JP2012520687A - 循環細胞の捕獲用デバイス - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
過去10年間以上で、CTCは、癌の病気の進行と治療成績のモニタリングと同じように早期の癌転移を検出するための新興の「バイオマーカー」となっている(例えば、非特許文献5参照)。しかしながら、CTCの分離は、血液中の数が多い血液細胞(109細胞/mL)の間で、CTCが極めて低濃度(mL当たり数百分のいくつ程度)な故に、技術的に困難である(例えば、非特許文献4、6、7参照)。
マイクロ流体技術はまた、全血試料からのCTCを捕獲するためにも使用されてきた(例えば、非特許文献8、9参照)。しかし、既存のCTC捕獲システムは、デバイスを介して血流を導入するための複雑な流体取り扱いシステムを必要としている。さらに、これらのシステムは、CTCを分離するために、細胞捕獲のために最適でない微細構造を使用している。
本発明の理解を容易にするために、幾つかの用語やフレーズが下記に定義されている。
本発明の実施態様に係るデバイスは、図1、2A、および2Bに概略的に示されている。デバイス(100および200)には、ナノ構造の表面領域(104と204)を有する基板(102および202)が含まれている。複数の結合剤(106と206)が、前記基板の前記ナノ構造表面領域に付加している。ナノ構造の表面領域は、縦方向寸法と横方向寸法を各々有する複数のナノ構造(ナノ構造108およびナノ構造 208のような)で構成されている。試料は、デバイス上に置かれ、生物学的細胞(110および210)は、結合剤と複数のナノ構造体が連携して作用することによって、選択的に捕獲される。
実施態様において、本発明のデバイスは、試料からの希少細胞を分離するために採用される。いくつかの実施態様では、希少細胞は末梢血からの循環腫瘍細胞である。他の実施態様では、希少細胞は、末梢血に見られる生物(例えば、細菌、ウイルス、原生生物、および菌類)である。さらなる実施態様では、希少細胞は、通常は血液中に検出されない非造血細胞(例えば、内皮細胞や胎児性細胞)、および造血由来の細胞(例えば、血小板、鎌状細胞赤血球、および白血球の亜集団)である。
本明細書に記載する実施例および実施態様は、例示目的のみではなく、その中の記載に照らした様々な変形や変更が当業者に示唆され、この出願の精神と範囲内に含まれている。
SiNW基板の調製と表面改質
ナノ構造の細胞捕獲基板を以下のように調製した。最初に、100〜200nmの直径を持つ密集シリコンナノワイヤー(SiNW)が、湿式化学エッチング法(図2A)を使用してシリコン基板(例えば、1cm× 2cm)上に導入された。シリコン基板の表面は、親水性になるように処理された。シリコン基板は、有機グリースからの汚染を除去するために、それぞれ10分間および5分間、室温でアセトンとエタノール中で超音波処理した。その後、脱脂シリコン基板を沸騰ピラニア溶液(4:1のH2SO4/H2O2(V /V))とRCA溶液(1:1:5のNH3/H2O2/H2O(V / V / V))各々に1時間加熱し、シリコン基板は、脱イオン水(DI)で数回洗浄した。浄化シリコン基板は、ウェットエッチングプロセスによって処理した。テフロン容器が容器として使用され、脱イオン水、HF、および硝酸銀からなるエッチング混合物は、室温で使用された。HFと硝酸銀の濃度は、それぞれ4.6Mと0.2Mであった。エッチング時間は、ナノワイヤーの必要な長さに応じて、可変であった。エッチング後、基板は、銀膜を除去するために15分間:沸騰王水(3:1のHCl/HNO3(V /V))に浸漬した。最後に、基板を、脱イオン水ですすぎ、窒素で乾燥し、表面改質のために準備した。これらの化学エッチングされたSiNWの長さは、異なるエッチング時間を適用することによって制御することができる。その結果、1〜25μmの様々な長さのSiNWを持つ一連のSiNW基板を得ることができた(図2C)。SiNW基板の調製後、NHS −マレイミド化学(図2B)が、SiNWの表面にストレプトアビジンを導入するために採用された。基板は、3−メルカプトプロピルトリメトキシシランの1%エタノール液(V /V)を用い室温で12時間、あるいは3−メルカプトプロピルトリメトキシシランの4%エタノール液(V /V)を用い室温で45分間、修飾された。基板は、それから、カップリング剤N−イマレイミドブチロキシスクシンイミドエステル(N−ymaleimidobutyryloxy succinimide ester)(GMBS、0.25 mM)で30分間処理し、その結果、基板にGMBS付加を行った。次に、基板を、ストレプトアビジンの10μg/mlで室温にて30分間処理し、GMBS上への固定化に導いた。基板は、過剰なストレプトアビジンを除去するために1XPBSで洗い流し、ストレプトアビジンでコートしたSiNW基板を、最大6ヶ月までPBS緩衝液(pH=7.2)中に4℃で保存した。ビオチン化した抗EpCAM(R&D)が、細胞捕獲実験に使用する前に、ストレプトアビジンでコートした基板上に新たに導入された。
SiNW基板と平坦基板上に捕獲された細胞の形態の比較
ナノスケール細胞/基板の相互作用は、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて可視化した。基板固定化細胞の形態を維持するために、試料は、グルタルアルデヒド固定、オスミウム四酸化処理、および脱水によって処理された。簡単に言えば、細胞は、基板上に24時間の培養後、0.1Mカコジル酸ナトリウムで緩衝化された1.5−4%のグルタルアルデヒドで固定(4℃、1時間)した。細胞は、次いで、1%四酸化オスミウムで後固定を1時間行って、1%タンニン酸を媒染剤として使用した。試料は、一連のアルコール濃度(30%、50%、70%および90%)で脱水し、0.5%酢酸ウラニルで染色し、さらに脱水(96%、100%、および100%アルコール)を行った。最後の脱水は、空気の乾燥が続くヘキサメチルジシラザン(HMDS)中で行った。一度乾燥し、試料は、10keVの加速電圧での日立S800電界放射型SEMを用いて試験する前に金でスパッタコーティングした。
細胞捕獲効率に対する捕獲時間の影響
最大細胞捕獲を達成するために必要な最小時間を決定するために、本出願人らは、異なる培養時間で10μmのSiNWと平坦Si−基板(抗EpCAMコーティング付き)の両方の細胞捕獲性能を検討した。三種のEpCAM発現癌細胞(すなわち、MCF7、U87脳癌細胞とPC3前立腺癌細胞)を試験した。図4Aは、培養時間と基板固定化細胞の数との相関関係をまとめたものである。SiNW基板の存在下で、最大の細胞捕獲が調べた細胞の種類に関係なく、45分の培養時間で達成された。45分の時点で、10μmのSiNWは、平坦Si基板と比較して、10倍までの細胞捕獲効率を示している。細胞数の連続的な増加が平坦Si基板に観察されたが、全体的な細胞の捕獲数は、SiNW基板に観察されたものよりも平坦Si基板で有意に低かった。
細胞捕獲効率に対するSiNWの長さの影響
本出願人らは、細胞捕獲実験に、SiNWの長さが 4、6、8、10、および20μmの一連のSiNW基板を利用した。癌細胞株(すなわち、MCF7、U87脳癌細胞、またはPC3前立腺癌細胞)を含む試料は、静的にSiNW基板と平坦基板の上で培養した。 抗EpCAMが、両方の基板上にコートされ、図4Bに示すようにされ、SiNWの縦方向寸法を大きくすると、捕獲された細胞数を増やすことになった。 SiNWの長さが6μmより長くなったとき、最大の細胞捕獲効率を達成した。
スパイクされた全血試料からのCTCの静的捕獲
本出願人らは、静的な細胞捕獲を実行するために本出願人らのデバイスの能力をテストした。人工CTC含有血液試料は、増殖させた緑色蛍光タンパク質(EGFP)発現のU87細胞をウサギの血液中に1000、100および5(細胞/mL血液)の細胞濃度でスパイクすることによって調製した。本スパイク(spiked)試料を10μmEpCAMコーティングSiNWの基板上で45分間培養した。表1に示すように、本出願人らのアプローチは高い捕獲率(>40%)、高い特異性(>40%)および高感度(>90%)を持っている。これらの結果は、本発明のデバイスが、非常に低い感度(約20−60%)および低い特異性(約0.1%)を持つ現在の最先端の技術すなわち免疫磁気ビーズ法よりも大幅にパフォーマンスが優れていることを示している。
無秩序混合のPDMS層の調製
本出願人らは、無秩序混合を生成する流れの層を有する本発明のマイクロ流量デバイスを生み出した(図6A及び6Bを参照)。無秩序混合のPDMS層は、スタンドアロンのソフトリソグラフィ技術により作製した。最初に、本出願人らは二層SU−8のパターンを有する、正のパターンを持つシリコンモールドを作製した。底層が主なマイクロチャネル(高さ100μmで幅2mm)であり、最上層が、ヘリンボーン模様(カオス的混合)のマイクロチャンネル(高さ25μm)である。このヘリンボーン模様構造は、粘性の流れに対し異方性抵抗を作ることができる銃身に旋条を付けることに似ている。 PDMS混合物を注ぎ数時間焼成した後に、ヘリンボーン模様構造を持つPDMS層をマイクロチャネルの上に得る。入口と出口がPDMS層にパンチされた後、1−3μmの厚さの接着PDMS層は、接触印刷によってPDMSブロックに転送され、組み立てデバイスを供する抗EpCAMコートSiNW基板の上に直接付着した。
細胞捕獲効率に対する流量の影響
マイクロ流体デバイスでの最大細胞捕獲数を達成するために必要な最適化された流量を決定するに、本出願人らは、PBSに100細胞/mLで乳癌細胞(すなわち、MCF7)をスパイクし、スパイク癌細胞を捕獲した。マイクロ流体デバイスは、試料瓶に接続された。ビオチン化抗EpCAM(BSA1%およびアジ化ナトリウム0.09%のPBS溶液(W/V)中での10μg/mL)は、マイクロ流体デバイスが溶液で満たされているような試料瓶に充填した。ビオチン化抗EpCAM溶液は、30分間培養し、それからマイクロ流体デバイスをPBSで洗浄した。試料1mLが、目的の流量でマイクロ流体チップを介して圧力をかけられ、PBSで洗浄した。マイクロ流体デバイスは、基板上に捕獲された細胞を固定するために、20分間PBS中4%パラホルムアルデヒド(PFA)で満たされた。捕獲細胞を染色して可視化するために、PFAは、PBS中の0.2%トリトンX−100を用い10分間、続いてDAPI溶液(脱イオン水1mL中1xDAPI試薬)を用いて 5分間で置き換えられた。マイクロ流体デバイスは、PBSで洗浄し、マイクロ流体層を基板から分離された。この基板を、イメージングのために標準的カバーガラスの上に反転した。
異なる癌細胞株に対するEpCAM発現レベルの影響
本発明の実施態様に係るマイクロ流体デバイスを用いたCTC捕獲効率に対するEpCAM発現の効果を決定するために、本出願人らは、細胞当たり約500,000抗原を用いた乳癌MCF7細胞を含め、細胞当たり約50,000抗原を用いた前立腺癌PC3細胞、そして細胞当たり約2,000抗原を用いた膀胱癌T−24細胞の、様々なEpCAM発現をもつ3種の癌細胞株間の捕獲収率を比較した。各細胞株は、100細胞/mLの濃度でPBSにスパイクした。各細胞株でEpCAM発現のさまざまなレベルにもかかわらず、平均捕獲収率はすべてのケースで90%より大であった(図8)。これらの結果は、マイクロ流体デバイスでの細胞とSiNW基板の間で増幅された細胞−基板相互作用によるものである可能性がある。
マイクロ流体デバイスを用いたスパイク試料からのCTC捕獲
マイクロ流体デバイスの細胞捕獲効率をテストするに、人工的なCTC含有血液試料を、5000、1000、500、100および50細胞/mLの細胞密度で健康なドナーの血液中にDiD 染色MCF7(乳癌細胞株)をスパイクすることによって調製した。スパイク試料は、45分間10μmのEpCAMコーティングSiNW基板上で培養した。図8に示すように、本出願人らのマイクロ流体デバイスは、免疫磁気ビーズ法よりもはるかに高い捕獲収率(>90%)を示している。流路中の赤血球の潜在的な空間的障害を評価するために、これらの研究は、健康なドナーからの溶解した血液を用いて繰り返した。全血および溶解した試料を用いて、本出願人らは同様の結果を得た(図9)。
本出願人らのマイクロ流体チップとセルサーチ(TM)技術との捕獲CTC数の比較
実験パラメータの最適化後、本出願人らはUCLAのIRB承認(IRB#09−03−038−01)でUCLAの泌尿器科と共同で転移性前立腺癌患者から採取したCTCの血液試料を用いて臨床試験を実施した。まず、静的な結合条件の下でCTCを捕獲するために、本発明の実施態様に係るデバイスの能力を調べた。簡単に述べると、血液試料は、高度な固形段階(solid−stage)の腫瘍患者(IRBで承認)から採取し、EDTAを含むバキュテナーチューブ(vacutainer tube)に集めた。ビオチン化抗EpCAM(1%BSA(W/V)および0.09%アジ化ナトリウム(W/V)のPBSに10μg/mL溶解)の25μLを1cm ×2cmの基板上に加え、30分間培養した。基板をPBSで洗浄し、試料1mLを基板上に加え、45分間培養(37℃、5%CO2)した。基板を、PBSで洗浄し、捕獲細胞を20分間PBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定した。
本出願人らのデバイスは、静的および流体条件の下で、CTC陽性の患者の検体を同定できたが、セルサーチ(TM)技術は、CTC数をなんら登録できなかった。
試薬
本発明の実施態様を実施するのに使用するのに適した試薬の非限定的例は、次のようなものがある。
1.極上級指向シリコン基板、p型、抵抗率約10−20オーム−cm(シリコンクエストインターナショナル社)。 室温で保存。
2.フォトレジスト(PR)AZ5214(AZエレクトロニックマテリアルズ米国社 (AZ Electronic Materials USA Corp.))。
3.現像液AZ400K(AZエレクトロニックマテリアルズ米国社)。
4.フォトレジストSU8−2100(マイクロケム社(MicroChem Corp.)、米国)。
5.フォトレジスト SU8−2025(マイクロケム社、米国)。
6.現像液SU8(マイクロケム社、米国)。
7.エタノール、>99.5%(シグマ・アルドリッチ社(Sigma−Aldrich))。室温で保存。
8.硫酸、98%(シグマ・アルドリッチ社、#32050−1)。室温で保存。
9.過酸化水素、30%(シグマ・アルドリッチ社、#31698−9)。室温で保存。
10.フッ化水素酸、水中48重量%(シグマ・アルドリッチ社、#339261−100mL)。室温で保存。
11.硝酸銀、>99.8%(シグマ・アルドリッチ社、#S6506−5G)。室温で保存。
12.アセトン、ACS試薬、光学グレード99.5%(フィッシャーサイエンティフィック社(Fisher Scientific)、#AC40010−0040)。室温で保存。
13.イソプロパノール、ACS試薬、光学グレード99.5%(フィッシャーサイエンティフィック社、#AC41279−5000)。室温で保存
14.3−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、95%(シグマ・アルドリッチ社、#175617−25G)。室温で保存。
15.N−イ−マレイミドブチリロキシスクシンイミドエステル(4−マレイミドブチル酸N−ヒドロスクシンイミド、GMBS)、>98%HPLC(シグマ・アルドリッチ社、#63175−25MG−F)。室温で保存。
16.ストレプトアビジン、1mg/mL(インビトロジェン社(Invitrogen)、#SNN1001)。単一使用の分注で−20℃保存。
17.グルタルアルデヒド E.M.グレード、3%(ポリサイエンスズ社(Polysciences))。室温で保存。
18.カコジル酸ナトリウム塩三水和物(シグマ・アルドリッチ社、#C0250−10g)。室温で保存。
19.四酸化オスミウム、ACS試薬、>98%(シグマ・アルドリッチ社、#419494−250mg)。有毒。室温で保管。
20.タンニン酸(エレクトロンマイクロスコピーサイエンスズ)。室温で保管。
21.酢酸ウラニル(エレクトロンマイクロスコピーサイエンスズ)。室温で保管。
22. ヘキサメチルジシラザン(HDMS)(シグマ、#H4875−00mL)。有毒。室温で保存。
23.トリメチルシリルクロライド(TMSCI、>98%、アルファ・エイサー社(Alfa Aesar)、#MFCD00000502)。
24.ポリジメチルシロキサン(PDMS、GE RTV 615)。
25.乳癌細胞株、MCF7(アメリカンタイプカルチャーコレクション)。
26.ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、1×)、液体(高グルコース)、(インビトロジェン社、#11965−118)。
27.ウシ胎児血清(FBS)、標準(フィッシャーサイエンティフィック社、#BW14−502F)。−20℃で保存。
28.ペニシリン−ストレプトマイシン、100×(フィッシャーサイエンティフィック社、#ICN1670049)。−20℃で保存。
29.クエン酸化全ウサギ血(コロラド血清社(Colorado Serum Company))。
30.ビブラント(Vybrant)(登録商標)DiD細胞標識溶液(インビトロジェン社、#11330−057)。4℃で保存。
31.ダルベッコのリン酸塩緩衝液(PBS)(インビトロジェン社、#14190250)。4℃で保存。
32.R&D製品マニュアルに従い10μg/mLに希釈したビオチン化抗ヒトEpCAM / TROP1抗体(ヤギIgG、R&D)。単一使用分注で−20℃に保存。
33.ラボ−テックチャンバースライド(Lab−Tek Chamber slide) 4穴ガラス製、滅菌(サーモフィッシャーサイエンティフィック、#177399)。室温で保存。
34.PBSで20μg/mLに希釈したサイトケラチン抗サイトケラチンPE(CAM5.2、フィコエリスリンとのコンジュゲート)(ビーディーバイオサイエンス社(BD Biosciences)、#347204)。単一使用分注で−20℃に保存。
35.PBSで20μg/mLに希釈したFITC抗ヒトCD45、Ms IgG1、クローンH130(ビーディーバイオサイエンス社、#555482)。単一使用分注で−20℃に保存。
36.1×PBS緩衝液(すすぎ剤)。4℃で保存。
37.1×PBS中の1%DAPI(核染色剤)。4℃で保存。
38.1×PBS中の4%パラホルムアルデヒド(固定剤)。4℃で保存。
39.ウシ血清アルブミン(BSA)(シグマ)。4℃で保存。
40.トリトンX−100。4℃で保存。
本発明の実施態様の実践方法
本発明の実施態様を作り実践するための方法の非限定的な例は次のとおりである。
1.シリコン基板を1cm×2cmの面積を有するシリコン基板部分にカットする。
2.カットシリコン基板をアセトン中10分間室温で超音波洗浄し、窒素ガス下でそれを乾燥する。次に、基板をエタノール中5分間室温で超音波洗浄し、窒素ガス下で乾燥する。これらの手順は、シリコン基板から汚れ(有機グリースなどのようなもの)を取り除く。
3.シリコン基板の表面をエッチングするために、まず熱沸騰ピラニア溶液(4:1のH2SO4/H2O2(V/V))中でシリコン基板を1時間加熱する。その後、基板を沸騰RCA(1:1:5のNH3/H2O2/H2O(V/V))溶液中で1時間加熱する。脱イオン水で基板を5回すすぐ。次に、シリコン基板をテフロン容器に置いて、エッチング液(4.6M HF、0.2M硝酸銀の脱イオン水溶液)で基板を50℃でエッチングする。
4.基板を沸騰王水(3:1のHCl/HNO3(V/V))に15分間浸す。
5.基板を脱イオン水ですすぎ、窒素ガス下で乾燥させる。
2.基板を 0.25mMのN−マレイミドブチリロキシスクシンイミドエステル(GMBS)で処理し、室温で30分間培養する。
3.基板を10μg/mLのストレプトアビジン(SA)で処理し、室温で30分間培養する。
4.過剰のストレプトアビジンを除去するために基板を1×PBSで洗い流す。
5.修飾基板は、最大6ヶ月間まで4−8℃で保存する。
2.細胞を4%グルタルアルデヒドの0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で固定し、細胞を4℃で1時間培養する。その後、1%四酸化オスミウムを用いて1時間細胞を固定する。媒染剤として1%タンニン酸を使用する。
3.一連のアルコール濃度(30%、50%、70%、および90%)で試料を脱水する。脱水後、0.5%酢酸ウラニルで試料を染色する。さらに一連のより高濃度のアルコール(96%、100%、および100%)を通し試料を脱水する。最終的にヘキサメチルジシラザン(HMDS)で試料を脱水する。
4.試料を空気乾燥する。
5.一度乾燥し、試料を金でスパッタコーティングし、電界放射型SEM(10keVの加速電圧)で調べる。
2.1000−1250、80−100、および5−20細胞/mLの細胞密度でウサギ血液中に染色したMCF7細胞をスパイクすることによって、コントロール試料を調製する。
2.各基板上に1mLのコントロール試料をロードする。
3.デバイス一式を45分間培養する(37℃、5%CO2)。
4.基板をPBSで少なくとも5回穏やかに洗う。
5.4%のパラホルムアルデヒド(PFA)のPBS溶液で基板上の捕獲細胞を20分間固定する。
6.捕獲細胞を染色して可視化するために、基板を0.2%トリトンX-100のPBS溶液0.9mLで10分間処理する。基板をDAPI溶液(蒸留水1mL中1×DAPI試薬)で5分間培養する。基板をPBSで3回洗浄する。標準のカバーガラス上に基板を反転する。
7.ニコンTE2000蛍光顕微鏡を用いて、細胞を画像に撮ってカウントする。
8.二元染色(赤:DiD+と青:DAPI+)を示し表現型の形態学的特徴を満たす細胞は、CTCとして保存する。色、明るさ、および細胞の大きさ、形状、そして核の大きさを含む形態学的特性が、潜在的なCTCを識別し、細胞残渣と非特異細胞を除外するために採用される。DAPI+のみでカウントされる細胞は、非特異的細胞である。
9.これらの手順は、血液試料調製の効率を最大にするものである。
2.高度な固形段階の腫瘍(IRBで承認された)を持つ患者から採取した血液試料が、抗凝固剤ETDAを含むバキュテナーチューブに収集される。試料は収集後すぐに処理されねばならない。
3.細胞を捕獲するために、各SiNP基板上に、患者試料の1mLをロードする。デバイス一式を45分間培養する(37℃、5%CO2)。少なくとも5回PBSで基板を穏やかに洗浄する。
4.4%パラホルムアルデヒド(PFA)のPBS溶液200μLを各基板上に室温で20分間ロードすることによって、基板上に捕獲された細胞を固定する。各基板をPBSで3回洗浄する。
5.室温で30分間0.3%トリトンX−100のPBS溶液200μLで各基板を処理することにより細胞を透過処理する。引き続き、PBSで各基板を3回洗浄する。
6.ブロッキング溶液(5%正常ヤギ血清、0.1%Tween20、3%BSAのPBS溶液)の200μLを各基板に加え、室温で1時間培養する。次に、蛍光標識抗体溶液(初期濃度20μL/1mL)の200μLを各基板へ加え、4℃で一晩暗所にて基板を培養する。200μLのPBSで3回洗浄する(最初の洗浄は室温で15分間、2番目と3番目の洗浄は室温で5分間)。DAPI溶液(10μg/mL)で基板を5分間培養する。各基板をPBSで3回洗浄する。
7.イメージングのための準備にカバーガラスの上に、ピンセットを使用して、基板をゆっくりと反転させる。
1.1.最適化された露光時間は、
1.1.1.DAPI(青)フィルタ:50msの露光時間(背景:約1300)、
1.1.2.FITC(緑)フィルタ:300msの露光時間(背景:約1600)、
1.1.3.TRITC(赤)フィルタ:100msの露光時間(背景:約1300)。
1.2.デジタイザは1MHzに設定する必要がある。その他の設定は、緑色フィルタで非常に高いバックグラウンドが生じる。
2.1.基板の右上隅でスタートし、4×または10×倍率で直径約7−20μmの核を求めスキャンする。
2.2.推定の細胞が突き止められたら、倍率を10×または20×に上げる。顕微鏡のマウスを使用して、DAPI、TRITCおよびFITCの蛍光下で蛍光強度を確認する。バックグラウンドの蛍光強度の2倍を超える試料の蛍光強度が、陽性結果として記録される。
3. 二元染色(赤:抗サイトケラチンPE+、および青:DAPI+)を示し、標準的な表現型と形態学的特徴を満たす細胞が、CTCとして記録されねばならない。二元染色(緑:抗CD45 FITC+、および青:DAPI+)を示す細胞は、リンパ球/非特異的細胞として除外する必要がある。すべての3つのフィルタ(緑+と赤+と青+)で染色を示すものは、細胞残渣として除外する必要がある。
2.基板の乾燥:基板を風で乾燥し、150℃で5分間ホットプレートの上に置く。
3.基板上にAZ5214を注ぐ。
4.基板を1000rpmで1分間回転する。
5.基板を100℃で1分間弱く焼く。
6.基板を56mJ/cm2の紫外線に曝す。
7.現像液の準備:AZ400K:水=1:3。
8.現像液でAZ5214を現像する。
9.製品に風を送り乾燥させる。
10.100℃で5分間AZ5214を強く焼く。
11.AZ5214でパターニングしたシリコン基板の表面をエッチングするために、シリコン基板をテフロン容器の中に置いて、基板をエッチング混合液(4.6モルHF、0.2モル硝酸銀の脱イオン水液)を用い50℃でエッチングする。
12.基板を沸騰王水(3:1のHCl/HNO3(V/V))に15分間浸す。
13.基板を脱イオン水ですすぎ、窒素ガス下で乾燥させる。
2.基板の乾燥:基板を風で乾燥し、150℃で5分間ホットプレート上に置く。
3.基板上にSU8−2100を注ぐ。
4.基板を3000rpmで1分間回転させる。
5.基板を15分間95℃で弱く焼く。
6.基板を 320mJ/cm2で紫外線に曝す。
7.基板を 95℃で10分間の後焼きをする。
8.SU−8現像液でSU8−2100を現像する。
9.製品を風で乾燥する。
10.SU8−2100を5分間150℃で強く焼く。
11.基板上にSU8−20250を注ぐ。
12.基板を2000rpmで1分間を回転させる。
13.基板を95℃で8分間弱く焼く。
14.基板を250mJ/cm2の紫外線に曝す。
15.基板を95℃で5分間の後焼きをする。
16.SU−8現像液でSU8−2025を現像する。
17.製品を風で乾燥する。
18.SU8−2025を150℃で10分間強く焼く。
2.シリコンモールド上によく混合したPDMSプレポリマー(GE RTV 615AおよびBの合計20g、混合比A:B =10:1)を注ぐ。
3.プレポリマーを80℃で48時間焼く。
4.シリコンモールドからPDMS層を剥離して、入口用と出口用の穴をパンチする。
5.マイクロ流体チップを形成するために、ストレプトアビジンコートのSiNP基板上にPDMS層をクラップ又はぽんぽんと叩く(clap)。
2.1000−1250、80−100、および5−20細胞/mLの細胞密度でウサギの血液中に染色MCF7細胞をスパイクすることによって、コントロール試料を準備する。
2.所望の流量でマイクロ流体チップを介して人工血液試料の1mLに圧力をかける。
3.マイクロ流体チップをPBS100μLで穏やかに洗浄する。
4.基板上に捕獲された細胞を固定するために4%パラホルムアルデヒド(PFA)のPBS溶液でマイクロ流体チップを20分間いっぱいに満たす。
5.捕獲細胞を染色して可視化するために、0.2%トリトンX−100のPBS液でPFAを置換し10分間培養する。
6.DAPI溶液(脱イオン水1mL中1×DAPI試薬)でトリトンX−100を5分間置換する。
7.マイクロ流体チップをPBS200μLで洗浄する。
8.基板からマイクロ流体層をアンクラップ又は叩いてはずし(unclap)、標準のカバーガラス上に基板を反転させる。
9.ニコンTE2000蛍光顕微鏡を用いて、細胞の画像を撮って数を数える。
10.二元染色(赤:DID+、および青:DAPI+)を示し表現型の形態学的特徴を満たす細胞はCTCとして数える。色、明るさ、および細胞の大きさ、形状、そして核の大きさなどの形態学的特性は、潜在的なCTCを識別するために、また細胞残渣と非特異細胞を除外するために、採用される。DAPI+のみによる細胞数は、非特異的細胞である。
2.流量(1mL/時間)でマイクロ流体チップを介して患者血液試料の1mLに圧力をかける。
3.マイクロ流体チップを100μLのPBSで穏やかに洗浄する。
4.20分間、基板上に捕獲された細胞を固定するために4%パラホルムアルデヒド(PFA)のPBS溶液でマイクロ流体チップを完全に満たす。
5.捕獲細胞を染色して可視化するために、0.2%トリトンX−100のPBS液でPFAを置換し、10分間培養する。
6.次に、蛍光標識抗体溶液(初期濃度20μL/1mL)の100μLでマイクロ流体チップを満たし、一晩4℃暗所でマイクロ流体チップを培養する。1mL/時間の流量で200μLのPBSにてマイクロ流体チップを洗う。
7.マイクロ流体チップにDAPI(脱イオン水1 mLに1×DAPI試薬)溶液の100μLを満たして、5分間培養する。200μLのPBSでマイクロ流体チップを洗浄する。
8.基板からマイクロ流体層を叩いてはずしし、標準のカバーガラス上に基板を反転させる。
1.1.最適化された露光時間は、
1.1.1.DAPI(青)フィルタ:50msの露光時間(背景:約1300)、
1.1.2.FITC(緑)フィルタ:300msの露光時間(背景:約1600)、
1.1.3.TRITC(赤)フィルタ:100msの露光時間(背景:約1300)。
1.2.デジタイザは1MHzに設定する必要がある。その他の設定は、緑色のフィルタで非常に高いバックグラウンドが生じる。
2.顕微鏡に試料を配置し、基板の端に焦点を合わせる。ピントが合ったら、DAPIにフィルタを切り替える。
2.1.基板の右上隅から始め、4×または10×の倍率で直径約7−20μmの核をスキャンする。
2.2.推定の細胞を探したら、倍率を10×または20×に上げる。顕微鏡のマウスを使用して、DAPI、TRITC、およびFITC蛍光下で蛍光強度を調べる。試料の蛍光強度がバックグラウンドの蛍光強度の2倍を超えているものを、陽性結果としてスコアする。
3.二元染色(赤:抗サイトケラチンPE+、青:DAPI+)を示し標準的な表現型および形態学的特徴を満たす細胞は、CTCとして数える。 二元染色(緑:抗CD45 FITC+、青:DAPI+)を示す細胞は、リンパ球/非特異的細胞として除外する必要がある。3つのフィルタ(緑+と赤+と青+)すべてで染色を示すものは、細胞残渣として除外する必要がある。
本明細書に引用の参考文献は、便宜上、以下にリストされている。
Claims (63)
- 生物学的な細胞を捕獲するデバイスであって、
ナノ構造表面領域を含む基板と、
前記基板の前記ナノ構造表面領域に付加された複数の結合剤、
ここで、前記ナノ構造の表面領域が、縦方向寸法と横方向寸法を各々有する複数ナノ構造体を含み、前記縦方向寸法が少なくとも横方向寸法の10倍よりも大きく、且つ、生物学的細胞が、前記結合剤と前記複数ナノ構造体の協同的な作用によって選択的に捕獲される、
とを含む生物学的細胞の捕獲用デバイス。 - 前記基板が、シリコン基板であり、前記複数ナノ構造体がシリコンナノワイヤーやナノファイバーであることを特徴とする、請求項1に記載のデバイス。
- 前記基板が、金属基板であり、前記複数ナノ構造体が金属ナノワイヤーやナノファイバーであることを特徴とする、請求項1に記載のデバイス。
- 前記金属基板が、チタン、アルミニウムまたはスチールの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項3に記載のデバイス。
- 前記基板が、無機酸化物基板であり、前記複数ナノ構造体が無機酸化物ナノワイヤーやナノファイバーであることを特徴とする、請求項1に記載のデバイス。
- 前記無機酸化物基板が、酸化亜鉛、酸化ケイ素、酸化チタン、または酸化アルミニウムの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項5に記載のデバイス。
- 前記基板が、高分子基板であり、前記複数ナノ構造体が高分子ナノワイヤーやナノファイバーであることを特徴とする、請求項1に記載のデバイス。
- 前記高分子基板が、ポリメチルメタクリレート、多糖類、またはポリ乳酸の少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項7に記載のデバイス。
- 前記ナノワイヤーまたはナノファイバーが、前記基板のバルク部と一体であることを特徴とする、請求項2〜8のいずれかの一項に記載のデバイス。
- 前記ナノワイヤーまたはナノファイバーが、前記基板の上に取り付けられていることを特徴とする、請求項2〜9のいずれかの一項に記載のデバイス。
- 前記縦方向寸法が少なくとも6μm長であることを特徴とする、請求項1から10のいずれかの一項に記載のデバイス。
- 前記横方向寸法が、30nmより大きくかつ400nmよりも小さいことを特徴とする、請求項1〜11のいずれかの一項に記載のデバイス。
- 前記基板のナノ構造表面領域が、ストレプトアビジンでコーティングされていて、前記結合剤が、ビオチン化されてストレプトアビジンでコーティングされた前記基板の前記ナノ構造表面領域に接続されていることを特徴とする、請求項1〜12のいずれかの一項に記載のデバイス。
- 前記複数の結合剤が、DNA、ペプチド、アプタマー、及び抗体の一つ以上を含むことを特徴とする、請求項1〜13のいずれかの一項に記載のデバイス。
- 前記複数の結合剤が、腫瘍細胞に対して過剰発現された複数の抗体を含むことを特徴とする。請求項1〜13のいずれかの一項に記載のデバイス。
- 前記複数の結合剤が、複数の抗上皮細胞接着分子抗体(抗EpCAM)であることを特徴とする、請求項1〜13のいずれかの一項に記載のデバイス。
- 前記複数の結合剤が、免疫細胞に対する複数の抗体であることを特徴とする、請求項1〜13のいずれかの一項に記載のデバイス。
- さらに、前記基板のナノ構造表面領域の少なくとも一部分が操作中に前記マイクロ流体チャンネルを介して流れる流体と接触するようなマイクロ流体チャンネルを形成するために前記基板に接続されているフロー層を含む、ここで生物学的細胞を捕獲するための前記デバイスがマイクロ流体デバイスである、ことを特徴とする、請求項1〜17のいずれかの一項に記載のデバイス。
- 前記フロー層が、生物学的細胞が前記基板のナノ構造表面領域に接触して捕獲されるようになる確率を高めるために無秩序流れを生じさせるテクスチャ表面からなることを特徴とする、請求項18に記載のデバイス。
- 前記テクスチャ表面が、流体の流れの主方向に相関的な配向になされている複数の構造体を含むことを特徴とする、請求項19に記載のデバイス。
- 前記複数の構造体が、ヘリンボーン模様に配向していることを特徴とする、請求項20に記載のデバイス。
- 前記フロー層が、エラストマー性ポリマーからなることを特徴とする、請求項18から21のいずれかの一項に記載のデバイス。
- 前記エラストマー性ポリマーが、シリコーンポリマー、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、及びポリテトラフルオロエチレン(テフロン)の一つ以上からなることを特徴とする、請求項22に記載のデバイス
- 生物学的細胞を捕獲するためのマイクロ流体デバイスであって、
ナノ構造の表面領域を含む基板と、
前記基板の前記ナノ構造表面領域の少なくとも一部分が、操作時には前記マイクロ流体チャネルを介して流れる流体と接触しているようなマイクロ流体チャネルを形成するように前記基板に付着されているフロー層と、
前記基板の前記ナノ構造表面領域に付着した複数の結合剤と、を含み、
ここで、前記ナノ構造表面領域が、縦方向寸法と横方向寸法を各々持つ複数のナノ構造体を含んでおり、また、
ここで、生物学的細胞が、前記結合剤と前記複数のナノ構造体が協同して作用することで選択的捕獲されるマイクロ流体デバイス。 - 前記基板が、シリコン基板であり、前記ナノ構造体が、複数のシリコンナノワイヤーまたはナノファイバーであることを特徴とする、請求項24に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記基板が金属基板であり、前記複数のナノ構造体が金属ナノワイヤーまたはナノファイバーであることを特徴とする、請求項24に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記金属基板が、チタン、アルミまたはスチールの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項26に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記基板が、無機酸化物の基板であり、前記複数のナノ構造体が無機酸化物のナノワイヤーまたはナノファイバーであることを特徴とする、請求項24に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記無機酸化物の基板が、酸化亜鉛、酸化ケイ素、酸化チタンまたは、酸化アルミニウムの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項28に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記基板が、高分子基板であり、前記複数のナノ構造体が高分子ナノワイヤーまたはナノファイバーであることを特徴とする、請求項24に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記高分子基板が、ポリメチルメタクリレート、多糖類、またはポリ乳酸の少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項30に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記ナノワイヤーまたはナノファイバーが、前記基板のバルク部と一体であることを特徴とする、請求項25〜31のいずれかの一項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記ナノワイヤーまたはナノファイバーが、前記基板の上に沈積されていることを特徴とする、請求項25〜32のいずれかの一項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記縦方向寸法が、少なくとも6μm長であることを特徴とする、請求項24〜33のいずれかの一項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記横方向寸法が、30nmよりも大きく400nmよりも小さいことを特徴とする、請求項24〜34のいずれかの一項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記ナノ構造表面領域が、ストレプトアビジンでコーティングされていて、前記結合剤が、ビオチン化されていてストレプトアビジンでコーティングされた前記ナノ構造表面領域に付着されていることを特徴とする、請求項24〜35のいずれかの一項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記複数の結合剤が、DNA、ペプチド、アプタマー、及び抗体の一つ以上を含むことを特徴とする、請求項24〜36のいずれかの一項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記複数の結合剤が、腫瘍細胞に対する複数の過剰発現抗体を含むことを特徴とする、請求項24〜36のいずれかの一項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記複数の結合剤が、複数の抗上皮細胞接着分子抗体(抗EpCAM)であることを特徴とする、請求項24〜36のいずれかの一項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記複数の結合剤が、免疫細胞に対する複数の抗体であることを特徴とする、請求項24〜36のいずれかの一項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記フロー層が、前記生物学的細胞が前記ナノ構造表面領域と接触して捕獲されるようになる、確率を高めるために無秩序流れを起こすテクスチャ表面を、含むことを特徴とする、請求項24に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記テクスチャ表面が、流体流れの主方向に相関的に配向した複数の構造体を含むことを特徴とする、請求項41に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記複数の構造体が、ヘリンボーン模様に配向していることを特徴とする、請求項42に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記フロー層がエラストマー性ポリマーを含むことを特徴とする、請求項24〜43のいずれかの一項に記載のデバイス。
- 前記エラストマー性ポリマーが、シリコーンポリマー、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、及びポリテトラフルオロエチレン(テフロン)の一つ以上を含むことを特徴とする、請求項44に記載のデバイス。
- さらに、流体入力マイクロチャンネルを含んでなることを特徴とする、請求項24〜45のいずれかの一項に記載のデバイス。
- さらに、マイクロ流体デバイスと流体接続したポンプを含んでなることを特徴とする、請求項24〜46のいずれかの一項に記載のデバイス。
- 細胞試料から生物学的細胞を選択的に単離する方法であって、
結合剤が生物学的細胞の亜集団を選択的に結合することを許す条件の下で請求項1〜47のいずれかの一項のデバイスに細胞試料を接触させて、その結果、結合した生物学的細胞となる工程、および
デバイスから非結合の生物学的細胞を除去する工程、とからなる
細胞試料から生物学的細胞を選択的に単離する方法。 - さらに、捕獲した生物学的細胞を水性媒体で洗浄する工程を含むことを特徴とする、請求項48に記載の方法。
- 細胞試料が、体液、血漿、唾液、髄液、および尿の一つ以上を含むことを特徴とする、請求項48または49に記載の方法。
- 生物学的細胞の亜集団が、循環腫瘍細胞を含むことを特徴とする、請求項48〜50のいずれかの一項に記載の方法。
- 細胞試料から少なくとも一つの標的生物学的細胞を選択的に単離する方法であって、
少なくとも一つの標的生物学的細胞を含む細胞試料を提供すること;および
標的生物学的細胞が捕獲されることになるように、複数のナノ構造体に細胞試料を接触させること、からなり、
ここで、標的生物学的細胞に特異的にそして結合する複数の結合剤が、ナノ構造体に接続されていて;
標的生物学的細胞がナノ構造体に接続された結合剤に結合し、結果として結合生物学的細胞を得ることができる、効果的な条件下になる方法。 - さらに、結合生物学的細胞を水性媒体で洗浄することを含むことを特徴とする、請求項52に記載の方法。
- さらに、標的生物学的細胞の存在を検出することを含むことを特徴とする、請求項52または53に記載の方法。
- 細胞試料が、体液、血漿、唾液、髄液、および尿の一つ以上を含むことを特徴とする、請求項52〜54のいずれか一項に記載の方法。
- 標的生物学的細胞が、循環腫瘍細胞を含むことを特徴とする、請求項52〜55のいずれかの一項に記載の方法。
- 複数の結合剤が、DNA、ペプチド、アプタマー、及び抗体の一つ以上を含むことを特徴とする、請求項52〜56のいずれかの一項に記載の方法。
- 前記複数の結合剤が、腫瘍細胞に対して複数の過剰発現された抗体を含むことを特徴とする、請求項52〜56のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の結合剤が、複数の抗上皮細胞接着分子抗体(抗EpCAM)であることを特徴とする、請求項52〜56のいずれかの一項に記載の方法。
- 前記複数の結合剤が、免疫細胞に対する複数の抗体であることを特徴とする、請求項52〜56のいずれかの一項に記載の方法。
- 請求項1〜47のいずれかの一項に記載のデバイスを含む、細胞試料から少なくとも一つの標的生物学的細胞を単離するのに有用なキット。
- さらに、哺乳動物被験体から試料を採取し、試料から生物学的細胞を単離するための指示を含むことを特徴とする、請求項61に記載のキット。
- 標的生物学的細胞が、循環腫瘍細胞を含むことを特徴とする、請求項61または62に記載のキット。
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