JPH02118452A - 細胞性検体スクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は細胞性検体のスクリーニング方法に関し、さら
に詳しくは抗原抗体反応を利用し、モノクローナル抗体
産生（Ｊ１１胞のスクリーニング等の細胞工学、１１２
びに免疫診断等のバイオテクノロジーや医療分子ｆに適
用できる細胞性検体スクリーニング方法に関するもので
ある。

〔従来技術とその課題〕

近年、細胞融合技術によって化学的に純粋なモノクロー
ナル抗体を多量に得る方法が開発され、病気の診断や治
療に使用され始めている。モノクローナル抗体を作製す
る方法は、腫瘍細胞とリンパ球とを細胞融合させて得ら
れるノ＼イブリドーマの中から目的とする抗体のみを産
生じている融合細胞をスクリーニングし、これを培養す
ることによってなされている。従来のスクリーニング方
法は、ハイブリドーマを限界希釈して、１個１個に分離
し、小穴のあいた容器の穴の中で別々に増殖しながら、
目的の抗体を産生じている細胞を選び出すことによって
行なわれていた。公知のように、１つの１１１１胞は１
種類の抗体のみを産生ずるから、ｒＪ的とする細胞をス
クリーニングするには非常に多数の細胞を検査しなけれ
ばならない。このように、従来のスクリーニング方法は
多大の労力と時間が必要であった。従って、迅速にスク
リーニング出来る方法の開発が急がれている。

本発明者らは、ウィルス抗原や細胞を極めて高い感度で
検出できるレーザ磁気免疫測定法等の研究を行い、その
成果を先に特願昭６１〜２２４５６７．６１−２５２４
２７．６１−２５４１６４．６２−２２０６３．６２−
１５２７９１，６２１５２７９２．６２−１８４９０２
．６２−２６４３１９．６２−２６７４８１．６３−６
０５０として特許出願している。これらの新しい免疫測
定法は抗原抗体反応の有無の検出にレーザ光を利用し、
標識材料として磁性微粒子を用いる点に特長があり、ピ
コグラムの超微量検出が可能である。

本発明者らは上述の測定方法に基づき、磁性微粒子を抗
原あるいは抗体に標識し、初めて、ウィルスの検出等を
行なった。この新しいレーザ磁気免疫測定法は従来最も
検出感度が高いとされてい’、、ｌ　ＲＩ　Ａ法よりも
、検出感度が高いことが確認されつつある。例えば、本
発明者らが［１本ウィルス学会第３５回総会（昭和６２
年１１月　講演番号４０１１　「新しく開発した免疫測
定装置を用いたウィルスの検出実験Ｊ）で発表したよう
に、不活性化したインフルエンザウィルスΔ、ＢＩｇを
ウィルスのモデルとして用い゛Ｃ１ウィルス検出実験を
行なったところ、１ｒｎ（７中に１個程度のウィルスが
存在する場合でも検出できた。

ところが、細胞をスクリーニングする技術は前述の通り
、多大の労力と時間がかかるのが現状である。本発明者
らはさらに検討した結果、このレーザ磁気免疫ａｌｌｌ
定法がウィルスや細胞等のスクリーニングにおいてター
ゲットの細胞等の確認、定１１１に非掌に有効であるこ
とを確認し、レーザｒ残気免疫測定法の応用として、磁
性微粒子をウィルス、癌１１１１胞あるいはリンパ球な
どの検体に１：１を識することによって、ウィルスやｆ
１１１胞を分離する方法を研究し、その成果を先に特願
昭６３−１０２９１Ｇ「゛ウィルス分離方法及び分離装
置Ｊ、６３−１０２９１９ｆ検体浦集方法及び浦実装置
」として特許出願している。前者は磁気フィルタにより
ウィルスを分離するものであり、その主目的は献血血液
からウィルスを除去することにある。後者は傾斜磁界中
で磁性体片に検体を磁気吸着させて捕集するものであり
、その「Ｉ的は検体を捕集することにある。これらの技
術は効果的にウィルスやＸ■１胞を捕集したり分離する
ことが出来る。

しかしながら、抗体産生細胞等の微量の生理活性物質を
産生ずる細胞のスクリーニングの場合は抗体産生能等の
活性が損なわれ易く、また極めて少数の細胞をスクリー
ニングする必要があるため、さらに技術の改良が望まれ
る。

本発明は、上記の１１情に鑑みてなされたもので、その
目的は細胞融合技術により得たハイブリドーマ、癌細胞
、エイズやＥＢウィルスに感染したリンパ球等の方法を
提供することにある。

本発明の細胞性検体スクリーニング方法は典型的には細
胞融合技術により得たハイブリドーマや癌細胞あるいは
リンパ球などの細胞性検体のスクリーニングに適用でき
るが種々のウィルスまたは酵素、ホルモン等の生理活性
物質のような生物性単位（検体）のスクリーニングにも
ノ凶用できる。

従って、本明細書においては、細胞性検体はこれら生物
性用ｒ４を含めることができる。

［課ＭＯを解決するための手段］ 本発明に従うと、ターゲットの細胞性検体と、該ターゲ
ット細胞性検体のみに′４ｊ？異的に反応する抗体を付
加した磁性体標識抗体とを抗原抗体反応さぜる第１工程
と、該第１工程で磁気標識された該ターゲット細胞性検
体を含む細胞性検体浮遊液に傾斜磁界を作用さゼて該タ
ーゲット細胞性検体のみを水面直下に局部ンノ苫縮する
第２工程と、該第２工程の局部濃縮点に細管を仲人し、
該ターゲット細胞性検体を回収する第３工程とを少なく
とも含むことを特徴とする細胞性検体スクリーニング方
法が提供される。

「作用」 本発明によれば、ターゲラ１−細胞性検体は抗原抗体反
応で磁性体標識抗体と結合し、磁気標識されているから
、外部磁力で確実に１透導・捕捉することか出来ろ。外
部磁界として、水面直下に局部濃縮されるように設計さ
れた傾斜磁界を磁気標識されたターゲット細胞性検体を
含む細胞性検体１７遊液に作用させると、ターゲット細
胞性検体は１核局部ｉｔＮ縮点に濃縮されることになる
。そして、該局部ｉｅ縮点に細管を挿入して前記ターゲ
ット細胞性検体を回収すれば、ターゲット細胞性検体の
みをスクリーニングすることが出来る。

なお、水面直下に濃縮する理由はターゲット細胞性検体
以外の細胞の混入を出来るだけ少なくするたｙ）である
。例えば、容器の底面を局部濃縮点として選んだ場合、
異物や沈澱した細胞の混入が避けられない。また、ター
ゲット細胞性検体以外のｔ（１１胞等の混入を避けるた
めには、！４１１４１１胞性検７遊液を予め希釈して細
胞性検体浮遊密度を少な（しておくこと、該ターゲット
細胞性検体を回収する工程は、前記細管内にターケラＩ
−１４１１胞性検体を磁気的に吸引してなされることが
好ましい。

以下に図面を参照して本発明をより具体的に詳述するが
、以下に示すものは本発明の一実施例に過ぎず、本発明
の範囲を同等制限するものではない。

［実施例１コ 本実施例は細胞性検体としてハイブリドーマ細胞を用い
た例である。

第１図は本発明に従う細胞性検体スクリーニング方法の
一実施例を示す模式図であって、（ａ）は磁性体標識抗
体添加工程、（ｂ）は抗原抗体反応工程、（ｃ）は局部
濃縮工程、（ｄ）は抗原抗体反応工程、（ｅ）は回収さ
れたターゲット細胞の状態を示す。

１欠１中符号ｌは磁性体標識抗体；２は回収したいター
ゲット細胞、２−１〜２−４はその他の細胞、３は容器
、４はターゲット細胞とその他の細胞が浮遊した細胞浮
遊液、５は傾斜磁界発生装置、６はターゲット細胞を回
収するためのキャップ、８はターゲット細胞を効率よく
回収するための磁性細線である。　ターゲット細胞２及
びその他の細胞２−１〜２−４はマウスから取り出され
、種々の抗体を産生しているプラズマ細胞とミエローマ
細胞とを細胞融合して得られたハイブリドーマである。

ｎｉｉ記傾斜磁界発生装置５は５−１７１ｉ磁石と５−
２磁極片、５−３継鉄から構成されている。叩ら、電磁
石５−１から出た磁束は容器３をＳ’１通して、１ｉｆ
ｔ極片５＝−１で集められ、継ｙ′、５−３を経由して
電磁石５−１に央るように磁気回路が形成されている。

従って、該電磁石よりも断面積が充分小さい、鋭利な先
り：１１形状を何する磁極片を前記検体容器の真上に設
置すれば磁束が該磁極片に集中する傾斜磁界が発生する
ことになる。本実施例では前記電磁石の直径はｉ　２０
　ｍｍ、磁極片の直径は１２ｍｍで先口：１シ径が２．
５ａ＋ｍの円錐台形の形状をしていて、検体容器の水面
の５ｍｍＪＨの所に設置されている。該磁極片の中心部
には直径２．０ｍｍの貫通穴が設けられている。該１１
通穴には外径１．２ｆｆｉｌＴｌ、内径０．５ｍｍの毛
細管が挿入可能である。

次に、本発明の細胞スフ１．１−ニング方法を説明する
。磁性体標識抗体添加工程（ａ）においては、予め、前
記ハイブリドーマをＰＢＳ溶液で１ｍｆ２当り数百側程
度の濃度に希釈した細胞浮遊液４を容器３の中に１１用
意しておき、目的とする抗体を結合させた磁性体標識抗
体を該容器に１０μＱ添加する。抗原抗体反応工程（１
３）においては、３７°Ｃで２時間インキュベー１・す
る。局部濃縮工程（ｃ）においては、前記工程後の容器
３を傾斜磁界発生装置５にセットし、電磁石に通電する
。磁気標識されたターゲット細胞及び未反応の前記磁性
体標識抗体は通電後、直しに、該磁極片５−２直下の水
面に集まり濃縮される。この時、水面直下の’１１３縮
点の磁界は約３ｋＧである。ターゲット細胞吸引工程（
ｄ）においては、該磁極片５−２に設けられた１゛５通
穴に前記毛細管６を挿入し、該局部濃縮点に徐々に近づ
ける。該毛細管が水面に到達するとｌｌＰｔ気標識され
たターゲット細胞及び未反応の１１１１記磁性体標識抗
体は該磁極片に磁気吸引されるので該毛細管の中に進入
することになる。第２図はこの様子を拡大して示した模
式図であって、第１図の局部濃縮工程（ｃ）に対応する
局部濃縮工程（ａ）では、該磁極片の先０：ｆｊが中空
であるために磁気標識されたターゲット細胞及び未反応
の前記磁性体（；：を識抗体は該磁極片の水面直下にリ
ング上にｄ！縮されている。第１図のターゲラ１−細胞
吸引工程（ｄ）に対応するターゲット細胞吸引工程（ｂ
）では、該磁極片の貫通穴に挿入した前記毛細管を水面
に接触させると、５μＱ程度の細胞浮遊１１ｋが毛細管
現象で該毛細管の中に吸い込まれる。この時、磁界が水
面に対して垂直方向にかかっているから磁気標識された
ターゲット細胞及び未反応の前記磁性体標識抗体が磁気
吸引され、自動的に毛細管内に回収される。毛ｆ１１１
管に回収された磁気標識されたターゲット細胞等のｍが
多い場合、バンド状、あるいはスポット状になっている
から、肉眼でも容易に確認することが出来る。該毛細管
に予めキャップ７を装置しておくと、細胞浮遊液の吸引
やターゲット細胞を別の容２ｇに移し代える際に好都合
である。（ｃ）は該毛細管中の回収した細胞を示してい
る。

第１図では図示しなかったが、局部濃縮工程（ｃ）にお
いて、本発明者らが先に発明した散乱法によるレーザ磁
気免疫測定法（例えば特願昭６２−２２０６２ｒレーザ
磁気免疫測定方法及び測定装置」）を適用すれば、ター
ゲット細胞の存在１１１が測定できる。

なお、ターゲット細胞吸引工程では、毛細管を磁極片の
側面から水面に近付ける方法も、もらろん可能である。

しかしながら、本実施例の方が磁気吸引効果は高く、磁
極片が毛細管の保持・移動ガイドの役割を果たしている
から、細胞スクリーニング方法としては確実であり、装
置の構造も簡単である。

［実施例２］ 第３図は実施例１において、局部ｄ５縮工程＜ｃ＞とタ
ーゲット細胞回収工程（（ｊ）が５′シなる方法である
。即し、磁極片５−２は実施例１と異なり、中実であっ
て、第１図の局部濃縮工程（ｃ）に対応する局部濃縮工
程（ａ）においては、磁気標識されたターゲット細胞及
び未反応の前記磁性体標識抗体はスポット状に濃縮され
ている。従って、ここでは図示しなかったが、干渉法に
よるレーザ磁気免疫測定法（例えば特願昭６２−１８４
９０２ｒレーザ磁気免疫測定方法及び装置」）によって
ターゲラ（・細胞の存在量が１ｌｌｌ＋定可能である。

第１図のターゲット細胞回収工程（ｄ）に対応するター
ゲット細胞回収工程（ｂ）においては、外径２ｆｆｌｆ
ｆｉ、内径Ｑ、５ｍｍの細管の中に太さ０．３１のニッ
ケル細線８を通した該細管６を斜めから該濃縮点の水面
に挿入する。該ニッケル細線は傾斜磁界中で磁化されて
いるので、ターゲット細胞等はニッケル細線に磁気吸引
されることによって、該細管内に自動的に回収される。

なお、ニッケル細線の代わりにパーマロイ等の高透磁率
細線を用いることもできる。これらの磁性細線を用いな
いで、ｆｌｌに細管を濃縮点に挿入する場合、ターゲッ
ト細胞以外の細胞の混入の可能性があるので、本実施例
の方法が好ましい。

［発明の効果］ 以上詳述したように、本発明に従う細胞性検体スクリー
ニング方法によれば、標識物質として磁性微粒子を用い
ているから、抗原抗体反応で磁性体標識抗体と結合した
ターゲット細胞を外部磁力たがって、この特徴を利用す
ることによって、モノクローナル抗体産生細胞の迅速な
スクリーニングが出来るので、細胞工学や医学に貢献す
るところが非常に大きい。

なお、本発明者らは先に、特願昭６３−１０２９１９「
検体捕集方法及び捕集装置」として類似の技術について
特許出願しているが、本発明はきわめて少ない細胞性検
体を細胞性検体浮遊液どともに回収することに特徴があ
る。そのため、細胞等、特に細胞の損傷が少ないので、
とりわけハイブリドーマのスクリーニングに適している
。

ららろん、細胞に限らず、培養不能の未知の極めて微Ｈ
１のウィルスを直接検出できるので、ウィルス学に貢献
するところが非常に大きい。例えば、非Ａ、非Ｂの肝炎
ウィルスの発見に寄与できる。

また、ｌｉ’ｆ’ｊ細胞等の細胞レベルの早期診断にも
有効であり、癌細胞から遊離して血液等の体液中に転移
しつつある極微１１の癌細胞の回収ができる。さらに、
抗１＋；Ｔ抗体反応によって特異的に結合する酵方法に
よって回収することができる。

このように、本発明が医学・医療分野や分子生物学等の
理学分野、細胞工学、遺伝子工学等のバイオテクノロジ
ーの分野で果たす効果は計り知れない。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の詳細な説明する、細胞性検体スクリー
ニング方法の一実施例を示す模式図、第２図は第１図の
局部濃縮工程（ｃ）、ターゲット細胞吸引工程（ｄ）に
対応する局部濃縮工程（ａ）、ターゲット細胞吸引工程
（ｉ））の様子を拡大して示した模式図、第３図は実施
例２における、局部濃縮工程（ａ）とターゲット細胞回
収工程（１））の模式図である。 １・・・・・磁性体標識抗体、２・・・・・・ターゲッ
ト細胞、２−１〜２−４・・・・・・その他の細胞、３
・・・・・容器、４・・・・・・細胞浮遊液、５・・・
・・・傾斜磁界発生装置、５−１・・・・・電磁石、５
−２・・・・・・磁極片、５−３・・・・継鉄、６・・
・・・細管、７・・・・・キャップ、８・・・・・磁性
！１１１線。 第２図 局部：Ｊ總工社 （ｂ） ターγ’、、トａ藺。 戚３１ 工程 第３図 （ｏ）　　局　合ゼＡ艷奪宕工千４ 人５１工拝

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ターゲットの細胞性検体と、該ターゲット細胞性検体の
   みに特異的に反応する抗体を付加した磁性体標識抗体と
   を抗原抗体反応させる第１工程と、該第１工程で磁気標
   識されたターゲット細胞性検体を含む細胞性検体浮遊液
   に傾斜磁界を作用させて該ターゲット細胞性検体のみを
   水面直下に局部濃縮する第２工程と、該第２工程の局部
   濃縮点に細管を挿入し、該ターゲット細胞性検体を該細
   胞浮遊液とともに回収する第３工程とを少なくとも含む
   ことを特徴とする細胞性検体スクリーニング方法。