KR20100122953A - 세포선별장치 및 그것을 이용한 세포선별방법 - Google Patents

Abstract

특정 물질을 생산하는 세포를, 한번에 대량으로 또한 단시간에 간편하게 선별하고, 또, 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자에 있어서의 결합력의 크기에 의해 세포선별을 효율적으로 행하기 위한 세포선별장치 및 세포선별방법을 제공한다. 1쌍의 전극과, 복수의 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체로 이루어지고, 상기 미세구멍의 바닥면에 특정 물질과 결합성을 지닌 인식 분자를 배치한 세포선별용기와, 전원을 구비한 세포선별장치로서, 상기 전원이 세포고정용 전원과, 세포 취출용 전원을 구비한 것을 특징으로 하는 세포선별장치와, 상기 세포선별장치를 이용한 세포선별방법으로서, 세포선별영역에 세포를 도입하여, 상기 미세구멍 내에 상기 세포를 고정시키고, 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자를 결합 반응시킨 후, 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 결합력이 약한 세포를 상기 미세구멍으로부터 취출하거나, 또는, 상기 세포 중 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 강하게 결합한 세포를 미세구멍에 남기는 세포선별방법인 것을 특징으로 하는 세포선별방법을 이용한다.

Description

세포선별장치 및 그것을 이용한 세포선별방법{CELL SELECTION APPARATUS, AND CELL SELECTION METHOD USING THE SAME}

본 발명은 세포선별을 효율적으로 행하기 위한 세포선별장치 및 그것을 이용한 세포선별방법에 관한 것이다.

본 출원은 2008년 4월 15일에 일본에 출원된 특허 출원 제2008-105396호에 의거해서 우선권을 주장하며, 그 내용을 여기에 원용한다.

최근, 질병의 진단약이나 의약품 원료로서, 생체 내에서 만들어지는 항체의 이용이 주목되고 있다. 항체란, 생체 내에 바이러스 등의 이물이 침입해 왔을 때, 그 이물과 특이적으로 결합하는 단백질의 일종이다. 항체는, 특정 바이러스 등의 이물과 결합함으로써, 그 바이러스를 죽이거나, 무독화시키거나 해서, 생체를 바이러스 등의 침입으로부터 지키는 기능을 지니고 있다. 여기서 항체가 특이적으로 결합하는 바이러스 등의 이물은 일반적으로 항원이라 칭해지고 있다. 또, 생체내의 항체는, 비장이나 림프절 속에 있는 세포로부터 만들어지며, 그 종류는 100만 종류를 초월한다고 일컬어지고 있다. 또한, 비장이나 림프절 속에 있는 항체를 만드는 세포는, 림프구나 B세포, 항체생산세포 등으로 칭해지고 있다.

또, 전술한 진단약이나 의약품은, 이 항체의 「특정 물질과 특이적으로 강하게 결합하는 성질」을 이용하고 있다. 특히, 항체를 이용한 진단약은 면역진단약, 항체를 이용한 의약품은 항체 의약 등으로 칭해지고 있다.

면역진단약의 예로서는, 생체 내에 침입한 바이러스 등을 항체에서 검출하는 감염증의 진단이나, 질병과 상관성이 높은 단백질 등을 검출함으로써 암이나 심질환, 자기면역질환 등의 진단에 이용되고 있다. 특히, 면역진단약은, 항체가 특정 물질에 특이적으로 결합하므로, 감도가 높고 신뢰성이 높은 진단약으로서 임상진단의 분야에서 널리 이용되고 있다.

또, 항체 의약의 예로서는, 생체 내에 침입한 병원균을 죽이거나, 질병을 야기시키는 단백질을 무독화시키거나, 암 세포의 증식을 억제하거나, 암 세포를 죽이거나, 알레르기 반응을 억제하는 등의 의약품이 있다. 특히, 항체 의약은, 항체가 특정 물질에 특이적으로 결합하므로, 부작용이 적은 의약품으로서 기대되고 있다.

또한, 면역진단약이나 항체 의약에 이용하는 항체는, 통상 1종류의 항체만으로 구성되어 있어, 일반적으로 단일클론항체라 칭해지고 있다.

그러나, 항체생산세포는, 생체 밖으로 취출(取出)되면 증식될 수 없어, 그 자체로는 항체를 공업적으로 대량으로 생산할 수는 없다. 그래서, 생체로부터 취출한 항체생산세포와 암 세포와 같은 무한히 증식하는 세포를 세포융합시켜서, 무한히 증식하면서 항체를 만드는 세포(이하, "융합세포" 또는 "하이브리도마"(hybridoma)라 칭함)를 얻어, 항체를 공업적으로 대량으로 생산하는 방법이 이용되고 있다. 이하의 1) 내지 3)에, 단일클론항체를 공업적으로 대량으로 생산하기 위한 융합세포를 얻는 대표적인 예를 나타낸다.

1) 마우스나 래트 등의 동물에게, 검출하고자 하거나 혹은 치료하고자 하는 이물인 목적 항원을 주사하여, 동물의 체내에서 그 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 만들게 한다(본 공정을 이하 "면역"이라 칭함).

2) 상기 1)에서 면역시킨 동물의 비장이나 림프절로부터 항체생산세포를 취출하여, 폴리에틸렌글라이콜 등의 세포막의 유동성을 높이는 매체 중에서 암 세포와 접촉시켜 융합(PEG법)하거나, 또는, 전극 사이에 넣은 용매 중의 항체생산세포와 암 세포에 교류전압을 인가해서 세포를 접촉시킨 후, 직류 펄스 전압을 인가해서 두 세포가 접촉한 세포막을 일시적으로 파괴하여 막 재생시킴으로써 융합(전기융합법)한다(본 공정을 이하 "세포융합"이라 칭함).

3) 상기 2)에서 얻어진 융합세포 중에서, 특히 목적 항원과 특이적으로 강하게 결합하는 항체를 형성하는 세포를 선택한다(본 공정을 이하 "세포선별"이라 칭함).

일반적으로, 항체생산세포는 면역시킨 마우스의 비장으로부터 취출되고(이하, "비장 세포"라 칭함), 그 수는 1∼2억개 정도이다. 이 중 세포융합에 의해 얻어지는 융합세포는 수 천개 정도, 또한 이 융합세포 중에서 목적 항원과 특이적으로 강하게 결합하는 항체를 만들고 있는 융합세포는 수 개 정도이다. 따라서, 상기 3)의 세포선별공정에 있어서, 수 천개의 융합세포 중에서 목적 항원과 특이적으로 강하게 결합하는 항체를 만들고 있는지의 여부를, 세포가 만드는 항체를 검출해서 효율적으로 조사할 필요가 있다.

세포가 만드는 항체의 검출 방법으로서, 면역화학적 측정방법이 일반적으로 이용되고 있다. 이것은, 항체가 항원을 특이적으로 인식하는 항원항체반응에 의거해서 항체의 검출을 행하는 방법이며, 그 우수한 정밀도, 간편성, 신속성, 경제성으로부터 최근 주목을 모으고 있다. 면역화학적 측정법에 있어서는, 검출방법으로서 매우 다종의 표지, 예를 들어, 효소, 방사성 트레이서, 화학발광성 및 형광성 표지, 금속원자 및 졸, 안정 유리기, 라텍스 및 박테리오파지(bacteriophage)가 적용되어 왔다.

면역화학적 측정방법 중에서도, 효소를 사용하는 효소면역(흡착) 측정법(이하, "ELISA법"이라 칭함)은, 경제성 및 편리성으로부터 특히 우수한 것으로서 널리 사용되기에 이르고 있다. ELISA법에서는, 항원 또는 항체를 고정화시키는 담체로서, 예를 들어, 폴리스타이렌제의 96웰의 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)가 이용되고 있다. 각 웰 내에 항원 또는 항체를 고정화시킨 후, 간접 경합법 또는 직접 경합법 등에 의해 표지화한 항원 또는 항체를 검출하여, 분석 대상물질의 양을 검출하고 있다. 종래의 ELISA법은, 간이하고도 신속한 측정법으로서 알려져 있지만, 측정에는 수 시간 정도가 소요되고 있다. 또, 한번에 검출가능한 샘플 수는 1플레이트의 웰 수로 한정된다. 따라서, 종래의 ELISA법보다도, 보다 단시간에 대량의 샘플을 측정할 수 있는, 간이하고 신속한 측정 방법이 요구되고 있었다.

이에 대해서, 상기 ELISA법의 과제를 해결하기 위해서, 다공질 소재 상에 분석 대상물질(예를 들어, 항체)과 특이적으로 반응하는 물질(예를 들어, 항원)을 고정화시키고(이하, "고정화 물질"이라 칭함), 분석 대상물질을 포함하는 용액을 상기 다공질 소재로 여과함으로써, 상기 다공질 소재 상의 상기 고정화 물질에 대해서 분석 대상물질을 반응시키고, 이어서, 상기 고정화 물질에 대하여 분석 대상물질과 경합해서 반응하는 표지화된 물질을 상기 다공질 소재로 여과함으로써, 상기 표지화된 물질을 상기 고정화 물질과 반응시켜, 해당 고정화 물질과 반응한 상기 표지화된 물질의 양을 측정함으로써, 분석 대상물질의 양을 검출하는 검출방법의 예가 보고되어 있다(예를 들어, 특허문헌 1 참조).

특허문헌 1에 기재된 방법은 항원항체반응을 이용한 분석대상물질의 검출 방법으로, 해당 방법에 있어서의 다공질 소재에 의한 여과는 벽부와 바닥부로 이루어진 복수의 웰을 구비한 플레이트를 이용해서 행하는 것이 바람직하고, 다공질 소재는 웰의 바닥부에 배치되어 있는 것이 바람직하다고 되어 있다. 이러한 플레이트는, 밀리포어사(Millipore Corporation)사에서 「MultiScreen」(등록상표)으로서 시판되고 있고, 다공질 소재로서 소수성 PVDF(폴리불화비닐리덴)를 이용한 「IP」, 다공질 소재로서 혼합 셀룰로스에스터를 이용한 「HA」, 다공질 소재로서 100% 나이트로셀룰로스를 이용한 「NC」등이 알려져 있다. 이들 플레이트는 96개의 웰을 구비하고 있다.

또한, 특허문헌 1에 기재된 방법은, 분석 대상물질의 용액을 여과한 후, 상기 고정화 물질에 대하여 분석 대상물질과 경합해서 반응하는 표지화된 물질을 여과함으로써, 양호한 검출 감도가 얻어지며, 게다가 30분 정도의 시간에 검출할 수 있다. 그러나, 상기 특허문헌 1에 기재된 방법에서는, 상기 벽부와 바닥부로 이루어진 복수의 웰을 구비한 플레이트를 이용해서 행하므로, 한번에 대량의 샘플을 측정하는 것이 어렵다고 하는 과제가 있었다. 여기서, 일반적으로 잘 사용되는 것은 전술한 바와 같이 96웰 플레이트이다.

한편, 융합세포를 제작하기 전에 목적 항체를 만드는 항체생산세포를 선별하고 나서 세포융합에 이용하는 방법이 있다. 이 목적 항체를 생산하는 항체생산세포의 선별수집기술로서는, 현재, 자기비즈방식에 의한 수집기술이나 흐름 세포 측정법(flow cytometry)을 이용한 수집기술이 널리 적용되고 있다.

자기 비즈 방식에서는, 목적 세포의 표면에 제시된 특정 물질과 특이적으로 반응하는 단일클론항체를 표면에 결합한 자기 비즈를 이용해서, 항원항체반응에 의해 목적으로 하는 세포를 선택적으로 자기 비즈에 결합시켜, 자기 칼럼을 통해서 비즈를 선별 포집한다(이하, "자기 비즈법"이라 칭함). 이 방법에서는 90% 정도의 회수율, 게다가 한번에 10⁹개 정도의 대량의 목적으로 하는 세포를 선별할 수 있다고 하는 이점이 있다(예를 들어, 특허문헌 2, 비특허문헌 1 참조). 그러나, 이 방법에서는, 목적으로 하는 세포를 항원항체반응에 의해 결합시킨 자기 비즈로부터 분리하지 않으면 안 될 경우가 생겨, 그 공정이 번잡해진다고 하는 과제가 있었다. 게다가, 이 방법에서는, 항원항체반응에서 결합의 여부에 의해서 세포를 선별하므로, 항원항체반응에 있어서의 결합력의 크기에 의해 세포를 선별할 수는 없었다.

한편, 흐름 세포 측정법은, 형광표지된 단일클론항체를 목적으로 하는 세포의 표면에 제시된 특정 물질과 항원항체반응에 의해 결합시켜서, 항체로부터 발현되는 형광으로 세포를 식별하는 방법이다(이하, "흐름 세포 측정법"이라 칭함). 구체적으로는, 노즐로부터 분출하는 제트류 중에 세포를 흘리고, 이 제트류에 초음파 진동을 가해서 액적화시켜, 액적으로 분리되기 직전에 수류에 전하를 부여하여, 목적 세포(즉, 형광표지된 세포)를 포함하는 액적을 양 또는 음으로 대전시켜서, 낙하 중에 대전된 액적을 전기장에서 편향시킴으로써 목적 세포를 포집한다. 이 방법에서는 자기 비즈 방식 이상의 순도를 얻을 수 있고, 또 복수의 레이저와 복수의 형광파장을 조합시켜서 6종류 정도의 다른 세포를 동시에 검출하는 것이 가능하다(예를 들어, 특허문헌 2 참조). 그러나, 이 방법은, 고가인 대형의 장치를 필요로 하므로, 간이하고도 신속한 측정은 어렵다고 하는 과제가 있었다. 게다가, 이 방법에서는, 항원항체반응에서 결합의 여부로 세포를 선별하므로, 항원항체반응에 있어서의 결합력의 크기를 기준으로 세포를 선별할 수는 없었다.

그 밖에도, 융합세포를 제작하기 전에 목적 항체를 만드는 비장 세포를 선별하고 나서 세포융합에 이용하는 방법으로서, 어떤 항원에 특이적으로 반응하는 비장 세포를 1개 선택하고, 선택한 비장 세포를 배양하여, 배양에 의해 증식한 비장 세포를 암 세포와 세포융합시켜 융합세포를 제작하는 방법(예를 들어, 특허문헌 3 참조)이나, 목적 항원을 면역시켜 얻어진 비장 세포와, 세포 표면에 목적 항원을 제시하는 암 세포를 혼합하여, 비장 세포 중 목적 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 제시하는 비장 세포를 암 세포의 표면의 목적 항원과의 특이적인 결합을 개재해서 선택적으로 접근시켜, 두 세포를 세포융합시키는 방법(예를 들어, 특허문헌 4 참조)이 있다.

그러나, 어느 쪽의 방법도 세포융합 전에 세포선별함으로써, 세포 수가 극단적으로 감소되어 버린다. 예를 들어, 목적 항체를 형성하는 마우스 비장 세포의 비율은 전체 비장 세포 수(일반적으로, 약 1×10⁸개 정도)의 1%정도 미만(약 1×10⁶개 정도)이라고 일컬어지고 있다. 따라서, 세포선별 후에 이용하는 세포융합법이 종래의 세포융합법인 PEG법(예를 들어, 비특허문헌 2, 비특허문헌 3 참조)이나 전기융합법(예를 들어, 비특허문헌 3 참조)이기 때문에, 그들의 융합 재생 확률이 일반적으로 0.2/10000 정도로 극히 낮으므로, 실질적으로 융합세포를 얻는 것이 어렵다고 하는 과제가 있었다. 또한, 세포선별작업과 세포융합작업을 각각의 용기 등에서 행하므로, 용기의 치환을 행할 때 세포를 손실할 가능성이 높다고 하는 과제도 있었다. 여기서, 일반적으로, 융합 재생 확률이란, 세포융합에서 생성한 융합세포수를 세포융합에 이용한 비장 세포수로 나눈 값이다.

또, 한번에 복수 종의 세포를 대량으로 선별·포집하는 것이 가능한 세포분리 시스템의 예도 보고되어 있다(예를 들어, 특허문헌 2 참조).

특허문헌 2에 기재된 방법은, 특정 온도(전이온도) 이상에서는 친수성을 나타내고, 그 온도 이하에서는 소수성을 나타내는 감온성 담체와, 해당 담체의 표면에 부착된 원하는 세포에 대한 항원결합구조를 가진 물질을 결합한 포집 세포를 포함하는 세포분리키트를 이용해서, 전이온도 이상의 온도로 조정된 목적 세포를 포함하는 수용액 중에 세포분리키트를 혼합하고, 항원항체반응에 의해 포집 세포에 목적으로 하는 세포를 결합시켜, 수용액으로부터 목적으로 하는 세포를 결합한 포집 세포 부착 담체를 분리해서 별도의 매체로 옮기고, 이 매체의 온도를 담체의 전이온도 이하로 해서 담체에 부착하여, 목적으로 하는 세포와 결합한 포집 세포를 담체로부터 이탈시켜, 담체와 목적으로 하는 세포를 결합한 포집 세포를 분리하고, 목적으로 하는 세포와 포집 세포와의 결합체를 pH의 조정 등에 의해 해리시켜, 목적으로 하는 세포를 포집 세포로부터 분리하는 방법이다. 이 방법에서는, 감온성 고분자화합물과, 목적으로 하는 세포에 대해서 항원항체반응하는 물질과 결합한 포집 세포를 조합시킴으로써, 감온성 고분자화합물을 이용해서 대량의 세포를 분리할 수 있다. 그러나, 목적으로 하는 세포를 포집 세포로부터 분리하는 공정이 번잡해진다고 하는 과제가 있었다. 게다가, 이 방법에서는, 항원항체반응에서 결합의 여부로 세포를 선별하므로, 항원항체반응에 있어서의 결합력의 크기를 기준으로 세포를 선별할 수는 없었다.

JP2001-281250 A JP2004-73112 A JP 3799392 B JP2006-6250 A

무라카미 히로키, 쓰가와라 타쿠야 저, 「세포공학개론」, 초판, 코로나사, 2001년 9월 10일, pp. 181-198 Kohler G., Milstein C, Nature, 256, pp. 495-497 (1975) De St. Groth S. F., Schedegger D., J. Immunol. Methods, 35, pp. 1-21 (1980) U. Zimmermann, G. Pilwat, H. Pohl, J. Biol. Phys., Volume 10, pp. 43-50 (1982)

본 발명은, 이러한 종래의 실상을 감안하여 제안된 것으로, 특정 물질을 생산하는 세포를, 한번에 대량으로 또한 단시간에 간편하게 선별하고, 또, 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자에 있어서의 결합력의 크기에 의해 세포선별을 효율적으로 행하기 위한 세포선별장치 및 세포선별방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, 상기 종래의 기술에 있어서의 문제점이나 과제를 해결하는 것으로서, 대향해서 배치되는 도전 부재로 이루어진 1쌍의 전극; 해당 1쌍의 전극 사이에 평판 형상의 스페이서를 개재해서 배치되고, 또한 상기 대향해서 배치된 전극의 방향으로 관통한 복수의 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체로 이루어지며, 해당 절연체가 상기 전극 중 어느 한쪽의 전극면 상에 배치되고, 상기 미세구멍의 바닥면에 특정 물질과 결합성을 지닌 인식 분자를 배치한 세포선별용기; 및 상기 1쌍의 전극에 전압을 인가하는 전원을 구비한 세포선별장치로서, 상기 전원이 제1교류전압을 인가하기 위한 제1교류전원인 세포고정용 전원과, 제2교류전압을 인가하기 위한 제2교류전원인 세포 취출용 전원을 구비한 것을 특징으로 하는 세포선별장치와, 상기 세포선별장치를 이용한 세포선별방법으로서, 상기 세포선별용기의 상기 1쌍의 전극 사이에 상기 스페이서를 개재해서 형성된 세포선별하는 공간인 세포선별영역에 세포를 도입하여, 상기 제1교류전원에 의해 상기 제1교류전압을 인가해서 상기 미세구멍 내에 상기 세포를 고정시키고, 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자를 결합 반응시킨 후, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘에 의해 상기 세포 중 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포를 상기 미세구멍으로부터 취출하거나, 또는, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘에 의해 상기 세포 중 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 강하게 결합한 세포를 미세구멍에 남기는 세포선별방법인 것을 특징으로 하는 세포선별방법을 사용함으로써, 상기의 종래 기술의 과제를 해결하는 것이 가능하다는 것을 찾아내어, 마침내 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명에 의하면, 이하의 효과를 거둘 수 있다.

1) 본 발명의 세포선별장치와 세포선별방법에 의하면, 제1교류전원에 의한 양의 유전 영동력에 의해, 1개의 미세구멍에 1개의 세포를 고정시킬 수 있고, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘에 의해, 미세구멍으로부터 세포를 취출하여 개별적으로 선별할 수 있으며, 인식 분자와 강하게 결합하는 특정 물질을 표면에 제시하고 있는 세포를 한번에 대량으로 또한 단시간에 간편하게 선별하는 것이 가능해진다.

2) 본 발명의 세포선별장치와 세포선별방법에 의하면, 특정 힘으로서 송액력이나 유전 영동력을 사용함으로써, 종래 기술에서는 곤란했던 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자에 있어서의 결합력의 크기를 기준으로 세포를 용이하게 선별하는 것이 비로소 가능해진다.

3) 본 발명의 세포선별장치와 세포선별방법에 의하면, 제1교류전원에 의한 양의 유전 영동력에 의해 미세구멍에 고정시킨 제1의 세포에 대해서, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘에 의해, 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자에 있어서의 결합력의 크기를 기준으로 미세구멍으로부터 세포를 취출하여 개별적으로 선별할 수 있고, 제2의 세포와 미세구멍에 남은 제1의 세포를 접촉시켜, 직류 펄스 전원에 의해 직류 펄스 전압을 인가함으로써, 인식 분자와 강하게 결합하는 특정 물질을 표면에 제시하고 있는 제1의 세포와 제2의 세포를 선택적으로 세포융합시키는 것이 가능해져, 대량의 세포를 대상으로 한 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자의 결합력의 평가에 의한 세포선별과 세포융합을 매우 단시간에 실시하는 것이 가능해진다.

4) 본 발명의 세포선별장치와 세포선별방법에 의하면, 제1교류전원에 의한 양의 유전 영동력에 의해 미세구멍에 고정시킨 제1의 세포에 대해서, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘에 의해, 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자에 있어서의 결합력의 크기를 기준으로 미세구멍으로부터 세포를 취출하여 개별적으로 선별할 수 있고, 제2의 세포와 미세구멍에 남은 제1의 세포를 접촉시켜, 직류 펄스 전원에 의해 직류 펄스 전압을 인가함으로써, 세포선별해서 미세구멍에 남은 제1의 세포와 제2의 세포를, 제1교류전원에 의한 제1교류전압에 의해 강제적으로 접촉시켜, 제1의 세포와 제2의 세포를 쌍으로 해서 세포융합시키므로, 종래의 세포융합법(PEG법, 전기융합법)에 비해서, 매우 높은 융합 재생 확률을 얻는 것이 가능해져, 세포선별 후에도 실질적으로 융합세포를 얻는 것이 비로소 가능해진다.

5) 본 발명의 세포선별장치와 세포선별방법에 의하면, 세포선별용의 장치 및 용기와 세포융합용의 장치 및 용기를 각각 준비할 필요가 없이, 세포선별과 세포융합을 연속해서 동일 용기 내에서 실시할 수 있으므로, 간이하고 단시간에 대량의 세포선별과 세포융합을 행할 수 있어, 신속하고 효율적인 조작을 할 수 있는 동시에, 세포의 활성도 유지할 수 있고, 세포를 세포선별용기로부터 세포융합용기에 옮김으로써 생기는 세포의 손실도 대폭 저감시킬 수 있다.

6) 본 발명의 세포선별장치와 세포선별방법에 의하면, 고가이면서 대형인 장치도 필요 없어, 저렴하면서 소형인 장치로 세포선별과 세포융합을 연속해서 행할 수 있다.

7) 본 발명의 세포선별장치와 세포선별방법에 의하면, 세포선별 후, 혹은 세포융합 후, 세포를 담체로부터 분리하는 번잡한 공정이 필요 없어 용이하게 선별한 세포나 융합세포를 회수하는 것이 가능해진다.

8) 본 발명의 세포선별장치와 세포선별방법에 의하면, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘을 건 채 제1의 세포와 제2의 세포를 세포융합시키는 것이 가능해져서, 선별에 의해 미세구멍으로부터 취출한 불필요한 세포가 세포융합될 확률이 낮아져, 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자의 결합력의 평가에 의한 융합세포의 선별을 매우 단시간에 실시하는 것이 가능해진다.

9) 본 발명의 세포선별장치와 세포선별방법에 의하면, 항원과의 결합력이 강한 항체를 세포 표면에 노출시키고, 또한, 항체의 클래스가 IgG인 항체를 표면에 많이 제시하고 있는 마우스 비장 세포와 마우스 암 세포를 선택적으로 세포융합시키는 것이 가능해져서, 얻어지는 융합세포의 수가 더욱더 대폭 감소되는 동시에, 얻어진 융합세포 중, 항원과의 결합력이 강하면서도 IgG 항체를 만드는 융합세포의 비율이 높게 되므로, 세포융합 후의 결합력이 강한 항체를 형성하는 융합세포를 선별하는 작업량이 더 한층 대폭 경감된다.

도 1은 본 발명에 있어서의 기본적인 세포선별방법의 개념을 나타내는 제1의 도면;
도 2는 본 발명에 있어서의 기본적인 세포선별방법의 개념을 나타내는 제2의 도면;
도 3은 본 발명에 있어서의 기본적인 세포선별방법의 개념을 나타내는 제3의 도면;
도 4는 본 발명에 있어서의 세포선별장치의 개념도 및 실시예 1, 2에 이용한 세포선별장치의 개념도;
도 5는 도 4에 나타낸 XX' 단면도;
도 6은 본 발명에 이용하는 미세구멍의 일례로서, 미세구멍의 평면형상에 내접하는 최대원의 직경이 미세구멍에 고정되는 세포의 직경의 2배보다 클 경우를 나타낸 도면;
도 7은 본 발명에 이용하는 미세구멍의 일례로서, 미세구멍의 평면형상에 내접하는 최대원의 직경이 미세구멍에 고정되는 세포의 직경보다 작을 경우를 나타낸 도면;
도 8은 본 발명에 이용하는 미세구멍의 일례로서, 미세구멍의 평면형상에 내접하는 최대원의 직경이 미세구멍에 고정되는 세포보다 1∼2배 정도 크면서도 미세구멍의 깊이가 미세구멍에 고정되는 세포의 직경 이하일 경우를 나타낸 도면;
도 9는 본 발명에 이용하는 교류전압의 파형의 일례로서, 정현파의 대표적인 파형을 나타낸 도면으로, 가로축(X축)은 시간을 나타내고, 세로축(Y축)은 전압을 나타냄;
도 10은 본 발명에 이용하는 교류전압의 파형의 일례로서, 삼각파의 대표적인 파형을 나타낸 도면으로, 가로축(X축)은 시간을 나타내고, 세로축(Y축)은 전압을 나타냄;
도 11은 본 발명에 이용하는 교류전압의 파형의 일례로서, 사다리꼴파의 대표적인 파형을 나타낸 도면으로, 가로축(X축)은 시간을 나타내고, 세로축(Y축)은 전압을 나타냄;
도 12는 본 발명에 이용하는 교류전압의 파형의 일례로서, 직사각형파의 대표적인 파형을 나타낸 도면으로, 가로축(X축)은 시간을 나타내고, 세로축(Y축)은 전압을 나타냄;
도 13은 본 발명에 있어서의 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자의 결합력의 크기를 음의 유전 영동력의 크기에 따라서 선별하는 방법의 개념을 나타낸 도면;
도 14는 본 발명의 실시예에서 이용한 미세구멍형성 절연체 일체형 하부전극을 제작하기 위한 일반적인 포토리소그래피와 에칭 방법을 도시한 개략도;
도 15는 실시예 1에 나타낸 시간경과에 의한 고정화 항체농도에 대한 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 미세구멍 유지율의 관계의 그래프로, 가로축(X축)은 인가전압(단위는 볼트(V))을 나타내고, 세로축(Y축)은 비즈 유지율(%)을 나타냄;
도 16은 실시예 2에 나타낸 인가전압에 의한 고정화 항체농도에 대한 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 미세구멍 유지율의 관계의 그래프로, 가로축(X축)은 인가전압(단위는 볼트(V))을 나타내고, 세로축(Y축)은 비즈 유지율(%)을 나타냄;
도 17은 본 발명에 있어서의 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향에 중력을 작용시킬 경우의 개념도;
도 18은 본 발명에 있어서의 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향에 자력을 작용시킬 경우의 개념도;
도 19는 본 발명에 있어서의 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향에 송액력을 작용시킬 경우의 개념도;
도 20은 본 발명에 있어서의 세포선별과 세포융합을 연속해서 행하는 세포선별방법의 개념을 나타내는 제1의 도면;
도 21은 본 발명에 있어서의 세포선별과 세포융합을 연속해서 행하는 세포선별방법의 개념을 나타내는 제2의 도면;
도 22는 본 발명에 있어서의 세포선별과 세포융합을 연속해서 행하는 세포선별방법의 개념을 나타내는 제3의 도면;
도 23는 본 발명에 있어서의 세포선별과 세포융합을 연속해서 행하는 세포선별방법의 개념을 나타내는 제4의 도면;
도 24는 본 발명에 있어서의 세포선별과 세포융합을 연속해서 행하는 세포선별방법의 개념을 나타내는 제5의 도면;
도 25는 본 발명에 있어서의 세포선별과 세포융합을 연속해서 행하는 세포선별방법의 개념을 나타내는 제6의 도면;
도 26은 본 발명에 있어서의 세포선별과 세포융합을 연속해서 행하는 세포선별방법의 개념을 나타내는 제7의 도면;
도 27은 본 발명에 있어서의 세포선별과 세포융합을 연속해서 행하는 세포선별방법 중, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향에 특정 힘을 작용시킨 채 세포융합을 행하는 개념을 나타내는 제1의 도면;
도 28은 본 발명에 있어서의 세포선별과 세포융합을 연속해서 행하는 세포선별방법 중, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향에 특정 힘을 작용시킨 채 세포융합을 행하는 개념을 나타내는 제2의 도면;
도 29는 본 발명에 있어서의 세포선별과 세포융합을 연속해서 행하는 세포선별방법 중, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향에 특정 힘을 작용시킨 채 세포융합을 행하는 개념을 나타내는 제3의 도면;
도 30은 본 발명에 있어서의 세포선별과 세포융합을 연속해서 행하는 세포선별방법 중, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향에 특정 힘을 작용시킨 채 세포융합을 행하는 개념을 나타내는 제4의 도면;
도 31은 본 발명에 있어서의 세포선별과 세포융합을 연속해서 행하는 세포선별방법 중, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향에 특정 힘을 작용시킨 채 세포융합을 행하는 개념을 나타내는 제5의 도면;
도 32는 본 발명에 있어서의 세포선별과 세포융합을 연속해서 행하는 세포선별방법 중, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향에 특정 힘을 작용시킨 채 세포융합을 행하는 개념을 나타내는 제6의 도면;
도 33은 본 발명에 있어서의 세포선별과 세포융합을 연속해서 행하는 세포선별방법 중, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향에 특정 힘을 작용시킨 채 세포융합을 행하는 개념을 나타내는 제7의 도면;
도 34는 본 발명에 있어서의 세포선별과 세포융합을 연속해서 행하는 세포선별방법 중, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향에 특정 힘을 작용시킨 채 세포융합을 행하는 개념을 나타내는 제8의 도면.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 세포선별장치는, 대향해서 배치되는 도전 부재로 이루어진 1쌍의 전극; 해당 1쌍의 전극 사이에 평판 형상의 스페이서를 개재해서 배치되고, 또한 상기 대향해서 배치된 전극의 방향으로 관통한 복수의 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체로 이루어지며, 해당 절연체가 상기 전극 중 어느 한쪽의 전극면 상에 배치되고, 상기 미세구멍의 바닥면에 특정 물질에 대해서 결합성을 지닌 인식 분자를 배치한 세포선별용기; 및 상기 1쌍의 전극에 전압을 인가하는 전원을 포함하는 세포선별장치로서, 상기 전원이 세포고정용 전원 및 세포 취출용 전원을 구비한 세포선별장치이다.

또, 본 발명의 세포선별장치는, 전술한 세포선별장치가 구비한 전원 중, 세포고정용 전원이 제1교류전압을 인가하는 제1교류전원으로 이루어지고, 세포 취출용 전원이 제2교류전압을 인가하는 제2교류전원으로 이루어지며, 제1교류전원과 제2교류전원을 전환시키는 전원전환기구를 구비한 세포선별장치이다.

또한, 본 발명의 세포선별장치는, 전술한 전원이 세포고정용 전원, 세포 취출용 전원 및 세포융합용 전원을 갖는 세포선별장치로서, 상기 전원에 있어서, 상기 세포고정용 전원이 제1교류전압을 인가하는 제1교류전원으로 이루어지고, 상기 세포 취출용 전원이 제2교류전압을 인가하는 제2교류전원으로 이루어지며, 상기 세포융합용 전원이 직류 펄스 전압을 인가하는 직류 펄스 전원으로 이루어지고, 상기 제1교류전원, 상기 제2교류전원 및 상기 직류 펄스 전원으로부터 임의의 1개 또는 임의의 2개의 전원을 선택해서 접속하는 전원전환기구를 구비하는 것을 특징으로 하는 전술한 세포선별장치이다.

또, 본 발명의 세포선별장치는, 상기 제1교류전원의 교류 주파수가 30㎑ 이상이고, 또한, 상기 제2교류전원의 교류 주파수가 20㎑ 미만인, 전술한 세포선별장치이다.

또한, 본 발명의 세포선별장치는, 상기 특정 물질과 결합성을 지닌 인식 분자가 항원인, 전술한 세포선별장치이다.

또, 본 발명의 세포선별장치는, 상기 세포선별용기의 상기 1쌍의 전극 사이에 상기 스페이서를 개재해서 형성된 세포선별하는 공간인 세포선별영역에 면하는 상기 전극의 표면 및/또는 상기 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체를 배치한 전극의 절연체 표면에 양이온성 폴리머를 배치하고, 상기 양이온성 폴리머가 폴리리신, 또는 폴리리신의 유도체, 또는 아미노기함유 폴리머인, 전술한 세포선별장치이다.

또한, 본 발명의 세포선별방법은, 전술한 세포선별장치를 이용한 세포선별방법으로서, 상기 세포선별영역 내에 세포를 도입하여, 상기 제1교류전원에 의해 상기 제1교류전압을 인가해서 상기 미세구멍 내에 상기 세포를 고정시키고, 상기 미세구멍의 바닥면에 배치한 상기 인식 분자와 세포 표면의 특정 물질을 결합 반응시킨 후, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘에 의해 상기 세포 중 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포를 상기 미세구멍으로부터 취출하거나, 또는, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘에 의해 상기 세포 중 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 강하게 결합한 세포를 미세구멍에 남기는 세포선별방법이다.

또, 본 발명의 세포선별방법은, 전술한 세포선별장치를 이용한 세포선별방법으로서, 상기 세포선별영역 내에 제1의 세포를 도입하여, 상기 제1교류전원에 의해 상기 제1교류전압을 인가해서 상기 미세구멍 내에 상기 제1의 세포를 고정시키고, 상기 제1의 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자를 결합 반응시켜, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘에 의해 상기 제1의 세포 중 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포를 상기 미세구멍으로부터 취출하고, 계속해서 상기 세포선별영역 내에 제2의 세포를 도입하여, 상기 미세구멍에 남은 상기 제1의 세포와 접촉시켜, 상기 전원전환기구에 의해 상기 직류 펄스 전원으로 전환하여 상기 직류 펄스 전압을 인가해서, 상기 미세구멍에 남은 상기 제1의 세포와 접촉한 상기 제2의 세포를 세포융합시키는 세포선별방법이다.

또한, 본 발명의 세포선별방법은, 전술한 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘이, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 중력, 자력, 상기 세포선별용기에 도입하는 용액의 송액력(送液力) 또는 상기 전원전환기구에 의해 전환된 상기 제2교류전원에 의한 상기 제2교류전압을 인가함으로써 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 유전 영동력 중 어느 하나 또는 둘 이상의 조합인 세포선별방법이다.

또, 본 발명의 세포선별방법은, 전술한 특정 힘이 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 송액력이며, 상기 세포선별용기에 도입하는 용액의 송액 속도의 크기를 변화시킴으로써 상기 송액력의 크기를 변화시켜, 상기 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포와, 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 강하게 결합한 세포를 선별하는 세포선별방법이다.

또한, 본 발명의 세포선별방법은, 전술한 특정 힘이 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 유전 영동력이며, 상기 제2교류전원에 의한 상기 제2교류전압의 크기 및/또는 주파수의 크기를 변화시킴으로써 상기 유전 영동력의 크기를 변화시켜, 상기 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포와 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 강하게 결합한 세포를 선별하는 세포선별방법이다.

또, 본 발명의 세포선별방법은, 전술한 미세구멍으로부터 취출한 세포를, 양이온성 폴리머를 배치한 상기 전극의 세포선별영역 측의 표면 및/또는 상기 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체를 배치한 전극의 절연체 표면에 포착시키는 세포선별방법이다.

또한, 본 발명의 세포선별방법은, 전술한 제2의 세포의 표면에 전술한 제1의 세포의 특정 물질을 인식하는 인식 분자를 고정시키고, 상기 특정 물질과 상기 인식 분자의 결합에 의해 상기 제1의 세포와 상기 제2의 세포를 결합하는 세포선별방법이다.

또, 본 발명의 세포선별방법은, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 상기 특정 힘을 건 채, 상기 직류 펄스 전압을 인가함으로써, 상기 제1의 세포와 상기 제2의 세포를 세포융합시키는 것을 특징으로 하는 세포선별방법이다.

또한, 본 발명의 세포선별방법은, 전술한 특정 물질이 세포 표면의 항체이며, 전술한 인식 분자가 항원인 세포선별방법이다.

또, 본 발명의 세포선별장치의 다른 양상은, 대향된 제1 및 제2전극과, 해당 전극에 교류전압을 인가하는 전원장치를 구비한 세포선별장치로서, 상기 제1전극의 제2전극측 표면에 미세구멍을 가진 절연체가 배치되고, 상기 미세구멍이 접촉한 전극 노출 부위 이외의 부분이 절연체로 덮이며, 또 제1 및 제2전극은 상기 절연체와 제2전극이 격리 배치되고, 상기 전극 노출 부위에 인식 분자가 배치되어 있으며, 그리고, 상기 전원장치는 주파수가 다른 2종류의 교류전압을 제1 및 제2전극에 인가하는 것인 세포선별장치이다.

이하에, 도면을 이용해서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 세포선별장치는, 대향해서 배치되는 도전 부재로 이루어진 1쌍의 전극; 상기 1쌍의 전극 사이에 평판 형상의 스페이서를 개재해서 배치되고, 또한 상기 대향해서 배치된 전극의 방향으로 관통한 복수의 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체로 이루어지며, 해당 절연체가 상기 전극 중 어느 한쪽의 전극면 상에 배치되고, 상기 미세구멍의 바닥면에 특정 물질에 대해서 결합성을 지닌 인식 분자를 배치한 세포선별용기; 및 상기 1쌍의 전극에 전압을 인가하는 전원을 포함하는 세포선별장치로서, 상기 전원이 세포고정용 전원과 세포 취출용 전원을 구비하거나, 혹은 상기 전원이 세포고정용 전원, 세포 취출용 전원 및 세포융합용 전원을 구비하고 있어도 된다.

여기서, 우선, 본 발명의 세포선별장치와 세포선별방법을 설명하기 위하여, 본 발명의 세포선별장치를 이용한 대표적인 세포선별방법의 개략, 즉, 세포용액을 세포선별영역에 도입해서 세포선별하는 방법을 도 1 내지 도 3에 의해 설명한다.

본 발명의 세포선별방법의 순서를 도 1, 도 2 및 도 3의 순으로 나타낸다. 우선, 도 1에 나타낸 바와 같이, 세포(50)가 주입된 세포용액(2)을 세포선별영역(1)에 넣고, 전원전환기구(7)를 제1교류전압을 인가하는 제1교류전원(5)에 접속한다. 제1교류전원은 세포고정용 전원이다. 이때, 세포는 절연체(8)에 형성된 미세구멍(9)을 향해서 이동하여 고정된다. 이 세포가 미세구멍을 향해서 움직일 때 작용하는 힘을 본 발명에서는 양(+)의 유전 영동력(10)이라 칭한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 양의 유전 영동력이란, 전극 간에 특정 주파수의 교류전압을 인가했을 때, 상부전극(14)과 미세구멍(9)으로 덮인 하부전극(15)과 같이, 전기력선(12)의 집중부위가 있으면, 그 전기력선의 집중부위(11)의 방향(즉, 미세구멍의 방향)을 향해서 세포 등의 유전체 입자를 움직이는 힘이다. 일반적으로, 유전 영동력은, 유전체 입자의 체적, 유전체 입자의 유전율과 용액의 유전율의 차이, 인가전압의 2승에 비례하고, 세포 등에 대해서는 높은 주파수(예를 들어, 30㎑ 이상)의 교류전압을 인가하면 양의 유전 영동력이 생긴다.

다음에, 도 2에 나타낸 바와 같이, 미세구멍에 고정된 세포는, 미세구멍의 바닥면과 접촉함으로써, 세포 표면의 특정 물질(33)과 미세구멍의 바닥면(본 발명의 세포선별장치의 다른 양상에 있어서의 제1전극의 미세구멍에 전극이 접촉한 전극 노출 부위)에 배치한 인식 분자(34)와의 결합 반응이 일어난다. 계속해서, 도 3에 나타낸 바와 같이, 전원전환기구(7)에 의해 제1교류전원(5)을 제2교류전원(6)으로 전환시켜, 제2교류전압을 인가한다. 제2교류전원은 세포 취출용 전원이다. 이때, 미세구멍 속에 있는 세포에는 음(-)의 유전 영동력(21)이 작용한다. 여기서 음의 유전 영동력이란, 세포를 미세구멍(9)으로부터 취출하는 방향으로 작용하는 힘이며, 일반적으로 세포 등에 대해서는 낮은 주파수(예를 들어, 20㎑ 미만)의 교류전압을 인가하면 음의 유전 영동력이 생긴다. 이것에 의해, 세포를 음의 유전 영동력을 이용해서 강제적으로 미세구멍 속으로부터 취출하는 것이 가능해진다. 이때, 미세구멍에 고정된 세포 중 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포(17)는 미세구멍으로부터 취출되고, 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자가 강하게 결합한 세포(18)는 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자의 결합력에 의해 미세구멍에 남김으로써 세포선별을 행할 수 있다. 또한, 제1교류전원과 제2교류전원은, 각각 제1교류전압과 제2교류전압을 인가하는 기능을 지니고 있으면, 각각 개별의 전원이어도 되고, 동일한 전원으로 전압이나 주파수를 전환시켜 사용해도 된다.

즉, 본 발명에 있어서의 세포선별을 행하는 양상으로서, 세포선별영역 내에 세포를 도입하고, 제1교류전압을 인가해서 미세구멍 내에 세포를 고정시킨 후, 세포 표면의 특정 물질(예를 들어, 항체)과, 인식 분자(예를 들어, 항원)를 결합 반응시키고, 전원전환기구에 의해 제1교류전원을 제2교류전원으로 전환시켜, 제2교류전압을 인가하고, 세포 중 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포를 미세구멍으로부터 취출하거나, 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자가 강하게 결합한 세포를 미세구멍에 남길 수 있으며, 또, 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포와 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자가 강하게 결합한 세포를 선별할 수 있고, 또한, 제2교류전원의 전압의 크기를 변화시킴으로써 선별 기준으로 되는 결합력을 임의로 설정할 수 있다.

여기서, 본 발명에 있어서 결합력의 크기란, 세포 표면의 특정 물질에 대한 인식 분자의 결합력 그 자체가 큰 것을 의미하는 것 외에도, 세포 표면의 특정 물질이 많은 것에 의해 결과적으로 인식 분자와의 결합력이 클 경우의 어느 한쪽 혹은 양쪽을 의미한다.

다음에, 본 발명의 세포선별장치의 구성에 대해서, 도면을 이용해서 상세히 설명한다.

도 4는 본 발명의 세포선별장치의 개념도를 나타낸 도면이다. 본 발명의 세포선별장치는 세포선별용기(13)와 전원(4)으로 구성되어 있다.

세포선별용기는, 도 4에 나타낸 바와 같이, 상부전극(14)과 하부전극(15) 사이에 스페이서(16)를 배치함으로써, 세포선별영역(1)을 확보하여, 미세구멍(9)을 형성한 절연체(8)를 하부전극의 세포선별영역 측에 배치한 구조를 지닌다.

본 발명의 세포선별장치의 다른 양상에 있어서는, 도 4의 미세구멍(9)을 형성한 절연체(8)를 배치한 하부전극은 제1전극에 해당하고, 상기 절연체와 격리 배치되는 상부전극은 제2전극에 해당한다. 무엇보다, 세포고정 또는 세포취출을 2종류의 교류전압의 인가에 의해 행하는 본 발명의 세포선별장치에서는, 어느 쪽의 전극을 상하에 배치해도 되고, 상하 이외에 좌우측 방향에 배치해도 된다. 또한, 스페이서(16)를 절연체(8)와 전극(14) 사이에 배치함으로써, 절연체와 전극을 격리시키고, 그 결과로서 세포선별영역(1)을 확보하여, 액체를 유지시키고 있지만, 예를 들어, 전극을 접근시켜서 표면장력을 갖게 하거나, 케이싱 내의 대향하는 면에 전극을 부착시켜 공간을 갖게 하는 등에 의해서 스페이서를 대체할 수 있다.

상부전극과 하부전극의 재질은 도전 부재로서 화학적으로 안정한 부재이면 특별히 제한은 없고, 백금, 금, 구리 등의 금속이나 스테인레스 등의 합금 및, ITO(Indium Tin Oxide: 산화인듐주석) 등의 투명도전성 재료를 성막한 유리 기판 등이어도 되지만, 세포선별을 관찰하기 위해서는, ITO 등의 투명도전성 재료를 성막한 유리 기판을 전극으로서 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 특정 물질과 결합성을 지닌 인식 분자를 미세구멍 부분에만 고정시키기 위해서는, 금전극이 보다 바람직하다. 이 경우, 금-티올 결합 등을 이용함으로써, 금전극이 표면에 노출되어 있는 부분에만 인식 분자를 부착시키는 것이 가능하다. 금-티올 결합이란, 분자 말단에 SH기를 가지는 티올 화합물이 금 등의 금속 표면에 결합하여, 치밀한 배향성의 단분자막을 형성하는 강고한 결합이다. 예를 들어, 특정 물질과 결합성을 지닌 인식 분자가 항원인 경우, 금-티올 결합의 결합력은, 항원항체반응의 결합력의 100만배 정도로 되므로, 보다 강고하게 미세구멍의 바닥면에 고정시키는 것이 가능하다. 또한, 금-티올 결합의 경우에는, 세포선별용기의 전극에 적당한 전압을 인가함으로써 금-티올 결합을 끊는 것이 가능하여, 세포선별용기의 재이용도 용이하다. 또한, 금-티올 결합을 이용하는 경우에는, 금전극을 이용하는 것 외에, ITO 등의 투명전극 등의 전극 표면에 금 나노 입자를 화학결합이나 물리흡착으로 고정시켜도 된다.

상부전극과 하부전극의 면적 등의 치수에는 특별히 제한은 없지만, 취급하기 쉬운 크기로서, 예를 들어, 세로 70㎜×가로 40㎜×두께 1㎜ 정도의 크기가 바람직하다. 세포선별용기의 상부전극과 하부전극에는 도전선(3)을 개재해서 전원(4)이 접속되어 있다. 전원(4)은 상부전극과 하부전극 사이에 제1교류전압을 인가하기 위한 제1교류전원(5)과 제2교류전압을 인가하기 위한 제2교류전원(6) 및 직류 펄스 전압을 인가하기 위한 직류 펄스 전원(35)으로 구성되어 있고, 이들 제1교류전원, 제2교류전원 및 직류 펄스 전원은, 전원전환기구(7)에 의해 적절하게 전환하여 사용할 수 있다. 또한, 제1의 전원은 세포고정용 전원이고, 제2의 전원은 세포 취출용 전원이며, 직류 펄스 전원은 세포융합용 전원이다. 여기서, 제2의 전원과 직류 펄스 전원 중 어느 한쪽 혹은 양쪽은, 필요에 따라서 설치하면 되고, 전원(4)이 제1교류전원(5)만으로 구성되어 있어도, 본 발명의 요지를 일탈하는 것은 아니다.

또, 전원이 제1교류전원만으로 구성된 경우에는, 전원전환기구(7)도 불필요해지고, 상부전극과 하부전극에 직접 제1교류전원을 접속하면 된다. 또한, 전원전환기구는, 상기 제1교류전원, 상기 제2교류전원 및 상기 직류 펄스 전원으로부터 임의의 1개 또는 임의의 2개의 전원을 선택해서 접속할 수 있는 것이 바람직하다. 이렇게 함으로써, 예를 들어, 상기 제2교류전원에 접속한 채 상기 직류 펄스 전원을 접속하면, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 음의 유전 영동력을 건 채, 직류 펄스 전압을 인가해서 세포융합시키는 것이 가능해져서, 세포선별을 보다 효율화하는 것이 가능해진다.

스페이서는, 상부전극과 하부전극이 직접 접촉하지 않도록 설치되고, 또한, 세포선별용기에 세포용액을 넣어두는 공간을 확보하기 위한 세포선별영역을 형성하는 관통 구멍을 지니고 있는 것으로, 그 재질은 절연재료이면 되고, 예를 들어, 유리, 세라믹, 수지 등이 있다. 또, 스페이서에는, 세포선별용기에 세포를 도입, 배출하기 위해서, 세포를 도입하는 도입 유로(29) 및 그것에 연통하는 도입구(19)와, 세포를 배출하는 배출 유로(30) 및 그것에 연통하는 배출구(20)가 형성되어 있다. 이와 같이, 스페이서는 전극과 절연체를 격리시켜, 액체를 유지시키기 위한 것으로, 예를 들어, 전극을 접근시켜서 표면장력을 갖게 하거나, 케이싱 내의 대항하는 면에 전극을 붙여서 공간을 갖게 하는 등에 의해 스페이서를 대체할 수 있다.

절연체(8)에는 미세구멍(9)이 형성되어 있다. 절연체(8)의 재질은, 예를 들어, 유리, 세라믹, 수지 등의 절연재료이면 특별히 제한은 없지만, 관통하는 미세구멍을 형성시킬 필요가 있으므로, 수지 등의 비교적 가공이 용이한 재료가 바람직하다. 수지에 관통하는 미세구멍을 형성하는 수단으로서는, 형성하는 미세구멍의 위치에 레이저를 조사하는 방법이나, 미세구멍의 위치에 관통구멍을 형성하기 위한 핀을 가진 금형을 이용해서 형성하는 방법 등의 기지의 방법을 이용하면 된다. 또한, 절연체에 UV경화성 수지 등을 이용하는 경우에는, 미세구멍에 상당하는 패턴을 묘화한 노광용 포토마스크를 이용해서 일반적인 포토리소그래피(노광)와 에칭(현상)에 의해 관통하는 미세구멍을 형성할 수 있다. 절연체에 복수의 미세구멍을 형성하는 경우에는, 절연체로서 UV경화성 수지를 이용하여, 일반적인 포토리소그래피와 에칭에 의한 방법으로 미세구멍을 형성하는 것이 바람직하다.

미세구멍의 형상이나 크기에는 특별히 제한은 없지만, 본 발명의 세포선별장치의 경우, 1개의 미세구멍에 1개의 세포를 고정시킨 쪽이 보다 효과적인 세포선별을 행하는 것이 가능해므로, 미세구멍의 평면형상에 내접하는 최대원의 직경이 미세구멍에 고정되는 세포의 직경(세포에 따라 다르지만, 1㎛ 내지 수십 ㎛정도)의 1∼2배 정도의 범위이면서도 미세구멍의 깊이가 미세구멍에 고정되는 세포의 직경 이하인 것이 바람직하다.

이 이유를 도면을 이용해서 더욱 상세히 설명한다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 미세구멍의 평면형상에 내접하는 최대원의 직경이 미세구멍에 고정되는 세포의 직경의 2배보다 큰 경우에는, 미세구멍에 세포가 복수개 들어가 버려, 효과적인 세포선별을 할 수 없게 되어버린다. 마찬가지로, 미세구멍의 깊이가 미세구멍에 고정되는 세포의 직경보다도 클 경우에도, 미세구멍에 복수개의 세포가 들어가 버려, 효과적인 세포선별을 할 수 없게 되어 버린다.

또, 도 7에 나타낸 바와 같이, 미세구멍의 평면형상에 내접하는 최대원의 직경이 미세구멍에 고정되는 세포의 직경보다 작은 경우에는, 미세구멍에 고정된 세포가 미세구멍의 바닥면에 접촉하지 않고, 미세구멍의 바닥면에 배치한 인식 분자와 세포 표면의 특정 물질이 결합할 수 없게 되어, 본 발명의 요건을 충족시킬 수 없다.

그러나, 도 8에 나타낸 바와 같이, 미세구멍의 평면형상에 내접하는 최대원의 직경이 미세구멍에 고정되는 세포보다 1∼2배 정도 크면서도 미세구멍의 깊이가 미세구멍에 고정되는 세포의 직경 이하인 경우에는, 거의 1개의 세포가 미세구멍 1개에 들어갈 확률이 높아지고, 미세구멍에 고정된 세포가 미세구멍의 바닥면에 확실하게 접촉하므로, 미세구멍의 바닥면에 배치한 인식 분자와 세포 표면의 특정 물질이 결합할 수 있어, 본 발명의 요건을 충족시킬 수 있으므로, 효과적인 세포선별을 행할 수 있다.

본 발명의 세포선별장치는, 1개의 미세구멍에 1개의 세포를 고정시킨 쪽이 보다 효율적인 세포선별을 행하는 것이 가능해지므로, 상기 절연체에 형성되는 복수의 미세구멍이, 절연체의 면에 있어서, 어느 쪽의 미세구멍으로부터도 이웃하는 미세구멍의 위치가 같은 위치에 형성되어 있는 것, 즉, 도 4의 절연체(8) 상에 형성된 미세구멍(9)으로 나타낸 바와 같이, 복수의 미세구멍이 절연체의 면에 있어서 어레이 형상으로 형성되어 있는 것이 바람직하다. 여기서, 어레이 형상이란, 미세구멍의 세로와 가로의 간격이 거의 등간격으로 배치되어 있는 것을 의미한다.

미세구멍을 어레이 형상으로 배치함으로써, 전극 간에 인가한 전압에 의해서 생기는 전계가 모든 미세구멍에 거의 균등하게 생기므로, 미세구멍에 세포가 고정될 확률도 각 미세구멍에서 동등하게 되어, 1개의 미세구멍에 1개의 세포를 고정시킬 수 있는 확률이 높아지게 된다. 또한, 1개의 미세구멍에 1개의 세포를 고정시키기 위해서는, 어레이 형상으로 형성한 미세구멍의 간격이 지나치게 좁아도 지나치게 넓어도 부적절하게 되는 일이 있다. 미세구멍의 간격이 지나치게 좁은 경우에는, 1개의 미세구멍에 복수의 세포가 고정될 확률이 높아져 결과적으로 세포가 들어가지 않은 미세구멍이 생길 확률이 높아지는 일이 있다. 또, 미세구멍의 간격이 지나치게 넓을 경우에는, 미세구멍과 미세구멍 사이에 세포가 남게 되어 버려, 세포가 들어가지 않은 미세구멍이 생길 확률이 높아지게 되는 일이 있다. 따라서, 보다 구체적으로는, 미세구멍의 서로 이웃하는 간격이, 미세구멍에 고정되는 세포의 직경의 0.5∼6배의 범위인 것이 바람직하고, 또한, 미세구멍의 간격이 고정되는 세포의 직경의 1∼2배 정도인 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명에 있어서의 미세구멍의 형상은, 원 형상으로 한정되는 것은 아니고, 삼각형이나 사각형 등의 다각형이어도 된다. 삼각형이나 사각형 등의 다각형인 경우에는, 각진 부분에서 전기력선의 집중 정도가 강화되므로, 유전 영동력은 원 형상의 미세구멍보다 강해져서 세포가 미세구멍에 고정될 확률이 높아진다고 하는 이점이 있다. 다만, 미세구멍을 어레이 형상으로 배치한 경우에는, 전후 좌우의 미세구멍으로부터의 유전 영동력이 동등하게 작용하는 쪽이, 1개의 미세구멍에 1개의 세포를 고정시킬 수 있는 확률이 높아지므로, 미세구멍의 형상은 점대칭인 것이 바람직하고, 또한, 정방형인 것이 보다 바람직하다.

도 5는, 도 4의 세포선별용기의 XX' 단면도를 나타낸 개략도이다. 상부전극(14), 스페이서(16), 절연체(8) 및 하부전극(15)을 도 5와 같이 접합시키는 수단으로서는, 각각을 접착제로 붙이거나, 가압한 상태에서 가열해서 융착시키는 방법이나, 스페이서를 표면 점착성이 있는 PDMS(poly-dimethylsiloxane)나 실리콘 시트와 같은 수지를 이용해서 제작함으로써 압착에 의해 접합시키는 방법 등, 기지의 방법을 이용하면 된다. 이와 같이 함으로써, 도 5에 나타낸 세포선별영역(1)을 형성할 수 있다.

본 발명에 있어서의 세포선별용기는, 미세구멍의 바닥면에 특정 물질과 결합성을 지닌 인식 분자를 배치하고 있다. 여기서, 특정 물질과 인식 분자의 조합의 예로서는, 예를 들어, 특정 물질로서 리간드를 표면에 제시하고 있는 세포를 선별하기 위해서는 인식 분자로서는 리셉터, 특정 물질로서 당쇄를 표면에 제시하고 있는 세포를 선별하기 위해서는 인식 분자로서는 렉틴, 특정 물질로서 항체를 표면에 제시하고 있는 세포를 선별하기 위해서는 인식 분자로서는 항원, 특정 물질로서 항원을 표면에 제시하고 있는 세포를 선별하기 위해서는 인식 분자로서는 항체인 것이 바람직하고, 특정 물질과 인식 분자가 선택적으로 결합하는 것이 가능하다면 특별히 제한은 없다. 또 미세구멍의 바닥면에 인식 분자를 배치하는 방법은, 적어도 미세구멍의 바닥면에 인식 분자가 고정되면 특별히 제한은 없고, 아마이드 결합이나 바이오틴-아비딘 결합, 티올 결합과 같은 화학결합을 이용해도 되며, 특정 물질과 결합성을 지닌 인식 분자 또는 단백질 등에 결합시킨 인식 분자가 주입된 용액을, 세포선별용기에 도입함으로써 물리흡착시켜도 된다.

상기 특정 물질이 인식 분자와 결합하는 부위 이외의 인식 분자의 부위에, 인식 분자를 미세구멍의 바닥면에 고정시키기 쉽게 하는 분자나, 단백질 등을 결합시켜도 된다. 인식 분자를 미세구멍의 바닥면에 고정시키기 쉽게 하는 분자로서는, 예를 들어, 바이오틴, 아비딘, 아미노기, 티올기, 이황화기, 및 이들을 포함하는 알킬쇄나 폴리에틸렌글라이콜쇄 등을 이용할 수 있다. 또한, 인식 분자를 미세구멍의 바닥면에 고정시키기 쉽게 하기 위한 단백질로서는, BSA(소 혈청알부민)나 BCP(BCP: Blue Carrier Immunogenic Protein), KLH(KEYHOLE LIMPET HEMOCYANIN) 등이 있다.

또, 이와 같이 인식 분자를 배치한 후, 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자의 결합 반응에 관여하지 않는 분자나 단백질을 미세구멍의 바닥면이나 절연체 표면에 접촉시켜서 화학결합이나 물리흡착시킨 것이어도 된다.

여기서, 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자의 결합 반응에 관여하지 않는 분자나 단백질을 절연체 표면에 접촉시켜서 화학결합이나 물리흡착시키는 것을 블로킹(blocking)이라고 한다. 블로킹은, 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자의 결합 반응에 무관한 분자나 단백질로 표면을 덮고, 세포 및 단백질이 표면에 비특이적으로 흡착되는 것을 방지할 목적으로 행해진다.

일반적으로, 블로킹에 이용되는 분자로서는, 알킬쇄나 폴리에틸렌글라이콜쇄 등이나 그들을 포함하는 분자 등이 있고, 블로킹에 이용되는 단백질 용액으로서는, 탈지우유(skim milk), BSA, 카제인 등을 들 수 있다.

또, 이러한 단백질은, 표면 전하나 소수상호작용에 의해 플라스틱 튜브, 마이크로 플레이트, 글라스 비드(glass bead), 절연체 등의 표면에 비특이적으로 흡착한다. 또한, 일반적으로 단백질을 흡착시키는 경우에는, 용매의 pH가 단백질의 등전점보다도 알칼리측 쪽이 양호한 것으로 되므로, 용매로서 인산완충 생리식염수(PBS), 탄산염 완충액(Na₂CO₃, NaHCO₃) 등이 이용된다.

이와 같이 블로킹함으로써, 세포 표면에 제시된 특정 물질과 인식 분자가 보다 선택적으로 결합하므로, 본 세포선별법에 의해 선별 효율을 올릴 수 있다.

또, 본 발명에 있어서의 전원은, 제1교류전원을 구비하고 있어, 필요에 따라서 제2교류전원과 직류 펄스 전원을 구비하고 있어도 된다.

제1교류전원은, 세포고정용 전원으로, 세포를 절연체에 형성된 미세구멍을 향해서 이동시켜 고정시키기 위하여 사용한다. 또한, 제2교류전원은, 세포 취출용 전원으로, 세포를 절연체에 형성된 미세구멍으로부터 유전 영동력에 의해 취출해서 선별하기 위하여 사용한다. 또한, 직류 펄스 전원은, 세포융합용 전원으로서, 본 발명에 의해 제1의 세포를 선별해서 미세구멍에 남은 제1의 세포를 대상으로, 계속해서 도입한 제2의 세포와 전기적으로 세포융합시키기 위하여 사용한다.

본 발명의 세포선별장치에 이용하는 제1교류전원은, 세포가 미세구멍에 고정될 수 있으면 특별히 제한은 없고, 예를 들어, 피크 전압이 1V∼20V 정도, 주파수 30㎑∼3㎒ 정도, 바람직하게는 1㎒∼3㎒ 정도의 정현파, 직사각형파, 삼각파, 사다리꼴파 등의 교류전압을 출력할 수 있는 교류전원 등이면 된다.

본 발명의 세포선별장치를 이용했을 경우, 1개의 미세구멍에 1개의 세포를 고정시킨 쪽이 보다 효율적인 세포선별을 행하는 것이 가능해지지만, 1개의 미세구멍에 대해서 1개의 세포를 고정시키기 위한 교류전압의 파형으로서는, 직사각형파인 것이 바람직하다. 그 이유로서, 도 9 내지 도 12에 나타낸 바와 같이, 교류전압의 파형이 정현파(도 9), 삼각파(도 10), 사다리꼴파(도 11)에 비해서, 직사각형파(도 12)는 순시에 설정한 피크 전압(31)에 도달하므로, 세포가 미세구멍으로 신속하게 움직이므로, 세포가 쌓여서 미세구멍에 들어갈 확률이 낮아지고, 따라서, 1개의 미세구멍에 대해서 1개의 세포를 고정시킬 확률이 높아지게 된다. 또한, 세포는 전기적으로 콘덴서로 간주할 수 있어, 직사각형파의 피크 전압이 변화되지 않는 동안에는, 미세구멍에 들어간 세포에는 전류가 흐르기 어렵게 되므로, 전기력선이 생기기 어려워, 세포가 들어있는 미세구멍에는 유전 영동력이 발생하기 어려워지므로, 일단 미세구멍에 세포가 들어가면, 다른 세포가 그 미세구멍에 들어갈 확률이 낮아져, 전기력선이 생겨 유전 영동력이 발생하고 있는 공간의 미세구멍에, 순차 세포가 들어가기 때문이다.

본 발명의 세포선별장치에 이용하는 교류전압의 파형은 직류성분을 갖지 않는 것이 바람직하다. 이것은, 직류성분에 의해 발생한 정전기력에 의해 세포가 특정 방향으로 치우친 힘을 받아서 이동하므로, 유전 영동력에 의해 세포를 미세구멍에 고정시키는 것이 곤란해지기 때문이다. 또, 세포를 함유하는 현탁액에 포함되는 이온이 전극 표면에서 전기반응을 일으켜 발열이 일어나고, 그것에 의해 세포가 열운동을 일으키므로, 유전 영동력에 의해 세포의 움직임을 제어할 수 없게 되어, 세포를 미세구멍에 끌어들이는 것이 곤란해지기 때문이다.

본 발명의 세포선별장치에 이용하는 제2교류전원은, 세포를 미세구멍으로부터 취출하는 것이 가능하다면 특별히 제한은 없고, 예를 들어, 피크 전압이 1V∼20V 정도, 주파수 20㎑ 미만, 바람직하게는 5㎑∼10㎑ 정도인 정현파, 직사각형파, 삼각파, 사다리꼴파 등의 교류전압을 출력할 수 있는 교류전원이면 된다.

본 발명의 세포선별장치에 이용하는 직류 펄스 전원은, 미세구멍 혹은 그 근방에서 서로 접촉한 제1의 세포와 제2의 세포를 세포융합시키는 것이 가능한 직류 펄스 전압을 발생시킬 수 있으면 특별히 제한은 없고, 예를 들어, 직류 펄스 전압으로서, 50V∼1000V, 펄스폭 10㎲∼50㎲ 정도의 직류 펄스 전압을 출력할 수 있는 직류 펄스 전원이면 특별히 제한은 없다.

또, 본 발명의 세포선별장치는, 상기 세포선별용기에 있어서의 상기 세포선별영역에 면하는 상기 전극의 표면 및/또는 상기 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체를 배치한 전극의 절연체 표면에 양이온성 폴리머를 배치해도 된다. 양이온성 폴리머는, 전극이나 절연체 표면의 음 전하와 세포 표면에 존재하는 시알산(sialic acid)의 음 전하를, 양이온성 폴리머가 가진 양 전하에 의해 이온결합시킨다. 이 양상으로 함으로써, 본 발명의 세포선별방법에 의해 미세구멍으로부터 취출한 세포를, 상기 세포선별영역에 면하는 전극의 표면이나, 상기 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체를 배치한 전극의 절연체 표면에 부착시키는 것이 가능하여, 미세구멍으로부터 취출한 세포가 미세구멍에 재고정될 확률이 낮아져, 선별 효율을 향상시키는 것이 가능해진다.

양이온성 폴리머로서는, 예를 들어, 폴리리신, 폴리리신의 유도체, 아미노기함유 폴리머 등이 있고, 세포를 부착시킬 수 있는 양이온성 폴리머이면 특별히 제한은 없지만, 세포에 대한 독성이 낮고, 세포 부착 능력이 높은 것은 바람직하다.

또, 양이온성 폴리머는, 세포선별용기의 전극에 적절한 전압을 인가함으로써 양이온성 폴리머를 제거하는 것이 가능하여, 세포선별용기의 재이용도 용이하다.

다음에, 본 발명에 있어서의 세포선별방법에 대해서 설명한다.

본 발명의 세포선별방법은, 전술한 세포선별장치를 이용한 세포선별방법으로서, 상기 세포선별영역 내에 세포를 도입하여, 상기 제1교류전원에 의해 상기 제1교류전압을 인가해서 상기 미세구멍 내에 유전 영동력에 의해 상기 세포를 고정시키고, 상기 미세구멍의 바닥면에 배치한 상기 인식 분자(예를 들어, 항원)와 세포 표면의 특정 물질(예를 들어, 항체)을 결합 반응시킨 후, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘에 의해 상기 세포 중 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포를 상기 미세구멍으로부터 취출하거나, 또는, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘에 의해 상기 세포 중 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 강하게 결합한 세포를 미세구멍에 남기는 세포선별방법이다.

여기서 특정 힘이란, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 힘으로서 세포 표면의 특정 물질과 미세구멍의 바닥면의 인식 분자와의 결합력(pN∼nN 정도)과 거의 같은 정도의 힘이면 특별히 제한은 없지만, 상기 세포선별용기에 도입하는 용액의 송액력이나, 상기 전원전환기구에 의해 전환된 상기 제2교류전원에 의한 상기 제2교류전압을 인가함으로써 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 유전 영동력이어도 되고, 미세구멍에 고정시킨 세포의 질량에 따라서 작용하는 중력이나, 세포 표면에 자성 미립자 등을 부착시켜 두면 자력이어도 된다.

또, 도 19에 나타낸 바와 같이, 세포 표면의 특정 물질(33)과 미세구멍의 바닥면의 인식 분자(34)의 결합력과 역방향의 특정 힘으로서, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 송액력(39)을 세포에 작용시키는 경우에는, 세포선별영역(1) 내에 세포가 주입되어 있지 않은 세포용액(2)을 도입하면 된다.

또한, 도 17에, 세포 표면의 특정 물질(33)과 미세구멍의 바닥면의 인식 분자(34)의 결합력과 역방향의 특정 힘으로서, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 중력(36)을 작용시킬 경우를 나타낸다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 세포선별영역(1)의 미세구멍(9)에 세포를 고정시킬 때에는, 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체를 배치한 전극이 아래쪽으로 되도록 설치하여, 세포 표면의 특정 물질(33)과 미세구멍의 바닥면의 인식 분자(34)를 결합시킨 뒤, 세포선별용기(13)를 거꾸로 해서 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체를 배치한 전극이 위쪽으로 되도록 설치하면 된다.

또, 도 18에, 세포 표면의 특정 물질(33)과 미세구멍의 바닥면의 인식 분자(34)의 결합력과 역방향의 특정 힘으로서, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향에 자력(37)을 작용시킬 경우를 나타낸다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 자성 미립자(45)를 표면에 부착시킨 세포를 이용해서, 세포선별용기(13)의 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체를 배치한 전극이 아래쪽으로 되도록 설치하고, 세포선별용기의 위쪽에 자성체(38)를 설치하면 된다. 또한, 자성 미립자를 세포에 부착시키는 방법은, 물리흡착이나, 바이오틴-아비딘 결합 등의 화학결합 등을 이용한 기지의 방법을 이용하면 된다.

이들 특정 힘 중 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용시키는 송액력은, 상기 세포선별용기에 도입하는 용액의 송액 속도의 크기를 변화시킴으로써 송액력의 크기를 용이하게 변화시킬 수 있다. 또, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용시키는 유전 영동력은, 상기 제2교류전원에 의한 상기 제2교류전압의 크기 및/또는 주파수의 크기를 변화시킴으로써 유전 영동력의 크기를 용이하게 변화시킬 수 있다. 즉, 상기 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포와, 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 강하게 결합한 세포를 선별할 때의, 선별 기준으로 되는 결합력을 임의로 설정하는 것이 가능해진다. 따라서, 특정 힘에 송액력이나 유전 영동력을 이용하면, 종래 기술에서는 곤란했던 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자에 있어서의 결합력의 크기를 기준으로 세포를 용이하게 선별하는 것이 비로소 가능해진다.

여기서, 특정 힘으로서, 중력, 자력, 송액력 혹은 유전 영동력을 거는 시간은, 목적 세포를 선별할 수 있으면 특별히 제한은 없다. 또한, 중력, 자력, 송액력 혹은 유전 영동력을 거는 시간이 어느 일정 시간까지는, 일반적으로 특정 물질과 인식 분자의 결합을 떼어 놓는 비율이 높아져, 머지않아 포화되므로, 어떤 일정한 시간 내이면, 중력, 자력, 송액력 혹은 유전 영동력을 거는 시간에 의해, 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 강하게 결합한 세포를 선별할 때의 선별 기준을 임의로 설정하는 것이 가능해진다.

또한, 본 발명의 세포선별방법은, 선별 대상으로 되는 세포나 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자의 결합력에 따라서, 상기 특정 힘이 중력, 송액력, 유전 영동력 및 자력 중 어느 하나여도 되고, 또는 어느 것인가 둘 이상의 힘을 조합시켜도 된다.

또, 본 발명의 세포선별방법에서는, 상기 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포를 미세구멍으로부터 취출하므로, 미세구멍 직경은 선별을 행하는 세포의 세포직경보다도 큰 것을 이용하는 것이 이상적이다. 그러나, 본 발명자들의 검토 결과로부터, 본 세포선별방법을 이용해서 세포융합을 행한 경우, 융합 재생 확률이 높아지므로, 미세구멍 직경과 세포직경을 거의 같은 크기로 하는 것이 바람직하다. 따라서, 후술하는 바와 같은 세포선별에 이어서 세포융합을 행할 경우, 미세구멍 직경의 크기와 세포직경의 크기가 거의 동일하게 되면, 세포가 미세구멍의 벽면에 비특이적으로 흡착되거나 하므로, 세포선별 시 상기 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포를 미세구멍으로부터 취출하기 어려워질 가능성이 있다. 이러한 경우에는, 세포를 포함하는 용액의 침투압 및/또는 비중을 변화시킴으로써, 보다 효과적으로 세포를 미세구멍으로부터 취출하는 것이 가능하다.

예를 들어, 300mM의 만니톨 용매로부터 500mM의 만니톨 용매로 용매치환함으로써, 용매의 침투압이 높아져 세포직경이 작아지므로, 세포를 미세구멍으로부터 취출하기 쉬워진다. 또, 용매를 만니톨로부터 수크로스로 용매치환하면, 수크로스의 비중의 쪽이 만니톨의 비중보다 크기 때문에, 세포에 부력이 작용하므로, 음의 유전 영동력, 송액력 혹은 자력을 이용했을 경우에 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 효과가 촉진된다. 이 방법은 수크로스 이외에도 피콜 등의 수용성 고분자를 용매에 첨가시키는 것에 의해서도 마찬가지로 세포에 부력이 작용한다.

또한, 본 발명의 세포선별방법에 있어서, 이러한 용매치환은 임의의 타이밍에서 가능하며, 세포선별 시 다른 용매로 용매치환해서 상기 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포를 미세구멍으로부터 취출한 후, 재차, 원래의 용매로 용매치환해서 용매를 원래의 것으로 되돌리는 것도 가능해서, 세포선별의 최적 용매조건과 세포융합의 최적 용매조건을 임의로 선택하는 것이 가능하다.

이하에서는, 상기 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자와의 결합력의 크기를 상기 제2교류전압의 크기, 즉, 세포에 작용하는 유전 영동력의 크기에 따라서 세포를 선별가능한 것을 예로 들어, 도면을 이용해서 더욱 상세히 설명한다.

도 1 내지 도 3 및 도 13에 본 발명의 세포선별방법의 개념도를 나타낸다.

도 1에 있어서, 미세구멍의 바닥면에 특정 물질과 결합성을 지닌 인식 분자(34)를 고정화시킨 상기 세포선별영역 내에 세포를 도입하여, 상기 제1교류전압을 인가함으로써 상기 미세구멍 내에 상기 세포를 고정시킨다. 다음에, 도 2에 나타낸 바와 같이, 세포를 미세구멍의 바닥면과 접촉시켜, 세포 표면의 특정 물질(33)과 상기 인식 분자의 결합 반응을 야기시킨다. 이어서, 도 3에 나타낸 바와 같이, 제2교류전압을 인가함으로써 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 힘(음의 유전 영동력)을 작용시킨다. 여기서, 도 13을 이용해서 상세히 설명하면, 세포 중 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자가 강하게 결합한 세포(18)는, 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자의 결합력(22) 쪽이, 음의 유전 영동력(21)보다 크기 때문에, 세포는 미세구멍에 남는다. 한편, 세포 중 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포(17)는, 음의 유전 영동력(21) 쪽이 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자의 결합력(22)보다 크기 때문에, 세포는 미세구멍으로부터 취출된다. 즉, 음의 유전 영동력의 크기를 조정함으로써, 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자의 결합력의 선별 기준을 조정해서, 세포를 선별할 수 있다. 여기서 음의 유전 영동력의 크기는, 제2교류전원의 전압이나 주파수로 제어할 수 있지만, 제2교류전원의 전압에 의해서 제어하는 것이 가장 간단하고 바람직하다. 예를 들어, 제2교류전원의 전압으로서 2.5V 내지 10V의 범위이면, 전압인가시간 30 내지 40초 정도로 선별이 가능해지지만, 세포에의 손상을 없게 하여 세포의 활성저하를 억제하기 위해서는 유전 영동력이 작용하는 범위에서 가능한 한 낮은 전압이 바람직하다.

이상과 같은 수순에 의해서, 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자의 결합력의 크기를, 상기 제2교류전압의 크기, 즉, 유전 영동력의 크기에 따라서 선별할 수 있다.

또, 본 발명의 세포선별방법은, 전술한 세포선별장치를 이용한 세포선별방법으로서, 이하에 기술하는 바와 같은 세포선별방법이어도 된다. 즉, 상기 세포선별영역 내에 제1의 세포를 도입하여, 상기 제1교류전원에 의해 상기 제1교류전압을 인가해서 상기 미세구멍 내에 상기 제1의 세포를 고정시킨다. 상기 제1의 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자를 결합 반응시켜, 전술한 특정 힘에 의해 상기 제1의 세포 중 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포를 상기 미세구멍으로부터 취출한다. 계속해서 상기 세포선별영역 내에 제2의 세포를 도입하여, 상기 미세구멍에 남은 상기 제1의 세포와 접촉시킨다. 상기 전원전환기구에 의해 상기 직류 펄스 전원으로 전환하여, 상기 직류 펄스 전압을 인가해서, 상기 미세구멍에 남은 상기 제1의 세포와 접촉한 상기 제2의 세포를 세포융합시키는 세포선별방법이어도 된다.

이러한 양상에 의해, 세포선별과 세포융합을 동일한 용기 내에서 연속해서 행하는 것이 가능하게 되므로, 상기 제1의 세포(예를 들어, 마우스 비장 세포) 중 세포 표면의 특정 물질(예를 들어, 항체)과 인식 분자(예를 들어, 항원)와의 결합력이 강한 제1의 세포를 선택해서 제2의 세포(예를 들어, 마우스 암 세포)와 세포융합시키는 것이 가능해진다. 그 때문에, 융합세포수가 대폭 감소하고, 또한, 항원과 강하게 결합하는 항체를 만드는 융합세포의 비율이 높아지므로, 세포융합 후에 항원과 강하게 결합하는 항체를 형성하는 융합세포를 세포선별하는 작업이 대폭 저감된다. 또, 본 발명의 세포선별장치에 있어서의 세포를 고정시키는 미세구멍의 수를 증가시키면(예를 들어, 100만개∼3000만개 정도), 대량의 샘플 세포를 대상으로 한 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자의 결합력의 평가에 의한 세포의 선별과 융합을, 매우 단시간에 실시하는 것이 가능해진다.

즉, 전술한 종래 기술인, ELISA법, 특허문헌 1에 기재된 방법 등에 의해 세포융합시킨 후 개개의 융합세포가 만드는 항체의 성능을 평가하는 방법이나, 자기 비즈법, 흐름 세포 측정법, 특허문헌 2 내지 4에 기재된 방법 등에 의해 세포선별한 후 별도의 장치나 용기에서 세포융합시키는 방법에 비해서, 세포선별용의 장치 및 용기와 세포융합용의 장치 및 용기를 각각 준비할 필요가 없어, 간이하고 단시간에 대량의 세포선별과 세포융합을 행할 수 있다.

또, 세포선별과 세포융합을 연속해서 동일한 용기 내에서 실시할 수 있으므로, 신속하고 효율적인 조작을 할 수 있는 동시에, 세포의 활성도 유지할 수 있다. 또한, 세포를 세포선별용기로부터 세포융합용기로 옮김으로써 생기는 세포의 손실도 대폭 저감시킬 수 있다. 또, 흐름 세포 측정법과 같은 고가의 대형 장치도 필요 없어, 저렴한 소형 장치로 세포선별과 세포융합을 연속해서 행할 수 있다.

또한, 본 발명의 세포선별방법은, 세포선별해서 미세구멍에 남은 제1의 세포와, 나중에 세포선별영역에 도입한 제2의 세포를, 제1교류전원에 의한 제1교류전압에 의해 강제적으로 접촉시켜, 제1의 세포와 제2의 세포를 쌍으로 해서 세포융합시킨다. 그 때문에, 매우 높은 융합 재생 확률을 얻는 것이 가능해지고(본 발명자들이 검토한 본 발명의 융합 재생 확률은, 세포선별하지 않은 경우에서 20/10000∼100/10000 정도), 세포선별에 의해 제1의 세포수가 대폭 감소하였다고 해도, 실질적으로 융합세포를 얻을 수 있다. 종래의 방법인 특허문헌 3에 기재된 방법이나 특허문헌 4에 기재된 방법에서는, 세포선별 후에 이용하는 세포융합법이 종래의 세포융합법인 PEG법이나 전기융합법이기 때문에, 그들의 융합 재생 확률이 일반적으로 0.2/10000 정도로 매우 낮으므로, 실질적으로 융합세포를 얻는 것이 어렵다고 하는 과제가 있었다. 본 발명의 세포선별방법에 의하면, 이들 과제를 해결하여, 세포선별 후에도 실질적으로 융합세포를 얻는 것이 비로소 가능해진다. 세포선별과 세포융합의 작업을 동일 용기에서 행하므로, 종래와 같이 용기의 치환을 행할 때에 세포를 손실할 가능성도 낮아진다.

또, 본 발명의 세포선별장치에서 세포선별 후, 혹은 세포융합 후, 미세구멍에 고정된 세포는, 용액의 pH 등을 조정하면 용이하게 인식 분자와 세포 표면의 특정 물질의 결합을 끊는 것이 가능하여, 자기 비즈법이나 특허문헌 2에 기재된 방법과 같이 목적 세포를 자기 비즈나 담체로부터 분리하는 번잡한 공정이 필요 없어, 용이하게 선별한 세포나 융합세포를 회수하는 것이 가능해진다.

또한, 본 발명의 세포선별방법에 있어서의, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향으로 작용시키는 특정 힘으로서, 송액력, 혹은 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향으로 작용시키는 유전 영동력을 이용하면, 세포선별용기에 도입하는 용액의 송액 속도의 크기나, 제2교류전원에 의한 제2교류전압의 크기나 주파수를 변화시킴으로써, 송액력이나 유전 영동력의 크기를 용이하게 변화시킬 수 있다. 그 때문에, 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포와, 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자가 강하게 결합한 세포를 선별할 때의, 선별 기준으로 되는 결합력을 임의로 설정하는 것이 가능해져서, 전술한 종래 기술에서 과제로 되고 있던 항원항체반응 등의 상기 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자에 있어서의 결합력의 크기에 의해 세포를 용이하게 선별하는 것 및 선별한 세포를 대상으로 별도의 세포와 세포융합시키는 것이 비로소 가능해진다.

또, 본 발명의 세포선별방법은, 본 발명의 세포선별장치에서 설명한 바와 같이, 미세구멍으로부터 취출한 세포를, 양이온성 폴리머를 배치한 상기 전극의 세포선별영역 측의 표면 및/또는 상기 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체를 배치한 전극의 절연체 표면에 포착시켜도 된다. 전술한 바와 같이, 양이온성 폴리머는, 전극이나 절연체 표면의 음 전하와 세포 표면에 존재하는 시알산의 음 전하를, 양이온성 폴리머가 갖는 양 전하에 의해 이온결합시키는 작용을 지닌다. 이 양상으로 함으로써, 본 발명의 세포선별방법에 의해 선별해서 미세구멍으로부터 취출한 세포를, 상기 세포선별영역에 면하는 전극의 표면이나, 상기 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체를 배치한 전극의 절연체 표면에 부착시켜, 미세구멍으로부터 취출한 세포가 미세구멍에 재고정될 확률이 낮아져서, 미세구멍에 고정된 세포와 보다 명확하게 구별해서 선별하는 것이 가능해지므로 선별 효율이 향상된다.

또, 본 발명의 세포선별장치가, 상기 세포선별용기에 있어서의 상기 세포선별영역에 면하는 상기 전극의 표면 및/또는 상기 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체를 배치한 전극의 절연체 표면에 양이온성 폴리머를 배치하지 않은 양상의 경우에는, 본 발명의 세포선별방법에 의해 선별해서 미세구멍으로부터 취출한 세포와 미세구멍에 남긴 세포를 선별한 후, 양이온성 폴리머를 포함하는 용액을 세포선별영역에 도입하고, 미세구멍으로부터 취출한 세포를 상기 세포선별영역에 면하는 전극의 표면이나, 상기 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체를 배치한 전극의 절연체 표면에 부착시켜도 된다. 이 양상에 의해, 양이온성 폴리머의 세포에 대한 독성이 염려될 경우에는, 미세구멍으로부터 취출한 세포를 상기 세포선별영역에 면하는 전극의 표면이나, 상기 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체를 배치한 전극의 절연체 표면에 부착시킨 후, 양이온성 폴리머를 포함하지 않는 용액을 세포선별영역에 도입하여, 세포선별 내의 용액을 치환해서 과잉의 양이온성 폴리머를 제거함으로써 세포에 대한 독성을 최소한으로 억제하여, 세포활성을 유지하는 것이 가능해진다.

전술한 미세구멍으로부터 취출한 세포를, 양이온성 폴리머를 배치한 상기 전극의 세포선별영역 측의 표면 및/또는 상기 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체를 배치한 전극의 절연체 표면에 포착시키는 방법은, 본 발명에 있어서의 세포선별과 세포융합을 연속해서 행할 경우에 특히 유효하다. 즉, 특정 힘에 의해 상기 제1의 세포 중 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포를 상기 미세구멍으로부터 취출한 후, 제1의 세포와 세포융합시키는 제2의 세포를 도입할 때에, 세포선별영역 내에 제2의 세포를 함유한 용액이 송액됨으로써, 미세구멍으로부터 취출한 제1의 세포가 재차 미세구멍에 들어가는 것을 방지할 수 있다. 또한, 미세구멍에 남은 제1의 세포, 즉, 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자와 결합력이 강한 제1의 세포와 제2의 세포를 보다 선택적으로 세포융합시키는 것이 가능해져, 세포융합 후에 융합세포를 선별하는 효율이 더욱 향상된다.

이하에서는, 상기 제1의 세포인 마우스 비장 세포의 세포 표면의 특정 물질인 항체와 상기 인식 분자인 항원과의 결합력의 크기를 상기 제2교류전압의 크기, 즉, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 유전 영동력의 크기에 의해서, 항원과 보다 강하게 결합하는 항체를 세포 표면에 제시하고 있는 마우스 비장 세포를 선별하고, 상기 제2의 세포인 마우스 암 세포를 도입해서 세포선별의 후 연속해서 세포융합시킴으로써, 항원과 보다 강하게 결합하는 항체를 형성하는 융합세포를 선별하는 것을 예로 들어, 도면을 이용해서 더욱 상세히 설명한다.

도 20 내지 도 26에 본 발명의 세포선별과 세포융합을 연속해서 행하는 방법의 개념도를 나타낸다.

도 20에 있어서, 특정 항체(40)와 결합하는 항원(41)을 미세구멍의 바닥면에 고정화시킨 세포선별영역(1)에 마우스 비장 세포(42)를 도입하고, 제1교류전원(5)에 의해 제1교류전압을 인가함으로써, 미세구멍(9)에 마우스 비장 세포를 고정시킨다. 다음에, 도 21에 나타낸 바와 같이, 마우스 비장 세포(42)를 미세구멍의 바닥면과 접촉시켜, 세포 표면에 제시되어 있는 항체(40)와 미세구멍의 바닥면에 고정시킨 항원(41)의 항원항체반응을 야기시켜 결합시킨다. 계속해서 도 22에 나타낸 바와 같이, 제2교류전원(6)에 의해 제2교류전압을 인가함으로써, 미세구멍으로부터 마우스 비장 세포를 취출하는 힘으로서 음의 유전 영동력(21)을 작용시킨다. 여기서, 미세구멍에 고정된 마우스 비장 세포 중 세포 표면의 항체와 항원이 강하게 결합한 세포(18)는, 그 항원과 항체의 결합력 쪽이, 음의 유전 영동력(21)보다 크기 때문에 세포는 미세구멍에 남는다. 한편, 마우스 비장 세포 중 세포 표면의 항체와 항원이 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포(17)는, 음의 유전 영동력(21) 쪽이 항원과 항체의 결합력보다 크기 때문에, 세포는 미세구멍으로부터 취출된다. 즉, 음의 유전 영동력의 크기를 조정함으로써, 세포 표면의 항체와 항원의 결합력의 선별 기준을 조정해서, 마우스 비장 세포를 선별할 수 있다. 또, 도 23에 나타낸 바와 같이, 미세구멍으로부터 취출한 마우스 비장 세포는, 폴리리신 등의 양이온성 폴리머(46)를 절연체 상에 배치함으로써, 절연체(8)에 포착시킨다. 다음에, 도 24에 나타낸 바와 같이, 재차 제1교류전원에 의해 제1교류전압을 인가하면서 세포선별영역(1)에 마우스 암 세포(43)를 도입하여, 도 25에 나타낸 바와 같이 마우스 암 세포를 미세구멍에 고정시킨다. 이때, 도 25에 나타낸 바와 같이 미세구멍으로부터 이미 취출한 마우스 비장 세포 중 세포 표면의 항체와 항원이 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포(17)는 양이온성 폴리머(46)에 의해 절연체(8)에 포착되어 있기 때문에, 유전 영동에 의해 재차 미세구멍(9)에 고정될 확률은 매우 낮다. 즉, 마우스 암 세포는, 음의 유전 영동력에 의해서 선택된 항원과 강하게 결합하는 항체를 세포 표면에 제시한 비장 세포하고만 접촉한다. 그 후, 도 26에 나타낸 바와 같이, 직류 펄스 전원(35)에 의해 직류 펄스 전압을 인가함으로써, 접촉하고 있는 마우스 비장 세포 중 세포 표면의 항체와 항원이 강하게 결합한 세포(18)와 마우스 암 세포(43)가 세포융합한다.

이상과 같은 수순에 의해서, 항원과의 결합력이 강한 항체를 세포 표면에 제시하고 있는 마우스 비장 세포와 마우스 암 세포를 선택적으로 세포융합시키는 것이 가능해져서, 얻어지는 융합세포수가 대폭 감소하고, 또한, 항원과 강하게 결합하는 항체를 만드는 융합세포의 비율이 높아지므로, 세포융합 후에 항원과 강하게 결합하는 항체를 만드는 융합세포를 세포선별하는 작업이 대폭 저감된다.

또, 본 발명의 세포선별방법은, 제2의 세포의 표면에 제1의 세포의 특정 물질을 인식하는 인식 분자를 고정시키고, 상기 특정 물질과 상기 인식 분자의 결합에 의해, 상기 제1의 세포와 상기 제2의 세포를 결합하는 세포선별방법이어도 된다.

이 양상에 의해서, 미세구멍의 바닥면에 고정된 인식 분자와 제2의 세포의 표면에 고정된 인식 분자의 양쪽에서 제1의 세포를 선별할 수 있으므로, 본 발명에 있어서, 특히 세포선별과 세포융합을 연속해서 행할 경우에, 선별 효율을 더욱 크게 향상시키는 효과가 얻어진다. 이 경우, 미세구멍의 바닥면에 고정된 인식 분자와 제2의 세포의 표면에 고정된 인식 분자는, 제1의 세포의 같은 특정 물질을 인식하는 동일한 인식 분자여도 되고, 제1의 세포의 다른 2종류의 특정 물질을 인식하는 다른 인식 분자여도 된다.

미세구멍의 바닥면에 고정된 인식 분자와 제2의 세포의 표면에 고정된 인식 분자가 제1의 세포의 같은 특정 물질을 인식하는 동일한 인식 분자인 경우에는, 제1의 세포가 비특이적으로 미세구멍에 고정되어 버릴 경우 등이 있을 수 있다. 제1의 세포가 비특이적으로 미세구멍에 고정되어 버릴 경우 등에는, 제2의 세포의 인식 분자로 재차 선별되므로, 세포선별의 정밀도를 향상시켜서 제1의 세포와 제2의 세포를 세포융합시킬 수 있기 때문에, 더욱 세포선별 효율이 향상된다.

또, 미세구멍의 바닥면에 고정된 인식 분자와 제2의 세포의 표면에 고정된 인식 분자가 제1의 세포의 다른 2종류의 특정 물질을 인식하는 다른 인식 분자인 경우에는, 예를 들어, 미세구멍의 바닥면에는 특정 항원을 고정시켜 두고, 항원과 강하게 결합하는 항체를 표면에 제시하고 있는 제1의 세포를 선별한다. 제2의 세포의 표면에는 IgG 항체를 선별하는 항IgG 항체를 고정시켜 둠으로써, 특정 항원과 강하게 결합하고 또한 IgG 부류의 항체(일반적으로, 단일클론항체로서는, IgG 부류의 항체가 이용되고, IgM 부류의 항체는 이용되지 않음)를 표면에 많이 제시하고 있는 제1의 세포만 선별한다. 따라서, 제1의 세포와 제2의 세포를 세포융합시키는 것이 가능하게 되므로, 더욱 세포선별 효율이 향상된다. 여기서, 제2의 세포에 고정되는 인식 분자는 IgG 항체로 한정되지 않고, 본 발명의 요지를 일탈하지 않는 범위이면 특별히 제한은 없고 임의로 변경이 가능하다. 예를 들어, 상기 예 이외에도, 미세구멍에는 특정 항원을 고정시켜 두고, 항원과 강하게 결합하는 항체를 표면에 제시하고 있는 제1의 세포를 선별한다. 또한, 제2의 세포의 표면에는 제1의 세포의 표면에 제시하고 있는 CD138을 선별하는 인식 분자를 고정시켜 둠으로써, 특정 항원과 강하게 결합하고 또한 항체를 세포로부터 분비되는 타입의 플라스마세포만 제1의 세포로부터 선별하여, 제1의 세포와 제2의 세포를 세포융합시키는 것이 가능해진다.

또한, 상기 양상의 경우에는, 미세구멍과 제1의 세포는 미세구멍에 고정된 인식 분자와 세포 표면의 특정 물질의 결합에 의해 고정되어 있고, 또한, 제1의 세포와 제2의 세포는, 제1의 세포 표면의 특정 물질과 제2의 세포의 표면에 고정된 인식 분자와 결합하여 접촉하고 있어, 미세구멍으로부터 제1의 세포와 제2의 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘을 걸었을 경우, 미세구멍에 고정된 인식 분자와 강하게 결합한 특정 물질을 표면에 제시하고 있는 제1의 세포와, 제1의 세포의 표면의 특정 물질과 강하게 결합한 인식 분자를 표면에 고정시킨 제2의 세포만이 쌍으로 되어서 미세구멍에 남는다. 따라서, 미세구멍으로부터 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘을 건 채 직류 펄스 전압을 인가함으로써, 세포융합시키는 것이 가능해진다. 이것에 의해, 특정 힘에 의해 미세구멍으로부터 취출한 제1의 세포와 제2의 세포는 항상 미세구멍으로부터 취출된 채로 되므로, 특정 물질과 인식 분자의 결합이 약한 제1의 세포와 제2의 세포가 세포융합할 확률이 감소되고, 특정 물질과 인식 분자의 결합의 강한 제1의 세포와 제2의 세포가 세포융합할 확률이 높아지므로, 융합세포의 선별 효율을 더욱 향상시키는 것이 가능해진다.

도 27 내지 도 34에 본 발명에 있어서의, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘을 작용시킨 채 직류 펄스 전압을 인가함으로써 세포선별과 세포융합을 연속해서 행하는 방법의 개념도를 나타낸다.

도 27에 있어서, 미세구멍의 바닥면에 특정 항체(40)와 결합하는 항원(41)을 고정화시킨 세포선별영역(1)에 마우스 비장 세포(42)를 도입하고, 제1교류전원(5)에 의해 제1교류전압을 인가함으로써, 미세구멍(9)에 마우스 비장 세포를 고정시킨다. 다음에, 도 28에 나타낸 바와 같이, 마우스 비장 세포(42)를 미세구멍의 바닥면과 접촉시켜, 세포 표면에 제시하고 있는 항체(40)와 미세구멍의 바닥면에 고정시킨 항원(41)의 항원항체반응을 야기시켜 결합시킨다. 계속해서, 도 29에 나타낸 바와 같이, 제2교류전원(6)에 의해 제2교류전압을 인가함으로써, 미세구멍(9)으로부터 마우스 비장 세포를 취출하는 힘으로서 음의 유전 영동력(21)을 작용시킨다. 여기서, 미세구멍에 고정된 마우스 비장 세포 중 세포 표면의 항체와 항원이 강하게 결합한 세포(18)는, 그 항원과 항체의 결합력 쪽이 음의 유전 영동력보다 크기 때문에, 세포는 미세구멍에 남는다. 한편, 마우스 비장 세포 중 세포 표면의 항체와 항원이 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포(17)는, 음의 유전 영동력 쪽이 항원과 항체의 결합력보다 크기 때문에, 세포는 미세구멍으로부터 취출된다. 즉, 음의 유전 영동력의 크기를 조정함으로써, 세포 표면의 항체와 항원의 결합력의 선별 기준을 조정해서, 마우스 비장 세포를 선별할 수 있다.

또, 도 30에 나타낸 바와 같이, 미세구멍으로부터 취출한 마우스 비장 세포는, 폴리리신 등의 양이온성 폴리머(46)를 절연체 상에 배치함으로써, 절연체(8)에 포착시킨다. 다음에, 도 31에 나타낸 바와 같이, 재차 제1교류전원에 의해 제1교류전압을 인가해서 세포선별영역에 표면에 제시하고 있는 항IgG 항체(44)를 고정시킨 마우스 암 세포(43)를 도입하고, 도 32에 나타낸 바와 같이 마우스 암 세포를 미세구멍에 고정시킨다. 이때, 도 32에 나타낸 바와 같이 미세구멍으로부터 이미 취출한 마우스 비장 세포(17)는 양이온성 폴리머(46)에 의해 절연체(8)에 포착되어 있기 때문에, 유전 영동에 의해 재차 미세구멍에 고정될 확률은 매우 낮다. 즉, 마우스 암 세포는, 음의 유전 영동력에 의해서 선택된 항원과 강하게 결합하는 항체를 세포 표면에 제시하고 있는 마우스 비장 세포하고만 접촉한다. 다음에, 도 32에 나타낸 바와 같이, 마우스 비장 세포의 세포 표면의 항체 중 IgG 타입의 항체(47)와, 마우스 암 세포의 표면에 제시하고 있는 항IgG 항체(44)를 항원항체결합시킨다. 다음에, 도 33에 나타낸 바와 같이, 미세구멍(9)으로부터 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 음의 유전 영동력(21)을, 제2교류전원(6)에 의한 제2교류전압을 인가해서 작용시킨다. 이때, 음의 유전 영동력(21)에 의해 마우스 비장 세포 중 IgG 타입의 항체를 표면에 제시하고 있는 비율이 적은 마우스 비장 세포(48)로부터 마우스 암 세포(43)는 떨어지지만, 마우스 비장 세포 중 IgG 타입의 항체를 표면에 제시하고 있는 비율이 많은 마우스 비장 세포(49)는 마우스 암 세포(43)와 접촉한 채 남는다. 그 후, 도 34에 나타낸 바와 같이, 제2교류전원(6)에 의한 제2교류전압을 인가한 채, 즉, 미세구멍(9)으로부터 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 음의 유전 영동력(21)을 건 채 직류 펄스 전원(35)에 의해 직류 펄스 전압을 인가함으로써, 접촉하고 있는 마우스 비장 세포와 마우스 암 세포만이 세포융합한다.

이상과 같은 수순에 의해서, 항원과의 결합력이 강한 항체를 세포 표면에 노출시키고, 또한, 항체의 부류가 IgG인 항체를 표면에 많이 제시하고 있는 마우스 비장 세포와 마우스 암 세포를 선택적으로 세포융합하는 것이 가능해져서, 얻어지는 융합세포의 수가 더욱 대폭 저감되는 동시에, 얻어진 융합세포 중, 항원과의 결합력이 강하면서도 IgG 항체를 만드는 융합세포의 비율이 높아지므로, 세포융합 후의 강한 항체를 형성하는 융합세포를 선별하는 작업량이 더욱 대폭 경감된다.

여기서, 제2의 세포의 표면에 인식 분자를 고정시키는 방법은, 적어도 제2의 세포의 표면에 인식 분자가 고정되면 특별히 제한은 없고, 예를 들어, 특정 물질과 결합성을 지닌 인식 분자용액에 제2의 세포의 표면과 인식 분자를 접촉시켜서 물리흡착시켜도 되고, 아마이드 결합이나 바이오틴-아비딘 결합, 티올 결합과 같은 화학결합을 사용해도 된다. 여기서, 상기 특정 물질이 인식 분자와 결합하는 부위 이외의 인식 분자의 부위에, 인식 분자를 제2의 세포의 표면에 고정시키기 쉽게 하기 위한 분자나 단백질 등을 결합시켜서, 제2의 세포의 표면에 고정시켜도 된다. 인식 분자를 제2의 세포의 표면에 고정시키기 쉽게 하기 위한 분자로서는, 예를 들어, 바이오틴, 아비딘, 티올기, 이황화기 및 이들을 포함하는 알킬쇄나 폴리에틸렌글라이콜쇄 등을 이용할 수 있다. 또한, 인식 분자를 제2의 세포의 표면에 고정시키기 쉽게 하기 위한 단백질로서는, BSA나 BCP, KLH 등이 있다.

이하, 본 발명의 실시형태에 대해서 상세히 설명한다. 또, 본 발명은, 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니고, 발명의 요지를 일탈하지 않는 범위에서 임의로 변경이 가능하다.

실시예

( 실시예 1)

도 4에 실시예 1에 이용한 세포선별장치의 개념도를 나타내었다. 세포선별장치는 크게 나누어, 세포선별용기(13)와 전원(4)으로 구성된다. 세포선별용기는, 도 4에 나타낸 바와 같이, 상부전극(14)과 하부전극(15) 사이에, 스페이서(16)를 배치하고, 복수의 미세구멍을 어레이 형상으로 형성한 절연체(8)를 스페이서와 하부전극 사이에 삽입한 구조를 가진다. 또, 후술하는 바와 같이, 미세구멍은, 하부전극(15) 상에 배치한 절연체에, 일반적인 포토리소그래피와 에칭에 의해 형성하였다.

상부전극과 하부전극은, 세로 70㎜×가로 40㎜×두께 1㎜의 파이렉스(등록상표) 기판에, ITO를 성막(막두께 150㎚) 한 것을 이용하였다. 스페이서는, 세로 40㎜×가로 40㎜×두께 1.5㎜의 실리콘 시트의 중앙을 세로 20㎜×가로 20㎜로 도려낸 형상으로 해서 이용하였다. 또, 도 4에 나타낸 바와 같이, 스페이서에는, 세포선별용기에 세포를 도입, 배출하기 위해서, 세포를 도입하는 도입 유로(29) 및 그것에 연통하는 도입구(19)와, 세포를 배출하는 배출 유로(30) 및 그것에 연통하는 배출구(20)를 형성하였다.

또한, 복수의 미세구멍을 가진 절연체(8)는, 도 14에 나타낸 포토리소그래피와 에칭에 의한 방법에 의해 하부전극에 일체로 형성함으로써 제작하였다.

처음에, ITO(23)를 성막한 파이렉스(등록상표) 유리(24)의 ITO 성막면에 레지스트(25)를 5㎛의 막두께로 되도록 스핀 코터를 이용해서 도포하고, 45분 자연건조 후, 핫플레이트를 이용해서 프리베이킹(80℃, 15분)을 행하였다. 레지스트에는 자일렌계의 음화형 레지스트를 이용하였다. 다음에, 세로 30㎜×가로 30㎜의 영역에, 미세구멍과 미세구멍의 세로와 가로의 간격이 20㎛로, 세로 1500개×가로 1500개의 어레이 형상으로 나열한 직경φ8.5㎛의 미세구멍 패턴을 그린 노광용 포토마스크(26)를 이용해서, UV 노광기에서 레지스트를 노광(27)하고, 현상액(32)에서 현상하였다. 노광 시간과 현상 시간은, 미세구멍의 깊이가 레지스트의 막두께와 동등한 5㎛로 되도록 조정하고, 미세구멍의 바닥면에 ITO가 노출하도록 하였다. 현상 후, 핫플레이트를 이용해서 포스트베이킹(115℃, 30분)을 행하여 레지스트를 굳혔다.

이와 같이 해서 제작한 상부전극(14), 스페이서(16), 미세구멍형성 절연체 일체형 하부전극(28)을 도 5와 같이 적층해서 압착하였다. 도 5는, 도 4에 나타낸 세포선별용기의 XX' 단면도이다. 스페이서인 실리콘 시트의 표면은 점착성이 있어, 압착함으로써 각 부품은 밀착되어, 세포를 함유한 세포융합액 A를 빠짐없이 세포선별용기 속에 넣을 수 있었다. 스페이서를 도려낸 면적이 세로 20㎜×가로 20㎜이므로, 이 공간에 존재하는 미세구멍의 수는 약 100만개이다.

또, 미세구멍의 바닥면의 하부전극에는, 이하의 처리에 의해 에스트라다이올(estradiol)(E2)을 소혈청알부민(BSA)에 결합시켜서 얻은 E2-BSA 항원을 고정화시켰다. 즉, E2-BSA 항원용액(2.0㎍/㎖)에 미세구멍형성 절연체 일체형 하부전극를 약 12시간 담그고, 미세구멍의 바닥면의 하부전극에 E2-BSA 항원을 물리흡착 시킨 후, 순수로 세정하였다. 다음에, 항체의 비특이적 흡착을 막기 위한 블로킹으로서, 탈지우유 1% PBS용액(0.01중량% NaNO₃ 함유)으로 미세구멍형성 절연체 일체형 하부전극을 약 12시간 담그고, 미세구멍의 바닥면의 하부전극에 탈지우유로 블로킹한후, 순수로 세정하였다. 또한, 이 처리에 의해 미세구멍을 형성하는 절연체에도 E2-BSA 항원이나 탈지우유 중의 성분이 물리흡착되어 고정되지만, 실제의 조작에서는, 후술하는 바와 같이 폴리스타이렌 비즈를 미세구멍에 넣고 나서 항원항체반응을 행하므로, 절연체 표면에 E2-BSA 항원이 고정되어 있어도 본 실시예에는 크게 영향을 주지 않는다.

또한, 전극 간에 전압을 인가하는 전원(4)은 상부전극과 하부전극의 전극 간에 제1교류전압을 인가하기 위한 제1교류전원(5)과 제2교류전압을 인가하기 위한 제2교류전원(6)과, 직류 펄스 전압을 인가하기 위한 세포융합용 전원(35)으로 구성되어 있고, 이들 제1교류전원, 제2교류전원 및 세포융합용 전원은, 전원전환기구(7)에 의해 적절하게 전환하여 사용할 수 있다. 또, 제1의 전원은 세포고정용 전원이며, 제2의 전원은 세포 취출용 전원이다. 또한, 금회의 실시예에서는, 제1교류전원과 제2교류전원은 엔에프회로설계 블록사 제품인 WF1966을 이용하고, 세포융합용 전원에는 네파진 주식회사(Nenagene Co. Ltd.) 제품인 LF101을 이용하였다.

상기 미세구멍형성 절연체 일체형 하부전극으로 구성한 세포선별장치를 이용하여, 후술하는 실험을 행하였다. 또한, 금회에는 세포선별의 모델계로서, 직경 6.0㎛의 폴리스타이렌 비즈(폴리사이언스사(Polysciences, Inc) 제품, 폴리비즈(Polybead, 등록상표), 폴리스타이렌 마이크로스피어(Polystyrene Microsphere))를 이용하였다.

상기 폴리스타이렌 비즈는, 0, 0.1, 1.0, 2.0㎍/㎖의 각 농도의 항E2-마우스 항체용액을 폴리스타이렌 비즈 표면에 접촉시켜서 물리흡착시킨 후에 블로킹하고, 항 E2- 마우스 항체를 고정화시켜 두었다. 항 E2- 마우스 항체의 고정화와 블로킹 방법은, 전술한 미세구멍의 바닥면의 하부전극에 E2-BSA 항원을 고정화 및 블로킹한 것과 마찬가지 방법으로 행하였다. 여기서, 높은 농도의 항E2-마우스 항체용액에 접촉시킨 폴리스타이렌 비즈일수록, 많은 항E2-마우스 항체가 폴리스타이렌 비즈의 표면에 고정화되어 있는 것으로 추정된다. 또한, 이 항E2-마우스 항체를 표면에 고정화시킨 폴리스타이렌 비즈를 이하에서는 항체 고정화 폴리스타이렌 비즈라고 칭한다.

상기 각 항체농도에서 항체를 고정화시킨 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 현탁액 600㎕(비즈 농도: 약 1.65×10⁶개/㎖)를 스페이서의 도입구로부터 1㎖용량의 분주기를 이용해서 각각 세포선별영역에 주입하였다. 예를 들어, 항E2-마우스 항체용액의 농도는 2.0㎍/㎖이고, 세포선별영역에 도입한 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 수는 약 9.91×10⁵개이며, 세포선별영역에 존재하는 미세구멍수 약 100만개와 거의 같은 수의 항체고정화 폴리스타이렌 비즈를 도입하였다. 그 후, 5분 정도 정치시키면, 중력 침강에 의해 세포선별영역에 존재하는 미세구멍의 약 37%에 항체고정화 폴리스타이렌 비즈가 들어갔다. 즉, 최종적으로 미세구멍에 들어간 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 수는 약 3.68×10⁵개였다. 그 이외의 항체고정화 폴리스타이렌 비즈는 미세구멍과 미세구멍 사이의 절연체 상에 남았다.

여기서, 본 실시예 1 및 후술하는 실시예 2에서는, 0, 0.1, 1.0 및 2.0㎍/㎖의 각 농도의 항체고정화 폴리스타이렌 비즈를 세포선별영역에 도입했을 때, 최종적으로 미세구멍에 남은 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 수(즉, 원래 미세구멍 내에 들어있던 항체고정화 폴리스타이렌 비즈 수)를 기준으로 해서 이하에 나타낸 유지율을 계산하였다(유지율 = 미세구멍에 유지된 항체고정화 폴리스타이렌 비즈 수/원래 미세구멍 내에 들어있던 항체고정화 폴리스타이렌 비즈 수×100).

또, 미세구멍에 들어간 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 수는, 세포선별영역의 10분의 1의 영역(세포선별영역 내의 임의인 6㎜×6㎜의 영역, 본 영역 내에는 약 10만개의 미세구멍이 존재함)의 미세구멍에 유지된 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 수를 계수(count)하여, 그것을 10배로 함으로써 구하였다(이하, 실시예 2도 마찬가지임).

다음에, 실온에서 약 40분간 정치시키고, 미세구멍 속에 들어있는 항체고정화 폴리스타이렌 비즈와 미세구멍의 바닥면을 접촉시켜, 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 표면의 항체와 미세구멍의 바닥면에 고정시킨 항원과의 항원항체반응을 야기시켰다. 계속해서, 제2교류전원에 의해 각각 전압 2.5, 5.0, 7.5, 10 및 15Vpp, 주파수 3㎒의 교류전압을 전극 간에 인가하고, 1분 후의 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 상태를 관찰하였다. 또한, 폴리스타이렌 비즈는 세포와는 달리, 제2교류전압의 주파수가 높을 때(예를 들어, 1㎒∼3㎒)에 음의 유전 영동력이 작용하고, 제2교류전압의 주파수가 낮을 때(예를 들어, 1㎑∼10㎑)에 양의 유전 영동력이 작용한다.

이때 항체를 고정화시키고 있지 않은 항체고정화 폴리스타이렌 비즈(항E2-마우스 항체의 농도가 0인 항E2-마우스 항체용액으로 처리한 항체고정화 폴리스타이렌 비즈)의 경우에는, 시간경과에 따라서 원래 미세구멍 내에 들어있던 항체고정화 폴리스타이렌 비즈에 대해서 대부분의 항체고정화 폴리스타이렌 비즈가 미세구멍으로부터 이탈되고, 전압 7.5V, 1분 인가 후에는, 원래 미세구멍 내에 들어있던 항체고정화 폴리스타이렌 비즈(약 3.45×10⁵개)에 대해서, 0.7%(약 2.42×10³개)의 항체고정화 폴리스타이렌 비즈밖에 미세구멍에 유지되고 있지 않았다.

또, 항E2-마우스 항체용액의 농도 0.1㎍/㎖의 비교적 낮은 농도의 항E2-마우스 항체용액으로 처리한 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 경우에는, 전압 7.5V, 1분간 인가 후에는, 원래 미세구멍 내에 들어있던 항체고정화 폴리스타이렌 비즈(약 3.12×10⁵개)에 대해서, 약 5.0%(약 1.56×10⁴개)의 항체고정화 폴리스타이렌 비즈가 미세구멍에 유지되었다. 또한, 도 15에 나타낸 바와 같이, 인가전압을 올림에 따라서, 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 미세구멍으로부터의 이탈의 비율은 증가하였다.

또한, 항E2-마우스 항체용액의 농도 2.0㎍/㎖의 비교적 높은 농도의 항E2-마우스 항체용액으로 처리한 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 경우에는, 전압 7.5V, 1분 인가 후에는, 원래 미세구멍 내에 들어있던 항체고정화 폴리스타이렌 비즈(약 3.68×10⁵개)에 대해서, 40%(약 1.47×10⁵개)의 항체고정화 폴리스타이렌 비즈가 미세구멍에 유지되었다. 또한, 도 15에 나타낸 바와 같이, 인가전압을 올림에 따라서, 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 미세구멍으로부터의 이탈의 비율은 증가하였다.

이상의 결과로부터, 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 표면에 많은 항E2-마우스 항체가 고정화되어 있을수록 미세구멍의 바닥면의 항원과의 결합력이 강한 것으로 여겨지므로, 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 표면에 고정화된 항체와 미세구멍의 바닥면에 고정화된 항원과의 결합력의 크기를, 제2교류전원의 전압의 크기에 의해 간단히, 그리고 30초 정도의 단시간에 선별할 수 있었다.

( 실시예 2)

실시예 1에서 이용한 0, 0.1, 0.5 및 2.0㎍/㎖의 각 농도의 항E2-마우스 항체용액을 이용해서 항E2 항체를 표면에 고정화시킨 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 현탁액 600㎕(비즈 농도: 약 1.65×10⁶개/㎖)를 스페이서의 도입구로부터 1㎖용량의 분주기를 이용해서 각각 세포선별영역에 도입한 후, 약 5분간 정치시켜 항체고정화 폴리스타이렌 비즈를 중력 침강시키고 나서, 더욱 실온에서 약 40분간 정치시키고, 미세구멍 속에 들어있는 항체고정화 폴리스타이렌 비즈와 미세구멍의 바닥면을 접촉시켜, 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 표면의 항체와 미세구멍의 바닥면에 고정시킨 항원과의 항원항체반응을 야기시켰다. 계속해서, 제2교류전원에 의해 전압 2.5Vpp, 주파수 3㎒의 교류전압을 전극 간에 인가하고, 시간경과에 대한 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 움직임을 관찰하였다.

이때, 항체를 고정화시키고 있지 않은 항체고정화 폴리스타이렌 비즈(항E2-마우스 항체의 농도가 0인 항E2-마우스 항체용액으로 처리한 항체고정화 폴리스타이렌 비즈)의 경우에는, 시간경과에 따라서 원래 미세구멍 내에 들어있던 항체고정화 폴리스타이렌 비즈에 대해서 많은 항체고정화 폴리스타이렌 비즈가 미세구멍으로부터 이탈되고, 1분 후에는 원래 미세구멍 내에 들어있던 항체고정화 폴리스타이렌 비즈(약 3.32×10⁵개)에 대해서, 7.6%(약 2.52×10⁴개)의 항체고정화 폴리스타이렌 비즈가 미세구멍에 남아 유지되었다. 또한, 도 16에 나타낸 바와 같이, 전압인가시간의 경과에 따라서, 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 미세구멍으로부터의 이탈의 비율은 증가하였다.

또, 항E2-마우스 항체용액의 농도 0.1㎍/㎖의 비교적 낮은 농도의 항E2-마우스 항체용액으로 처리한 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 경우에는, 1분 후에는 원래 미세구멍 내에 들어있던 항체고정화 폴리스타이렌 비즈(약 3.41×10⁵개)에 대해서, 37.5%(약 1.28×10⁵개)의 항체고정화 폴리스타이렌 비즈가 미세구멍에 유지되었다. 또한, 도 16에 나타낸 바와 같이, 전압인가시간의 경과에 따라서, 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 미세구멍으로부터의 이탈의 비율은 증가하였다.

또한, 항체고정화 폴리스타이렌 비즈 중 항E2-마우스 항체용액의 농도 2.0㎍/㎖의 비교적 높은 농도의 항E2-마우스 항체용액으로 처리한 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 경우에는, 1분 후에는 원래 미세구멍 내에 들어있던 항체고정화 폴리스타이렌 비즈(약 3.83×10⁵개)에 대해서, 55.6%(약 2.13×10⁵개)로 많은 항체고정화 폴리스타이렌 비즈가 미세구멍에 유지되었다. 또한, 도 16에 나타낸 바와 같이, 전압인가시간의 경과에 따라서, 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 미세구멍으로부터의 이탈의 비율은 증가하였다.

이상의 결과로부터, 실시예 1과 마찬가지로, 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 표면에 많은 항E2-마우스 항체가 고정화되어 있을수록, 미세구멍의 바닥면의 항원과의 결합력이 강한 것으로 여겨지므로, 항체고정화 폴리스타이렌 비즈의 표면에 고정화된 항체와 미세구멍의 바닥면에 고정화된 항원과의 결합력의 크기를, 제2교류전원의 전압인가시간에 의해 간단하게, 그리고 30초 정도의 단시간에 선별할 수 있었다.

( 실시예 3)

실시예 1과 마찬가지의 세포선별장치를 이용해서, 특정 항체를 표면에 제시하고 있는 비장 세포의 선별을 행하였다. 세포는, 면역시키고 있지 않은 마우스 비장 세포 A와, E2항원으로 면역시킨 마우스 비장 세포 B를 이용하였다. 또한, E2항원으로 면역시킨 마우스 비장 세포 B에는, 그 세포 표면에 E2 항체를 제시하고 있는 세포(이하, "항체 제시 세포"라 칭함)가 존재한다. 본 실시예 3은, 음의 유전 영동력의 크기를 결정하는 제2교류전원의 교류전압의 크기에 의해, 이 항체 제시 세포가 제시하고 있는 항체와 미세구멍의 바닥면에 고정시킨 항원과의 항원항체반응의 결합력을 식별하여, 항체 제시 세포를 선별하는 예이다

우선, 마우스 비장 세포 A 및 마우스 비장 세포 B를, 각각 300mM 농도의 만니톨 수용액에 현탁시켜, 0.7 ×10⁶개/㎖의 밀도로 되도록 세포현탁액을 조정하였다.

다음에, 상기 마우스 비장 세포 A의 세포현탁액 600㎕를 스페이서의 도입구로부터 1㎖용량의 분주기를 이용해서 주입하였다. 또한, 이 세포현탁액에 들어있는 마우스 비장 세포 A의 세포수를 계수한 바, 약 4.11×10⁵개였다. 제1교류전원에 의해 전압 10Vpp, 주파수 3㎒의 직사각형파 교류전압을 전극 간에 인가한 바, 2∼3초 정도의 매우 짧은 시간에 어레이 형상으로 형성한 복수의 미세구멍의 1개에 거의 1개의 마우스 비장 세포 A를, 약 38%의 미세구멍에 고정시킬 수 있었다. 즉, 미세구멍에 고정된 마우스 비장 세포 A의 수는 약 3.80×10⁵개였다.

또한, 미세구멍에 고정된 비장 세포의 수는, 실시예 1과 마찬가지로, 세포선별영역의 10분의 1의 영역(세포선별영역 내의 임의의 6㎜×6㎜의 영역, 본 영역 내에는 약 10만개의 미세구멍이 존재함)의 미세구멍에 유지된 비장 세포의 수를 계수하여, 그것을 10배로 함으로써 구하였다(이하, 본 실시예에 있어서의 미세구멍에 고정된 비장 세포의 수는 마찬가지 방법으로 구하였다).

다음에, 마우스 비장 세포 A와 미세구멍의 바닥면을 접촉시켜, 약 40분간 실온에서 정치시켰다. 그 사이에, 마우스 비장 세포 A의 표면에 E2 항체가 제시되어 있으면, 미세구멍의 바닥면에 고정시킨 E2항원과 항원항체반응이 일어나 결합하고, 마우스 비장 세포 A의 표면에 E2 항체가 제시되어 있지 않으면, 미세구멍의 바닥면에 고정시킨 E2항원과 항원항체반응은 일어나는 일이 없어 결합하지 않는다. 계속해서, 제2교류전원에 의해 전압 5Vpp, 주파수 10㎑의 교류전압을 전극 간에 30초간 인가하여 음의 유전 영동력을 작용시킨 바, 거의 모든 마우스 비장 세포 A가 미세구멍으로부터 이탈되는 양상이 관찰되었다. 이어서, 300mM 농도의 만니톨 수용액 700㎕를 스페이서의 도입구로부터 1㎖용량의 분주기를 이용해서 주입하고, 이 미세구멍으로부터 이탈된 마우스 비장 세포 A를 배출구로부터 배출하였다. 그 후, 미세구멍에 남은 세포수를 계수한 바 약 8.2×10²개였다. 즉, 본 세포선별장치에 도입한 마우스 비장 세포 A 중 약 0.2%(= 8.2×10²/3.80×10⁵×100)의 마우스 비장 세포 A가 미세구멍에 유지되었다. 이것은, 면역시키고 있지 않은 마우스 비장 세포 A에는, 그 세포 표면에 E2 항체를 제시하고 있는 항체 제시 세포가 거의 존재하지 않으므로, 미세구멍의 바닥면에 고정시킨 E2항원과 항원항체반응이 일어나지 않았기 때문에, 거의 모든 마우스 비장 세포 A가 미세구멍으로부터 이탈된 것이라고 추정된다.

이어서, 상기 마우스 비장 세포 B의 세포현탁액 600㎕를 스페이서의 도입구로부터 1㎖용량의 분주기를 이용해서 주입하였다. 또한, 이 세포현탁액에 들어있는 마우스 비장 세포 B의 세포수를 계수한 바, 약 3.98×10⁵개였다. 제1교류전원에 의해 전압 10Vpp, 주파수 3㎒의 직사각형파 교류전압을 전극 간에 인가한 바, 2∼3초 정도의 매우 짧은 시간에 어레이 형상으로 형성한 복수의 미세구멍의 1개에 대략 1개의 마우스 비장 세포 A를 약 36%의 미세구멍에 고정시킬 수 있었다. 즉, 미세구멍에 고정된 마우스 비장 세포 A의 수는 약 3.62×10⁵개였다.

다음에, 마우스 비장 세포 B와 미세구멍의 바닥면을 접촉시켜, 약 40분간 실온에서 정치시켰다. 이 사이에, 마우스 비장 세포 B의 표면에 항E2 항체가 제시되어 있으면, 미세구멍의 바닥면에 고정시킨 E2항원과 항원항체반응이 일어나 결합하고, 마우스 비장 세포 B의 표면에 E2 항체가 제시되어 있지 않으면, 미세구멍의 바닥면에 고정시킨 E2항원과 항원항체반응은 일어나는 일이 없어 결합하지 않는다. 계속해서, 제2교류전원에 의해 전압 5Vpp, 주파수 10㎑의 교류전압을 전극 간에 30초간 인가해서 음의 유전 영동력을 작용시킨 바, 몇 개인가의 마우스 비장 세포 B가 미세구멍으로부터 이탈되는 양상이 관찰되었다. 이어서, 300mM 농도의 만니톨 수용액 700㎕를 스페이서의 도입구로부터 1㎖용량의 분주기를 이용해서 주입하고, 이 미세구멍으로부터 이탈된 마우스 비장 세포 B를 배출구로부터 배출하였다. 그 후, 미세구멍에 남은 세포수를 계수한 바 약 1.20×10⁴개였다. 즉, 본 세포선별장치에 도입한 마우스 비장 세포 B 중 약 3.3%(= 1.20×10⁴/3.62×10⁵×100)의 마우스 비장 세포 B가 미세구멍에 유지되었다. 이것은, 전압 5Vpp, 주파수 10㎑의 음의 유전 영동력에서는 유리되지 않는 강한 항원항체반응에서 결합한 마우스 비장 세포 B가 약 3.3% 존재하는 것이라고 추정된다.

이어서, 마찬가지로 상기 마우스 비장 세포 B의 세포현탁액 600㎕를 스페이서의 도입구로부터 1㎖용량의 분주기를 이용해서 주입하였다. 또한, 이 세포현탁액에 들어있는 마우스 비장 세포 B의 세포수를 계수한 바, 약 4.18×10⁵개였다. 제1교류전원에 의해 전압 10Vpp, 주파수 3㎒의 직사각형파 교류전압을 전극 간에 인가한 바, 2∼3초 정도의 매우 짧은 시간으로, 어레이 형상으로 형성한 복수의 미세구멍의 1개에 거의 1개의 마우스 비장 세포 A를, 약 39%의 미세구멍에 고정시킬 수 있었다. 즉, 미세구멍에 고정된 마우스 비장 세포 A의 수는 약 3.89×10⁵개였다.

다음에, 마우스 비장 세포 B와 미세구멍의 바닥면을 접촉시켜, 약 40분간 실온에서 정치시켰다. 이 사이에, 마우스 비장 세포 B의 표면에 E2 항체가 제시되어 있으면, 미세구멍의 바닥면에 고정시킨 E2항원과 항원항체반응이 일어나 결합하고, 마우스 비장 세포 B의 표면에 E2 항체가 제시되어 있지 않으면, 미세구멍의 바닥면에 고정시킨 E2항원과 항원항체반응은 일어나는 일이 없어 결합하지 않는다. 계속해서, 제2교류전원에 의해 전압 8Vpp, 주파수 10㎑의 교류전압을 전극 간에 30초간 인가해서 음의 유전 영동력을 작용시킨 바, 몇 개인가의 마우스 비장 세포 B가 미세구멍으로부터 이탈되는 양상이 관찰되었다. 이어서, 300mM 농도의 만니톨 수용액 700㎕를 스페이서의 도입구로부터 1㎖용량의 분주기를 이용해서 주입하고, 이 미세구멍으로부터 이탈된 마우스 비장 세포 B를 배출구로부터 배출하였다. 그 후에 미세구멍에 남은 세포수를 계수한 바 약 4.67×10³개였다. 즉, 본 세포선별장치에 도입한 마우스 비장 세포 B 중 약 1.2%(= 4.67×10³/3.89×10⁵×100)의 마우스 비장 세포 B가 미세구멍에 유지되었다. 이것은, 전압 8Vpp, 주파수 10㎑의 음의 유전 영동력보다도 강한 항원항체반응에서 결합한 마우스 비장 세포 B가 약 1.2% 존재하는 것이라고 추정된다.

이상의 사항으로부터, 음의 유전 영동력을 발생시키는 제2교류전원의 교류전압의 크기에 의해, 표면에 제시한 항체와 항원과의 결합력을 식별하여, 항체를 표면에 제시한 세포를 선별하는 것을 확인할 수 있었다.

( 비교예 1)

실시예 3과 마찬가지로 특정 항체를 표면에 제시하고 있는 비장 세포의 선별을 행하였다. 세포는, 면역시키고 있지 않은 마우스 비장 세포 A와, E2항원으로 면역시킨 마우스 비장 세포 B를 이용하였다. 본 비교예는, 마우스 비장 세포 A 및 마우스 비장 세포 B에 존재하는 항체 제시 세포를 바이오틴화 E2-BSA와 항원항체반응시킨 후, 스트렙토아비딘 자기 비즈(MACS회사 제품인 μMACS 스트렙토아비딘 키트)와 반응(바이오틴-아비딘 결합)시킴으로써, 항체 제시 세포를 선택적으로 자기 비즈에 결합시켜, 항체 제시 세포와 결합한 자기 비즈를 자석을 이용해서 선별 포집함으로써, E2 항체를 표면에 제시하고 있는 마우스 비장 세포를 선별한 예이다.

실시예 3과 마찬가지로, 면역시키고 있지 않은 마우스 비장 세포 A와, E2항원으로 면역시킨 마우스 비장 세포 B를 이용해서, 각각 완충액(MACS회사 제품 μMACS 스트렙토아비딘 키트)에 현탁시켜, 2.0 ×10⁸개/㎖의 밀도로 되도록 세포현탁액을 조정하였다. 다음에, 조정한 각 비장 세포를 바이오틴화 E2-BSA 용액과 혼합해서 항원항체반응시켰다. 이때, 바이오틴화 E2-BSA 용액과 혼합한 마우스 비장 세포 A의 수는 약 1.31×10⁸개, 마우스 비장 세포 B의 수는 약 1.55×10⁸개였다. 이 사이에, 마우스 비장 세포의 표면에 E2 항체가 제시되어 있으면, 바이오틴화 E2-BSA의 E2항원과 항원항체반응이 일어나 결합하고, 마우스 비장 세포의 표면에 E2 항체가 제시되어 있지 않으면, 바이오틴화 E2-BSA의 E2항원과 항원항체반응은 일어나는 일이 없어 결합하지 않는다.

계속해서, 항원항체반응을 거쳐서 바이오틴화한 마우스 비장 세포를, 스트렙토아비딘 자기 비즈와 혼합해서 바이오틴-아비딘 결합시켰다. 다음에, 자석을 이용해서 자기 비즈와 세포현탁액을 분리하였다. 그 후, 자기 비즈와 함께 회수된 마우스 비장 세포의 수를 계수한 바, 마우스 비장 세포 A는 약 3.91×10⁵개, 마우스 비장 세포 B의 수는 약 4.95×10⁶개였다. 또한, 자기 비즈와 함께 회수된 마우스 비장 세포의 수는, 자기 비즈와 함께 회수된 마우스 비장 세포를 완충액(MACS회사 제품인 μMACS 스트렙토아비딘 키트)으로 현탁시킨 세포현탁액을 혈구계산판 상에 적하하여 계수하였다.

이상의 사항으로부터, 상기 마우스 비장 세포 A의 경우, 약 0.3%(= 3.91×10⁵/1.31×10⁸×100)의 마우스 비장 세포 A가 자기 비즈에 유지되었다. 이것은, 면역시키고 있지 않은 마우스 비장 세포 A에는, 그 세포 표면에 항E2 항체를 제시하고 있는 항체 제시 세포가 거의 존재하지 않기 때문에, 바이오틴화 E2항원과 항원항체반응이 일어나지 않고, 따라서, 스트렙토아비딘 자기 비즈와 바이오틴-아비딘 결합이 일어나지 않아, 대부분의 마우스 비장 세포 A는 자기 비즈로 회수할 수 없었던 것으로 추정된다.

또, 상기 마우스 비장 세포 B의 경우, 약 3.2%(= 4.95×10⁶/1.55×10⁸×100)의 마우스 비장 세포 B가 자기 비즈에 유지되었다. 이것은, 바이오틴화 E2항원과 항원항체반응에서 결합한 마우스 비장 세포 B가 약 3.2% 존재하는 것이라고 추정된다.

이와 같이 본 비교예에서는 자기 비즈에 결합하는지의 여부에 의해서 마우스 비장 세포를 선별할 수는 있었지만, 자기 비즈에 고정된 항원과 비장 세포의 표면에 제시된 항체의 결합력에 따라서, 비장 세포를 선별할 수는 없었다.

( 실시예 4)

실시예 1과 같은 세포선별장치를 이용해서, 마우스 비장 세포(직경 약 6㎛)와 마우스 암 세포(직경 약 10㎛)를 이용하여, 미세구멍에서 마우스 비장 세포의 선별을 행하지 않고 세포융합했을 경우와, 미세구멍에서 마우스 비장 세포의 선별을 행하여 세포융합했을 경우의 비교를 행하였다. 이하에 실험 조작을 나타내지만, 모든 실험 기구나 시약류, 세포선별용기의 구성 부재는 멸균한 것을 이용하였다. 또한, 미세구멍에서 마우스 비장 세포의 선별을 행하지 않고 세포융합하는 세포선별장치는, 실시예 1의 세포선별장치에 있어서 미세구멍의 바닥면의 하부전극에 E2-BSA 항원을 고정시키지 않은 세포선별장치를 이용하였다.

마우스 비장 세포로서는, E2-BCP(BCP:Blue Carrier Immunogenic Protein) 복합체를 복강내 주사에 의해 10회 이상, 2주간 걸러 면역을 반복한 마우스의 비장 세포를 이용하였다. 이하에, 마우스로부터의 비장 세포의 취출 순서를 기술한다.

우선, 밀폐병 중에 키무 타올(キムタオル)을 넣고, 세보플루란(마루이시제약 제품)을 이용해서 마우스를 안락사시켰다. 70% 소독용 에탄올을 마우스에 충분히 살포한 후, 클린 벤치 내의 해부대에 주사 바늘로 고정하였다. 다음에, 핀셋으로 외피를 따내어 해부용 가위로 칼자국을 넣고, 우선 외피를 잘라내었다. 다음에, 새로운 별도의 가위를 이용해서 내피를 절개하여, 비장을 노출시켜, 핀셋을 이용해서 비장을 체외로 끌어내면서, 가위로 비장을 마우스의 몸으로부터 절단하였다. 50㎖ 원심 튜브에 10㎖의 10% FBS(소 혈청)를 포함하는 동물세포배양용의 배지(이하, "배지 A"라 칭함)를 넣어두고, 그 속에 비장을 옮겨서 요동시켜 표면을 세척하였다. 다음에, 비장을 φ9㎝ 스미론사 제품 샤알레의 뚜껑 위로 옮기고, 2개의 핀셋을 이용해서, 적출한 비장의 주변에 부착된 지방을 제거하였다. φ 9㎝ 스미론사 제품 샤알레 중에 10㎖의 배지 A를 넣고, 40㎖ 메시의 셀 스트레너(팔콘(Falcon)사 제품) 속에서 비장을 4 내지 5개의 작은 조각으로 되도록 새로운 가위로 절단하고, 5㎖ 테루모 시린지의 꼬리 부분의 평탄부를 이용해서 비장을 충분히 갈아 으깨었다. 셀 스트레너와 테루모 시린지의 꼬리 부분에 부착된 비장 세포는 배지 A로 씻어내었다. 샤알레 중의 비장 세포가 들어있는 현탁액은 50㎖ 원심 튜브로 옮겨, 샤알레를 배지 A에서 2회 세정하고, 세정액도 원심 튜브 내에서 혼합하였다. 비장 세포가 들어있는 현탁액을 1500rpm, 실온에서 5분간 원심분리 후, 상청액을 흡인기(aspirator)로 흡인하고, 비장 세포의 펠릿을 풀어내었다(解きほぐした). 다음에, 1㎖의 FBS 속에 풀어진 비장 세포를 현탁시킨 후, 적혈구 파쇄액(시그마사 제품)을 9㎖ 가해서 잘 혼합하고, 실온에서 3분간 정치시키고, 적혈구의 파쇄를 행하였다. 재차 비장 세포가 들어있는 현탁액을 1500rpm, 실온에서 5분간 원심분리 후, 상청액을 흡인기에서 흡인하고, 세포 펠릿을 풀어낸 후, 20㎖의 배지 A에 현탁하였다. 셀 스트레너를 이용해서, 50㎖ 원심 튜브 중에 비장 세포가 들어있는 현탁액을 여과하고, 이 비장 세포가 들어간 현탁액 중, 10㎖를 1500rpm, 실온에서 5분간 원심분리 후, 상청액을 흡인기로 흡인시키고, 비장 세포의 펠릿을 풀어내었다. 즉시 10㎖의 무혈청 동물세포배양용의 배지(이하, "배지 B" 칭함)에 풀린 비장 세포를 현탁시킨 후, 1500rpm, 실온에서 5분간 원심분리하고, 상청액을 흡인기로 흡인한 후, 비장 세포의 펠릿을 풀어내었다. 다음에, 300mM의 만니톨, 0.1mM의 CaCl₂, 0.2mM의 MgCl₂, 0.1mg/㎖의 BSA가 들어간 20㎖의 세포융합액(이하, "세포융합액 A"라 칭함)에 비장 세포를 현탁시킨 후, 1500rpm, 실온에서 5분간 원심분리하고, 상청액을 흡인기로 흡인한 후, 비장 세포의 펠릿을 풀어내었다. 재차 소량의 세포융합액 A에 비장 세포를 현탁시키고, 셀 스트레너를 이용해서 50㎖ 팔콘 튜브 내에 여과를 행하고 나서, 세포융합액 A로 희석시켜, 비장 세포의 최종밀도를 0.8×10⁶개/㎖로 조정한 마우스 비장 세포가 들어있는 세포융합액 A를 준비하였다. 또한, 300mM의 만니톨을 주성분으로 하는 세포융합액 A는 세포의 침투압과 거의 등장이다.

다음에, 마우스 암 세포를 준비하는 순서를 기술한다. 마우스 암 세포인 SP2/0(이하, "골수종(myeloma) 세포"라 칭함)는 항상 1×10⁶개/㎖ 이하의 밀도로 되도록, φ15㎝ 부유배양용 샤알레 중 배지 A에 현탁시키고, 37℃, 5%의 CO₂ 인큐베이터 내에서 계대시킨 것을 이용하였다. 세포융합 전날, 골수종 세포의 밀도가 2.0×10⁵개/㎖로 되도록 배지 A에 골수종 세포를 현탁시키고, φ15㎝ 부유배양용 샤알레에 배지 A의 액량 40㎖를 골수종 배양액으로서 넣고, 합계 10매의 샤알레에서 배양을 행하였다. 골수종 배양액을 샤알레로부터 원심 튜브로 옮기고, 1000rpm에서 5분간 원심분리 후, 상청액을 흡인기로 흡인하고, 골수종의 세포 펠릿을 풀어 내었다. 즉시 50㎖의 배지 B를 각 튜브에 분산되도록 가해서 골수종 세포를 현탁시켜, 1개의 튜브에 모은 후, 재차 1000rpm, 실온에서 5분간 원심분리시키고, 상청액을 흡인기로 흡인해서 골수종 세포의 펠릿을 풀어내었다. 20㎖의 배지 B를 각 튜브에 분산되도록 가해서 골수종 세포를 현탁시켜, 1개의 튜브에 모은 후, 다시 1000rpm, 실온에서 5분간 원심분리시키고, 상청액을 흡인기로 흡인해서 골수종 세포의 펠릿을 풀어내었다. 다음에, 40㎖의 세포융합액 A에 골수종 세포를 재현탁시키고, 1000rpm, 실온에서 5분간 원심분리시키고 나서, 상청액을 흡인기로 흡인하고, 골수종 세포의 펠릿을 풀어내었다. 재차 소량의 세포융합액 A에 골수종 세포를 현탁시키고, 셀 스트레너를 이용해서 50㎖ 팔콘 튜브 내에 여과를 행하고, 세포융합액 A로 희석시켜, 최종밀도를 6.7×10⁶개/㎖로 조정한 골수종 세포가 들어있는 세포융합액 A를 준비하였다.

계속해서 각각 개별의 융합 용기를 이용하여, 이하의 (방법 A) 및 (방법 B)의 방법으로 세포선별과 세포융합을 행하였다.

(방법 A)

실시예 1의 세포선별장치에 있어서 미세구멍의 바닥면의 하부전극에 E2-BSA 항원을 고정시키지 않은 세포선별용기를 이용한 세포선별장치를 사용해서 세포융합을 행하였다. 세포선별용기에 상기 마우스 비장 세포가 들어있는 세포융합액 A를 600㎕(손실분도 고려하면 마우스 비장 세포수는 약 50만개) 세포선별영역에 도입하고, 세포선별영역 내에서 비장 세포를 충분히 침강시켰다. 다음에, 제1교류전원에 의해 전압 10Vpp, 주파수 3㎒의 직사각형파 교류전압을 전극 간에 인가하고, 약 100만개의 미세구멍 중 거의 반 정도인 50만개의 미세구멍에 대해서, 거의 1개의 미세구멍에 1개씩 마우스 비장 세포를 어레이 형상으로 고정시켰다. 계속해서 골수종 세포가 들어있는 세포융합액 A를 600㎕(세포의 손실분도 고려하면, 골수종 세포수는 약 400만개) 세포선별영역에 도입하였다. 이 경우, 마우스 비장 세포의 수의 약 8배 많은 골수종 세포를 세포선별영역에 도입했으므로, 미세구멍에 고정된 마우스 비장 세포 상에, 적어도 1개의 골수종 세포가 접촉한 상태로 되어 있는 것으로 추정된다. 다음에, 전원전환기구에 의해 전원을 직류 펄스 전원(네파진 주식회사 제품, LF101)으로 전환하고, 전극 간에 전압 100V, 펄스폭 30㎲의 직류 펄스 전압을 1회 인가해서 세포융합을 행하였다.

(방법 B)

실시예 1의 세포선별장치와 마찬가지로, 미세구멍의 바닥면의 하부전극에 E2-BSA 항원을 고정시킨 세포선별용기를 이용한 세포선별장치를 사용해서, 세포선별과 세포융합을 행하였다. 상기 마우스 비장 세포가 들어있는 A를 600㎕(마우스 비장 세포수 약 50만개) 세포선별영역에 도입하고, 세포선별영역 내에서 마우스 비장 세포를 충분히 침강시킨 세포선별용기를 준비하였다. 다음에, 세포선별용기의 전극 간에 제1교류전원에 의해 전압 10Vpp, 주파수 3㎒의 직사각형파 교류전압을 인가하고, 약 100만개의 미세구멍 중 거의 반 정도인 50만개의 미세구멍에 대해서, 거의 1개의 미세구멍에 1개씩 마우스 비장 세포를 어레이 형상으로 고정시켰다. 다음에, 세포선별장치를 약 2분 정도 정치시키고, 미세구멍의 바닥면의 하부전극에 고정화된 E2-BSA와 마우스 비장 세포 표면에 제시된 E2 항체의 항원항체반응을 행하였다. 다음에, 전원전환기구에 의해 제2교류전원으로 전환하고, 제2교류전압(전압 15Vpp, 주파수 10㎑의 직사각형파 교류전압)을 세포선별용기에 인가하여, 항원항체 반응하고 있지 않은 마우스 비장 세포를 미세구멍 근방의 절연체 상에 취출함으로써 세포선별을 행하였다. 계속해서, 융합선별용기에, 마우스 골수종(mouse myeloma) 세포가 들어있는 세포융합액 A를 600㎕(마우스 골수종 세포수는 약 400만개) 세포선별영역에 도입하고, 전원전환기구에 의해 직류 펄스 전원으로 전환하여, 전극 간에 전압 100V, 펄스폭 30㎲의 직류 펄스 전압을 1회 인가해서 세포융합을 행하였다.

상기 (방법 A) 및 (방법 B)에서 세포융합을 행한 세포현탁액을 그대로 15분 정치시킨 뒤 세포선별용기 내의 세포현탁액을 HAT 배지(H: 하이포잔틴(hypoxanthine), A: 아미노프테린(aminopterine), T: 티미딘(thymidine)을 성분으로 하는 배지)에서 희석시키고, 96 구멍(혹은 "웰") 플레이트(팔콘사 제품)에 옮긴 후, CO₂ 인큐베이터에서 융합세포의 배양을 행하였다. 또한, HAT 배지는, 융합세포만을 선택적으로 증식시키는 배지이다. 6일 후에 각 웰의 융합세포의 콜로니수를 계수하여 융합 재생 확률을 산출하였다. 여기서 융합 재생 확률이란 각 융합 용기당의 「세포융합에서 생성한 융합세포의 콜로니수/도입한 마우스 비장 세포수」이다. 또한, 콜로니수를 계수한 HAT 배지를 전체 교환하고, 7일 후에 ELISA법에 의해 각 웰의 배양 상청액의 E2 친화성을 가지는 항체의 유무를 판정하였다.

ELISA법의 평가 방법은 이하와 같이 행하였다. E2-BSA를 ELISA 플레이트에 고정화시킨 후, 1% 탈지우유로 블로킹하였다. 그 후, 융합세포의 배양 상청액을 반응시켜, 알칼리 포스파타제 표지 항마우스 IgG 항체를 결합시켰다. 미반응의 효소표지항체를 B/F 분리 후, 발색기질인 파라나이트로페닐인산(PNPP)을 분주시시켜, 405㎚에서의 형광강도를 측정하였다. 측정을 행한 웰 중 형광강도가 백그라운드보다도 분명하게 높은 값인 웰을 E2 항체 양성 웰이라고 판정하고, E2 항체 양성 웰률을 산출하였다. 여기서 E2 항체 양성 웰률이란 각 세포선별용기당의 「E2 항체 양성이라고 판정된 웰수/세포융합으로 생성한 융합세포의 콜로니수」이다. 이상과 같이 해서 산출된 각 세포선별용기당의 융합 재생 확률과 E2 항체 양성 웰률은, 이하와 같이 되었다:

(방법 A) 융합 재생 확률: 16/10000, E2 항체 양성 웰률: 0.8%

(방법 B) 융합 재생 확률: 7/10000, E2 항체 양성 웰률: 1.4%.

이상의 사항으로부터, 세포선별을 행하지 않은 것(방법 A)보다도 본 발명에 의한 세포선별을 행한 쪽(방법 B)이, 얻어지는 융합세포수는 적지만(융합 재생 확률은 낮지만), E2 특이적인 항체를 생산하고 있는 융합세포의 비율이 높은 것을 나타냈다. 이상으로부터 세포융합 전에, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘에 의해, 세포 표면의 특정 물질과 미세구멍에 고정시킨 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포를, 미세구멍으로부터 취출해서 세포선별을 행함으로써, ELISA법으로 평가를 행하는 융합세포수(ELISA 플레이트수)를 절감할 수 있고, 또한 세포를 선별하는 작업량이나 작업시간을 대폭 삭감할 수 있어, 보다 단일클론항체의 개발이 효율적으로 행해지는 것이 표시되었다.

( 실시예 5)

실시예 1과 마찬가지의 세포선별장치를 이용해서, 실시예 4와 마찬가지의 실험을 행하였다. 마우스 비장 세포가 들어있는 세포융합액 A와, 마우스 골수종 세포가 들어있는 세포융합액 A를 준비하였다. 다만, 마우스 비장 세포의 밀도는 1.6×10⁶개/㎖로, 마우스 골수종 세포의 밀도는 6.7×10⁶개/㎖로 각각 조정하였다.

계속해서 각각 개별의 융합 용기를 이용해서, 이하의 (방법 C) 및 (방법 D)의 방법으로 세포선별과 세포융합을 행하였다.

(방법 C)

실시예 1의 세포선별장치에 있어서, 미세구멍의 바닥면의 하부전극에 E2-BSA 항원을 고정시키지 않은 세포선별용기를 이용한 세포선별장치를 사용해서 세포융합을 행하였다. 세포선별용기에 상기 마우스 비장 세포가 들어있는 세포융합액 A를 600㎕(손실분도 고려하면 마우스 비장 세포수는 약 100만개) 세포선별영역에 도입하고, 세포선별영역 내에서 비장 세포를 충분히 침강시켰다. 다음에, 제1교류전원에 의해 전압 10Vpp, 주파수 3㎒의 직사각형파 교류전압을 전극 간에 인가하고, 약 100만개의 미세구멍에 대해서, 거의 1개의 미세구멍에 1개씩 마우스 비장 세포를 어레이 형상으로 고정시켰다. 계속해서 골수종 세포가 들어있는 세포융합액 A를 600㎕(세포의 손실분도 고려하면, 골수종 세포수는 약 400만개) 세포선별영역에 도입하였다. 이 경우, 마우스 비장 세포의 수의 약 4배 많은 골수종 세포를 세포선별영역에 도입했으므로, 미세구멍에 고정된 마우스 비장 세포 상에, 적어도 1개의 골수종 세포가 접촉한 상태로 되어 있는 것으로 추정된다. 다음에, 전원전환기구에 의해 전원을 직류 펄스 전원(네파진 주식회사 제품, LF101)으로 전환하여, 전극 간에 전압 100V, 펄스폭 30㎲의 직류 펄스 전압을 1회 인가해서 세포융합을 행하였다.

(방법 D)

실시예 4의 방법 B의 세포선별장치와 마찬가지로, 미세구멍의 바닥면의 하부전극에 E2-BSA 항원을 고정시킨 세포선별용기를 이용한 세포선별장치를 사용해서 세포선별과 세포융합을 행하였다.

상기 마우스 비장 세포가 들어있는 세포융합액 A를 600㎕(마우스 비장 세포수 약 100만개) 세포선별영역에 도입하고, 세포선별영역 내에서 마우스 비장 세포를 충분히 침강시킨 세포선별용기를 준비하였다. 다음에, 세포선별용기의 전극 간에 제1교류전원에 의해 전압 10Vpp, 주파수 3㎒의 직사각형파 교류전압을 인가하고, 약 100만개의 미세구멍에 대해서, 거의 1개의 미세구멍에 1개씩 마우스 비장 세포를 어레이 형상으로 고정시켰다. 다음에, 세포선별장치를 약 2분 정도 정치시키고, 미세구멍의 바닥면의 하부전극에 고정화된 E2-BSA와 마우스 비장 세포 표면에 제시된 E2 항체의 항원항체반응을 행하였다. 다음에, 전원전환기구에 의해 제2교류전원으로 전환하여, 제2교류전압(전압 15Vpp, 주파수 10㎑의 직사각형파 교류전압)을 세포선별용기에 인가해서, 항원항체반응하고 있지 않은 마우스 비장 세포를 미세구멍 근방의 절연체 상에 취출함으로써 세포선별을 행하였다. 계속해서 융합선별용기에, 양이온성 폴리머의 1개인 0.01%의 폴리 L리신(시그마사 제품, 이하 "PLL"이라 약칭함)을 포함하는 세포융합액 A를 2회 도입하고, 미세구멍으로부터 취출한 마우스 비장 세포를 절연체 상에 정전기적으로 고정시켰다. 다음에, 세포융합액 A를 4회 도입하고, 과잉의 PLL 성분을 제거한 후, 마우스 골수종 세포가 들어있는 세포융합액 A를 600㎕(골수종 세포수는 약 400만개) 세포선별영역에 도입하고, 전원전환기구에 의해 직류 펄스 전원으로 전환하여, 전극 간에 전압 100V, 펄스폭 30㎲의 직류 펄스 전압을 1회 인가해서 세포융합을 행하였다.

상기 (방법 C) 및 (방법 D)에서 세포융합을 행한 세포현탁액을 그대로 15분 정치시킨 뒤, 실시예 4와 마찬가지로 세포선별용기 내의 세포현탁액을 HAT 배지에서 희석시키고, 96 구멍 플레이트(팔콘사 제품)에 옮긴 후, CO₂ 인큐베이터에서 융합세포의 배양을 행하여, 6일 후에 각 웰의 융합세포의 콜로니수를 계수해서 융합 재생 확률을 산출하였다. 또한, 콜로니수를 계수한 HAT 배지를 전체 교환하고, 실시예 4와 마찬가지로, 7일 후에 ELISA법에 의해 각 웰의 배양 상청액의 E2 친화성을 가지는 항체의 유무를 판정하였다.

이상과 같이 해서 산출된 각 세포선별용기당의 융합 재생 확률과 E2 항체 양성 웰률은 이하와 같이 되었다:

(방법 C) 융합 재생 확률: 27/10000, E2 항체 양성 웰률: 0.4%

(방법 D) 융합 재생 확률: 2/10000, E2 항체 양성 웰률: 3.8%.

이상의 사항으로부터, 세포선별을 행하지 않은 것(방법 C)보다도, 본 발명에 의해 세포선별에 부가해서 미세구멍으로부터 취출한 비장 세포를 PLL에 의해 절연체 상에 정전기적으로 고정시켜 미세구멍에의 재고정 방지를 행한 쪽(방법 D)이, 얻어지는 융합세포수는 적지만(융합 재생 확률은 낮지만), E2 특이적인 항체를 생산하고 있는 융합세포의 비율이 실시예 4보다도 더욱 높은 것을 나타내었다. 이상으로부터 세포융합 전에, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘에 의해, 세포 표면의 특정 물질과 미세구멍에 고정된 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포를 미세구멍으로부터 취출해서 세포선별을 행하고, 또 세포선별에 계속해서 미세구멍으로부터 취출한 세포를 미세구멍 이외의 부분에 보충해서 미세구멍부에의 재고정을 방지함으로써 ELISA법으로 평가를 행하는 융합세포수(ELISA 플레이트수)를 더욱더 저감시킬 수 있고, 또한 세포를 선별하는 작업량이나 작업시간을 더한층 대폭 삭감시킬 수 있어, 단일클론항체의 개발이 보다 효율적으로 행해지는 것이 표시되었다.

( 비교예 2)

비교예 1에서 선별한 마우스 비장 세포 B를 일반적인 전기융합법으로 세포융합하였다. 전기적 세포융합을 행하는 전극에는, 전극 간 1㎜의 금제의 와이어 전극(네파진 주식회사 제품, MS골드 와이어 전극)을 이용해서, 이 전극에 세포융합용 전원(네파진 주식회사 제품, LF101)을 접속하였다.

세포는, 비교예 1에서 선별한 마우스 비장 세포 B와 마우스 골수종 세포를 이용하였다. 마우스 항체생산세포 B와 마우스 골수종 세포를 4:1로 혼합하고, 양쪽의 세포를 300mM 농도의 만니톨 수용액에 현탁시켜, 1.7 ×10⁷개/㎖의 밀도로 되도록 세포현탁액을 조정하였다. 양쪽 세포현탁액에는, 세포융합에서의 세포막의 재생을 촉진시키기 위해서, 0.1mM의 염화칼슘, 0.1mM의 염화마그네슘을 첨가하였다.

상기 세포현탁액 40㎕(마우스 항체생산세포수: 약 60만개, 마우스 골수종 세포수: 약 15 만개)를 전극 사이에 주입하고, 세포융합용 전원을 이용해서, 전압20Vpp, 주파수 3㎒의 정현파 교류전압을 전극 간에 인가하였다. 세포 펄 체인의 형성을 확인 후, 세포융합을 행하기 위하여, 전압값 200V, 펄스폭 30㎲의 직류 펄스 전압을 인가하였다. 10분 정치시킨 뒤 세포선별용기 내의 세포현탁액을 HAT 배지에 주입하였다. 세포현탁액을 주입한 HAT 배지를 CO₂ 인큐베이터에 넣어서 세포배양을 행하여 6일 후에 융합세포를 계수한 결과, 융합세포를 확인할 수는 없었다. 이것은, 선별에 의해서 남게 된 마우스 비장 세포 B의 수가 적고, 세포현탁액의 밀도조정이나 원심분리에 의해, 세포융합용 전극에 마우스 비장 세포 B를 옮길 때 더욱 손실되어 적게 되어 버린 것에 부가해서, 통상의 전기융합법의 융합 재생 확률이 0.2/10000 정도로 매우 낮기 때문에, 실질적으로 융합세포를 얻을 수 없었다고 여겨진다.

본 발명의 세포선별장치와 세포선별방법에 의하면, 제1교류전원에 의한 양의 유전 영동력에 의해, 1개의 미세구멍에 1개의 세포를 고정시킬 수 있다. 또, 미세구멍으로부터 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘에 의해, 미세구멍으로부터 세포를 취출하여 개별적으로 선별할 수 있으므로, 인식 분자와 강하게 결합하는 특정 물질을 표면에 제시하고 있는 세포를 한번에 대량으로 또한 단시간에 간편하게 선별하는 것이 가능해진다. 따라서, 본 발명은 의약품 제조나 임상진단 분야에서 이용가능성이 있다.

1: 세포선별영역 2: 세포용액
3: 도전선 4: 전원
5: 제1교류전원 6: 제2교류전원
7: 전원전환기구 8: 절연체
9: 미세구멍 10: 양의 유전 영동력
11: 전기력선의 집중부위 12: 전기력선
13: 세포선별용기 14: 상부전극
15: 하부전극 16: 스페이서
17: 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포
18: 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자가 결합한 세포
19: 도입구 20: 배출구
21: 음의 유전 영동력
22: 세포 표면의 특정 물질과 인식 분자의 결합력
23: ITO 24: 파이렉스(등록상표) 유리
25: 레지스트 26: 노광용 포토마스크
27: 노광
28: 미세구멍형성 절연체 일체형 하부전극
29: 도입 유로 30: 배출 유로
31: 피크 전압 32: 현상액
33: 특정 물질 34: 인식 분자
35: 직류 펄스 전원 36: 중력
37: 자력 38: 자성체
39: 송액력 40: 항체
41: 항원 42: 마우스 비장 세포
43: 마우스 암 세포 44: 항IgG 항체
45: 자성 미립자 46: 양이온성 폴리머
47: 마우스 비장 세포의 세포 표면의 항체 중 IgG 타입의 항체
48: 마우스 비장 세포 중 IgG 타입의 항체를 표면에 제시하고 있는 비율이 적은 마우스 비장 세포
49: 마우스 비장 세포 중 IgG 타입의 항체를 표면에 제시하고 있는 비율이 많은 마우스 비장 세포
50: 세포

Claims (22)

1. 대향해서 배치되는 도전 부재로 이루어진 1쌍의 전극;
   해당 1쌍의 전극 사이에 평판 형상의 스페이서를 개재해서 배치되고, 또한 상기 대향해서 배치된 전극의 방향으로 관통한 복수의 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체로 이루어지며, 상기 절연체가 상기 전극 중 어느 한쪽의 전극면 상에 배치되고, 상기 미세구멍의 바닥면에 특정 물질에 대해서 결합성을 지닌 인식 분자를 배치한 세포선별용기; 및
   상기 1쌍의 전극에 전압을 인가하는 전원을 포함하는 세포선별장치로서,
   상기 전원이 세포고정용 전원 및 세포 취출용 전원을 구비한 것을 특징으로 하는 세포선별장치.
2. 제1항에 있어서, 상기 전원에 있어서, 상기 세포고정용 전원이 제1교류전압을 인가하는 제1교류전원으로 이루어지고, 상기 세포 취출용 전원이 제2교류전압을 인가하는 제2교류전원으로 이루어지며, 상기 제1교류전원과 상기 제2교류전원을 전환시키는 전원전환기구를 구비하는 것을 특징으로 하는 세포선별장치.
3. 제1항에 있어서, 상기 전원은 상기 세포고정용 전원 및 상기 세포 취출용 전원에 부가해서, 세포융합용 전원을 구비한 것을 특징으로 하는 세포선별장치.
4. 제3항에 있어서, 상기 전원에 있어서, 상기 세포고정용 전원이 제1교류전압을 인가하는 제1교류전원으로 이루어지고, 상기 세포 취출용 전원이 제2교류전압을 인가하는 제2교류전원으로 이루어지며, 상기 세포융합용 전원이 직류 펄스 전압을 인가하는 직류 펄스 전원으로 이루어지고, 상기 제1교류전원, 상기 제2교류전원 및 상기 직류 펄스 전원으로부터 어느 1개 또는 2개의 전원을 선택해서 접속하는 전원전환기구를 구비하는 것을 특징으로 하는 세포선별장치.
5. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 제1교류전원의 교류 주파수가 30㎑ 이상이며, 또한, 상기 제2교류전원의 교류 주파수가 20㎑ 미만인 것을 특징으로 하는 세포선별장치.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정 물질과 결합성을 지닌 인식 분자는 항원인 것을 특징으로 하는 세포선별장치.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포선별용기의 상기 1쌍의 전극 사이에 상기 스페이서를 개재해서 형성된 세포선별하는 공간인 세포선별영역에 면하는 상기 전극의 표면 및/또는 상기 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체를 배치한 전극의 절연체 표면에 양이온성 폴리머를 배치한 것을 특징으로 하는 세포선별장치.
8. 제7항에 있어서, 상기 양이온성 폴리머가 폴리리신, 또는 폴리리신의 유도체, 또는 아미노기함유 폴리머인 것을 특징으로 하는 세포선별장치.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 세포선별장치를 이용한 세포선별방법으로서,
   상기 세포선별영역 내에 세포를 도입하는 단계;
   상기 제1교류전원에 의해 상기 제1교류전압을 인가해서 상기 미세구멍 내에 상기 세포를 고정시키는 단계;
   상기 미세구멍의 바닥면에 배치한 상기 인식 분자와 세포 표면의 특정 물질을 결합 반응시키는 단계; 및
   상기 결합 반응시킨 후, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘에 의해 상기 세포 중 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포를 상기 미세구멍으로부터 취출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포선별방법.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 세포선별장치를 이용한 세포선별방법으로서,
    상기 세포선별영역 내에 세포를 도입하는 단계;
    상기 제1교류전원에 의해 상기 제1교류전압을 인가해서 상기 미세구멍 내에 상기 세포를 고정시키는 단계;
    상기 미세구멍의 바닥면에 배치한 상기 인식 분자와 세포 표면의 특정 물질을 결합 반응시키는 단계; 및
    상기 결합 반응시킨 후, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘에 의해 상기 세포 중 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 강하게 결합한 세포를 미세구멍에 남기는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포선별방법.
11. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 세포선별장치를 이용한 세포선별방법으로서,
    상기 세포선별영역 내에 세포를 도입하는 단계;
    상기 제1교류전원에 의해 상기 제1교류전압을 인가해서 상기 미세구멍 내에 상기 세포를 고정시키는 단계;
    상기 미세구멍의 바닥면에 배치한 상기 인식 분자와 세포 표면의 특정 물질을 결합 반응시키는 단계;
    상기 결합 반응시킨 후, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 특정 힘에 의해 상기 제1의 세포 중 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포를 상기 미세구멍으로부터 취출하는 단계;
    상기 취출하는 단계에 이어서, 상기 세포선별영역 내에 제2의 세포를 도입하여, 상기 미세구멍에 남은 상기 제1의 세포와 접촉시키는 단계; 및
    상기 전원전환기구에 의해 상기 직류 펄스 전원으로 전환해서 상기 직류 펄스 전압을 인가하여, 상기 미세구멍에 남은 상기 제1의 세포와 접촉한 상기 제2의 세포를 세포융합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포선별방법.
12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정 힘은 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 중력인 것을 특징으로 하는 세포선별방법.
13. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정 힘은 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 자력인 것을 특징으로 하는 세포선별방법.
14. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정 힘은 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는, 상기 세포선별용기에 도입하는 용액의 송액력(送液力)인 것을 특징으로 하는 세포선별방법.
15. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정 힘은, 상기 전원전환기구에 의해 전환된 상기 제2교류전원에 의한 상기 제2교류전압을 인가함으로써 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 유전 영동력인 것을 특징으로 하는 세포선별방법.
16. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정 힘은, 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 특정 힘 중, 둘 이상의 특정 힘의 조합인 것을 특징으로 하는 세포선별방법.
17. 제14항 또는 제16항에 있어서, 상기 특정 힘은 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 송액력이며, 상기 세포선별용기에 도입하는 용액의 송액 속도의 크기를 변화시킴으로써 상기 송액력의 크기를 변화시켜, 상기 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포와, 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 강하게 결합한 세포를 선별하는 것을 특징으로 하는 세포선별방법.
18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 특정 힘이 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 유전 영동력이며, 상기 제2교류전원에 의한 상기 제2교류전압의 크기 및/또는 주파수의 크기를 변화시킴으로써 상기 유전 영동력의 크기를 변화시켜, 상기 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 결합하고 있지 않거나 혹은 결합력이 약한 세포와 세포 표면의 특정 물질과 상기 인식 분자가 강하게 결합한 세포를 선별하는 것을 특징으로 하는 세포선별방법.
19. 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세구멍으로부터 취출한 세포를, 제7항 또는 제8항에 기재된 양이온성 폴리머를 배치한 상기 전극의 세포선별영역 측의 표면 및/또는 상기 미세구멍을 가진 평판 형상의 절연체를 배치한 전극의 절연체 표면에 포착시키는 것을 특징으로 하는 세포선별방법.
20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2의 세포의 표면에 상기 제1의 세포의 특정 물질을 인식하는 인식 분자를 고정시키고, 상기 특정 물질과 상기 인식 분자의 결합에 의해, 상기 제1의 세포와 상기 제2의 세포를 결합하는 것을 특징으로 하는 세포선별방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 미세구멍으로부터 상기 세포를 취출하는 방향으로 작용하는 상기 특정 힘을 건 채, 상기 직류 펄스 전압을 인가함으로써, 상기 제1의 세포와 상기 제2의 세포를 세포융합시키는 것을 특징으로 하는 세포선별방법.
22. 대향된 제1 및 제2전극과, 해당 전극에 교류전압을 인가하는 전원장치를 구비한 세포선별장치로서,
    제1전극의 제2전극 측 표면에 미세구멍을 지닌 절연체가 배치되고, 상기 미세구멍이 접촉한 전극 노출 부위 이외의 부분이 절연체로 덮이며, 또 제1 및 제2전극은 상기 절연체와 제2전극이 격리 배치되고, 상기 전극 노출 부위에 인식 분자가 배치되어 있으며, 그리고, 상기 전원장치는 주파수가 다른 2종류의 교류전압을 제1 및 제2전극에 인가하는 것인 세포선별장치.

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