JPH02118431A - 電子顕微鏡検体調整法及び電子顕微鏡検体調整器具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗原抗体反応を利用した、ウィルス学や免疫
学並びに細胞工学等のバイオテクノロジーの技法に関す
るものである。

〔従来技術とその課題〕

近年、後天性免疫不全症候群、成人工細胞白血病、非Ａ
非Ｂウィルス性肝炎等のような新型ウィルス性疾病によ
り人類の健康は冒されており、さらに輸血か原因で新た
な感染の危険にさらされている。これら感染症の早期診
断法が世界的規模で開発されている。従来の感染症の診
断は抗体検査か主であった。その理由は感染直後ではウ
ィルス粒子の数がきわめてすくないため、従来の検査法
では検出できないからである。例えば、ウィルスを直接
検出する方法として、従来より血球凝集法等が知られて
いる。しかしながら、この方法では、検出感度が不足す
るため、ウィルスを培養して１子方個以上に増殖する必
要があった。一方、ウィルスの存在確認のための形態観
察は電子顕微鏡が唯一の手段である。形態観察によって
ウィルス群の判定が可能になり、新しいウィルスを発見
した場合も最終的には電子顕微鏡下でのウィルスの確認
が不可欠である。しかしながら、ウィルスは大きさが２
０〜２００ｎｍ程度であるため、超高倍率でなければ観
察できない。μｍ台の極めて狭い領域を観察することに
なるから、ウィルスか高濃度に存在していなければ観察
は困難を極める。このような理由から、従来は１ｍｆ２
当りウィルス粒子が一億ないし十億個無ければ電子顕微
鏡観察は事実上不可能であった。

従って、ウィルスを直接検出する従来の方法はまずウィ
ルスを培養する技術を確立することが重要であった。し
かし、ウィルス培養に当たって、ウィルス毎に宿主が異
なるため、ウィルス培養に適した感受性細胞を見つける
必要があった。しかも、その感受性細胞の検索に当たっ
ては、動物の細胞を使って人に感染するウィルスを培養
することは出来ないため、困難を極めている。このよう
な事情のため、人に感染するウィルス学の研究は動物の
場合に比べると非常に遅れている。例えば、ウィルス性
肝炎は感染力が強いため、現在、医療従事者か患者から
感染する事故が多発し、社会問題となっている。ウィル
ス性肝炎としては、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィル
スが知られていて、ワクチンら製造されている。しかし
、非Ａ、非Ｂのウィルス性肝炎が以前から予想されてい
るにも関わらず、ウィルスの存在が確認されていないた
め、的確な治療法が無い事情にある。

癌は最初１つの細胞が癌化し、長い年月を経て発症にい
たる。現在の診断法は内視鏡、ＣＴ、病理検査等はとん
どが医師の目で行われている。そのため、癌と診断され
た時点では、目で診断できない癌が方々に転移していて
手術しても再発することが多い。転移の無い時期に細胞
レベルで診断できれば再発はなくなり、手術無しに免疫
療法だけで癌を冶癒させることも可能になる。現在、腫
瘍マーカ等の癌免疫診断法が研究開発されているが、実
用されているものは少ない。

本発明者らは、ウィルス抗原や細胞を極めて高い感度で
検出できるレーザ磁気免疫測定法等の研究を行い、その
成果を先に特願昭６１−２２４５６７号、同６１−２５
２４２７号、同６１−２５４１６４号、同６２−２２０
６３号、同６２−１５２７９１号、同６２−１５２７９
２号、同６２１８４９０２号、同６２−２６４３１９号
、同６２−２６７４８１号、同６３−６０５０号として
特許出願している。これらの新しい免疫測定法は抗原抗
体反応の有無の検出にレーザ光を利用し、標識材料とし
て磁性微粒子を用いる点に特徴があり、ピコグラムの超
微１検出が出来る。

ところが、ウィルス、癌細胞あるいはリンパ球などの検
体を電子顕微鏡で効率よく観察する技術は、検体を濃縮
・精製する方法の技術革新が今日までなく、従来の遠心
沈降法に頼らざるを得ないのが現状である。そのため、
検体調整に多くの労力がかかり、極めて効率が悪かった
。本発明者らは、磁性微粒子をウィルス、癌細胞あるい
はリンパ球などの検体に標識することによって、ウイル
スや細胞の捕捉・分離方法を研究し、その成果を先に特
願昭６３−１０２９１６号、同６３−１０２９１９号と
して特許出願している。これらの特許は効率的にウィル
スや細胞を捕集したり分離することが出来る。また、細
胞融合技術によって得たハイブリドーマ細胞のスクリー
ニングの際に、磁性微粒子を目的のモノクローナル抗体
を産生ずるハイブリドーマに標識し、これを外部磁力に
よって選択的に回収する新しいスクリーニング方法につ
いても特許出願中である。しかしながら、捕集した検体
を電子顕微鏡で効率よく観察するためには、技術の改良
が必要であった。

本発明は、上記の事情に鑑みてなされたもので、その目
的はウィルス、癌細胞、エイズやＥＢウィルスに感染し
たリンパ球は勿論のこと、モノクローナル抗体を産生ず
る！・イブリドーマ等の各種細胞の観察のための、検出
感度が高く、観察効率のよい電子顕微鏡検体調整法及び
電子顕微鏡検体調整器具を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の第１の発明に従うと、検体に磁気標識する第１
の工程と、前記第１工程で磁気標識された検体に傾斜磁
界を作用させて該検体を電子顕微鏡観察用メツシュ表面
上に誘導・固着する第２の工程と、前記第２工程で固着
された磁気標識検体を前記傾斜磁界中でネガティブ染色
する第３の工程とを少な（とも含むことを特徴とする電
子顕微鏡検体調整法が提供される。

検体検索を容易にする方法として、予め、検体と特異的
に反応する抗体を該検体を含む検体浮遊液に加え、該検
体を凝集させた後、該検体を磁気標識すれば電子顕微鏡
観察が非常に容易になる。

検体の濃縮・精製を特に必要とする場合は、第１の発明
の第１工程後の磁気標識された検体を含む検体浮遊液に
傾斜磁界を作用させて該磁気標識検体のみを水面上に局
部濃縮した後、該局部濃縮点に細管を挿入して、該磁気
標識検体を回収する検体濃縮工程を実施した後、前記第
２工程以下の工程がなされることが好ましい。

また、第１の発明の第２工程において、電子顕微鏡観察
用メツシュが着脱可能なフィルム上に保持され、該フィ
ルム裏面から、電子顕微鏡観察用メソン二部の磁界か最
も高くなるような傾斜磁界を検体に作用させることによ
って該検体を電子顕微鏡観察用メツシュ表面上に誘導・
固着することか好ましい。

さらに、第２の発明に従うと、容器水面上への磁気標識
検体の局部濃縮機構と、該検体の回収機構と、電子顕微
鏡観察用メツシュの（呆持機構と、該電子顕微鏡観察用
メツシュ表面上への該検体の誘導・固着機構を少なくと
も具備することを特徴とする電子顕微鏡検体調整器具が
提供される。

〔作用〕

本発明によれば、検体は、抗原抗体反応で磁性体標識抗
体と結合し、磁気標識されているから、外部磁力で確実
に電子顕微鏡観察用メツシュ上に誘導・固着することが
出来る。検体に磁気標識する方法には２種類の方法があ
る。１つの方法は、検体と特異的に反応するモノクロー
ナル抗体等の抗体を結合した磁性体標識抗体を直接検体
と抗原抗体反応させる方法であり、他の方法は、まず検
体と特異的に反応するＩｇＧ抗体を該検体に加えて該検
体を予め凝集させた後、１８Ｇ抗体と反応するプロティ
ンＡを結合した磁性体標識抗体を抗原抗体反応させる方
法である。前者の方法は、検体中の目的とするウィルス
や細胞等の目的物体を抗原抗体反応によって選択的に磁
性体標識抗体で捕捉する方法であるから、電子顕微鏡観
察の際に、目的物体以外の混入が少なく、磁性体標識抗
体を目印に検索することによって、観察の信頼性か高い
点に特徴がある。これに対して、後者の方法は、磁性体
標識抗体に用いるプロティンＡは目的物体以外の全ての
ＩｇＧ抗体にも反応するから、選択性は前者の方法より
も劣る。しかしながら、目的物体は予めＩｇＧ抗体によ
って凝集しているから、目的物体がウィルスのように極
微小体である場合、磁気標識された凝集体の存在を検索
すればよいから電子顕微鏡観察の際かきわめて効率的に
できる。

なお、磁性体標識抗体作製に用いる磁性微粒子は、マグ
ネタイトのような鉄系酸化物、遷移金属あるいは希土類
元素からなる強磁性体が好ましく、これらの磁性微粒子
は生物体よりも密度が高いから、電子顕微鏡視野では黒
色に見え、極めて容易にその存在が確認できる。

さて、検体中には目的物体よりも目的物体以外の多数の
異物体が非常に多く含まれているのが通常である。これ
らの異物体が電子顕微鏡観察の際に妨害となるから、電
子顕微鏡の検体調整の目的の一つは目的物体を精製する
ことにある。生物体は外部磁力には反応しないから、検
体を磁気標識して、目的物体のみを分離する本発明の方
法は目的物体の精製には極めて好都合である。また、本
発明の方法では外部磁力として、水面に局部濃縮される
ように設計された傾斜磁界を磁気標識された検体を含む
検体浮遊液に作用させることによって、目的物体は該局
部濃縮点に濃縮されることになる。そして、該局部濃縮
点に細管を挿入して、前記目的物体を回収すれば、検体
の精製と濃縮が同時に達成できる。なお、水面に濃縮す
る理由は目的物体以外の異物体の混入を出来るだけ少な
くするためである。例えば、容器の底面を局部濃縮点と
して選んだ場合、異物や沈澱した細胞の混入が避けられ
ない。

濃縮・精製された検体は電子顕微鏡観察のために、通常
直径３ｍｍ程度の銅メツシユの上に載せ、観察が容易な
ように染色される。従来の工程では、検体をホルムバー
ル等の支持膜がはられた銅メツシユ上に滴下して付着さ
せた後、余分の検体は、濾紙で吸い取られ、リンタング
ステン酸等の染色液を滴下して染色後、再び染色液を濾
紙で吸い取り自然乾燥した後に電子顕微鏡観察に供され
るのが一般であった。このような検体及び染色液の濾紙
等による除去工程が取られていたので、滴下された大部
分の検体は銅メソシュ上に留まらず濾紙で吸い取られて
しまっていた。前述のように、ウィルス粒子を観察する
ために必要な実用上のウィルス濃度が１ｍ１２当たり一
億個以上であることの理由の１つは、上記工程でごく一
部の検体しかメツシュ上に留まらないためである。本発
明の方法に従えば、検体をメツシュ上に滴下し、染色す
る工程ではメツシュの着脱が可能なメツシュ保持フィル
ムの裏面から、該メソンユ中央部の磁界が最も高くなる
ような傾斜磁界を該検体に作用させることによって該検
体は該電子顕微鏡観察用メツシュ中央表面上に誘導・固
着される。従って、余分な検体及び染色液を濾紙等で吸
い取る際に、磁気標識された検体はメツシュ上に磁気吸
引されているから、濾紙等に吸い取られることはない。

このため、例えば、ウィルス粒子観察の場合、１ｍＱ、
当り数十個程度の希薄な検体でも容易に電子顕微鏡観察
可能である。

本発明の電子顕微鏡検体調整Ｉｓ具を用いれば、以上説
明した本発明の電子顕微鏡検体調整法が誰にでも容易に
実施できる。

以下に図面を参照して本発明をより具体的に詳述するか
、以下に示すものは本発明の一実施例に過ぎず、本発明
の範囲を同等制限するものではない。

〔実施例１〕 第１図は本発明に従う電子顕微鏡検体調整法の一実施例
を示す工程図であって、検体を磁気標識する第１工程、
磁気標識された該検体を電子顕微鏡観察用メツシュ上に
傾斜磁界中で誘導・固着する第２工程、傾斜磁界中でネ
ガティブ染色する第３工程からなる。本実施例に用いた
検体は、ノ＼型インフルエンザウィルス（Ａ／石川／７
／８２　（＋（３Ｎ２））であって、１ｍＱ当り百万個
のウィルスが存在することが血球凝集反応及び血球計算
板から確かめている。こめ濃度のインフルエンサウイル
スをＰＢＳ溶液で１０倍段階希釈をしていき、該ウィル
スの電子顕微鏡観察限界を調べた。まず、検体を磁気標
識しない従来の方法で電子顕微鏡観察したところ、該ウ
ィルス粒子の存在を確認、することができなかった。

次に本実施例の第１工程を説明する。磁気標識に用いた
抗体は該ウィルスに対するウサギ高度免疫血清を精製し
て得られたＩｇＧ抗体であって、これをデキストランで
コートした平均粒径１０ｎｍのマグネタイトからなる磁
性微粒子に共有結合して、磁性体標識抗体を得た。検体
の磁気標識は該検体１ｍＣと前記磁性体標識抗体１０μ
Ｑとを３５°Ｃ１２，５時間のインキュベートの条件で
行なった。

次に第２工程を説明する。第２図は磁気標識された検体
を電子顕微鏡観察用メツシュ上に傾斜磁界中で誘導・固
着する器具の断面図であって、図中符号１は電磁石、１
ａは電磁石鉄心、２は磁極片（Ａ）、３はメツシュ載台
、４は接着フィルム、５はメツシュホルダー　６はメ・
ノシュ、７は細管、８はキャップである。純鉄からなる
円錐形状の磁極片（Ａ）２は電磁石鉄心１ａの上に載せ
られ、その周りは非磁性体であるアルミ製のメツシュ載
台３でカバーされている。磁極片（Ａ）２の先端は磁界
が過度に集中しないように切断されており、端面の直径
は２ｍｍである。本実施例では該磁極片端面の磁界が約
３ＫＧになるように、電磁石１を励磁した。前記メツシ
ュ載台３の中央は直径４ｍｍの貫通孔が設けられていて
、該磁極片（Δ）２の端面が前記貫通孔の中央に位置し
、かつ、メツシュ載台３の表面よりもＱ、５ｍｍ低くな
っている。前記貫通孔は必ずしも必要でないが、貫通孔
を設けた理由は、メツジュロと磁極片（Ａ）２の距離を
接近させ強い磁界を得やすいこと、メツジュロと磁極片
（Ａ）２の中心を合わせやすいことにヨル。ホルムバー
ル支持膜がはられた直径３ｍｍの銅メソジュロは接着性
を有するパラフィルム（接着フィルム）４に着脱可能な
ように軽く接着され、メツシュホルダー５で保持されて
いる。すなわち、該メツシュホルダー５は、第３図に示
すように、外径２０ｍｍ、内径３ｍｍ、厚さ１ｍｍのア
クリル樹脂であって、底面には上述の接着フィルム４が
はられ、前記メツジュロはメツシュホルダー５の中央部
の接着フィルム４に軽く接着されている。

メノンユ６は小さく、薄いためその取扱いには従来注意
が必要であったが、本実施例のようなメツシュホルダー
５に入れて取り扱えば、検体調整が簡単で、検体調整済
みのメツジュロの運搬、保管も容易である。メツジュロ
の取り出しの際は、裏面の接着フィルム４を指等で軽く
押し出せば、メソジュロは容易に接着フィルム４からは
がれ、メツジュロをビンセントで取り出すことができる
。

さて、メ・７シユホルダー５を前記メツシュ載台３中夫
に載せ、電磁石１を励磁した状態で毛細管７中の磁気標
識された検体をキャップ８を圧縮して数μＱをメツジュ
ロ上に滴下すると、磁界は前記磁極片（Δ）２によって
メソシュ中央部が最も高くなるような傾斜磁界が発生す
るため、磁気標識された検体は確実に、メツジュロ中央
部に誘導・磁気吸引される。検体滴下約１分後、電磁石
１を励磁したままで余分の検体を濾紙で吸い取る。以上
の処理で、磁気標識された検体のみがメツジュロ上に固
着されることになる。

次に第３工程は、電磁石１を励磁したままで、ｐＨ７の
１％リンタングステン酸からなるネガティブ染色液を数
μＱメツジュロの上に滴下し、３０秒後濾紙で余分の該
染色液を吸い取り自然乾燥する。

以上説明した電子顕微鏡検体調整法を上述のインフルエ
ンザウィルスに適用して検出限界ヲ調べた結果、ウィル
ス濃度１万個／ｍ１２程度でも倍率５万倍の電子顕微鏡
視野で非常に簡単にウィルスの検索かできた。写真１は
磁気標識されたインフルエンザウィルスの電子顕微鏡写
真である。該ウィルス粒子の直径は１１００ｎであって
、写真１から明らかなように、黒く見える磁性体標識抗
体がウィルスの周りに結合しているのが分かる。

〔実施例２〕 実施例１で説明した検体を磁気標識する第１工程の前に
、ウィルスを凝集させる工程を実施した。

即ち、実施例１で用いた検体１ｍｇに、同じ〈実施例１
で用いたＩｇＧ抗体を２０μＱ加え、３５°Ｃ１２，５
時間、引続き、４°Ｃ１晩のインキュベーションによっ
て、該ウィルス同士を凝集させた。

この工程の後、実施例１と同じ工程の検体調整を行った
。実施例１と異なるところは、検体を磁気標識するのに
用いた磁性体標識抗体のみである。

すなわち、本実施例ではデキストランコート磁性微粒子
にプロティンＡを結合させた。プロティンＡはＩｇＧ抗
体のみに結合するから、前記ＩｇＧ抗体によって凝集し
た該ウィルスが磁気標識されることになる。このように
、予め、ウィルス同士を凝集させる前処理を施すことに
よって電子顕微鏡の観察がいっそう容易になり、ウィル
ス濃度数十個／ｍ１２程度でも簡単に検索できた。写真
２は’ｔＭ’Ｊしたインフルエンザウィルスに磁気標識
した電子顕微鏡写真である。十数側のウィルス粒子が凝
集し、黒く見える磁性体標識抗体が該ウィルスの周りに
結合していることが一見して分かる。

本実施例のように予め検体を凝集させ電子顕微鏡の観察
を容易にする方法は従来から免疫電子顕微鏡法として公
知であるが、検体を磁気標識する方法は、本発明が初め
てである。従来の免疫電子顕微鏡法よりも検出感度が５
桁以上改善された。

〔実施例３〕 実施例２で説明したウィルス凝集工程、検体を磁気標識
する第１工程の後に、検体の濃縮・精製工程を実施し、
しかる後に実施例２の第２工程、第３工程の検体調整を
行った。次に、検体濃縮・精製工程を詳しく説明する。

第４図は検体１農縮・精製工程を説明する図であって、
（ａ）は濃縮・精製工程、（ｂ）は回収工程を示すもの
である。図中符号ＩＯは容器、１１は磁気標識された検
体、１１−１は回収された検体、１２は磁極片（Ｂ）で
ある。電磁石１からでた磁束は磁極片（Ｂ）１２に集ま
るように磁気回路が形成されているので、磁極片（Ｂ）
１２の真下の水面の磁界が最も高くなるような傾斜磁界
が発生する。本実施例では最大磁界は３ＫＧであった。

なお、磁極片（Ｂ）１２の中心は中空であって、毛細管
７が挿入できるようになっている。容器１０には第１工
程後の磁気標識された検体１１を含む検体浮遊液１ｍＱ
が入っている。

濃縮・精製工程（ａ）においては、前記電磁石１と磁極
片（Ｂ）１２の間に容器ＩＯを挿入し、電磁石１を励磁
すると、磁気標識された検体１１は磁極片（Ｂ）＋２の
真下の水面に誘導され濃縮される。この時、検体浮遊液
中の各種混入物は磁力に反応しないから、前記濃縮点に
は磁気標識された検体１１のみが存在することになって
、検体１１の濃縮と精製が同時に行なわれることになる
。

検体回収工程（ｂ）においては、前記電磁石１を励磁し
たままで、前記磁極片（Ｂ）１２の貫通穴に毛細管７を
挿入して、前記濃縮黒水面に接触させると、検体浮遊液
は毛細管現象で、また、磁気標識された検体は磁気吸引
力によって該細管の中に回収される。本実施例では、毛
細管７として外径］、１ｍｍ、内径０．５ｍｍの毛細管
を用いた。毛細管７の中には毛細管現象によって、約５
μＱの溶液が自然吸引された。なお、キャップ８は回収
した検体をメッンユ上に滴下する次の工程の際に用いる
ものである。

従来、電子顕微鏡検体調整において、検体の精製が充分
でないと電子顕微鏡観察に著しい支障をきたしていたが
、本実施例の精製効果によって電子顕微鏡観察が非常に
容易になるとともに、濃縮効果によって検出感度が向上
し、ウィルス濃度数百側／ｍＱ以下でも短時間で検索す
ることが可能になった。

以上説明した検体調整法は、次に説明する検体調整器具
を使用することによって、誰でも簡単に効率よ〈実施す
ることができる。

第５図、第６図は電子顕微鏡検体調整器具の構成を示す
図であって、図中符号１３は磁極片（Ｂ）１２を保持す
る継鉄（Ａ、）、１４は継鉄（Ｂ）である。継鉄（Ａ）
１３は継鉄クランプねじ１５によって継鉄（Ｂ）１４と
連結され、第６図に示すように、任意の方向に固定でき
る。電磁石１からでた磁束は容器１０を貫通した後、磁
極片（Ｂ）１２で集束され、継鉄（Ａ）１３と継鉄（Ｂ
）　　１４を通って再び電磁石１に戻るように磁気回路
が形成される。電磁石１と磁極片（Ｂ）１２の距離が１
１ｍｍのとき、電磁石１にＩＡの電流を流すと磁極片（
Ｂ）１２直下０．５ｍｍの位置での磁界は３ＫＧであっ
た。容器１０は容器支持台１６に設けられた容器案内面
１７にセットされ、容器支持台クランプネジ１８によっ
て高さ調節ステージ１９に取り付けられている。容器支
持台１６は高さ調節ステージ１つによって、任意の高さ
に調節可能であり、また、第６図に示すように、任意の
方向に固定できる。

さて、上述した本実施例の検体精製・濃縮工程は、本調
整器具を第５図に示すように組み立てて行なう。まず、
磁極刃片（Ｂ）１２から毛細管１２を外した状態で、検
体を入れた容器１０を容器案内面１７に載せ、磁極片（
Ｂ）１２と容器１０の水面の距離が５ｍｍになるように
、高さ調節ステージ１つによって調節する。次に、電磁
石にｌＡを通電し、磁気標識された検体を磁極片（Ｂ）
１２の真下の水面に誘導・濃縮する。約１分後、毛細管
７を磁極片（Ｂ）１２の貫通孔に差し込み、高さ調節ス
テージによって容器１０を上に持ち上げ、毛細管７を容
器１０の水面に接触させると、瞬間的に磁気標識された
検体は検体浮遊液とともに毛細管７の中に磁気吸引力に
よって吸い込まれる。検体の回収を確実にするために、
毛細管７を水面に接触させる操作を繰り返すことが好ま
しい。

何故ならば、検体は水面に濃縮されているので、毛細管
７が水面に接触する瞬間が最も回収されやすく、毛細管
７を水面の中に入れすぎると回収困難になるからである
。電磁石１の通電を停止した後に、磁極片（Ｂ）１２か
ら毛細管７を取り出せば検体は毛細管７の中に回収され
る。

次に、本調整器具を用いた、第２工程、第３工程の実施
法を説明する。第２工程、第３工程は、本調整器具を第
６図に示すように組み立てる。すなわち、電磁石１上に
あった磁極片（Ｂ）１２と容器支持台１６をそれぞれ継
鉄クランプねじ１５、容器支持台クランプねじ１８を緩
め、回転させて退避させる。電磁石１の鉄心】ａ上に第
２図に示したように前記磁極片（Ａ）２、さらに該磁極
片（Ａ）２の上に前記メツシュ載台３を載せる。該載台
３の中央上に第３図で示したメツシュボルダ−５を載せ
る。次に、電磁石１に０．５Ａの電流を流して電磁石１
を励磁した状態で、前記毛細管７に回収した検体を滴下
する。メツシュホルダ−５裏面からは磁極片（Ａ）２中
心の磁界が最も高くなる傾斜磁界が作用しているから、
磁気標識された検体はメツジュロ中央表面上に磁気吸引
され、メッンユ６に固着される。この際、磁界があまり
強いとメツジュロのホルムバール支持膜が破れることか
あるので、上述のように検体を濃縮・精製する工程より
も磁界を弱くすることが好ましい。

本検体調整器具では電磁石１に０．５Ａ通電した場合、
メツジュロ上の磁界は約２．５ＫＧであった。

〔発明の効果〕

以上詳述したように、本発明に従う電子顕微鏡検体調整
法によれば、検体は抗原抗体反応で磁性体標識抗体と結
合し磁気標識されているから、外部磁力で確実に電子顕
微鏡観察用メツシュ上に誘導・固着することができ、検
体の検出感度が飛躍的に向上する。また、本発明の検体
調整器具を用いることによって、一連の検体調整工程が
効率的にかつ容易に実施できる。」二連した実施例では
、検体としてインフルエンザウィルスの場合を説明シタ
力、本発明の検体調整法はウィルスに限られるものでな
く、癌細胞、リンパ球等の各種細胞の電子顕微鏡観察に
ももちろん適用できる。

また、メツ７ユ上に検体をネガティブ染色する方法のみ
ならず、検体を樹脂に埋め込み薄切片を透過電子顕微鏡
で観察する方法にも適用できる。

すなわち、従来薄切片を作製する場合、検体を遠心沈降
する操作を繰り返しながら、検体を固定、脱水、埋め込
みの過程を進める方法が取られていたが、本発明の検体
調整法を適用すれば、遠心沈降する代わりに、傾斜磁界
中で検体を局所に誘導、保持できるから、検体の固定、
アルコールによる脱水が容易に行え、また、埋め込みの
際にも検体を局所に集中できるから、ミクロトームで切
断するのが容易になる。

本発明によれば、培養不能の未知の極めて微量のウィル
スを直接検出できるので、ウィルス学に貢献するところ
が非常に大きい。例えば、非Ａ、非Ｂ、の肝炎ウィルス
の発見に寄与できる。また癌細胞等の細胞レベルの早期
診断にも有効であり、癌細胞から遊離して血液等の体液
中に移転しつつある極微量の癌細胞の観察ができる。こ
のように、本発明が医学・医療分野や分子生物学等の理
学分野、細胞工学、遺伝子工学等のバイオテクノロジー
の分野で果たす効果は計り知れない。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に従う電子顕微鏡検体調整法の一実施例
を示す工程図、第２図は磁気標識された検体を電子顕微
鏡観察用メツシュ上に傾斜磁界中で誘導・固着する器具
の断面図、第３図はメツシュホルダーの概略図、第４図
は検体濃縮・精製工程を説明する図であって、（ａ）は
濃縮・精製工程、（ｂ）は回収工程、第５図、６図は電
子顕微鏡検体調整器具の構成を示す図、写真１．２はそ
れぞれ、実施例１の検体調整法、実施例２の検体調整法
によって得られたインフルエンザウィルスの電子顕微鏡
像である。 ンブねし、１６・・・・・容器支持台、１７・・・・・
・容器案内面、１８・・・・・・容器支持台クランプネ
ジ、１９・・・・・・高さ調節ステージ、２０・・・・
・・台。 ■・・・・・電磁石、１ａ・・・・・・電磁石鉄心、２
・・・・・・磁極片（Ａ）、３・・・・・・メツシュ載
台、４・・・・・・接着フィルム、５・・・・・・メツ
シュホルダー　６・・・・・・メツシュ、７・・・・・
細管、８・・・・・・キャップ、１０・・・・・・容器
、１１・・・・磁気標識された検体、１１−１・・・・
・・回収された検体、１２・・・・・・磁極片（Ｂ）、
１３・・・・・・継鉄（Ａ）、１４・・・・・・継鉄（
Ｂ）、１５・・・・・・継鉄クラ第２図 第３ 図 手続字甫正書Ｃ−７）氏） 平成１年４月４日 １、事件の表示 昭和６３年特許願第２７２１０６号 ２、発明の名称 電子顕微鏡検体調整法及び電子顕微鏡検体調整器具３、
補正をする者 事件との関係　　特許出願人 日本電信電話株式会社 ４゜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）検体に磁気標識する第１の工程と、前記第１工程
   で磁気標識された検体に傾斜磁界を作用させて該磁気標
   識検体を電子顕微鏡観察用メッシュ表面上に誘導・固着
   する第２の工程と、前記第２工程で固着された該磁気標
   識検体を前記傾斜磁界中でネガティブ染色する第３の工
   程とを少なくとも含むことを特徴とする電子顕微鏡検体
   調整法。 （２）請求項１に記載の電子顕微鏡検体調整法において
   、第１の工程以前に予め、検体と特異的に反応する抗体
   を該検体を含む検体浮遊液に加え、該検体を凝集させる
   工程を行ない、その後、前記第１工程以下の工程を行な
   うことを特徴とする電子顕微鏡検体調整法。（３）請求
   項１に記載の電子顕微鏡検体調整法において、第１工程
   後の磁気標識された検体を含む検体浮遊液に傾斜磁界を
   作用させて該磁気標識検体のみを水面に局部濃縮した後
   、該局部濃縮点に細管を挿入して、該磁気標識検体を回
   収する検体濃縮・精製工程を実施した後、第２工程以下
   の工程がなされることを特徴とする電子顕微鏡検体調整
   法。 （４）請求項１に記載の電子顕微鏡検体調整法において
   、第２の工程で用いる電子顕微鏡観察用メッシュが着脱
   可能なフィルム上に保持され、該フィルム裏面から、該
   電子顕微鏡観察用メッシュ部の磁界が最も高くなるよう
   な傾斜磁界を磁気標識検体に作用させることによって該
   検体を該電子顕微鏡観察用メッシュ表面上に誘導・固着
   することを特徴とする電子顕微鏡検体調整法。 （５）容器水面上への磁気標識検体の局部濃縮機構と、
   該検体の回収機構と電子顕微鏡観察用メッシュの保持機
   構と、該電子顕微鏡観察用メッシュ表面上への該検体の
   誘導・固着機構を少なくとも具備することを特徴とする
   電子顕微鏡検体調整器具。