JPWO2007055178A1 - 細胞の分取方法、及び当該方法に用いる基材 - Google Patents
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Abstract
Description
Visser J.W.M. (1984) Isolation of murine pluripotent hemopoietic stem cells. J. Exp. Med., 59, 1576-1590 Miltenyi S. (1990) High Gradient Magnetic Cell Separation With MACS, Cytometry, 11, 231-238 Greenberg and Hammer: Cell Separation Mediated by Differential Rolling Adhesion, BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, VOL.73, NO.2, APRIL 20, 2001, 111-124
基材には、図4に示すように、内径1mm、外径2mm、長さ100mmのポリエチレン製のチューブ基材を用いた。まず、図4に示すポリエチレン製のチューブ基材に対して、室温の条件でオゾンガスにより4時間処理した。その後、20%のアクリル酸/メタノール溶液中にて60℃、4時間加熱することでポリエチレン表面に対してポリアクリル酸のグラフト鎖を重合した。このグラフト化チューブ基材を、37℃で30分間超音波処理を行なって洗浄した後、0.1Mの1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)溶液に4℃、2時間浸漬して、表面のカルボキシル基を活性化した。
〔提示マーカー密度による分離の検討〕
上記(1)で作製したリガンド提示基材(抗CD34抗体固定化チューブ基材)の性能を検証した。まず、細胞群を分散させた分散液の調製を行なった。CD34陰性細胞である急性白血病由来のHL60細胞と、CD34陽性細胞であるKG−1a細胞をそれぞれリン酸緩衝液に懸濁させ、細胞分散液を調製した。
リガンド提示基材で分離した間葉系幹細胞を用いて骨細胞への分化誘導実験を行った。
Claims (16)
- 特定のレセプターを細胞表面に提示した細胞を含む細胞群から、上記レセプターと一時的に結合するリガンドがグラフト鎖を介して表面に提示されたリガンド提示基材を用いることによって、レセプターの提示密度が所定範囲内である細胞を分取することを特徴とする分取方法。
- 特定のレセプターを細胞表面に提示した細胞を含む細胞群から、上記レセプターと一時的に結合するリガンドがグラフト鎖を介して表面に提示されたリガンド提示基材を用いることによって、レセプターの提示密度に応じて、或る提示密度を有する細胞を、提示密度の高低に従って順次分取することを特徴とする分取方法。
- 上記リガンド提示基材は、上記リガンドによって平滑な表面が形成されており、
上記分取は、上記表面に沿って細胞群を移動させて、上記細胞が上記リガンドと上記結合しながら上記平滑な表面を回転移動することによって行われ、
細胞の移動速度は、提示密度に応じたリガンドとの上記結合の度合いによって減速されることを特徴とする請求項1または2に記載の分取方法。 - 上記細胞群を分散させた分散液を上記平滑な表面に流し、上記細胞が分散液から受けるシェアストレスによって、上記結合を解離させることを特徴とする請求項3に記載の分取方法。
- 上記細胞群を分散させた分散液を、傾斜させた上記平滑な表面に流すことによって、上記細胞に生じる斜面を転がる力を用いて、上記結合を解離させることを特徴とする請求項3または4に記載の分取方法。
- 上記細胞は、幹細胞であることを特徴とする請求項1から5の何れか1項に記載の分取方法。
- 上記リガンドは、サイトカインであることを特徴とする請求項1から6の何れか1項に記載の分取方法。
- 上記サイトカインは、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、ストロマ細胞由来因子1(SDF1)、血小板由来増殖因子(PDGF)、インスリン様増殖因子(IGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、ニューロトロフィン−3(NT−3)、ニューロトロフィン−4(NT−4)、骨形成因子(BMP)、又は、インターロイキン(IL)であることを特徴とする請求項7に記載の分取方法。
- 上記レセプターは、抗原であり、
上記リガンドは、当該抗原に対して抗原−抗体反応を起こす抗体であることを特徴とする請求項1から6の何れか1項に記載の分取方法。 - 上記抗原は、血管内皮前駆細胞の表面の特異的な抗原であり、
上記抗体は、抗CD31抗体、抗CD34抗体、抗CD133抗体、抗CD144抗体、抗Flk−1抗体、抗Flk−2抗体、抗Flk−3抗体、抗Flk−4抗体、抗Flt−1抗体、抗Flt−2抗体、抗Flt−3抗体、抗Flt−4抗体、抗tie−2抗体、抗PECAM抗体、抗VEカドヘリン抗体及び抗VEGF受容体抗体からなる群より選択される少なくとも1種であることを特徴とする請求項9に記載の分取方法。 - 請求項1から10の何れか1項に記載の分取方法に用いる、リガンドがグラフト鎖を介して表面に提示されたリガンド提示基材。
- 上記リガンド提示基材は、管状の基材であり、当該管の内壁に上記リガンドが上記グラフト鎖を介して平滑な表面を形成していることを特徴とする請求項11に記載のリガンド提示基材。
- 上記リガンド提示基材は、溝が形成された平面状の基材であることを特徴とする請求項11に記載のリガンド提示基材。
- 上記溝に上記リガンドが上記グラフト鎖を介して形成されていることを特徴とする請求項13に記載のリガンド提示基材。
- 請求項1から10の何れか1項に記載の分取方法に用いるリガンド提示基材の製造方法であって、
リガンドを提示する前の基材の表面にグラフト鎖を重合する重合工程と、
上記重合工程によって重合された上記グラフト鎖に、リガンドを固定する固定工程とを含むことを特徴とするリガンド提示基材の製造方法。 - 請求項1から10の何れか1項に記載の分取方法に用いるリガンド提示基材を備えた分離装置であって、
上記リガンド提示基材と、
上記リガンド提示基材のリガンド表面を傾斜させるための傾斜手段を備えていることを特徴とする分離装置。
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