JPS6379070A

JPS6379070A - レ−ザ−磁気免疫測定法

Info

Publication number: JPS6379070A
Application number: JP22456786A
Authority: JP
Inventors: Koichi Fujiwara; 幸一藤原; Juichi Noda; 野田　壽一; Hiromichi Mizutani; 水谷　裕迪; Hiroko Mizutani; 弘子水谷
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date: 1986-09-22
Filing date: 1986-09-22
Publication date: 1988-04-09
Anticipated expiration: 2010-11-29
Also published as: JPH07111429B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は抗原抗体反応を利用した免疫測定法のうち、超
高窓度の測定法に属するものであり、微量の検体から特
定の抗体又は抗原を検出可能な免疫測定法に関するもの
である。

〔従来の技術〕

エイズ、成人Ｔ細胞白血病等の新型ウィルス性疾病、並
びに、各種ガンの早期検査法として、抗原抗体反応を利
用した免疫測定法の開発が、現在、世界的規模で進めら
れている。

これは、抗原であるビールス等が生体に侵入した場合に
形成される抗体が、前記抗原と特異的に反応する性質（
抗原抗体反応）を利用して、抗体又は、抗原そのものを
検出しようとするものである。このための、？ＡＷｋ免
疫測定法として、従来からラジオイムノアンセイ（ＲＩ
Ａ）、酵素イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ等が実
用化されてきた。これらは、アイソトープ、酵素、蛍光
体で標識された抗原又は抗体を用い、これと特異的に反
応する抗体又は、抗原の有無を検出するものである。

このうちＲＩＡは、抗原抗体反応に寄与した検体量を、
標識化されたアイソトープの放射＆’ＪＩＩを測定する
ことにより定量するものであり、現在のところ、ピコグ
ラム程度の超微量測定が唯一可能な方法である。しかし
、ＲＩＡは放射性物質を取り扱わなければならないため
、特殊設備が必要であり、半減期や廃棄物処理等の点か
ら、使用時期、場所等の制約があった。又、酵素、蛍光
体を用いる方法では、発色や、発光を用いて抗原抗体反
応の有無を確認するものであるため、測定が半定量的で
あり、検出限界もナノグラム程度であった。従って、Ｐ
ＴＡと同程度の検出感度を有し使用上の制限のない免疫
測定法が求められていた。

又、抗原抗体反応の有無の検出にレーザー光を用いる方
法としては、肝臓層の検出を目的として、プラスチック
の微粒子にＡＦＰ（アルファ・フェト・プロティン）に
対する抗体をつけ、抗原抗体反応に基づく該プラスチッ
ク同士の凝集により生じた質量変化を、レーザー光の散
乱又は透過状態の変化から調べる方法が発表されている
。この方法では、検出感度はＩＱ−１０ｇであり、従来
のレーザー光を用いた方法の百倍以上とされているが、
ＲＩＡの感度の百分の一以下である。この方法は、水溶
液中での抗原抗体のブラウン運動の変化を利用している
ため、測定に際しては、検体を含む水溶液の温度制御を
精密に行う必要があり、気温や振動等の外界の影響を受
は易い欠点があった。

〔発明の目的及び解決しようとする問題点〕本発明は、
半減期や廃棄物処理等の種々の制約を解決し、ＲＩＡと
同程度のピコグラムの検出感度を有する新しい免疫測定
法を実現しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、磁性超微粒子を標識として用い、特定の、又
は未知の抗原又は抗体にこの標識を付けて磁性体標識体
とする。次に、検体としての抗体又は抗原を既知の固相
化された抗原又は抗体と抗原抗体反応させ、又は検体と
しての抗体又は抗原を直接固相化し、前記磁性体標識体
と抗原抗体反応を起こさせる。その後未反応の前記磁性
体標識体を除去した後に、検体を液相中に分散させる。

この場合に前記検体が、前記磁性体標識体と特定の抗原
抗体反応を起こす抗原又は抗体である場合には、検体を
含む液相中に磁性体標識体が残存し、それら以外の場合
には、液相中には磁性体標識体は存在しない。よって、
液相中の磁性体標識体の有無及び存在量を知ることによ
り検体の特定及び定量が可能となる。磁性体標識体の有
無及び存在量は、液相中に分散した検体によるレーザー
光の散乱、透過光の強度変化を測定することにより知る
ことができる。

〔作用〕

本発明は磁性超微粒子を抗原抗体反応の標識として用い
るために、未反応の磁性体標識体を磁場により検体から
分離除去することができる。また、液相化した後は、磁
気的方法により磁性体標識体を濃縮し、検出感度を向上
させることができる。また、この磁性体標識体を交流磁
場内で駆動しつつ該交流磁場と同期した散乱光または透
過光の変化を選択的に測定することにより、外界の影響
、バンクグランドの散乱の除去等を有効に行うことがで
きる。本発明では、磁性超微粒子を標識として用いてい
るので使用時期や場所の制限はない。

本発明で、検体と磁性体標識体を反応させる前処理には
、固相化された既知の抗原又は抗体と検体としての抗体
又は抗原を反応させる間接法と、検体としての抗体又は
抗原を直接固相化する直接法がある。また、磁性体標識
体を反応させる方法としては、検体と磁性体標識体を積
極的に反応させる方法と、反応を阻害する方法（競合阻
害反応検出法）とがある。以下に実施例を示す。

〔実施例〕

ス隻■上第１図は本発明の第１の実施例（間接法）を説明する図
であって、（ａ）〜（ｄ）は検体の調整工程を、（ｅｌ
）〜（ｆ）は比較対照試料の調整工程を示している。１
は寒天より成る支持体、２はウィルス抗体、３はウィル
ス抗原、４は磁性体標識ウィルス抗体、５は希土類磁石
、６はガラスセルである。（ａ）は既知のウィルス抗体
２を支持体１に固相化する工程、（ｂ）は固相化した抗
体２に患者の血液中の未知のウィルス抗原３を注入し、
抗原抗体反応をさせる工程、（ｃ）はウィルス抗原３に
磁性体標識ウィルス抗体４を反応させる工程、（ｄ）は
支持体ｌを溶解、除去後、検体をガラスセル６に入れ、
水溶液中に分散させる液相化工程である。（ｅ）（ｆ）
は比較対照試料の調整工程を示しくｅ）は、ウィルス抗
原３が存在しなかったために検体と抗原抗体反応をしな
かった磁性体標識ウィルス抗体４を希土類磁石５により
、該面相化抗体から分離・除去する工程、（ｆ）は比較
対照試料の液相化工程である。（ｅ）と同様の工程を（
ｃ）にほどこすことにより未反応の過剰な磁性体標識ウ
ィルス抗体４を検体から除去することができる。本実施
例において、ウィルス抗体を寒天に固定した理由は、（
Ｃ）の工程で、過剰の標識体を希土類磁石で分離、除去
する操作を容易にするためである。

（ｅ）の除去工程は、磁性体標識体の特性を利用して磁
石を用いて行ったが、洗浄によっても除去は可能である
。磁石と洗浄の併用も有効である。磁性体標識ウィルス
抗体４として、本実施例ではウィルス抗原３と特異的に
結合する抗体をマグネタイト超微粒子の表面に被覆した
ものを使用した。磁性超微粒子としてマグネタイトを選
んだ理由はマグネタイトがウィルスや特異抗体との親和
性が良くウィルス等を標識するのに適しているためであ
る。また、外部磁場による分離、除去、並びに後述する
散乱光、透過光の測定を効率的かつ効果的に行うために
は、該マグネタイトは単磁区粒子構造が好ましく、粒子
径は５０ｎｍ程度が適当であった。なお、磁性超微粒子
はマグネタイトに限られるものではなく、Ｔフェライト
等の化合物磁性体、鉄、コバルト等の金属磁性体でも勿
論よい。

第２図は本発明の実施例の内、前記で説明した、調整済
みの検体並びに比較対照試料をレーザー光散乱・透過法
で測定する方法を説明する図であって、８は出力５ｍＷ
のＨｅＮｅレーザー、９は入射光線、１０は散乱光束、
１１は透過光線、１２はＳｉフォトダイオード、１３は
ロックインアンプ、１４は電磁石、１５は電磁石１４を
駆動するための０゜５１Ｔ　ｚの低周波電源、１６は散
乱光を集光するレンズ、エフは偏光板である。検体ある
いは比較対照試料の入ったガラスセル６は電磁石１４の
中に装着され、レーザー人射光線９の周りに磁性体標識
体は誘導・濃縮され、レーザー８による検体を含む液体
からの散乱光束１０又は透過光線１１はフォトダイオー
ド１２で検出される。液相中の磁性体標識ウィルス抗体
４の運動は、電磁石１４により制御されるため、散乱光
束１０及び透過光線１１の強度は、低周波電源１５の周
波数に同調することになる。したがって、ロックインア
ンプ１３で低周波電源１５の周波数に同調した散乱光束
１０あるいは、透過光ｋｉｌｌのみを増幅すれば、温度
変動等の外乱の影響を全く受けないで、検体を含む液体
からの散乱光あるいは透過光の強度を測定することが出
来る。

本実施例の場合、検体を含む液体からの散乱光強度は交
流磁場の周期に同期して測定されたが、比較対照試料中
には磁性体標識体が存在しないために交流磁場に同期す
る成分は存在せず散乱光強度は直流的でありロックイン
アンプ１３を通して測定することによりバックグランド
レベルを知ることができる。既知の螢の磁性体標識体を
含む標準溶液を希釈しなからＩＩ＋定した結果、ｔＡと
ほぼ同程度のピコグラムの検出限界を有することが明ら
かになった。

なお、通常の測定は散乱光で行えばよいが、検体の種類
、濃度によっては透過光を使用する方が高Ｓ／Ｈの測定
が出来る場合がある。

偏光板１７は検体からの偏光成分を分離して測定するた
めに使用するものである。即ち入射レーザー光として、
直線偏光に近いものを用い液相中に磁性体標識体が存在
しないときに消光するようにクロスニコルに設定してお
き、光路中に磁性体標識体が誘導されたときに偏光状態
が変化して出射光が得られるようにしておく。本実施例
においては、磁性体標識体を０．５Ｈｚの低周波に同調
させて該検体を含む液体からの散乱光を測定したが、該
低周波電源は０．５Ｈｚに限られるものではなく、検体
を含む水溶液の粘度及び磁界強度等に応じた最適な周波
数を決めることが好ましい。

本実施例で磁界による濃縮、交流磁場の印加をしない場
合でも、磁性体標識体を含む検体と、比較対照試料との
散乱強度の差から、マイクロダラム程度の検出は可能で
あった。

実施例２第３図は本発明の第２の実施例（間接法）を説明する図
であって、（ａ）〜（ｄ）は検体の調整工程を、（ｅ）
〜（ｆ）は比較対照試料の調整工程を示している。１は
ゼラチンより成る支持体、２はウィルス抗体、３はウィ
ルス抗原、４゛　はマグネタイトの超微粒子により標識
された、磁性体標識抗免疫グロブリンである。ここで抗
免疫グロブリンとは、ウィルス抗体を他の生体にいれる
ことにより形成される特異抗体であり、ウィルス抗体と
特異的に抗原抗体反応する特性を有する。５は希土＜Ｍ
　Ｌｍ石、６はガラスセルである。（ａ）は既知のウィ
ルス抗原３を支持体重に固相化する工程、（ｂ）は検体
である。患者の血液中のウィルス抗体２とウィルス抗原
３を反応させる工程、（Ｃ）は磁性体標識抗免疫グロブ
リン４゛　とウィルス抗体２を抗原抗体反応させる工程
、（ｄ）は支持体１を溶解、除去後、検体をガラスセル
６に入れ、水溶液中に分散させる液相化工程である。（
ｅ）は未反応の磁性体標識抗免疫グロブリン４゛を希土
類磁石５により、該固相化抗原から分離・除去する工程
、（ｆ）は比較対照試料の液相化工程である。

検体をこれらの工程を通して調整した後、前記実施例１
のレーザー光散乱法により検体の定量を行ったところ、
実施例１と同程度のピコグラムのウィルス抗体の検出が
できた。

実車■１第４図は本発明の第３の実施例（直接法）を説明する図
であって、（ａ）〜（ｄ）は検体の調整工程を示してい
る。１はゼラチンより成る支持体、４は鉄超微粒子によ
り標識された磁性体標識ウィルス抗体、３゛はインフル
エンザウイルス、５Ｉは電磁石、６はガラスセルである
。（ａ）は検体である患者の血液中の未知のウィルス３
゛を支持体１に固相化する工程、（ｂ）は既知の磁性体
標識ウィルス抗体４とウィルス３゛を反応させる工程、
（Ｃ）は過剰な磁性体標識ウィルス抗体４を電磁石５１
により分離・除去する工程、（ｄ）は支持体ｌを溶解、
除去後、該検体をガラスセル６に入れ、水溶液中に分散
させる液相化工程である。

種々の型の既知のインフルエンザウィルス抗体に標識し
た磁性体標識ウィルス抗体鴫を用意し、これと患者から
採取した未知のインフルエンザウィルス３゛とを抗原抗
体反応させ、検体をこれらの工程を通して調整した後、
前記実施例１のレーザー光散乱法により検体検査を行う
ことにより、インフルエンザウィルスの特定が可能とな
る。本方法による測定法は、検出感度が高いために従来
の酵素や蛍光体を用いる方法に比較して、ウィルス感染
初期の段階でインフルエンザウィルスの特定を行うこと
が出来た。

実施貫土第５図は本発明の第４の実施例である、競合阻害反応検
出法の一例を説明する図であって、１はゼラチンより成
る支持体、２はウィルス抗体、３はウィルス抗原、２１
は磁性体標識ウィルス抗原、５は希土類磁石、である。

本実施例では、（ａ）〜（ｄ）は検体の調整工程を、（
ｅ）〜（ｆ）は比較対照試料の調整工程を示している。

＜ａ）は既知のウィルス抗体２を固相化する工程、（ｂ
）は固相化された抗体２と、患者のウィルス抗原３とを
抗原抗体反応させる工程、（ｃ）は別工程で磁性体によ
り標識した磁性体標識ウィルス抗原２１を前記（ｂ）の
抗原抗体反応後の検体と反応させる工程、（ｄ）は前記
工程（ｃ）で未反応の磁性体標識ウィルス抗原２１を磁
石５により捕集する工程、（ｅ）は比較対照試料に磁性
体標識ウィルス抗原２１を反応させる工程、（ｆ）は未
反応の磁性体標識ウィルス抗原２１を磁石５により捕集
する工程である。

検体及び比較対照試料をこれらの工程により調整した後
、前記実施例１のレーザー光散乱法により測定したとこ
ろ、本実施例の場合は、磁性体標識ウィルス抗原２１は
検体を含む液相中ではウィルス抗原３によりウィルス抗
体２との反応を阻害されるため未反応のまま磁石により
除去される。しかし比較対照試料を含む液相中にはウィ
ルス抗原３は存在しないため磁性体標識ウィルス抗原２
１はライスルス抗体會と反応し検出されることになる。

その結果検体を含む液相中からは磁性体標識体は検出さ
れず、比較対照試料を含む液相中のみに磁性体標識体が
検出された。但し、ウィルス感染初期の患者からの検体
ではウィルス抗原３の数が極めて少ないため、工程（ｂ
）では一部の固相化抗体のみがウィルス抗原３と反応す
るため、検体を含む液相中からも磁性体標識体は検出さ
れるがウィルス抗原３の増加につれ検出量は減少する。

この減少量により、ウィルス抗原３の量を定量すること
ができる。

ズ４１吐ｉ第６図は本発明の第５の実施例である、競合阻害反応検
出法の他の一例を説明する図であって、１はゼラチンよ
り成る支持体、３はウィルス抗原、２はウィルス抗体、
４は磁性体標識ウィルス抗体、５は希土類磁石、である
。本実施例では、（ａ）〜（ｄ）は検体の調整工程を、
（ｅ）〜（ｆ）は比較対照試料の調整工程を示している
。（ａ）は既知のウィルス抗原３を固相化する工程、（
ｂ）は固相化された抗原３と患者のウィルス抗体２と抗
原抗体反応させる工程、（ｃ）は磁性体標識ウィルス抗
体４をウィルス抗体２に反応させる工程、（ｄ）は前記
工程で未反応の磁性体標識ウィルス抗体４を磁石５によ
り捕集する工程、（ｅ）は比較対照試料に磁性体標識ウ
ィルス抗体４を反応させる工程、（、ｆ）は未反応の磁
性体８！識ウィルス抗体４を磁石５によりｔｉｉ集する
工程である。

本実施例においても、実施例４と同じ結果が得られた。

上記実施例に於て、支持体として寒天またはゼラチンを
用いているが、これらの間には本質的な差異はなく、固
相化される抗原、または抗体との組合せから経験的に選
択される。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明は磁性超微粒子を抗原抗体
反応の標識として用い、未反応の磁性超微粒子を磁場中
で分離除去後、磁場中で検体を含む液体にレーザー光を
照射し、４Ｘｔ識体からの散乱光又は透過光を測定する
ものでありＲＩＡ法と比較して、使用時期、場所等の制
限がない、又電磁石等により外部から、磁性体標識体を
レーザー照射部へ誘導濃縮することにより、検出感度の
向上を図ることができる。又同様の手段により外部から
磁性体標識体の運動を制御することにより外界の影響を
排除することが可能である。

本測定法は特に抗原抗体反応の検査の自動化に適した方
法であるから、集団検診で必要とされる、各種のウィル
ス、ガン等のスクリーニング検査に用いれば特に効果が
発揮される。また、抗原抗体反応の他に、従来ＲＩＡ法
が適用されているペプチドホルモン等の種々のホルモン
あるいは種々の酵素、ビタミン、薬割などの測定にも応
用することが可能である。このように、本発明の方法は
患者の早期診断、治療に役立てることが出来、医療界に
つくすところ大である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の第１の実施例、第２図は本発明の実施
例のうち、レーザー光の散乱・透過を計測する方法を説
明した図、第３図は本発明の第２の実施例、第４図は本
発明の第３の実施例、第５図は本発明の第４の実施例、
第６図は本発明の第５の実施例を示す図である。１・・・支持体、　　２・・・ウィルス抗体、３・・・
ウィルス抗体、３′・・・インフルエンザウィルス、４・・・磁性体標識ウィルス抗体、４°・・・磁性体標識抗免疫グロブリン、５・・・希土
Ｗ４磁石、６・・・ガラスセル、８・・・レーザー、　
９・・・入射光線、ｌＯ・・・散乱光束、１１・・・透
過光綿、１２・・・フォトダイオード、１３・・・ロックインアンプ、１４・・・電磁石、　■５・・・低周波電源、１６・・
・レンズ、　１７・・・偏光板、２１・・・磁性体標識
ウィルス抗原、５１・・・１ｔＴ！１石

Claims

【特許請求の範囲】

（１）一の抗原又は抗体に磁性体超微粒子を標識して磁
性体標識体とし、該磁性体標識体と検体を抗原抗体反応
させる工程と、該工程後の前記検体から、未反応の前記
磁性体標識体を分離除去する工程と、該工程の後の前記
検体を液体中に分散させてレーザー光を照射する工程と
、該工程による前記検体からの散乱光または透過光を測
定する工程からなることを特徴とするレーザー磁気免疫
測定法。
（２）磁性体標識体と抗原抗体反応させる検体が、該検
体と、該検体の特異抗体又は抗原との、抗原抗体反応後
のものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載のレーザー磁気免疫測定法。
（３）磁性体超微粒子により標識される抗体が抗免疫グ
ロブリンであることを特徴とする特許請求の範囲第１項
又は第２項記載のレーザー磁気免疫測定法。
（４）未反応の磁性体標識体を分離除去する工程が、磁
石による分離除去であることを特徴とする特許請求の範
囲第１、２又は第３項記載のレーザー磁気免疫測定法。
（５）液体中に分散された検体が磁場中に置かれ、該磁
場によりレーザー光照射部分に誘導、濃縮されているこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１、２、３又は４項記
載のレーザー磁気免疫測定法。
（６）レーザー光が照射される検体が磁場中におかれ、
該磁場により交流的に駆動され、該駆動に同期した散乱
光または透過光を検出することを特徴とする特許請求の
範囲第１、２、３、４又は５項記載のレーザー磁気免疫
測定法。