JP2017158484A - ナノワイヤデバイス、該ナノワイヤデバイスを含む分析装置、サンプルの加熱処理方法及びサンプルの分離方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】絶縁性基板2、絶縁性基板2上に、少なくとも一部が積層された導電体層3、導電体層3上に形成されたナノワイヤ4及び、導電体層3に接する様に又は導電体層3上に形成された一対の電極5、を含む、ナノワイヤデバイス1。ナノワイヤ4が捕捉対象サンプルを特異的に認識するペプチド及び/又は核酸で修飾されており、加熱によりナノワイヤ4から前記ペプチドが離脱するナノワイヤデバイス1。
【選択図】図1
Description
該絶縁性基板上に、少なくとも一部が積層された導電体層、
該導電体層上に形成されたナノワイヤ、及び、
前記導電体層に接するように形成された一対の電極、
を含むナノワイヤデバイス。
(2)前記導電体層が、前記絶縁性基板上に積層され、
前記一対の電極が、前記導電体層の上に形成されている、
上記(1)に記載のナノワイヤデバイス。
(3)前記一対の電極が前記絶縁性基板上に形成され、
前記導電体層の一部が前記一対の電極の上に積層され、前記導電体層の他の部分が前記絶縁性基板上に積層されている、
上記(1)に記載のナノワイヤデバイス。
(4)前記ナノワイヤが、捕捉対象サンプルを特異的に認識するペプチド及び/又は核酸で修飾されている、
上記(1)〜(3)の何れか一に記載のナノワイヤデバイス。
(5)前記ペプチドが、加熱によりナノワイヤから離脱するペプチドである、
上記(4)に記載のナノワイヤデバイス。
(6)上記(1)〜(5)の何れか一に記載のナノワイヤデバイス、
分析部、
を含む分析装置。
(7)上記(1)〜(4)の何れか一に記載のナノワイヤデバイスと、サンプルが含まれる溶液とを接触させるサンプル接触工程、
前記ナノワイヤデバイスの一対の電極に通電することで、導電体を介してナノワイヤを加熱するナノワイヤ加熱工程、
加熱したナノワイヤでサンプルを加熱処理するサンプル加熱処理工程、
を含む、サンプルの加熱処理方法。
(8)上記(5)に記載のナノワイヤデバイスと、捕捉対象サンプルが含まれる溶液とを接触させるサンプル捕捉工程、
前記ナノワイヤデバイスの一対の電極に通電することで、導電体を介してナノワイヤを加熱するナノワイヤ加熱工程、
ナノワイヤを加熱することで、捕捉対象サンプルを捕捉したペプチドをナノワイヤから離脱させるサンプル離脱工程、
を含む、サンプルの分離方法。
また、導電体を介してナノワイヤ自身が加熱することから、従来のビーズを用いた分離方法と比較して、操作性が向上する。
(a)触媒を導電体層3上に堆積する。
(b)SiO2、Li2O、MgO、Al2O3、CaO、TiO2、Mn2O3、Fe2O3、CoO、NiO、CuO、ZnO、Ga2O3、SrO、In2O3、SnO2、Sm2O3、EuO等の材料を用い、パルスレーザーデポジション、VLS(Vapor−Liquid−Solid)法等の物理蒸着法でナノワイヤ4を形成する。なお、触媒を用いて作製するナノワイヤ4は、分岐鎖を有しないナノワイヤであってもよいし、分岐鎖を有するナノワイヤであってもよい。
[デバイス1の作製]
以下の手順によりデバイス1を作製した。
(1)DCスパッタ装置(SC−701MkII ADVANCE、Sanyu Denshi)を用いて、シリコン基板(アドバンテック社製)上に、Al2O3を3wt%ドープした酸化亜鉛(ZnO)を約100nmの厚さとなるように積層した。
(2)次に、ナノワイヤ4を形成する部分にマスクをした後、上記のスパッタ装置を用い、チタン(Ti)を10nm、その上に白金(Pt)が100nmとなるように積層することで、一対の電極を作製した。電極の作製後は、マスクを除去した。
(3)50mLビーカーにヘキサメチレンテトラミン0.225gと、硝酸亜鉛6水和物0.476gを入れて撹拌し、ナノワイヤ成長液を作製した。
(4)上記(2)で作製したシリコン基板を、上記(3)で作製したナノワイヤ成長液に浸漬し、95℃で3時間、水熱合成することで、一対の電極の間のZnO層(導電体層)上にナノワイヤを形成した。
実施例1で作製したデバイス1の一対の電極5の部分を導電性のクリップで挟み、クリップを電源(ALINCO社製DM−305MV)に接続した。また、接触型温度計(testo社製905−T2)をナノワイヤ4に当接させ、一対の電極5に印加する電流の大きさを変化させた時のナノワイヤ4の温度を測定した。図5は、印加する電流の大きさとナノワイヤの温度の関係を示すグラフである。図5に示すように、印加する電流を大きくするほどナノワイヤ4の温度は、ほぼ直線状に高くなることが明らかとなった。したがって、ナノワイヤ4の温度は、印加する電流の大きさにより調整することができる。
サンプルとして枯草菌(ATCC社)を準備し、定法によりODが0.4になるまで培養した。細菌の生死を検出する蛍光試薬(Invitrogen社製:LIVE/DEAD(登録商標)BacLight(登録商標) Bacterial Viability Kit)を用い、細胞膜透過性の異なる2つの核染色試薬であるSYTO 9(生細胞検出用)、及びPI(死胞検出用)を同時染色した。
次に、核染色試薬で染色した細胞をピペットでデバイス1の上に滴下し、40mAの電流を30秒印加した。
図6はデバイス1の加熱前後のサンプルの蛍光写真である。加熱前には、生細胞の蛍光を確認できた。一方、加熱後は生細胞の蛍光は確認できなかったが、死細胞の蛍光を確認した。
以上の結果から、本発明のデバイス1は、細胞等の加熱処理(加熱滅菌)等に使用できることを確認した。
<実施例2>
次に、サンプルの分離実験を行った。なお、ペプチドが離脱する温度を調べる際に、ナノワイヤ4の周囲にサンプル液がある状態では、接触型温度計を用いてナノワイヤ4の温度を測定することは困難である。そのため、サンプルの分離実験は、ペプチドで修飾したナノワイヤ4への大腸菌の捕捉実験と、蛍光色素で標識したペプチドを修飾したビーズを加熱した際のペプチドの離脱の2通りの実験で、サンプルの分離について検証した。
以下の手順で、実施例2のデバイス1を作製した。
(1)上記実施例1で作製したデバイス1において、一対の電極を形成する工程を除いた以外は、実施例1と同様の手順でデバイス1を作製した。
(2)以下のアミノ酸配列のペプチドを定法により合成し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に100μMとなるように溶解し、ペプチド溶液を作製した。
[N]−GRHIFWRRGGGHKVPR−[C](配列番号:1)
上記配列の内、C末端側の「HKVPR」がZnOナノワイヤに結合する配列で、N末端側の「GRHIFWRR」が大腸菌を認識する配列である。なお、大腸菌を認識する配列は、グラム陰性細菌の細胞表層のリポ多糖を認識する配列であることから、大腸菌以外にも応用が可能である。
(3)デバイス1に、上記(2)で作製したペプチド溶液を200μL滴下し、2時間室温で静置した。
(4)ペプチド溶液を除去し、PBS 1mLを加え、5分間振とうした。
(5)デバイス1上のPBSを除去し、更に、新たなPBS 1mLでリンスした。
以上の手順により、実施例2で用いるデバイス1を作製した。
以下の手順により、大腸菌を蛍光染色したサンプルを調整した。
(1)大腸菌(DH5α;タカラバイオ株式会社)のPBS懸濁液に、SYTO9を1.5μMとなるように添加した。
(2)遮光して、30分間室温で静置した。
(3)5,000×gで遠心分離し、上清を除去した。
(4)遠心沈降物を、PBS 1mLに懸濁した。
(5)上記(3)及び(4)の手順を、3回繰り返した。
(6)5×107 cells/mLとなるようにPBSで希釈して、大腸菌懸濁液を作製した。
以下の手順により、上記実施例2の[デバイス1の作製]で作製したデバイス1が、大腸菌を捕捉できるか確認を行った。
(1)作製した大腸菌懸濁液を、デバイス1上に100μL滴下した。
(2)遮光し、2時間室温で静置した。
(3)デバイス1上の液を除き、PBS 500μLを添加したディッシュにデバイス1を沈め、5分間振とうした。この操作は、2回繰り返した。
(4)PBS 500μLで、デバイス1の表面をリンスした。
(5)デバイス1にカバーガラスを被せて、蛍光顕微鏡で観察した。
図7(A)は、実施例2で撮影した蛍光写真である。
大腸菌を含まないPBSをサンプル液とした以外は、実施例2と同様の手順で実験を行った。図7(B)は比較例1で撮影した蛍光写真である。
実施例2のデバイスにおいて、ナノワイヤをペプチドで修飾しなかった以外は、実施例2と同様の手順で実験を行った。図7(C)は比較例2で撮影した蛍光写真である。
次に、ペプチドの配列と離脱温度の関係を調べた。図8は実験の手順を示しており、詳細な手順を以下に記載する。
(1)TBS−T(pH7.5のトリス緩衝液+0.5% TWEEN20)に、ZnO粒子(住友大阪セメント社製、Dp=15〜35nm)を0.4mg/mlとなるように懸濁した。
(2)上記(1)の懸濁液を1.5ml遠沈管に90μlずつ分注し、10μMペプチド溶液(TBS)を15μlずつ加え1h攪拌した。なお、ペプチドには、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)で標識した、RCARRY(配列番号:2)、HYQSNW(配列番号:3)を用いた。
(3)上記(2)の遠沈管を、16,900gで15min、遠心分離した。
(4)上清100μlを96穴マイクロタイタープレートに分注し、残りを破棄した。
(5)TBS−T 115μlに再懸濁し、加温(20℃、40℃、60℃)しながら1h攪拌した。
(6)上記(5)の遠沈管を、16,900gで15min、遠心分離した。
(7)上清100μlを96穴マイクロタイタープレートに分注した。
(8)プレートリーダー(DS Pharma Biomedical社製、POWERSCAN 4)を用いて、上記(4)及び(7)でマイクロタイタープレートに分注した上清の蛍光強度を、励起波長が495nm、蛍光波長が517nmで測定した。
Claims (8)
- 絶縁性基板、
該絶縁性基板上に、少なくとも一部が積層された導電体層、
該導電体層上に形成されたナノワイヤ、及び、
前記導電体層に接するように形成された一対の電極、
を含むナノワイヤデバイス。 - 前記導電体層が、前記絶縁性基板上に積層され、
前記一対の電極が、前記導電体層の上に形成されている、
請求項1に記載のナノワイヤデバイス。 - 前記一対の電極が前記絶縁性基板上に形成され、
前記導電体層の一部が前記一対の電極の上に積層され、前記導電体層の他の部分が前記絶縁性基板上に積層されている、
請求項1に記載のナノワイヤデバイス。 - 前記ナノワイヤが、捕捉対象サンプルを特異的に認識するペプチド及び/又は核酸で修飾されている、
請求項1〜3の何れか一項に記載のナノワイヤデバイス。 - 前記ペプチドが、加熱によりナノワイヤから離脱するペプチドである、
請求項4に記載のナノワイヤデバイス。 - 請求項1〜5の何れか一項に記載のナノワイヤデバイス、
分析部、
を含む分析装置。 - 請求項1〜4の何れか一項に記載のナノワイヤデバイスと、サンプルが含まれる溶液とを接触させるサンプル接触工程、
前記ナノワイヤデバイスの一対の電極に通電することで、導電体を介してナノワイヤを加熱するナノワイヤ加熱工程、
加熱したナノワイヤでサンプルを加熱処理するサンプル加熱処理工程、
を含む、サンプルの加熱処理方法。 - 請求項5に記載のナノワイヤデバイスと、捕捉対象サンプルが含まれる溶液とを接触させるサンプル捕捉工程、
前記ナノワイヤデバイスの一対の電極に通電することで、導電体を介してナノワイヤを加熱するナノワイヤ加熱工程、
ナノワイヤを加熱することで、捕捉対象サンプルを捕捉したペプチドをナノワイヤから離脱させるサンプル離脱工程、
を含む、サンプルの分離方法。
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