,优选以15kGy的线量来进行,在不需要杀菌时,从有效进行亲水化处理和防止基材的劣化的观点出发,优选在0.5kGy~200kGy的范围内进行,更加优选在1kGy~100kGy的范围内进行。
在本发明的分级装置中,在采用膜进行分离或浓缩的情况下,可以使用平面过滤器、筒式过滤器等平膜型分离膜(以下称作“平膜”)、中空丝等中空状分离膜(中空丝膜)中的任一个,由于一般中空丝膜每单位处理液量的膜表面积大,压损也小,所以能够最有效地使用。为了使每单位处理液量的膜表面积变大,优选内径小的中空丝,优选1000μm以下的,更加优选500μm以下的。另外,平面过滤器具有可容易且价廉的进行制膜的优点。作为膜原材料,可以列举选自纤维素、乙酸纤维素、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲酯等聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1,1-偏二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚乙烯和聚丙烯、以及它们的衍生物中的一种以上的原材料。其中近年来良好地被应用于透析仪器等的聚砜,分级特性良好,所以是优选的原材料。
实施例
用以下实施例来详细说明本发明,但本发明的范围不仅限于这些实施例。
《实施例A》
<回收容器的BSA吸附量的测定>
将100mg的SIGMA制的血清清蛋白(ALBUMIN,BOVINE:A-7906,Lot.41k1270)溶解于100ml的PBS中,调制1000μg/ml的BSA溶液。将2ml该BSA溶液加入回收容器中,加盖以不使溶液蒸发,在25℃下静置4小时。此时BSA溶液与4.0cm2的回收容器内表面接触,使用该面积来计算BSA的吸附量。将回收容器中的BSA溶液用吸引器吸引除去,5次用3ml的PBS洗净。在回收容器中加入3ml的50体积%的乙酸水溶液,在25℃下静置12小时,连同回收容器一起冷冻干燥。为了抑制要回收的BSA吸附在回收容器表面上,在回收容器中加入1ml的将40g的大日本制药制的ブロツクエ一ス粉末(UK-B40,lot.STK084206)溶解于1升水中而形成的溶液,用涡动混合器混合,溶解回收容器内壁上付着的BSA,从而制作BSA定量分析试样。BSA的定量使用BETHYL公司的血清清蛋白ELISA定量试剂盒(Bovine Albumin ELISA Quantitation Kit(E10-113,lotE10-113-11)),依照试剂盒付带的说明书来进行分析。吸附量按照数学式(2)来计算。
A=B/C 数学式(2)
式(2)中的符号
A:BSA吸附量(ng/cm2)
B:由BSA定量分析得到的BSA的量(ng)
C:BSA溶液和回收容器的接触面积(cm2)
<中空丝膜的BSA吸附量的测定>
集束30根用于微型组件的中空丝膜,在不闭塞中空丝膜中空部的情况下,用环氧类的封装剂将两末端固定在玻璃管组件壳体上,制作微型组件。该微型组件的内直径约为5mm,长约为12cm,与一般的中空丝膜型透析器同样具有2个与中空丝膜的内侧相连的进出口(血液进出口)、和2个与外侧连接的进出口(透析液进出口)。用蒸馏水洗净该微型组件的中空丝膜和组件内部。然后,从透析液进出口注入PBS,之后盖上,用PBS充满中空丝的外侧。在与一个血液进出口相连的硅胶管的中途设置蠕动泵,另外一个血液进出口也与硅胶管相连。将这2根硅胶管的开放端插入GreinerBio-One社制PP管(188261)中。在该PP管中加入10ml的将100mg的SIGMA制的血清清蛋白(ALBUMIN,BOVINE:A-7906,Lot.41k1270)溶解于100ml的PBS的1000μg/ml的BSA溶液,用蠕动泵以1ml/min的流速在25℃下循环4小时。然后用蠕动泵以10ml/min的流速快速地输送300ml的PBS液。此时,从硅胶管排出的PBS被废弃,不再循环。
然后除去微型组件内的PBS。拆开微型组件,取出中空丝。取出的中空丝的长为15cm。将该中空丝切成1cm长,全部放入GreinerBio-One社制的PP管(188261)中,加入5ml的50体积%的乙酸水溶液,在25℃下静置12小时。然后,过滤分离中空丝,将乙酸溶液连同回收容器一起冷冻干燥。在回收容器中加入2ml的将40g的大日本制药制ブロツクエ一ス粉末(UK-B40,lot.STK084206)溶于1升水中而形成的液体,用涡动混合器混合,将付着在回收容器内壁上的BSA溶解,制成BSA定量分析试样。BSA的定量使用BETHYL公司的血清清蛋白ELISA定量试剂盒(BovineAlbumin ELISA Quantitation Kit(E10-113,lotE10-113-11)),依照试剂盒附带的说明书来进行分析。吸附量按照式(3)计算。另外,中空丝内表面积按照数学式(4)来计算。
D=E/F 数学式(3)
数学式(3)中的符号
D:BSA吸附量(ng/cm2)
E:由BSA定量分析得到的BSA的量(ng)
F:中空丝内表面积(cm2)
F=(G/2)2P·H·I 数学式(4)
数学式(4)中的符号
F:中空丝内表面积(cm2)
G:中空丝内径
P:圆周率
H:从组件中取出的中空丝的每一根的长度(cm)
I:中空丝根数
<液体中存在的β2-微球蛋白的测定>
使用和光纯药工业株式会社售的グラザイムβ2-微球蛋白-EIA检测仪(代码305-11011),依照试剂盒附带的说明书来进行分析。
<血清和回收液的清蛋白的测定>
使用BETHYL公司的人血清ELISA定量试剂盒(Human AlbuminELISA Quantitation Kit:E80-129,lotE80-129-9),依照试剂盒附带的说明书来进行分析。
<回收容器(1)的制造>
将ナカライテスク社制的聚乙烯醇(28311-25,(实际上是乙烯醇-乙酸乙烯酯的共聚物,皂化度为86.5-89.0%)、LotNo.M2B1968)溶解在超纯水中,调制浓度为1000ppm的聚乙烯醇共聚物水溶液。在生产日本社制的带有夹子的袋(ユニパツクE-4)中加入50ml的该聚乙烯醇水溶液,在其中浸渍BECTONDICKINSON社制的5ml的聚苯乙烯圆管(352054),照射γ线。此时γ线的吸收线量为26kGy。γ线照射后,用1升超纯水洗净聚苯乙烯圆管,在50℃的烘箱中干燥3小时,得到回收容器(1)。
<回收容器(2)的准备>
直接使用BECTON DICKINSON社制的5ml的聚苯乙烯圆管(352054)作为回收容器(2)。
<微型组件(1)的制造>
切下东丽株式会社制透析器BS1.8L(Lot.20440312)的组件两端的树脂粘接构件,得到中空丝膜。所得中空丝膜的大小为内直径200μm、膜厚40μm。集束100根该中空丝膜,在不闭塞中空丝膜中空部的情况下,用环氧类的封装剂将两末端固定在玻璃管组件壳体上,制作微型组件。该组件的内直径约为5mm,长约为17cm,与一般的中空丝膜型透析器同样具有2个与中空丝膜的内侧相连的进出口(血液进出口)、和2个与外侧连接的进出口(透析液进出口)。用蒸馏水洗净该微型组件的中空丝膜和组件内部。然后,填充PBS,得到中空丝膜微型组件(以下,简称为微型组件(1))。
<微型组件(2)的制造>
同样集束40根从东丽株式会社制透析器BS1.8L切下的中空丝膜,在不闭塞中空丝膜中空部的情况下,用环氧类的封装剂将两末端固定在玻璃管组件壳体上,制作微型组件。该组件的内直径约为5mm,长约为17cm,与一般的中空丝膜型透析器同样具有2个与中空丝膜的内侧相连的进出口(血液进出口)、和2个与外侧连接的进出口(透析液进出口)。用蒸馏水洗净该微型组件的中空丝膜和组件内部。然后,填充PBS,得到中空丝膜微型组件(以下,简称为微型组件(2))。
<微型组件(3)的制造>
将18重量份的聚砜(ソルベ一社制ユ一デル(注册商标)P-3500)和9重量份的聚乙烯吡咯烷酮(BASF社制K30)加入至72重量份的N,N’-二甲基乙酰胺和1重量份的水的混合溶剂中,在90℃下加热14小时进行溶解,得到制膜原液。将该制膜原液从0.3mm外径、0.2mm内径的孔型双重圆筒型口模的外侧管排出。从内侧管排出由作为芯液的58重量份的N,N’-二甲基乙酰胺和42重量份的水形成的溶液。
将排出的制膜原液通过从口模到凝固浴液面的350mm距离,然后导入100%水的凝固浴,得到中空丝膜。用电镜(日立社制S800)确认所得中空丝膜的结构,结果具有非对称结构。将10000根得到的中空丝膜插入与一般的透析器同样具有透析液入口和透析液出口的圆筒状的塑料壳体中,两端部用树脂密封,制成有效膜面积为1.6m2的中空丝膜组件。用水洗净该中空丝膜,然后从该组件切取中空丝膜,准备100根。在50℃下、相对湿度为13%的气氛下干燥24小时。将该中空丝膜与实施例A4同样地用环氧类的封装剂将两末端固定在玻璃管组件壳体上,制作微型组件。用蒸馏水洗净该微型组件的中空丝膜和组件内部。然后填充PBS,得到浓缩用中空丝膜微型组件(以下,简称为微型组件(3))。
<微型组件(4)的制造>
与微型组件(1)同样地制造微型组件。然而,虽然进行了用蒸馏水洗净微型组件的中空丝膜和组件内部,但没有进行到PBS的填充。
将ナカライテスク社制的聚乙烯醇(28311-25,LotNo.M2B1968)溶于超纯水,调制浓度为1000ppm的聚乙烯醇水溶液。将10ml的上述液体用蠕动泵以1ml/min的流速从该微型组件中空丝膜的内侧的一个血液进出口加入,经过中空丝内部从另一个血液进出口出去,经过管进入该血液进出口侧的透析液进出口,从另一个透析液进出口排出。
然后,在微型组件的中空丝内侧和外侧填充该聚乙烯醇的状态下,在将4处进出口密封的状态下,照射γ线。此时γ线的吸收线量为26kGy。用3L的40℃的蒸馏水洗净该微型组件的中空丝膜和组件内部。
然后,填充PBS,得到中空丝膜微型组件(以下,简称为微型组件(4))。
<微型组件(5)的制造>
与微型组件(2)同样地制造微型组件。然而,虽然进行了微型组件的中空丝膜和组件内部的蒸馏水洗净,但没有进行到PBS的填充。
将ナカライテスク社制的聚乙烯醇(28311-25,LotNo.M2B1968)溶解在超纯水中,调制浓度为1000ppm的聚乙烯醇水溶液。将10ml的上述液体用蠕动泵以1ml/min的流速从该微型组件中空丝膜的内侧的一个血液进出口加入,经过中空丝内部从另一个血液进出口出去,经过管进入该血液进出口侧的透析液进出口中,从另一个透析液进出口排出。
然后,在微型组件的中空丝内侧和外侧填充该聚乙烯醇的状态下,在将4处进出口密封的状态下,照射γ线。此时γ线的吸收线量为26kGy。用3L的40℃的蒸馏水洗净该微型组件的中空丝膜和组件内部。
然后,填充PBS,得到中空丝膜微型组件(以下,简称为微型组件(5))。
<微型组件(6)的制造>
与微型组件(3)同样地制造微型组件。然而,虽然进行了用蒸馏水洗净微型组件的中空丝膜和组件内部,但没有进行到PBS的填充。
将ナカライテスク社制的聚乙烯醇(28311-25,LotNo.M2B1968)溶解在超纯水中,调制浓度为1000ppm的聚乙烯醇水溶液。将10ml的上述液体用蠕动泵以1ml/min的流速从该微型组件中空丝膜的内侧的一个血液进出口加入,经过中空丝内部从另一个血液进出口出去,经过管进入该血液进出口侧的透析液进出口中,从另一个透析液进出口排出。然后,在微型组件的中空丝内侧和外侧填充该聚乙烯醇的状态下,在密封4处的进出口的状态下,照射γ线。此时γ线的吸收线量为26kGy。用3L的40℃的蒸馏水洗净该微型组件的中空丝膜和组件内部。然后,填充PBS,得到中空丝膜微型组件(以下,简称为微型组件(6))。
<实施例A1>
首先,准备1个微型组件(1),盖上外侧的一个进出口,另一个进出口连接硅胶管。用硅胶管连接原液入口和出口,使中空丝膜内侧液体形成循环回路,并在回路中设置蠕动泵,使溶液可以循环。在上述溶液循环回路的中途设置三向阀,在三向阀的一方向上设置注入泵。将其作为第1阶段的膜分离单元。进而,对微型组件(2)中的1个微型组件,盖上外侧的一个进出口,另外的一个进出口连接硅胶管。用硅胶管连接组件的原液入口和出口,使微型组件(2)的中空丝膜内侧液体形成循环回路,并在回路中设置蠕动泵,使溶液可以循环。进而在上述溶液循环回路的中途设置三向阀。将其作为第2阶段的膜分离单元。进而,盖上另外一个微型组件(2)的外侧的一个进出口,将剩下的一个进出口连接硅胶管。用硅胶管连接组件的原液入口和出口,使第2个微型组件(2)的中空丝膜内侧液体形成循环回路,并在回路中设置蠕动泵,使溶液可以循环。进而在上述溶液循环回路的中途设置三向阀。将其作为第3阶段的膜分离单元。
盖上微型组件(3)外侧的一个进出口,使另一个进出口作为滤液出口。用硅胶管连接组件的原液入口和出口,使该微型组件(3)的中空丝膜内侧液体也形成循环回路,并使用蠕动泵,使溶液可以循环。另外在溶液循环回路的中途设置2个三向阀。将上述系统作为浓缩膜单元。
将分离膜单元第3阶段的微型组件的处理液回收口和浓缩膜单元的三向阀用硅胶管接合。另外,在浓缩膜单元的溶液循环回路的中途设置由三向阀形成的浓缩单元的处理液回收口,在浓缩的操作中仅使溶液循环回路开通。在该处理液回收口的端部设置回收容器(1)。在整个系统中填充PBS,从而制作了将清蛋白以上的蛋白质通过分子筛分级的膜分离单元和将蛋白质浓缩的单元串联的复合系统。
图1是此实施例A1使用的分离系统的简图。液体的流向用箭头示出。血清和稀释液(PBS)经过注入泵100、三向阀101,注入第1阶段溶液循环回路102中。进而,该液体通过第1阶段泵103被输送,注入第1分离膜组件105(微型组件(1))中,在第1阶段溶液循环回路102循环。从第1阶段的膜分离单元的处理液回收口104得到被第1膜分离单元处理的溶液。接着,该溶液经过第2阶段的膜分离单元的三向阀201,在第2阶段溶液循环回路202中进而通过第2阶段泵203被输送,注入第2分离膜组件205(第1微型组件(2))中,在第2阶段的溶液循环回路202中循环。从第2阶段的膜分离单元的处理液回收口204得到被第2膜分离单元处理的溶液。进而,该溶液经过第3阶段的膜分离单元的三向阀301,在第3阶段溶液循环回路302中进而通过第3阶段泵303被输送,注入第3分离膜组件305(第2微型组件(2))中,在溶液循环回路302中循环。从第3阶段的膜分离膜单元的处理液回收口304得到第3膜分离单元处理的液体。进而,该处理液经过浓缩膜单元的三向阀401,在第4阶段溶液循环回路402中进而通过第4阶段泵403被输送,注入浓缩膜组件405(微型组件(3))中,在第4阶段溶液循环回路402中循环。此时,从浓缩膜单元的滤液出口404取出从浓缩膜组件405透过的液体,废弃。结束透过、浓缩操作之后,通过打开浓缩单元的三向阀406,从回收容器407(回收容器(1))中取出在微型组件(3)的第4阶段溶液循环回路402中残留的溶液。
具体条件如下所示。将1ml的人血清(Sigma社制、H1388(Lot073K445))以0.2ml/min的速度加入第1阶段的膜分离单元,然后在第1阶段的膜分离单元、第2阶段的膜分离单元、第3阶段的膜分离单元中一起以流量为5.0mL/min的条件在各溶液循环回路循环,在各组件的过滤流量为0.2mL/min的流速下,在20℃实施过滤4小时。此时,通过注入泵100以0.2mL/min的速度加入过滤出的容量分的PBS,以确保各分离单元和浓缩单元保持一定的循环液量。
经4小时的运行后,回收容器407(回收容器(1))中得到的溶液中的清蛋白的量为0.336μg,β2-微球蛋白的量为0.853μg,用作原液的人血清中的清蛋白量为31200μg,β2-微球蛋白的量为1.19μg,因而可以在保持β2-微球蛋白量的同时,大幅除去清蛋白。
另外,测定了BSA的吸附量,结果回收容器(1)为16.6ng/cm2、微型组件(1)的中空丝为397.9ng/cm2、微型组件(2)的中空丝为378.4ng/cm2、微型组件(3)的中空丝为429.3ng/cm2。
<实施例A2>
首先,准备1个微型组件(4),盖上外侧的一个进出口,另一个进出口连接硅胶管。用硅胶管连接原液入口和出口,使中空丝膜内侧液体形成循环回路,并在该回路中设置蠕动泵,使溶液可以循环。在上述溶液循环回路的中途设置三向阀,在三向阀的一向上设置注入泵。将其作为第1阶段的膜分离单元。进而,对微型组件(5)中的1个微型组件,盖上外侧的一个进出口,另外的一个进出口连接硅胶管。用硅胶管连接组件的原液入口和出口,使微型组件(5)的中空丝膜内侧液体形成循环回路,并在该回路中设置蠕动泵,使溶液可以循环。进而在上述溶液循环回路的中途设置三向阀。将其作为第2阶段的膜分离单元。进而,盖上另外一个微型组件(5)的外侧的一个进出口,将剩下的一个进出口连接硅胶管。用硅胶管连接组件的原液入口和出口,使第2个微型组件(5)的中空丝膜内侧液体形成循环回路,并在回路中途设置蠕动泵,使溶液可以循环。进而在上述溶液循环回路的中途设置三向阀。将它作为第3阶段的膜分离单元。
盖上微型组件(6)外侧的一个进出口,使另一个作为滤液出口。用硅胶管连接组件的原液入口和出口,使该微型组件(6)的中空丝膜内侧液体也形成循环回路,并使用蠕动泵,使溶液可以循环。另外在溶液循环回路的中途设置2个三向阀。将上述系统作为浓缩膜单元。
将分离膜单元第3阶段的微型组件的处理液回收口和浓缩膜单元的三向阀用硅胶管接合。另外,在浓缩膜单元的溶液循环回路的中途设置由三向阀形成的浓缩单元的处理液回收口,在浓缩的操作中仅使溶液循环回路开通。在该处理液回收口的端部设置回收容器(1)。在整个系统中填充PBS,制作了与实施例1同样的将清蛋白以上的蛋白质通过分子筛分级的膜分离单元和将蛋白质浓缩的单元串联的复合系统。
与实施例1同样地进行注入、分离、浓缩和回收操作。具体条件如下所示。将1ml的血清以0.2ml/min的速度加入第1阶段的膜分离单元,然后第1阶段的膜分离单元、第2阶段的膜分离单元、第3阶段的膜分离单元一起以流量为5.0mL/min的条件在各溶液循环回路中循环,在各组件的过滤流量为0.2mL/min的流速下,在20℃实施过滤4小时。此时,从注入泵以0.2mL/min的速度加入过滤出容量分的PBS,以确保各分离单元和浓缩单元保持一定的循环液量。
运行4小时后,回收容器(1)中得到的溶液中的清蛋白的量为0.251μg、β2-微球蛋白的量为0.981μg,而用作原液的人血清中的清蛋白的量为31200μg,β2-微球蛋白的量为1.19μg,因而可以在维持β2-微球蛋白的量同时大幅除去清蛋白。
另外,测定了BSA的吸附量,结果回收容器(1)为17.6ng/cm2、微型组件(4)的中空丝为35.6ng/cm2、微型组件(5)的中空丝为39.2ng/cm2、微型组件(6)的中空丝为42.8ng/cm2。
<比较例A1>
除了取代实施例A1的回收容器(1),而使用回收容器(2)以外,其余与实施例A1同样地进行4小时的过滤运行。回收容器(2)中得到的液体中的清蛋白的量为0.490μg,β2-微球蛋白量为0.202μg,而用作原液的人血清中的清蛋白量为31200μg、β2-微球蛋白量为1.19μg,虽然可以除去清蛋白,但β2-微球蛋白的回收率低。
另外,测定了BSA的吸附量,结果回收容器(2)为236.4ng/cm2、微型组件(1)的中空丝为377.1ng/cm2、微型组件(2)的中空丝为394.5ng/cm2、微型组件(3)的中空丝为429.3ng/cm2。
将以上的结果总结于表1、2中。表1示出了BSA的吸附量,表2示出了β2-微球蛋白的回收量。在使用吸附量为50ng/cm2以下的回收容器或中空丝的实施例A1、A2中,β2-微球蛋白的回收率高,与此相对的是,在使用吸附量多于50ng/cm2的回收容器和中空丝膜的比较例A1中β2-微球蛋白的回收率低。用这样的一部分导入了低吸附表面的装置能够实现β2-微球蛋白的高回收率。上述结果显示了该装置不仅能够抑制膜表面上的清蛋白的堆积和孔眼堵塞,使β2-微球蛋白能够良好地透过膜,而且也抑制了透过的β2-微球蛋白的吸附损失,可高收率的回收β2-微球蛋白。
《实施例B》
对本发明的分级装置中的用于回收含有被分级的微量的蛋白质的聚苯乙烯试管(BECTON DICKINSON制“5ml聚苯乙烯圆底管:5ml PolystyrenRound-Bottom Tube”)和聚丙烯制试管(BECTON DICKINSON制“5ml聚丙烯圆底管:5ml Polypropyrene Round-Bottom Tube”),比较吸附和回收性能。
<人β2-微球蛋白的吸附试验>对蛋白质相对于基材表面的吸附评价,对用人β2-微球蛋白的溶液进行的情况予以说明。在实施例中使用的人β2-微球蛋白(以下简称作β2-MG),是指ORIENTALYEAST CO.,LTD制的重组的人β2-微球蛋白(Recombiant Human β2-microgloblin,目录代码47194000),或它的等同品。另外,本发明中的牛血清清蛋白是指SIGMA制的血清清蛋白粉末(Bovine Albumin Powder,产品编号A7906),或它的等同品。
使用将2-MG(ORIENTALYEAST CO.,LTD制的重组的人β2-微球蛋白,目录代码47194000)调制成200ng/ml、将牛血清清蛋白(SIGMA制的Bovine Albumin Powder,产品编号A7906)(以下简称为BSA)调整至10μg/ml的PBS(日本制药社制的ダルベツコPBS)水溶液作为蛋白质溶液(以下作为蛋白质溶液A)。由于蛋白质溶液A中的蛋白质也吸附在调制使用的容器上,所以吸附试验必须在调制后的5分钟之内开始。将上述那样调制的蛋白质溶液A象下面那样在吸附试验中使用。即,作为对照试样,在已加入100μl阻断剂(大日本制药出售的ブロツクエ一ス商品目录代码UK-B25)的容器(エツペンドルフ社制セイフ一ロツク管商品No.0030 120,086)中加入500μl的蛋白质溶液A,在β2-MG浓度测定之前一直在-70℃下冷冻保管。作为吸附评价试样,将蛋白质溶液A与评价基材接触,在25℃下静置1小时,然后向已加入100μl阻断剂(大日本制药售的ブロツクエ一ス目录代码UK-B25)的容器(エツペンドルフ社制セイフ一ロツクチユ一ブ商品No.0030 120,086)中加入500μl的蛋白质溶液A,在β2-MG浓度测定之前一直在-70℃下冷冻保管。另外,蛋白质溶液A相对于评价基材表面积的添加量为2ml/cm2~8ml/cm2。
β2-MG的浓度测定使用β2-MG测定试剂盒(和光纯药工业售グラザイムβ2-微球蛋白EIA检测,代码.305-11011),依照试剂盒附带的说明书来进行。蛋白质的吸附量通过(数学式5)算出。
(a)=((b)-(c))/(d)(数学式5)
(数学式5)中的符号如下所示。
(a):塑料试管的蛋白质吸附量(ng/cm2)
(b):对照试样中的β2-MG量(ng)
(d):吸附评价试样中的β2-MG量(ng)
(d):塑料试管和蛋白质溶液A的接触面积(cm2)
<实施例B1>
将聚苯乙烯制试管(BECTON DICKINSON制“5ml PolystyreneRound-Bottom Tube”浸渍在100ml的1000ppm的乙烯醇-乙酸乙烯酯共聚物(重均分子量为10000、皂化度为80%、Aldrich制、目录编号.360627)的水溶液中,照射γ线。γ线的吸收线量为25kGy。将聚苯乙烯试管从聚乙烯醇的水溶液中取出,用500ml流水洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管供给人β2-微球蛋白吸附试验用。结果示于表3。
<实施例B2>
将与实施例B1最初准备的聚苯乙烯制试管相同的试管浸渍在100ml的10ppm的实施例B1的乙烯醇-乙酸乙烯酯共聚物的水溶液中,照射γ线。γ线的吸收线量为26kGy。将聚苯乙烯试管从聚乙烯醇的水溶液中取出,用500ml流水洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管供给人β2-微球蛋白吸附试验用。结果示于表3。
<实施例B3>
将与实施例B1最初准备的聚苯乙烯制试管相同的试管浸渍在100ml的1000ppm的聚乙烯醇(分子量为22000、ナカライテスク制、代码No.28311-25)的水溶液中,照射γ线。γ线的吸收线量为25kGy。将聚苯乙烯试管从聚乙烯醇的水溶液中取出,用500ml流水洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管供给人β2-微球蛋白吸附试验用。结果示于表3。
<实施例B4>
将与实施例B1最初准备的聚苯乙烯制试管相同的试管浸渍在100ml的10ppm的与实施例B3相同的聚乙烯醇水溶液中,照射γ线。γ线的吸收线量为27kGy。将聚苯乙烯试管从聚乙烯醇的水溶液中取出,用500ml流水洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管供给人β2-微球蛋白吸附试验用。结果示于表3。
<实施例B5>
将聚丙烯制试管(BECTON DICKINSON制“5ml PolypropyreneRound-Bottom Tube”浸渍在100ml的1000ppm的聚乙烯醇(分子量为10000、Aldrich制、目录编号.360627)的水溶液中,照射γ线。γ线的吸收线量为25kGy。将聚苯乙烯试管从聚乙烯醇的水溶液中取出,用500ml流水洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管供给人β2-微球蛋白吸附试验用。结果示于表3。
<实施例B6>
将与实施例B5最初准备的聚丙烯制试管相同的试管浸渍在100ml的10ppm的与实施例B5相同的聚乙烯醇水溶液中,照射γ线。γ线的吸收线量为25kGy。将聚苯乙烯试管从聚乙烯醇的水溶液中取出,用500ml流水洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管供给人β2-微球蛋白吸附试验用。结果示于表3。
<实施例B7>
将实施例B5最初准备的聚丙烯制试管浸渍在100ml的1000ppm的聚乙烯醇(分子量为22000、ナカライテスク制、代码No.28311-25)水溶液中,照射γ线。γ线的吸收线量为26kGy。将聚苯乙烯试管从聚乙烯醇的水溶液中取出,用500ml流水洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管供给人β2-微球蛋白吸附试验用。结果示于表3。
<实施例B8>
将与实施例B5最初准备的聚丙烯制试管相同的试管浸渍在100ml的10ppm的与实施例B7相同的聚乙烯醇的水溶液中,照射γ线。γ线的吸收线量为27kGy。将聚苯乙烯试管从聚乙烯醇的水溶液中取出,用500ml流水洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管供给人β2-微球蛋白吸附试验用。结果示于表3。
<比较例B1>
将与实施例B1最初准备的聚苯乙烯制试管相同的试管用500ml流水洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管供给人β2-微球蛋白吸附试验用。结果示于表3。
<比较例B2>
将与实施例B5最初准备的聚丙烯制试管相同的试管用500ml流水洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管供给人β2-微球蛋白吸附试验用。结果示于表3。
<比较例B3>
将与实施例B1最初准备的聚苯乙烯制试管相同的试管浸渍在100ml的1000ppm的聚乙烯基吡咯烷酮(分子量为50000、BASF制Kollidon25)的水溶液中,照射γ线。γ线的吸收线量为25kGy。将聚苯乙烯试管从聚乙烯基吡咯烷酮的水溶液中取出,用500ml流水洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管供给人β2-微球蛋白吸附试验用。结果示于表3。
<比较例B4>
将与实施例B1最初准备的聚苯乙烯制试管相同的试管浸渍在100ml的1000ppm的聚乙烯基吡咯烷酮(分子量为3000、BASF制的Kollidon12PF)的水溶液中,照射γ线。γ线的吸收线量为27kGy。将聚苯乙烯试管从聚乙烯醇的水溶液中取出,用500ml流水洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管供给人β2-微球蛋白吸附试验用。结果示于表3。
<比较例B5>
将与实施例B1最初准备的聚苯乙烯制试管相同的试管浸渍在100ml的1000ppm的聚乙二醇(分子量为20000、片山化学工业制的聚乙二醇20000)的水溶液中,照射γ线。γ线的吸收线量为25kGy。将聚苯乙烯试管从聚乙烯醇的水溶液中取出,用500ml流水洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管供给人β2-微球蛋白吸附试验用。结果示于表3。
<比较例B6>
将与实施例B1最初准备的聚苯乙烯制试管相同的试管浸渍在100ml的1000ppm的聚乙二醇(分子量为20000、和光纯药工业制的聚乙二醇2000)的水溶液中,照射γ线。γ线的吸收线量为26kGy。将聚苯乙烯试管从聚乙烯醇的水溶液中取出,用500ml流水洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管供给人β2-微球蛋白吸附试验用。结果示于表3。
<比较例B7>
将与实施例B1最初准备的聚苯乙烯制试管相同的试管浸渍在100ml的1000ppm的聚乙烯亚胺(分子量为25000、Aldrich制、目录代码40872-7)的水溶液中,照射γ线。γ线的吸收线量为26kGy。将聚苯乙烯试管从聚乙烯醇的水溶液中取出,用500ml的流水洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管供给人β2-微球蛋白吸附试验用。结果示于表3。
<比较例B8>
将与实施例B1最初准备的聚苯乙烯制试管相同的试管的内壁用15ml的甲醇洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管在100ml的25000ppm的MPC和甲基丙烯酸丁酯的共聚物的甲醇溶液中浸渍1分钟。将该试管从聚甲基丙烯酸羟基乙基酯溶液中取出,倒出试管内的液体,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管用500ml的流水洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管供给人β2-微球蛋白吸附试验用。结果示于表3。
<比较例9>
将与实施例B5最初准备的聚丙烯制试管相同的试管的内壁用15ml的甲醇洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管在100ml的25000ppm的MPC和甲基丙烯酸丁酯的共聚物的甲醇溶液中浸渍1分钟。将该试管从聚甲基丙烯酸羟基乙基酯溶液取出,倒出试管内的液体,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管用500ml的流水洗净,在70℃的烘箱中干燥1小时。将该试管供给人β2-微球蛋白吸附试验用。结果示于表3。
如表3所示,人β2-微球蛋白吸附试验(使用由浓度为200ng/ml的人β2-微球蛋白和浓度为10g/ml的牛血清清蛋白形成的蛋白质水溶液)的结果为,本发明的情况(实施例1~9)比比较例1~9的β2-MG吸附量(人β2-微球蛋白的吸附量)少,对微量生物体成分的吸附抑制、高收率的回收有效。
表1.BSA吸附量
回收容器 | 中空丝 | |||
实施例A1 | 回收容器(1)16.6ng/cm2 | 微型组件(1)397.9ng/cm2 | 微型组件(2)378.4ng/cm2 | 微型组件(3)429.3ng/cm2 |
实施例A2 | 回收容器(1)17.6ng/cm2 | 微型组件(4)35.6ng/cm2 | 微型组件(5)39.2ng/cm2 | 微型组件(6)42.8ng/cm2 |
比较例A1 | 回收容器(2)236.4ng/cm2 | 微型组件(1)377.1ng/cm2 | 微型组件(2)394.5ng/cm2 | 微型组件(3)429.3ng/cm2 |
表2.分级前后的清蛋白量和β2-微球蛋白量
清蛋白 | β2-微球蛋白量 | |||
分级前 | 分级后 | 分级前 | 分级后 | |
实施例A1 | 31200μg | 0.336μg | 1.19μg | 0.853μg |
实施例A2 | 31200μg | 0.251μg | 1.19μg | 0.981μg |
比较例A1 | 31200μg | 0.490μg | 1.19μg | 0.202μg |
表3
β2-MG吸附量(ng/cm2) | |
实施例B1 | 1.03 |
实施例B2 | 1.23 |
实施例B3 | 1.21 |
实施例B4 | 2.05 |
实施例B5 | 1.64 |
实施例B6 | 1.63 |
实施例B7 | 1.03 |
实施例B8 | 1.23 |
实施例B9 | 1.05 |
比较例B1 | 5.13 |
比较例B2 | 8.61 |
比较例B3 | 4.17 |
比较例B4 | 4.01 |
比较例B5 | 4.91 |
比较例B6 | 4.94 |
比较例B7 | 4.09 |
比较例B8 | 6.35 |
比较例B9 | 6.38 |
产业可利用性
本发明的分级装置,在进行蛋白质组学分析时,在制作试样中是非常有用的,可在医学、特别是在疾病的发现上应用。
Claims (30)
1.一种蛋白质和/或肽的分级装置,蛋白质和/或肽接触的基材表面的至少一部分,在与1000μg/ml的牛血清清蛋白溶液接触时,牛血清清蛋白向该基材表面的吸附量为50ng/cm2以下。
2.如权利要求1所述的分级装置,与蛋白质和/或肽接触的基材表面的至少一部分是被亲水化处理而形成的。
3.如权利要求2所述的分级装置,是在基材表面赋予亲水性高分子从而被亲水化处理的。
4.如权利要求3所述的分级装置,亲水性高分子含有羟基。
5.如权利要求4所述的分级装置,亲水性高分子的至少一部分是聚乙烯醇或聚乙烯醇的共聚物。
6.如权利要求5所述的分级装置,聚乙烯醇的共聚物是聚乙烯醇-聚乙酸乙烯酯共聚物。
7.如权利要求6所述的分级装置,聚乙烯醇-聚乙酸乙烯酯共聚物的皂化度为0.70以上、小于1。
8.如权利要求3所述的分级装置,通过在基材表面接枝亲水性高分子而使基材表面亲水化。
9.如权利要求8所述的分级装置,通过照射放射线来接枝亲水性高分子。
10.如权利要求9所述的分级装置,作为牛血清清蛋白的吸附量为50ng/cm2以下的基材是膜。
11.如权利要求10所述的分级装置,该膜的形状为中空丝。
12.如权利要求11所述的分级装置,其特征在于,具备供给含有蛋白质和/或肽的溶液的供给构件、从溶液中分离蛋白质和/或肽的构件、以及将溶液中的蛋白质和/或肽浓缩的构件。
13.如权利要求12所述的分级装置,是制作用于蛋白质和/或肽的质谱分析的试样的前处理装置。
14.如权利要求13所述的分级装置,蛋白质和/或肽是血液、血清、血浆等的血液来源物、尿、腹水、唾液、泪液、房水、脑脊髓液、羊水、胸水或细胞提取液中含有的蛋白质和/或肽。
15.一种蛋白质和/或肽的分级装置,蛋白质和/或肽接触的基材表面的至少一部分,在浓度为200ng/ml的人β2-微球蛋白和浓度为10μg/ml的牛血清清蛋白形成的蛋白质水溶液与该基材表面接触时,人β2-微球蛋白相对于该基材的吸附量为3ng/cm2以下。
16.如权利要求15所述的分级装置,蛋白质和/或肽接触的基材表面的至少一部分是经过亲水化处理而形成的。
17.如权利要求16所述的分级装置,是在基材表面赋予亲水性高分子而被亲水化处理的。
18.如权利要求17所述的分级装置,亲水性高分子含有羟基。
19.如权利要求18所述的分级装置,亲水性高分子的至少一部分是聚乙烯醇或聚乙烯醇的共聚物。
20.如权利要求19所述的分级装置,聚乙烯醇的共聚物是聚乙烯醇-聚乙酸乙烯酯共聚物。
21.如权利要求20所述的分级装置,聚乙烯醇-聚乙酸乙烯酯共聚物的皂化度为0.70以上、小于1。
22.如权利要求17所述的分级装置,通过在基材表面上接枝亲水性高分子而使基材表面亲水化。
23.如权利要求22所述的分级装置,通过照射放射线来接枝亲水性高分子。
24.如权利要求22所述的分级装置,作为人β2-微球蛋白的吸附量为3ng/cm2以下的基材是膜。
25.如权利要求24所述的分级装置,该膜的形状为中空丝。
26.如权利要求24所述的分级装置,具备供给含有蛋白质和/或肽的溶液的供给构件、从溶液中分离蛋白质和/或肽的构件、以及将溶液中的蛋白质和/或肽浓缩的构件。
27.如权利要求26所述的分级装置,是制作用于蛋白质和/或肽的质谱分析的试样的前处理装置。
28.如权利要求27所述的分级装置,蛋白质和/或肽是血液、血清、血浆等的血液来源物、尿、腹水、唾液、泪液、房水、脑脊髓液、羊水、胸水或细胞提取液中含有的蛋白质和/或肽。
29.一种蛋白质和/或肽的分级装置,具备供给含有蛋白质和/或肽的溶液的供给构件、从溶液中分离蛋白质和/或肽的构件、以及将溶液中的蛋白质和/或肽浓缩的构件,在分级装置中的蛋白质和/或肽接触的基材表面的至少一部分接枝有亲水性高分子。
30.如权利要求29所述的分级装置,亲水性高分子是聚乙烯醇或聚乙烯醇的共聚物,接枝是通过放射线进行的。
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