JP5780274B2

JP5780274B2 - 細胞回収方法

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Publication number: JP5780274B2
Application number: JP2013158666A
Authority: JP
Inventors: 佐登美吉岡
Original assignee: Seiko Epson Corp
Current assignee: Seiko Epson Corp
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2013-07-31
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2029-03-27
Also published as: JP2013215217A

Description

本発明は、がん細胞を他の細胞と分離することができるがん細胞分離装置およびがん細胞分離方法に関する。

世界各国において、がんはヒトの主要な死因の一つである。がんによる死亡理由のほとんどは、がんの転移による再発によるものである。原発巣からのがんの転移は、がん細胞が血管やリンパ管を経由して別の組織の血管壁に定着した後、浸潤して微小転移巣新を形成することによって成立する。

現在、がんの転移を防ぐ方法として化学療法や放射線療法が広く行われているが（特開２００８−３１０７８６号公報）、効果が不充分な場合もある。

特開２００８−３１０７８６号公報

本発明は、細胞懸濁液中からがん細胞を確実に分離することができるがん細胞分離装置およびがん細胞分離方法を提供する。

本発明の一態様に係るがん細胞分離装置は、
がん細胞と特異的に結合する抗体が固定化された抗体固定化領域を有する流路を含み、
前記流路に導入された細胞懸濁液中におけるがん細胞と他の細胞との移動速度の差を利用して、がん細胞を他の細胞と分離する。

上記がん細胞分離装置において、前記抗体固定化領域は、前記流路の全表面に設けられていることができる。

上記がん細胞分離装置において、前記流路は、第１の部分と、前記第１の部分の一端部から２つに分岐する第２の部分および第３の部分と、を含み、
前記第１の部分の表面のうち前記第２の表面側に、前記抗体が固定化されていない抗体固定化禁止領域が設けられ、
前記第１の部分の表面のうち前記第３の表面側に、前記抗体固定化領域が設けられていることができる。

上記がん細胞分離装置は、第１の電極対および第２の電極対をさらに含み、前記がん細胞および前記他の細胞が、それぞれ前記第１の電極対から前記第２の電極対までを通過するのに要する時間を検出することができる。この場合、上記がん細胞分離装置は誘電泳動電極対をさらに含むことができる。さらにこの場合、上記がん細胞分離装置は、前記時間に基づいて、前記誘電泳動電極対を制御することができる。

本発明の他の一態様に係るがん細胞分離方法は、がん細胞と特異的に結合する抗体が固定化された抗体固定化領域を有する流路に細胞懸濁液を導入し、前記細胞懸濁液中におけるがん細胞と他の細胞との移動速度の差を利用して、がん細胞を他の細胞と分離する工程を含む。

上記がん細胞分離装置によれば、流路に導入された細胞懸濁液中におけるがん細胞と他の細胞との移動速度の差を利用して、がん細胞を他の細胞と分離することにより、細胞自体に加わるダメージが小さいうえに、がん細胞を高精度でかつ選択的に除去することができる。また、がん細胞の分離に際して複雑な構造の流路を必要とせず、単純な構造の流路によってがん細胞を分離できるため、流路製造の際のコストを下げることができる。さらに、流路の表面に固定化させる抗体の種類を適宜選択することにより、幅広い種類のがん細胞の除去に対応することができる。

本発明の一実施形態に係るがん細胞分離装置を模式的に示す断面図。図１に示されるがん細胞分離装置によるがん細胞分離方法を説明する図。本発明の別の一実施形態に係るがん細胞分離装置を模式的に示す断面図。本発明の他の一実施形態に係るがん細胞分離装置を模式的に示す断面図。

以下に、本発明の一実施形態にかかるがん細胞分離装置およびがん細胞分離方法について具体的に説明する。

１．第１実施形態
１．１．がん細胞分離装置の構成およびがん細胞分離方法
図１は、本発明の一実施形態に係るがん細胞分離装置１０を模式的に示す断面図であり、図２は、図１に示されるがん細胞分離装置１０の拡大断面図であって、がん細胞分離装置１０によるがん細胞分離方法を説明する図である。

本実施形態に係るがん細胞分離装置１０は、細胞懸濁液２６中からがん細胞２０を他の細胞（がん細胞以外の細胞）２４と選択的に分離する機能を有する。なお、本明細書において「がん細胞」とは、悪性の腫瘍細胞を意味する。細胞懸濁液２６は少なくとも細胞を含む液であって、がん細胞を含む可能性がある液であり、例えばがん細胞および他の細胞を含む液である。細胞懸濁液２６としては、例えば血液、リンパ液、唾液、尿、涙液等の体液が挙げられる。

本実施形態に係るがん細胞分離装置１０は、流路１１を含む。流路１１は、がん細胞２０と特異的に結合する抗体１３が固定化された抗体固定化領域１２を有する。本実施形態に係るがん細胞分離装置１０では、抗体固定化領域１２は図１および図２に示されるように、流路１１の表面（細胞懸濁液２６と接触する面）全体に設けられている。

がん細胞２０と特異的に結合する抗体１３としては、例えば、がん細胞２０の表面抗原２２に対する抗体が挙げられる。本実施形態に係るがん細胞分離装置１０では、がん細胞２０と特異的に結合する抗体１３として、がん細胞２０の表面抗原２２に対する抗体１３を用いる場合について説明する。この場合、がん細胞２０の表面抗原２２に対する抗体１３は、分離対象のがん細胞２０の種類に応じて選択することができる。例えば、上皮がんに共通の表面抗原に対する抗体としては、Ｅｐ−ＣＡＭ抗体、Ｎ−カドヘリン抗体等が挙げられ、乳がん特有の表面抗原に対する抗体としては、ＨＥＲ２抗体等が挙げられ、大腸がん特有の表面抗原に対する抗体としては、ＮＳ１９−９抗体等が挙げられ、前立腺がん特有の表面抗原に対する抗体としては、ＣＤ４９、ＣＤ５４，ＣＤ５９抗体等が挙げられる。上記に例示されたこれらの抗体を抗体１３として用いることができる。

抗体１３の固定化は、物理吸着による方法または化学結合による方法を用いることができる。化学結合による方法は、確実な固定化を達成できる点で有用である。例えば、表面が水酸基を含む材質からなる場合、抗体中のカルボキシル基を活性エステル化した後、水酸基と該活性エステル基とを反応させることにより、化学結合によって該表面に抗体を固定化させることができる。

本実施形態に係るがん細胞分離装置１０は、流路１１に導入された細胞懸濁液２６中におけるがん細胞２０と他の細胞２４との移動速度の差を利用して、がん細胞２０を他の細胞２４と分離する。

より具体的には、図２に示されるように、がん細胞２０の表面抗原２２は抗体１３と特異的に結合し、流路１１の表面を転がるように移動するため、流路１１内での移動速度が遅い。これに対して、他の細胞２４は抗体１３と結合しないため、がん細胞２０と比較して大きな速度にて流路１１内を移動する。これにより、がん細胞２０と他の細胞２４との間に移動速度の差が生じる。よって、流路１１から所定時間以内に排出されるのが他の細胞２４であり、他の細胞２４から所定時間以降に流路１１から排出されるのががん細胞２０である。したがって、細胞懸濁液２６を流路１１に導入してから所定時間以内に流路１１から排出される細胞を他の細胞２４として回収し、細胞懸濁液２６を流路１１に導入してから所定時間以降に流路１１から排出される細胞をがん細胞２０として回収することにより、がん細胞２０を他の細胞２４と分離することができる。

分離対象となるがん細胞２０としては、例えば循環がん細胞（ＣＴＣ）が挙げられる。このうち、細胞懸濁液２６が血液またはリンパ液である場合、本実施形態に係るがん細胞分離装置１０を用いて、患者から採取した血液またはリンパ液からＣＴＣを除去した後、該血液またはリンパ液を再び患者の体内に戻すことによって、患者のがんの転移を確実に抑えることができる。例えば、血液中からＣＴＣを選択的に分離することにより、ＣＴＣとその他の成分（例えば、赤血球、白血球、血小板等の正常細胞、塩類、アルブミン等の血漿タンパク質、免疫グロブリン等の抗体、血液凝固因子等）とを分離することができるうえ、他の細胞および成分に及ぼすダメージを最小限にすることができる。なお、体液は希釈されたものであってもよい。

また、本実施形態に係るがん細胞分離装置１０を用いたがん細胞（ＣＴＣの除去）を、放射線療法および／または化学療法と併用してもよいし、あるいは、放射線療法または化学療法の代替として用いることもできる。すなわち、本発明の一実施形態に係るがんの治療および／または予防方法は、本実施形態に係るがん細胞分離装置１０を用いて患者から摂取した体液からがん細胞を除去した後、該体液を患者の体内に戻す工程を含む。この場合、該体液を患者の体内に戻す工程は例えば、血液透析と同様の手法を用いることができる。

なお、本実施形態に係るがん細胞分離装置１０を、がん細胞以外の細胞、ウイルス、細菌、タンパク質、低分子〜高分子化合物、粒子、コロイド、例えば花粉等のアレルギー物質、毒物、有害物質、環境汚染物質を液体中から分離するための装置として使用してもよい。また、本実施形態に係るがん細胞分離装置１０を例えば、血液透析、血液浄化、細胞分化誘導、遺伝子導入のための装置、病原菌の除去装置（水浄化フィルター）として使用してもよい。

１．２．作用効果
（ｉ）一般的な細胞分離方法
微量でかつ少量の細胞を分離するために一般に用いられている細胞分離方法では、目的の細胞を染色したり、目的の細胞を粒子と化学結合させたりすることにより、目的の細胞と目的以外の細胞との差異を生じさせたうえで、物理的手法または化学的手法を用いて目的の細胞の分離を行なう。

（ｉｉ）本実施形態に係るがん細胞分離装置１０
これに対して、本実施形態に係るがん細胞分離装置１０によれば、流路１１に導入された細胞懸濁液２６中におけるがん細胞２０と他の細胞２４との移動速度の差を利用して、がん細胞２０を他の細胞２４と分離することにより、細胞に加わるダメージが小さいうえに、がん細胞２０を高精度でかつ選択的に除去することができる。また、がん細胞２０の分離に際して複雑な構造の流路を必要とせず、単純な構造の流路１１によってがん細胞２０を分離できるため、流路製造の際のコストを下げることができる。さらに、流路１１の表面に固定化させる抗体１３の種類を適宜選択することにより、幅広い種類のがん細胞２０の除去に対応することができる。

２．第２実施形態
２．１．がん細胞分離装置の構成および使用方法
図３は、本発明の別の一実施形態に係るがん細胞分離装置１００の一断面を模式的に示す図である。

本実施形態に係るがん細胞分離装置１００は、（ｉ）流路１１０が第１の部分１１０ａと、第１の部分１１０ａの一端部から２つに分岐する第２の部分１１０ｂおよび第３の部分１１０ｃとを含む点、ならびに、（ｉｉ）流路１１０を挟むように、第１の電極対３２ａ，３２ｂ、第２の電極対３４ａ，３４ｂ、および誘電泳動電極対３６ａ，３６ｂがそれぞれ設けられている点で、第１実施形態に係るがん細胞分離装置１０と異なる構成を有する。

本実施形態に係るがん細胞分離装置１００は、上述の第１実施形態に係るがん細胞分離装置１０と同様に、流路１１０に導入された細胞懸濁液２６中におけるがん細胞２０と他の細胞２４との移動速度の差を利用して、がん細胞２０を他の細胞２４と分離する。上記移動速度の差は、物理的手法（例えば、伝導度、インピーダンス、光センシング）で検出することができる。

また、本実施形態に係るがん細胞分離装置１００は、がん細胞２０および他の細胞２４がそれぞれ、第１の電極対３２ａ，３２ｂから第２の電極対３４ａ，３４ｂまでを通過するのに要する時間を検出することができる。なお、本実施形態に係るがん細胞分離装置１００においては、第１の電極対３２ａ，３２ｂから第２の電極対３４ａ，３４ｂを通過する細胞が、がん細胞２０か他の細胞２４かを判定できるように、流路１１０内における細胞懸濁液２６の流速は、１つの細胞が第１の電極対３２ａ，３２ｂから第２の電極対３４ａ，３４ｂを通過するのを検出できる程度に設定することが好ましい。

より具体的には、図３に示されるように、がん細胞２０の表面抗原２２は抗体１３と特異的に結合し、流路１１０の表面を転がるように移動するため、流路１１０内での移動速度が遅い。これに対して、他の細胞２４は抗体１３と結合しないため、がん細胞２０と比較して大きな速度にて流路１１０内を移動する。これにより、がん細胞２０と他の細胞２４との間に移動速度の差が生じる。したがって、がん細胞２０が第１の電極対３２ａ，３２ｂから第２の電極対３４ａ，３４ｂまでを通過するのに要する時間（Δｔ_c）は、他の細胞２４が、第１の電極対３２ａ，３２ｂから第２の電極対３４ａ，３４ｂまでを通過するのに要する時間（Δｔ_n）より長い。

よって、本実施形態に係るがん細胞分離装置１００では、１の細胞が、第１の電極対３２ａ，３２ｂから第２の電極対３４ａ，３４ｂまでを通過するのに要する時間を検出し、かかる移動時間に基づいて、がん細胞２０および他の細胞２４のどちらかであるかを判定する。これにより、がん細胞２０を他の細胞２４と分離することができる。より具体的には、リファレンス細胞が、第１の電極対３２ａ，３２ｂから第２の電極対３４ａ，３４ｂまでを通過するのに要する時間をΔｔ_refとし、１の細胞が第１の電極対３２ａ，３２ｂから第２の電極対３４ａ，３４ｂまでを通過するのに要する時間がΔｔ_refより短い場合、他の細胞２４であると判定する（Δｔ_n＜Δｔ_ref）。一方、１の細胞が第１の電極対３２ａ，３２ｂから第２の電極対３４ａ，３４ｂまでを通過するのに要する時間がΔｔ_refより長い場合、がん細胞２０であると判定する（Δｔ_c＞Δｔ_ref）。Δｔ_refはがん細胞２０の種類および流路１１０内での細胞懸濁液２６の流速等の条件に応じて、実測値に基づいて適宜決定することができる。

また、本実施形態に係るがん細胞分離装置２００によれば、誘電泳動電極対３６ａ，３６ｂが流路１１０の分岐点１１０ｄより前方（第１の部分１１０ａ）に設けられていることにより、各細胞が第１の電極対３２ａ，３２ｂから第２の電極対３４ａ，３４ｂを移動するのに要した時間に基づいて、印加する電圧を制御することによって、各細胞を第２の部分１１０ｂまたは第３の部分１１０ｃへ移動するように制御することができる。

例えば、１の細胞ががん細胞２０の場合、第１の電極対３２ａ，３２ｂから第２の電極対３４ａ，３４ｂを移動するのに要する時間が、他の細胞よりも長い（＞Δｔ_ref）。よって、１の細胞が第１の電極対３２ａ，３２ｂから第２の電極対３４ａ，３４ｂを移動するのに要する時間が長い場合、該１の細胞はがん細胞２０であると判定し、該１の細胞（がん細胞２０）が誘電泳動電極対３６ａ，３６ｂの間を通過する際に誘電泳動電極対３６ａ，３６ｂに所定の電圧を印加することにより、該１の細胞（がん細胞２０）を第３の部分１１０ｃへと移動させる。

一方、１の細胞が他の細胞２４の場合、第１の電極対３２ａ，３２ｂから第２の電極対３４ａ，３４ｂを移動するのに要する時間が、がん細胞２０よりも短い（＜Δｔ_ref）。よって、１の細胞が第１の電極対３２ａ，３２ｂから第２の電極対３４ａ，３４ｂを移動するのに要する時間が短い場合、該１の細胞は他の細胞２４であると判定し、該１の細胞（他の細胞２４）が誘電泳動電極対３６ａ，３６ｂの間を通過する際に誘電泳動電極対３６ａ，３６ｂに所定の電圧を印加することにより、該１の細胞（他の細胞２４）を第２の部分１１０ｂへと移動させる。

なお、第１の電極対３２ａ，３２ｂ、第２の電極対３４ａ，３４ｂ、および誘電泳動電極対３６ａ，３６ｂはいずれもデータ処理部（図示せず）に電気的にまたは光学的に接続されており、第１の電極対３２ａ，３２ｂおよび第２の電極対３４ａ，３４ｂからデータ処理部に送信された情報に基づいて、１の細胞が第１の電極対３２ａ，３２ｂから第２の電極対３４ａ，３４ｂを移動するのに要する時間がデータ処理部で算出され、かかる時間に基づいて、１の細胞ががん細胞２０または他の細胞２４のどちらかであるかがデータ処理部で判定される。次いで、この判定結果に基づいて、がん細胞の種類に応じて所定の電圧が誘電泳動電極対３６ａ，３６ｂに印加される。

また、本実施形態に係るがん細胞分離装置１００によれば、図３に示されるように、第１の部分１１０ａの表面のうち第２の表面１１０ｂに近い側に、抗体１３が固定化されていない抗体固定化禁止領域１４が設けられ、第１の部分１１０ａの表面のうち第３の表面１１０ｃに近い側に、抗体固定化領域１２が設けられている。これにより、第１の部分１１０ａにおいて、がん細胞２０は抗体１３と結合しながら流路１１０の抗体固定化領域１２近傍を移動するのに対して、他の細胞２４は、抗体１３と結合せずに流路１１０内を移動する。これにより、がん細胞２０を第３の部分１１０ｃへと導き、他の細胞２４を第２の部分１１０ｂへと導くことができる。これにより、がん細胞２０と他の細胞２４とをより確実に分離することができる。

３．第３実施形態
３．１．がん細胞分離装置の構成および使用方法
図４は、本発明の他の一実施形態に係るがん細胞分離装置２００の一断面を模式的に示す図である。

本実施形態に係るがん細胞分離装置２００は、流路２１０の第３の部分２１０ｃにも抗体固定化領域１２が設けられている点で、第２実施形態に係るがん細胞分離装置１００と異なる構成を有するが、上記の点以外は第２実施形態に係るがん細胞分離装置１００と同様の構成を有する。よって、本実施形態に係るがん細胞分離装置２００は、第２実施形態に係るがん細胞分離装置１００と同様の作用効果を有する。また、本実施形態に係るがん細胞分離装置２００の使用方法も、第２実施形態に係るがん細胞分離装置１０と同様である。

本実施形態に係るがん細胞分離装置２００は図４に示されるように、上述の第２実施形態に係るがん細胞分離装置１００と同様に、第１の部分２１０ａの表面のうち第２の表面２１０ｂ側に、抗体１３が固定化されていない抗体固定化禁止領域１４が設けられ、第１の部分２１０ａの表面のうち第３の表面２１０ｃ側に、抗体固定化領域１２が設けられている。これにより、第１の部分２１０ａにおいて、がん細胞２０は、抗体１３と結合しながら抗体固定化領域１２近傍を移動するため、がん細胞２０は第３の部分２１０ｃに移動しやすい。その結果、がん細胞２０を第３の部分２１０ｃへとより容易に導くことができる。これにより、がん細胞２０と他の細胞２４とを確実に分離することができる。

さらに、本実施形態に係るがん細胞分離装置２００は、図４に示されるように、流路２１０の第３の部分２１０ｃにも抗体固定化領域１２が設けられている。より具体的には、第３の部分２１０ｃの片側（第１の部分２１０ａにおいて抗体固体化領域１２が設けられている側と同じ側）に抗体固定化領域１２が設けられている。このため、第３の部分２１０ｃにおいても、がん細胞２０は抗体固定化領域１２の抗体と結合しながら移動する。これにより、がん細胞２０を第３の部分２１０ｃへとより確実に導くことができる。

本発明に係る実施の形態の説明は以上である。本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び結果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。

１０，１００，２００…がん細胞分離装置、１１，１１０，２１０…流路、１２…抗体固定化領域、１３…抗体、１４…抗体固定化禁止領域、２０…がん細胞、２２…表面抗原、２４…他の細胞、２６…細胞懸濁液、３２ａ，３２ｂ…第１の電極対、３４ａ，３４ｂ…第２の電極対、３６ａ，３６ｂ…誘電泳動電極対、１１０ａ，２１０ａ…第１の部分，１１０ｂ，２１０ｂ…第２の部分、１１０ｃ，２１０ｃ…第３の部分、１１０ｄ，２１０ｄ…分岐点

Claims

細胞と結合することが可能な抗体が固定された第１の流路と、前記第１の流路から分岐する第２の流路および第３の流路と、を含む細胞分離装置の第１の流路に前記細胞を含む細胞懸濁液を導入するステップと、
前記細胞が、前記第１の流路に設けられた第１の電極対から第２の電極対までを移動する時間を検出するステップと、
前記移動時間に基づいて、前記第１の流路の前記第１の電極対および前記第２の電極対が設けられた位置よりも下流側に設けられた誘電泳動電極対に電圧を印加するステップと、を含むことを特徴とする細胞回収方法
請求項１に記載の細胞回収方法であって、
前記細胞懸濁液が前記第１の流路を移動する時間を基準として、当該時間より長い時間をかけて前記第１の流路を移動する細胞を回収する、細胞回収方法。