JPH01321363A - レーザ磁気免疫測定方法を実施するための検体調整方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野ゴ 本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫測定方法に関ず
ろらのである。更に詳述するならば、本発明は極めて微
量の検体から特定の抗体または抗原を定量的に検出可能
なレーザ磁気免疫測定方法を実施するための検体調整方
法に関するものである。

「従来の技術」 後天性免疫不全症候群、成人Ｔ細胞白面病等のような新
型ウィルス性疾病、あるいは各種ガンの早期検査法とし
て、抗原抗体反応を利用した免疫測定法の開発が、現在
、世界的規模で推進されている。

従来から知られる微潰免疫測定法としては、ラジオイム
ノアッセイ（以下、ＥＴＡ法と記す）、酵素イムノアッ
セイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）、蛍光イムノアッセイ（Ｆ　Ｉ　Ａ
）法等が既に実用化されている。これらの方法は、それ
ぞれアイソトープ、酵素、蛍光物質を標識として付加し
た抗原または抗体を用い、これと特異的に反応する抗体
または抗原の有無を検出する方法である。

ＲＩＡは、標識化されたアイソトープの放射線量を測定
することにより抗原抗体反応に寄与した検体量を定量す
るものであり、ピコグラム程度の超微量測定が可能な現
在唯一の方法である。しかしながら、この方法は放射性
物質を利用するので、特殊設備を必要とし、また、半減
期等による標識効果の減衰等を考慮しなければならない
ので、実施には大きな制約がある。さらに、放射性廃棄
物処理が社会問題となっている現状を考慮すると、その
実施は自ずと制限される。

一方、酵素、蛍光体を標識として用いる方法は、抗原抗
体反応に寄与した検体量を発色や発光を観測することに
より検出する方法であり、ＥＴＡ法の如き実施上の制約
はない。しかしながら、検出限界はナノグラム程度であ
る。

上述のように、従来の免疫測定法においては、高い検出
感度を有するＥＴＡ法は、放射性物質を使用するために
、その実施については多くの制約があり、一方、実施の
容易な酵素イムノアッセ（ＥＴＡ）法、蛍光イムノアッ
セイ（Ｆ’ＩＡ）法等は感度が低いため、主として抗体
検査に適用されていた。抗体検査は人体の免疫反応によ
ってつくられた抗体を検出する方法であるから、感染直
後の血中のウィルスの直接検出は原理的に不可能である
。

また、レーザ光を利用して抗原抗体反応の有無を検出す
る方法として、例えば、主に肝臓癌の検出を目的として
開発されたＡＦＰ（アルファ・フェトプロティン）を利
用した方法がある。従来のレーザ光散乱法の根本的欠点
は、検体が分散された溶液の１部分のみをレーザ照射し
て検出するために、これ以上に検出感度を高めることは
原理的に望外のものである。また、このような本質的欠
点があるため、多量の検体を必要としていた。

これに対し、本発明者らは、従来の方法とは原理を異に
する免疫測定法の研究を行ない、先に特願昭６１−２２
４５６７号、特願昭６１−２５２４２７号、特願昭６１
−２５４１６４号、特願昭６２−２２０６２号、特願昭
６２−２２０６３号、特願昭６２−１５２７９１号、特
願昭６２−１５２７９２号、特願昭６２−１８４９０２
号、特願昭６２−２６４３１９号、特願昭６２−２６７
４８１号としてレーザ磁気免疫測定法及び測定装置につ
いての発明を特許出願している。これらの新しい免疫測
定法は標識材料として磁性体微粒子を用いる点に特徴が
あり、アイソトープを用いないでピコグラムの超微量検
出が可能である。本発明者らは上述の特許に基づき、磁
性体微粒子を抗原あるいは抗体に標識し、初めて、ウィ
ルスの検出等を行なった。この新しいレーザ磁気免疫測
定法は従来量も検出感度が高いとされているＥＴＡ法よ
りも、検出感度が高いことが確認されつつある。

例えば、本発明者らが日本ウィルス学会第３５回総会（
昭和６２年１１月　講演番号４０１１ｒ新しく開発した
免疫測定装置を用いたウィルスの検出実験」）で発表し
たように、不活性化したインフルエンザウィルスＡ１Ｂ
型をウィルスのモデルとして用いて、ウィルス検出実験
を行なったところ、１ｍＱ中に１側枕度のウィルスが存
在する場合でも検出できた。レーザ光を濃縮された検体
に照射して検体からの出射光を検出する方法は、このよ
うに検出感度が非常に高い方法である。

「発明が解決しようとする課題」 ところで、上述のＥＴＡ法、ＥＴＡ法、ＥＴＡ法等の標
識法においては、それぞれアイソトープ、酵素、蛍光色
素の各標識試薬を検体に過剰に加えて、検体との間で抗
原抗体反応させた後、未反応の標識試薬を洗浄により除
去する方法が取られている。検体の亀が少なくなるほど
標識試薬が検体よりら大過剰となるため、洗浄で除去で
きずに残留する標識試薬の非特異反応が重要な問題とな
っていた。レーザ磁気免疫測定法においてら、同様に除
去できずに残留する標識試薬の非特異反応が悪影響を及
ぼすことがある。

本発明課題は、先に本発明者らが発明したレーザ磁気免
疫測定法において、非特異反応を低減するための検体調
整方法を提供することにある。

「課題を解決するための手段」 本発明に係るレーザ磁気免疫測定方法を実施するための
検体調整方法は、外部磁力によって磁性体標識抗体を局
所的に保持した磁性体標識抗体保持部に検体を注入して
該検体と前記磁性体標識抗体とを抗原抗体反応させる第
１の工程と、前記工程後に前記外部磁力を解除して前記
磁性体標識抗体を回収する第２の工程と、を少なくとも
含むことを特徴とするものである。

本発明の検体調整方法を効果的に実施するためには、前
記外部磁力が変動磁界であって、磁性体微粒子に抗体を
結合しなる磁性体標識抗体が前記磁性体標識抗体保持部
において、局所的に攪拌されることが望ましい。検体は
、局所的に攪拌され磁性体標識抗体保持部に注入される
ことによって、微量の磁性体標識抗体と効率的に反応す
ることが出来る。

本発明の実施例態様として、前記磁性体微粒子を超常磁
性体超微粒子として用いることが挙げられる。これによ
り未反応の磁性体標識抗体が混在したままでも検体を定
量することが可能となる。

また、本発明の他の実施態様として、前記磁性体標識抗
体よりも質量または体積が充分に大きな非磁性体微小球
に検体を予め捕捉しておくことが挙げられる。これによ
って、未反応の磁性体標識抗体を検体と反応した磁性体
標識検体複合体から分離することが容易になる。分離の
手段としては、遠心分離あるいはフィルターなどが適用
できる。

「作用」 本発明に従うレーザ磁気免疫測定方法を実施するための
検体調整方法は、先に本発明者らが発明して出願した磁
性体微粒子を標識物質に用いる方法に対して特有の効果
が発揮される。即ち、磁性体標識抗体は磁力で任意の場
所に誘導・固定可能である。外部磁力で該磁性体標識抗
体を反応容器内の局所に保持し、検体を該磁性体標識抗
体が存在する部分に注入する方法によって、従来大過剰
に加えていた標識試薬の量を著しく低減することが可能
になった。抗原抗体反応後、該外部磁力を解除すれば、
固定されていた該磁性体標識抗体は移動可能となるから
、適当な緩衝液を注入して検体と反応した磁性体標識抗
体を検査容器に回収することが出来る。このような検体
調整方法によって回収した磁性体標識抗体は検体と未反
応のものも含まれている。未反応の磁性体標識抗体を分
離するいわゆるＢ／Ｆ分離を行なう場合は、本発明者ら
が特許出願した発明にある検体をマクロビーズで捕捉す
る処理工程を導入することによって、遠心分離で容易に
分離できる。

即ち、該磁性体微粒子に抗体を結合して得られる磁性体
標識抗体よりも充分に大きな質量を有する非磁性体粒子
の表面上で検体を捕捉した後、該磁性体標識抗体と検体
とを抗原抗体反応させる。

検体を捕捉するための前記非磁性体粒子は磁性体であっ
てはならない。何故ならば、検体を捕捉後磁性体標識抗
体で標識する意味が無くなるからである。前記非磁性体
微粒子としては、平均粒径０゜１〜１０μｍ程度の微粒
子が好ましい。該非磁性体粒子は、例えばアクリルポリ
マー樹脂やポリスチレン樹脂等のプラスチック微小球、
あるいはシリカやアルミナ等の無機コロイド粒子などが
好ましい。

非磁性体粒子の表面に検体を捕捉する方法の一つとして
、該非磁性体粒子の表面を活性化して検体を非特異的に
吸着させる方法をとることができる。この方法は、スク
リーニング検査や、患者のうがい液からインフルエンザ
ウィルスを検出するような場合に有効である。うがい液
にはウィルスは多くても数百側程度しか存在しないし、
また、Ａ型、Ｂ型等の複数の変異株があるから、まずウ
ィルスを特定せずに確実に前記非磁性体粒子に捕捉する
目的に適している。もう一つの方法として、非磁性体粒
子の表面上に予め既知の抗体あるいは抗原を固定してお
き検体を抗原抗体反応によって特異的に結合させる方法
がある。この方法は、非特異反応をできる限り排除して
特定のウィルスのみを確実に検出する精密検査に適して
いる。

本発明の検体調整方法によって回収された検体は、遠心
によるＢ／Ｆ分離が望ましいが、フィルタによって分離
することも可能である。遠心分離の一例としては、例え
ば、１μｍのアクリルポリマー樹脂を非磁性体粒子とし
て用いた場合、該非磁性体粒子に捕捉された抗原抗体複
合体は１５００ｒｐｍ、５分間の低速遠心で沈殿する。

一方、未反応の磁性体標識抗体は沈殿せず、上清として
留まる。沈澱物を採取して、例えば、１４　Ｅ　Ｐ　Ｅ
　Ｓのような緩衝液中に抗原抗体反応体を分散させる。

以上、説明したＢ／Ｆ分離を行なう方法の他に、該磁性
体微粒子として本発明者らが先に発明し、特許出願した
超常磁性体超微粒子を用いる方法を適用すれば、未反応
の磁性体標識抗体が混在したままでも検体を定量するこ
とが可能であるから、本発明のレーザ磁気免疫測定方法
を実施するための検体調整を行なった検体を直接レーザ
磁気免疫測定装置で定量することが出来る。

以」二のようにして、本発明の検体調整は実施されろ。

本発明の検体調整方法を適用した後、前述したレーザ磁
気免疫測定法及び測定装置について技術開示している方
法で極微量の抗原あるいは抗体の検出を行うことができ
る。この新しいレーザ磁気免疫測定法はウィルスが１側
枕度でら検出できる感度がある。

以下に図面を参照して本発明をより具体的に詳述するか
、以下に示すものは本発明の一実施例に過ぎず、本発明
の技術的範囲を何等制限するしのではない。

「実施例」 笈苺例１ 第１図は本発明の１実施例の検体調整工程を説明する模
式図であって、（ａ）は磁性体標識抗体注入工程、（ｂ
）は検体注入工程、（ｃ）は検体回収工程、（ｄ）は測
定工程である。

図中、符号ｌは反応容器、２は流量調節弁、３は磁石、
４は受は皿、５は検査容器、１０ａは磁性体微粒子、ｆ
ｏｂは抗体、１０は磁性体標識抗体、１１は検体中の抗
原である。反応容器ｌは異径断面のガラス容器であって
、細くくびれた部分に磁石３がセットされている。該磁
石は該反応容器に対して移動可能である。該反応容器の
広い口からマイクロシリンジで注入された液体は流量調
整弁２によって流量が制御され、細い口から重力落下し
、受は皿４で受けられる。磁性体標識抗体ｌＯは、礁体
性微粒子１０ａと抗体１０ｂからなり、磁性体微粒子１
０ａは平均粒径５ｎｍのマグネタイト超常磁性体超微粒
子であって、その表面はデキストランで被覆され、抗体
１０ｂが該デキストランに共有結合されている。

次に、本発明の検体調整方法を説明する。磁性体標識抗
体注入工程（ａ）においては、前記流ｍ調整弁２を開き
、一定量の前記磁性体標識抗体ｌＯが含まれた緩衝液を
マイクロシリンジで前記反応容器１に注入すると、該磁
性体標識抗体ｌＯは前記磁石３によって細くくびれた該
反応容器ｌの部分で保持され、緩衝液は受は皿４に落下
する。検体注入工程（ｂ）においては、前記流量調整弁
２を調節して、マイクロシリンジで重犯反応容器ｌに注
入されていた検体が極僅かづつ受は皿４に落下するよう
にする。この工程で検体は、前記磁性体標識抗体１０が
保持された細くくびれた該反応容器１を通過する際に、
該磁性体標識抗体１０と抗原抗体反応することになる。

該反応を促進するために、反応容３１は３５°Ｃ〜３７
°Ｃに加温されていることが望ましい。流量調節弁２の
調整の目安としては、例えば、毎時１−１−１Ｏ程度が
適当である。ＩＮ　Ｉ　Ａ法等の従来の検体調整方法は
、検体溶液に大過剰の標識試薬を加えることによって検
体と標識体との接触の確率を上げていたが、本発明の方
法では、検体の磁性体標識抗体１０が保持された狭い領
域を全量ゆっくりと通過するように工夫されているから
、検体と磁性体標識抗体ｌＯとが遭遇する確率が非常に
高められる。従って、磁性体標識抗体ｌＯの添加量は従
来よりも１桁以上低減できる。

次に、検体回収工程（ｃ）においては、前記流量調節弁
２を一旦閉じ、前記磁石３を前記反応容器ｌから遠ざけ
た後、緩衝液を該反応容器ｌに所定量注入して前記磁性
体標識抗体ＩＯと結合した磁性体標識検体並びに未反応
の磁性体標識抗体１０を該緩衝液に分散させた後、該流
量調節弁２を開き、検査容器ｌに注入する。

測定工程（ｄ）においては、本発明者らが現在出願中の
レーザ磁気免疫測定方法に記載した超常磁性超微粒子を
標識に用いた。この方法は、電磁石と該電磁石に対向し
て設置された磁極片からなる傾斜磁界発生装置の中に首
記検査容器を挿入し、該検査容器の該磁極片直下の水面
に濃縮された検体からの散乱光等の出射光を検出するも
のであって、いわゆるＢ／Ｆ分離が不要な方法である。

即ち、検体と抗原抗体反応した磁性体標識抗体は未反応
の磁性体標識抗体よりも体積が増大するため、ブラウン
運動が不活発となるから首記傾斜磁界発生装置で濃縮す
る際に未反応のものよりも濃縮されやすいことを利用す
る方法である。例えば、散乱光の経時変化パターンから
、反応したものと未反応のものとを識別ずろことが出来
る。

以上説明した検体調整方法を、うがい液中のインフルエ
ンザウィルスの検出を想定したモデル実験に適用したと
ころ、１０ｍＱの水溶液中に存在する数百側程度存在す
るウィルスを検体調整から１ｉｌｌｌ定までの所要時間
３時間程度で検出することが出来た。なお、うがい液中
のインフルエンザウィルスを鶏卵で培養し、血球凝集反
応を肉眼で観察する従来の方法では、数週間かかってい
た。

実施例２ 本実施例においては実施例１と同様に、実験−に安全性
の高い不活化したインフルエンザウィルスを用いて実施
した。ウィルスか非特異的に付着するように活性化した
アクリルポリマーからなる非磁性体粒子を用いて３５℃
、２．５時間インキュベートの条件で検体を捕捉した。

検体を捕捉処理後、前記非磁性体粒子のウィルスが付着
していない表面をＢＳＡで被覆し、該磁性体粒子を不活
性化した。この後の検体調整工程は実施例１の（ａ）〜
（ｃ）の工程とほぼ同じ方法であるが、本実施例では、
前記磁石を前記反応容器に対して移動することによって
、該磁性体標識抗体を攪拌させ、検体と磁性体標識抗体
とが遭遇する確率をさらに高める方法を取った。

検体回収工程（ｃ）後、前記工程で得られた未反応の磁
性体標識抗体を磁性体標識検体から分離するために、Ｉ
　５００　ｒｐｍ、５分間の遠心処理を行ない、沈澱物
を検査容器に採取して、特願昭６２−１８４９０２号に
記載の干渉法によるレーザ磁気免疫測定方法でウィルス
の検出を行なった。その結果、うがい液中に存在するウ
ィルス数十個程度の検出が出来た。

「発明の効果」 以上詳述のように、本発明に従うレーザ磁気免疫測定方
法を実施するための検体調整方法は、磁性体標識抗体の
使用１の低減が可能であるため、未反応の該磁性体標識
抗体による非特異反応を低減に極めて有効である。この
結果、測定のＳ／Ｎ比が改善されるので、検出感度の改
善に極めて効果的である。また、高価なモノクローナル
抗体を有効に使用することが出来るから、経済化が図れ
る。さらに、検体を連続的に反応させることが出来るか
ら、うがい液等の多量の検体中に僅かしか存在しないウ
ィルスの検出にも資料である。また、検体調整法の自動
化に適している。

このように、ＩＮ　Ｉ　Ａ法以上の検出感度を有してい
るから、従来不可能であった、感染直後の抗原検査が実
施できる。更に、非磁性体粒子、標識体として用いる磁
性超微粒子は、放射線あるいはＩＩＬ性の点では問題な
く、検体に対して安定なしのを容易に入手できる。

本発明は、実施例に上げたウィルスの検出に限らず、癌
の字間診断、アレルギー、細菌等の検査や従来ＲＩ　Ａ
法か適用されていたベプチドポルモン等の種々のホルモ
ンあるいは種々の酵素、ビタミン、薬剤などの測定にも
応用することが可能である。従って、従来は限定された
施設でｌ”ＭＡ法によらなければ実施できなかった精密
な測定を、一般的な圏境で広〈実施することが可能とな
る。

集団検診等のような一般的な状況で、各種のウイルス、
癌等のスクリーニング検査等の精密な測定が広〈実施で
きれば、癌あるいはウィルス性疾患等の早期診断が可能
となり、有効な早期治療を的確に実施することが可能と
なる。

また、本発明は上述の各種の免疫診断の他、献血＋ｍ液
中のウィルスの分離・除去にも適用できる。

即し、標識物質として磁性微粒子を用いているから、抗
原抗体反応で磁性体標識抗体と結合した献血血液中のウ
ィルスは外部磁力によって特異的に捕捉・排除できる。

本実施例ではウィルスのモデルとしてインフルエンザウ
ィルスを用いているが、ウィルスに応じて磁性体標識抗
体を選択すれば、全てのウィルスの分離・除去に本発明
の方法は適用可能である。複数の種類の磁性体標識抗体
を混合して用いることによって、例えば、エイズ、ＡＴ
　Ｌ、Ｂ型肝炎ウィルスを同時に献血血液から分離する
こともできる。また、非Ａ１非Ｂ型肝炎の患者あるいは
免疫したチンパンジーの血清からｒｇＧを単離して、磁
性体標識抗体を作製すれば、存在が確認されていない非
Ａ、非Ｂ型肝炎ウィルスの除去ら可能である。本発明は
ウィルスに限らず、いわゆる癌マーカや癌細胞から遊離
して血液等の体液中に転移しつつある極微量の癌細胞の
捕捉にも用いることができる。従って、癌細胞等の細胞
レベルの早期診断にら有効である。さらに、抗原抗体反
応によって特異的に結合する酵素、ホルモン等の微量の
生理活性物質が本発明の方法によって捕捉することかで
きる。

このように、本発明が医学・医療分野や分子生物学等の
理学分野、細胞工学、遺伝子工学等のバイオチクノロノ
ーの分野で果たす効果は計り知れない。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のｌ実施例の検体調整工程を説明する模
式図であって、（ａ）は磁性体標識抗体注入工程、（ｂ
）は検体注入工程、（Ｃ）は検体回収工程、（ｄ）は測
定工程を示す図である。 ｌ・・・・・・反応容器、２・・・・・・流量調節弁、
３・・・・・・磁石、４・・・・・・受は皿、５・・・
・・・検査容器、１０ａ・・・・・・磁性微粒子、１０
ｂ・・・・・・抗体、ｌＯ・・・・・・磁性体標識抗体
、１１・・・・・抗原。 出顎人　　日本電信電話株式会社

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）外部磁力によって磁性体微粒子に抗体を結合して
   なる磁性体標識抗体を局所的に保持した磁性体標識抗体
   保持部に検体を注入して該検体と前記磁性体標識抗体と
   を抗原抗体反応させる第１の工程と、前記工程後に前記
   外部磁力を解除して前記磁性体標識抗体を回収する第２
   の工程と、を少なくとも含むことを特徴とするレーザ磁
   気免疫測定方法を実施するための検体調整方法。
2. （２）前記磁性体微粒子が超常磁性体超微粒子であるこ
   とを特徴とする請求項１記載のレーザ磁気免疫測定方法
   を実施するための検体調整方法。
3. （３）前記外部磁力が変動磁界であって、前記磁性体標
   識抗体が前記磁性体標識抗体保持部において局所的に攪
   拌されることを特徴とする請求項１又は２記載のレーザ
   磁気免疫測定方法を実施するための検体調整方法。
4. （４）前記検体が前記第１の工程以前に前記磁性体標識
   抗体よりも質量または体積が充分に大きな非磁性体微小
   球に捕捉されていることを特徴とする請求項１、２又は
   ３記載のレーザ磁気免疫測定方法を実施するための検体
   調整方法。