JPH03183642A - レーザ磁気免疫測定用標識体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、抗原抗体反応を利用して極めて微量の栓体か
らｆ、９宇の片原宇ｔ・１を片体を、常滑的に締出する
ことができるレーザ磁気免疫測定に用いる標識体に関す
るものである。

「従来の技術」 後天性免疫不全症候群、成人Ｔ細胞白血病等のような新
型ウィルス性疾病あるいは各種馬の早期検診法として、
抗原抗体反応を利用した免疫測定法の開発が現在、精力
的に行イつれている。このような免疫測定法の一つとし
て、従来のアッセイ法に較べ１０２倍から１０３倍の高
感度でかつ汎用性のある新しい抗原検査方法が本発明者
らによって提案されている。（特願昭６１−２２４５６
７号、同６１−２５２４２７号、同６１−２５４１６４
号、同６２−２２０６２号、同６２−２２０６３号、同
６２−１５２７９１号、同６２−１８４９０２号、同６
３−１０２９１４号等。）該検査方法は、抗原抗体反応
の有無の検出にレーザ光を利用し、さらに標識材料とし
て磁性体＠粒子を用いたレーザ磁気免疫測定方法である
。

上記標識材料として用いる抗原捕捉用標識材料としては
、ｍ市販されているポリマビーズを表面処理し、その上
に抗体を結合さ０た乙の、■米国特許第４４５２７７３
号（Ｍｏｌｄａｙ）　、米国特許第４４５４２３４シ：
　（Ｃｚｅｌｉｎｓｋｉ）　、米国特許４５８２６２２
号（Ｉ　ｋｅｄａ）　、特開昭６３−５０１９号（角Ｉ
Ｌ１）等において開示されたように、磁ＰＬ体微粒子を
ボリマコートシた乙の、等か゛挙げられる。

−・方マイクロビーズ表面に結合した抗体？こよって抗
六；（をｒ１１１捉Ｌ　ｌ；”、’Ｉ定化するマイク［
ｌビーズのナイ到として（ユｆｆ機ポリマースフェアか
唯一のらのであてた。

「発明か解決しようとする課題」 現（１：、、＠　ＰＩ：微粒子・と抗ｊ７ｊ抗体反応に
よ−）で抗原を１．与１定−・１′るために用いられて
いる材料（ユ、これよ−ご仁に抗体を被覆したポリマビ
ーズである。

ところかこのようなポリマビーズにあ−）では、ポリマ
ビーズ表面処理に、Ｌるプ〔Ｊティン、１　’９６）抗
体１１η捉ｆ１７タンパク質の固定ｌこより、Ｉノ’を
原のｊ１特安的吸着が起こり易くなるばかりでなく、ポ
リマビーズの比重が小さくＩに近いために、抗原あるい
は腫瘍マーカか捕捉されてら比重の変化が小さく、この
ためひきつついて行な−）遠心分離効率にＪ、る固足−
非１・ｆｉｌ定（ＢＮ）分離の効率か悪いという欠点が
あった。このためレーザ磁気免疫測定の感度を低下さＵ
゛る原因とへっているという重大な問題かあった。

＋　Ｒｌ！／Ｊ　ｔｒ　に、：己課題を解決”４゛るた
め１こなされノこ６のてｊ５す、本発明ｔｊ）目的（ま
ポリマビーズの２　（、、−ｙ以り大きな比ＩＲを示４
゛ンリカマイクロビーズ（比！Ｆ２　、２　ｇ／　ｃｍ
Ｊ）を用いることにより、遠心分離効率か良く、かつ非
特異反応ＰＬの９乙ｉいレーザ磁／、１免疫標識体を提
供することにある。

［課題を解決するための手段」 本発明の請求項！記載のレーザ磁気免疫測定用Ｐ　、Ｊ
体（よ、抗原抗体反応をｆｌいる検Ａ　、ｊ、ｅ薬で３
で）、。

て、Ｌ’Ｌ子に而に７ラン処理を施しノこンリカマイク
〔ｌビーズを検か試薬の標識体保持体として用いろこと
を解ｔｋト段とした。

本発明の請求項２のレーザ磁気免疫測定用標識体（ユ、
シラン処理として、ノリ力マイクし１ビーズ拉ｒ・表面
にアミノ括をｒｉ　ｔろ処理であることを、また本発明
の請求項３記載のレーザ磁気免疫測定用標識体は、ノリ
力マイクロビーズの粒子ｉ７が１０ナノメートル以上ｌ
０００ナノメートル以トであることを、それぞれの解決
手段とした。

ｊ−作／ＭＪ 水中での分散性の優れているコロイド状のソリ力マイク
（ｌビーズを用いて、その拉−１表面にシラン処理、特
に粒子表面をアミノ化するシラン処理を施すことにより
、ノリ力マイクロピーズを被覆するプ〔ノテインＡ等の
抗体捕捉用タンパク質に拮含さ０゛た抗体の１０部を内
部に、Ｆａｂ部を４則に向ＩＩた１に常な立体配置で抗
体を固定する事が可能どな−、ノニ。

以下、本発明をよ／）ｇ￥紐１１こ説１１／ｌする。

本発明１こ／１７いられるノリ力マイク〔１ヒーズの粒
子径は特に限定されるものではへいか、１０ナノメート
ル以上１０００ナノメートル以下がｔｌ’ＦましＬ）。

現状ではＩＯナノメートル未’／：６の１ｉｉ分散のコ
ロイド状ンリカビーズの製造か困難なためであり、Ｍｌ
、ｓａｔ、ｈ５１；＾ノ１：（ｔＪｌ；ｒ−１−１）制
、”Ｓｒ＜ａｆＷ二ｂｔ：；’、＞ｂｗ大れる。また約
１０００ナノメートルより大きいンリツノマイクロビー
ズでは、水中での安定な分散お９Ｌびｆ″Ｉ−遊か困難
てあり、ａ冒１１１ｊの経過ととち？こンＪツカマイク
「ｌビーズか沈＃−４゛るのを防ぐことがむずかしいた
めである。モして尖験的に選ばれたンリカマイク〔ｌビ
ーズの粒子ｉ子の最ら好ましい範囲は１０ナノメートル
以上４００ナノメートル以［パである。

シラン処理を施して表面かアミノ化されたシリカマイク
Ｃｌビーズのゼータ電位の値は一３５ｍＶから一２ｍＶ
の範囲に在ることが、分散性や水溶６’！ｉｚ性さらに
ＪＦ　＃’ｊ　５”ｄ反応をｍｌえる上で好ましい。

表面か／シノール基でにＪ、わ力、ているコ［ノイド状
ンリカマイクロビーズをシラン処理する方法としては、
ビニル化、アミノ化、エボキン化、カルポキンル化、ク
ロル化、メルカプト化、メタクロキン化など種々の反応
を用いることかできる。

１該ビニル化の７１にはヒニルトリメ）・キノシラン（
Ｃｌｌ２−ＣＩ−Ｉ　Ｓ　ｌ（ＯＣｉｌ、）　３）　−
ヒニルトリエトキ’ｙ’ｉ’ｙｙ　（ｎｌ−１，＝ｆ”
ＩＩＩ　　（Ｏｆ：ｒｆ、Ｃ目、、）、）ヒニルトリス
　（２−メトキシエトキン）７ラン（ＣＩＩ　２・Ｃｌ
ｌＳｉ　　（ＯＣｌｌｐＣＩＬＯＣＩ−１３）３）等を
用いる′１ｆが出来る。該エポキシ化のためには３−ク
リノドキノブ〔１ピルトリメトキノシラン（ＣＩＩ、Ｃ
ＩＣＩＩ、０ＣＩＬＣＩＬＣｆＬＳｌ　（ＯＣｔ１３）
３）、０／ ３−クリノトキップ［ｌピルメヂルキメトキ７シラン　
　（Ｃ１１、Ｃ１１Ｃ１１２０Ｃ）Ｉ　　２Ｃ）Ｉ　　
、ＣＩ（、ｓｉ　　　Ｃｌｌ３（Ｏｃ　ＪＪＪ）　２）
　、２−　　（３，４−エボキシンク［ｌヘキシル）に
デルトリメトキンシラン（ＯＣ８１１９Ｃ１１２（／　
ＩＩ　２Ｓｌ　（０（／　１１３）３）等を用いる事か
゛出来る。

該夕［ｌル化のためには３−りＵＪ　Ｃｌブロピルメチ
ルノメトキノシラン（ＣｆＩＣＩＩ　、Ｃ１１２ＣＩＩ
　２ＣＩＩ　３（ＯＣＩ１３）、）、３−クロ「！ブロ
ピルトリメトキ７シラン（ＣＯＣｌ１．ＣＩＩ、Ｃｌｌ
２Ｓ　Ｉ　（ＯＣ１１３）３）オ・を用いる°ｊ「か出
来る。該メルカプト化のためには３メルカプドブ（！ピ
ルトリメトキシシラン（ＩＩ　Ｓ　Ｃ１１２ＣＩＩ２Ｃ
ＨｖＳＩ　（ＯＣＩＩ３）　３）等をＪｆＪ　ｔｌ　ル
’Ｊｆか出来る。１亥メタク〔Ｊギシ化のためには３−
メタクロキンブ［ノビルトリメトキシシランＣＩ□−〇
（ＣＩＩ３）Ｃ００ＣＩＩ２（１１，ＣＩｌ、Ｓｉ　（
ＯＣＩｆ３）３等を用いる事か出来る。

ＩｇＧ抗体を結合するために特に有用なソラン処理とし
てアミノ化がある。アミノ化処理の方法としてはアミノ
プロピルトリアルコキシシラン（ＮＩＩ２（］ｌ、）３
Ｓｉ　（ＯＲ）３　　Ｒ：アルキル基であり、たとえば
Ｃ１１３、Ｃｔｌ’４５−等である。）、アミツブし！
ピルメチルジアルコキシシラン（ＮＨｙ（ＣＩＩ　、）
３　Ｓ　ｉ　Ｃ［１３（ＯＲ）２）、アミノプロピルジ
メチルモノアルコキンシラン（Ｎ　Ｈ、（ＣＨ２）３Ｓ
　ｉ　（ＣＪｒ、）、ＯＲ）　、Ｎ−（２−アミノエチ
ル）３−アミノプロピルトリアルコキシシラン（Ｎ　Ｉ
−１、Ｃ１１、Ｃ１１、ＮＨ（Ｃ１ｌｔ）３Ｓｉ　（Ｏ
Ｒ）３、ここでＲ（アルキルｌ、０はＣ１１３−、Ｃ，
ｌ−１５−等である。）、Ｎ−（２アミノエヂル）３−
アミノプロピルメチルジアルコキツシラン（Ｎ　Ｈ２Ｃ
ＩＩ　２ＣＨｔＮ　Ｈ（ＣＩＩ　、）３Ｓ　ｉＣＨｓ（
ＯＲ）２、Ｒ：　ＣＨａ　　、Ｃ２Ｈ５−等のアルキル
基である。）、Ｎ−（２−アミノエチル）３アミノプロ
ピルジメチルアルコキシシラン（Ｎ１１２Ｃｌｌ２ＣＪ
Ｉ２ＮＩＩ（ＣＨ，）　３Ｓ　ｉ　（Ｃ１１３）２（：
）　Ｒ。

ここでＩＩはＣＨ３、Ｃ１！Ｈ５−などのアルキル基を
ル４゛。）等のアミノシランカップリング剤を用いろ“
１１かできる。

さらにカンマ−線照射下での７リカマイクロヒーズのア
ンモニア水溶液との反応によって、シリカマイク［１ヒ
一ズ表面に直接アミノ基を生成さ０゛る°１１ら出来ろ
。

本発明はノリ力マイクロヒーズ」二にアミツノ、ｔが化
学的に共γｆ結合しているものであれば良く、前記以外
の（＝Ｉｆらかのアミノ基形成反応を用いる７ｆが１ｊ
来、本明細ＩＩｆに開示した反応に限定される乙のでは
ｊｌい）、２ 実施例Ｊ （吏１８！（ガｊＩ） ０　、０６　　％β度の・Ｖ均粒１そ１７ナノメータの
コ（ｌイト状ノリ力マイクロヒーズに、濃度０１％の３
−アミツブ［１ピルトリエトキノノラノを室温で３時１
７ｊＪ反応さ０°た。未反応の該アミツシランを透析に
より除いた後に、該シリカマイクロビーズのセータ電位
を測定したところ−３，Ｉｍ　Ｖでありノニ。

次に該シリカマイクロビーズにプロティンＡを被覆させ
た後、抗体を結合させた。さらに抗原抗体反応により抗
原を捕捉した後、マグネタイト磁性標識体を該抗原と結
合させてレーザ磁気免疫測定を　１ｔ　つ　）こ。

この測定では抗原量がピコグラム／ｍ（ｌの極微少量で
ら抗原を定電する事が出来た。抗原としてはインフルエ
ンザウィルス、肝炎ウィルスをもちいた。

なお、アミツシランとして、アルコキシ基が２官能、あ
るいは１官能の有機シランカップリング剤を用いても同
様な結果か得られた。

（実施例２） 水溶液濃度０．０１％から０．１％までの平均粒径かそ
れぞれ１５ｎｍ、２０ｎｍ、８０ｎｍ、　　Ｉ　００ｎ
ｍ、２００ｎｍの５種類の異なる親水性のコロイド状ノ
リ力マイクロヒーズを用意した。ついでこれらシリカマ
イク「１ヒーズに、０．０１％から０．２％までの３−
アミノプ口ピルトリエトキ７シランを室温で約４時間反
応させところ、第１図に示したように２ないし３時間で
終了し、ゼータ電位が一定値Ｊこなった。このゼータ電
位を第１表に示した。

第１表 ａ）単位：ｍＶ いずれのシリカマイクロビーズを用いてもゼータ電位は
一５ｍＶから−Ｉ　Ｉｍ　Ｖの範囲にあり、初期のシリ
カマイクロビーズｊこ較べ、静電的な反発を非常に小さ
くする事が出来た。初期のシリカマイクロビーズのゼー
タ電位は約−３４ｍＶ程度あり、アミノ化変成前に較べ
て値が負？こ大きい。

本シリカマイクロビーズ表面のアミノ基を用いてプロテ
ィンＡを化学的に反応固定させた後、さらに抗体を化学
的に結合させる事によって、高性能な磁性標識体と抗原
抗体反応によって結合するシリカマイクロビーズを製造
する事ができた。

なお３−アミノプロピルトリエトキシシランの変わりに
アルコキシ基が２官能、あるいは１官能の３−アミノプ
ロピルエトキシシランを用いても同様？こ高性能な磁性
標識体に結合した抗原捕捉シリカマイクロビーズをつく
る事が出来た。

（実施例３） 実施例２Ｉこ用いたシリカマイクロビーズをアンモニア
水溶液（ａ度ｆ％以上）と混合した後？こガンマ−線を
１時間、照射した。本操作によりシリカマイクロビーズ
表面のシラノール基をアミノ基に変換する事が出来た。

表面のシラノール基をアミノ基に変成する程度は、カン
マ−線の照射時間を変える事によって行う事が出来る。

これらのアミノ基変成ンリカマイクロビーズをプロティ
ンＡと結合させ、更に抗体を結合させた後、抗原を抗原
抗体反応によって捕捉固定さ０−た後、レーザ磁気免疫
測定法により測定を行ったところ、１ｏ−１！ダラムの
高感度で抗原を定量する事が出来た。

「発明の効果」 以上説明したように、本発明のレーザ磁気免疫測定用標
識体は、比重の大きなシリカマイクロビーズを用いてい
るため、抗原を結合したシリカマイクロビーズの遠心分
離を効率よく行う事が出来る。このためレーザ磁気免疫
測定法の感度の向上を大幅に計れる効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は　０．２％濃度のアミノプロピルトリエトキシ
シランを０．０２％のシリカビーズと反応させた時のゼ
ータ電位の反応時間による変化を示した図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）抗原抗体反応を用いる検査試薬であって、粒子表面
   にシラン処理を施したシリカマイクロビーズを検査試薬
   の標識体保持体として用いることを特徴とするレーザ磁
   気免疫測定用標識体 ２）該シラン処理として、シリカマイクロビーズ粒子表
   面にアミノ基を有する処理であることを特徴とする請求
   項１記載のレーザ磁気免疫測定用標識体 ３）シリカマイクロビーズの粒子径が１０ナノメートル
   以上１０００ナノメートル以下であることを特徴とする
   レーザ磁気免疫測定用標識体