JPH0588787B2 - - Google Patents

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JPH0588787B2
JPH0588787B2 JP61130506A JP13050686A JPH0588787B2 JP H0588787 B2 JPH0588787 B2 JP H0588787B2 JP 61130506 A JP61130506 A JP 61130506A JP 13050686 A JP13050686 A JP 13050686A JP H0588787 B2 JPH0588787 B2 JP H0588787B2
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  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Magnetic Means (AREA)
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗原・抗体の測定法に関し、特に、
安全で、高感度、高信頼性である上に極めて短時
間で測定結果が得られる測定法に関する。
〔従来の技術〕
従来、試料液中の抗原又は抗体の濃度を測定す
る方法の1つとして、ラテツクス凝集法が知られ
ている。この方法は、測定しようとする抗原又は
抗体と特異的に反応する抗体又は抗原を固定化し
たポリエチレン等のラテツクス粒子を試料液中に
分散させ、抗原−抗体反応に伴なつて生成するラ
テツクス粒子の凝集塊量を光散乱を利用して光学
的に測定し、もつて試料液中の抗原又は抗体の濃
度を測定するものである。
〔発明が解決しようとする問題点〕
上記のラテツクス凝集法はラジオイムノアツセ
イのように危険性がなく安全で、またエンザイム
イムノアツセイに比べ簡便であるとの利点を有す
るが、抗原−抗体反応に伴なうラテツクス粒子の
凝集に長い場合には約2時間以上という長時間を
要するため短時間で測定結果が得られないという
問題を有している。また、凝集塊量の測定に高価
な光学装置を必要とする不利もある。
そこで、本発明の目的は、高感度、高信頼性で
かつ安全であるばかりでなく、短時間で測定結果
を得ることができる抗原・抗体の測定法、特に抗
原・抗体濃度測定法を提供することにある。
〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、かかる測定法として、試料液中の抗
原又は抗体の濃度を測定する方法であつて、前記
の抗原又は抗体に特異的に結合し得る抗体又は抗
原を固定化した磁気微粒子を前記試料液中に分散
させることにより抗原−抗体反応を生起させ、抗
原−抗体−磁気微粒子結合体を生成させ、 次に、試料液に磁界を適用して前記の抗原−抗
体−磁気微粒子結合体の凝集塊を生成させ、 次に、磁界の適用を停止して、未反応の抗体又
は抗原を固定化した磁気微粒子を試料液中に分散
させ、 次に、試料液中に懸濁する前記凝集塊濃度を測
定する、 工程を有する抗原・抗体濃度測定法を提供する
ものである。
本発明において、抗原又は抗体の固定化に用い
る磁気微粒子の材料は、特に限定されず、例え
ば、磁性金属微粉、Fe3O4,γ−Fe2O3,Co−γ
−Fe2O3、(NiCuZn)O・Fe2O3,(CuZn)O,
Fe2O3.(Mn・Zn)O.Fe2O3,(NiZn)O・Fe2O3
SrO・6Fe2O3,BaO・6Fe2O3,SiO2で被覆した
Fe3O4(粒径200Å)〔Enzyme Microb.
Technol.,vol.2,p.2−10(1980)参照〕,各種の
高分子材料(ナイロン、ポリアクリルアミド等)
とフエライトとの複合微粒子等が挙げられる。ま
た、これらの磁気別粒子の粒径は、50Å〜10μm
の範囲が好ましく、特に100Å〜1μmの範囲であ
ることが好ましい。磁気微粒子の粒径が小さすぎ
ると外部磁場による凝集操作が不可能となるか、
もしくは非常に強い磁場を要する。また、粒径が
大きすぎると試料液に良好に分散させることが困
難となる。
上記の材料および粒径を有するものの中でも特
に好ましいものとして、SiO2で被覆した粒径約
200ÅのFe3O4粒子、及び粒径200〜300Åのγ−
Fe2O3粒子を挙げることができる。さらに、この
ような好ましい磁気微粒子として、走磁性細菌か
ら得られる磁鉄鉱(Fe3O4)からなる微粒子(粒
径約500Å)が挙げられる。前記走磁性細菌は、
例えば特開昭62−61599号に開示された方法およ
び採取器により淡水又は海水から容易に採取する
ことができる。
本発明に用いられる抗原又は抗体を固定化した
磁気微粒子は、上記の磁気微粒子に所要の抗原又
は抗体を固定化することにより製造することがで
きる。抗原又は抗体の磁気微粒子への固定化は、
抗原又は抗体の固定化技術として公知の方法によ
り行なうことができ、例えば、シランカツプリン
グ剤、ブドウ状球菌より得られるProteinAを磁
気微粒子に被膜させ、そして抗体を結合させる方
法等を用いて行なう。
上記の磁気微粒子に固定化される抗体又は抗原
の種類は、被測定対象である特定の抗原又は抗体
に対して抗体又は抗原の関係にあるものであり、
試料液中の抗原又は抗体に応じて選択される。か
かる抗原又は抗体の例としては次のものを挙げる
ことがでできる。
抗原類:IgG、IgA、IgM、IgE、アルブミン、
HCG、AFP、カルジオライピン抗原、血液型物
質、コンカナバリンA、DNT、ブロスタグラン
ジン、CRP、HBs、ヒト成長ホルモン、ステロ
イドホルモン、CEA、IgD等: 抗体類:抗アルブミン抗体、抗HCG抗体、抗
IgG抗体、抗IgA抗体、抗IgM抗体、抗IgE抗体、
抗IgD抗体、抗AFP抗体、抗DNT抗体、抗プロ
スタグランジン抗体、抗ヒト凝固フアクター抗
体、抗CRP抗体、抗HBs抗体、抗ヒト成長ホル
モン抗体、抗ステロイドホルモン抗体、およびこ
れらを含む血清、並びにモノクローナル抗体: 本発明の方法により測定し得る試料液中の抗原
又は抗体の例としても上記例示のものを挙げるこ
とができる。
本発明の方法においては、まず、抗原又は抗体
を固定化した磁気微粒子を試料液中に分散させ
る。例えば、1mgの抗体固定化磁気微粒子を0.5
%の界面活性剤(Tween80)を含む0.15N NaCl
溶液4.5mlに懸濁し、60Wで1分間超音波をかけ
て分散させる。
次に1〜100μg/mlの抗原溶液を0.5ml加え撹拌
する。この分散処理により、試料液中に存在した
抗体又は抗原は磁気微粒子上に固定化されている
抗原又は抗体に結合し、抗原−抗体−磁気微粒子
からなる三元結合体を生成する。これらの結合体
は、抗原−抗体反応の進行により隣接する結合体
同士で凝集する傾向にあるが、放置するとその速
度は極めて緩慢である。
本発明の方法ではこの段階で試料液に磁界を適
用する。すると、前記結合体同士の凝集が促進さ
れ、極く短時間、即ち1〜10分間で凝集が終了し
凝集塊が生成する。この凝集塊の生成量(凝集塊
の大きさ×数)は試料中に存在した抗原又は抗体
の濃度に比例する。なお、試料液に磁界を適用す
る方法は特に限定されず、例えば、試料液の容器
の外側に対向させて磁石を配置する方法、試料容
器を電磁石のコイルの中に設置する方法等が挙げ
られる。
上記の凝集塊の生成時には、未反応の抗原又は
抗体固定化磁気微粒子も磁界の作用やクーロン力
等で物理的に凝集したり、前記凝集塊に付着する
可能性があるが、この段階で磁界の適用が停止さ
れ、撹拌、振動等により分散処理を施すと、この
ような未反応抗原又は抗体を有する磁気微粒子の
凝集物や付着物は、再び液中に微細に分散され
る。一方、前記の抗原−抗体反応により生成した
凝集塊はその状態のまま液中に残存することにな
る。
次に、液中に存在する凝集塊の生成量(大きさ
×数)を測定する。測定法は特に限定されない
が、自動測定化に適する点で好ましい方法とし
て、イメージセンサを利用する方法が挙げられ
る。この方法は、凝集塊を含む試料を光学顕微鏡
に供し、CCDカメラにより顕微鏡視野の像をと
らえる。背景(バツクグランド)が白い画素とし
て示されるのに対し、凝集塊は黒い画素として示
される。黒い画素数から凝集塊の大きさと数をコ
ンピユータ処理によりヒストグラム化し凝集塊の
生成量を求める。あるいは他の方法としては、凝
集塊の大きさおよび数に依存する赤外光の散乱の
度合を測定する方法を用いることもできる。前記
のイメージセンサを利用する方法は、従来のラテ
ツクス凝集法ではラテツクス粒子の光透過性のた
めに利用することに技術的な困難があつたが、本
発明の磁気微粒子凝集法では容易にこれを利用す
ることができるため、、凝集塊の測定を安価な装
置を用いて行なうことができる。
〔実施例〕
以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。
実施例 1 (1) (MnZn)O・Fe2O3で表わされるフエライ
トからなる平均粒径300Åの粒子に、5ml/g
フエライトのアセトンを添加し、35℃で5分間
強く撹拌した。次に、γ−アミノプロピルトリ
エトキシシラン5μ/gフエライトを加え、
35℃でアセトンがほぼ完全に蒸発するまで撹拌
した。次に、フエライト微粒子を約100ml/g
フエライトのアセトン中に懸濁させ、懸濁後3
分以内に生じた沈殿物は除去し、その後24時間
放置後までに生じた沈殿物0.2gに25mlの2%グ
ルタルアルデヒド溶液(0.1M Na−borate緩
衝液に溶解)を加え、20℃で撹拌後1M
NaOH水溶液を徐々に加えて溶液のPHを11.0に
調整し、1時間反応させた。その後、遠心によ
り得られた沈殿物を水で洗浄後、抗ヒトIgG血
清液中に懸濁し、4℃で16時間撹拌した。こう
して、抗ヒトIgG抗体固定化フエライト微粒子
を得た。
(2) 上記の抗体固定化フエライト微粒子1mgを
0.5%ポリソルベート(polysorbate)80
(Tween80)を含む0.154N NaCl水溶液5mlに
懸濁し、60Wで1分間超音波をかけて分散処理
し、次に0,1,10,100μg/mlの4種類の濃
度でヒトIgGを加えた。
これら4種類の濃度でヒトIgGを含む試料に
磁石を近づけ、フエライト微粒子を凝集させて
抗原−抗体反応によるフエライト微粒子間結合
を生じさせた。
次にこれらを激しく振とうして抗原−抗体反
応による結合以外(クーロン力、磁力等)によ
つて凝集している塊りを分散させた。次にこれ
らの試料を光学顕微鏡で観察するとヒトIgG濃
度が0μg/mlの試料ではフエライト微粒子の凝
集塊が認められなかつたが、ヒトIgGを含む試
料では数μm〜数10μmの凝集塊が認められた。
そこでこれらの顕微鏡像をCCDカメラとコン
ピユーターにより画像処理し、凝集度を定量化
した。
実施例 2 (1) ヒト血清アルブミン66重量%、平均粒径300
ÅのFe3O4微粒子19重量%およびブドウ状球菌
タンパクA(staphylococcal protein A)15重
量%からなる混合物190mgを0.5mlの水に懸濁し
た後、綿実油60mlを加え、60Wで1分間超音波
を作用させて均一に分散させた。次に、全体を
50℃の綿実油200ml中に徐々に加え、撹拌を10
分間行なつた。2000×gで15分間遠心分離を行
ない、得られた沈殿物を無水エーテルで洗浄し
綿実油を除去した。次に、2000×gで15分間遠
心分離し、沈殿物を水で洗浄し、大気中で乾燥
した。こうして得た処理物を0.5mgとり、0.1%
のポリソルベート80(Tween80)を含む0.154N
NaCl0.2mlを加えて懸濁させた。この懸濁液に
抗ヒトIgG0.5mgを加え、37℃で40分間反応さ
せ、抗体(抗ヒトIgG)固定化Fe3O4微粒子を
得た。
(2) 上記の抗体固定化Fe3O4微粒子1mgを0.5%ポ
リソルベート80(Tween80)を含む0.154N
NaCl水溶液5mlに懸濁し、60Wで1分間超音
波をかけて分散処理し、次に0,1,10,
100μg/mlの4種類の濃度でヒトIgGを加えた。
これら4種類の濃度でヒトIgGを含む試料に磁
石を近づけ、Fe3O4微粒子を凝集させて抗原−
抗体反応によるフエライト微粒子間結合を生じ
させた。
次にこれらを激しく振とうして抗原−抗体反応
による結合以外(クーロン力、磁力等)によつて
凝集している塊りを分散させた。次にこれらの試
料を光学顕微鏡で観察するとヒトIgG濃度が
0μg/mlの試料ではFe3O4微粒子の凝集塊が認め
られなかつたが、ヒトIgGを含む試料では数μm
〜数10μmの凝集塊が認められた。そこでこれら
の顕微鏡像をCCDカメラとコンピユーターによ
り画像処理し、凝集度を定量化した。
実施例 3 (1) 平均粒径300Åの磁鉄鉱(Fe3O4)粒子10mg
をγ−アミノプロピルトリエトキシシラン中に
加え、室温で10分間撹拌した。0.1Mリン酸緩
衝液(PH7.0)で洗浄後、2.5%濃度でグルタル
アルデヒドを含む0.1Mリン酸緩衝液(PH7.0)
中、室温で1時間反応させた。次いで、0.1M
リン酸緩衝液で洗浄後1,8−ジアミノ−4−
アミノメチルオクタン原液と室温で1時間反応
させた。0.1Mリン酸緩衝液で洗浄後、再び2.5
%グルタルアルデヒドを含む0.1Mリン酸緩衝
液(PH7.0)中で1時間反応させた。次に、
Fe3O4微粒子を抗ヒトIgG1mg/mlを含む0.1M
リン酸緩衝液生理食塩水4ml中に懸濁し、4℃
で12時間撹拌して反応を進めた。こうして抗体
(抗ヒトIgG)を固定化したFe3O4微粒子を得
た。
(2) 上記の抗体固定化Fe3O4微粒子1mgを0.5%ポ
リソルベート80(Tween80)を含む0.154N
NaCl水溶液5mlに懸濁し、60Wで1分間超音
波をかけて分散処理し、次に0,1,10,
100μg/mlの4種類の濃度でヒトIgGを加えた。
これら4種類の濃度でヒトIgGを含む試料に磁
石を近づけ、Fe3O4微粒子を凝集させて抗原−抗
体反応によるフエライト微粒子間結合を生じさせ
た。
次にこれらを激しく振とうして抗原−抗体反応
による結合以外(クーロン力、磁力等)によつて
凝集している塊りを分散させた。次にこれらの試
料を光学顕微鏡で観察するとヒトIgG濃度が
Oμg/mlの試料ではFe3O4微粒子の凝集塊が認め
られなかつたが、ヒトIgGを含む試料では数μm
〜数10μmの凝集塊が認められた。そこでこれら
の顕微鏡像をCCDカメラとコンピユーターによ
り画像処理し、凝集度を定量化した。
〔発明の効果〕
本発明の抗原・抗体の測定法は、安全であり、
高感度、高信頼性であるばかりでなく、極めて短
時間で測定結果が得られる利点があり、さらに自
動測定化にも適している。具体的には、抗原又は
抗体の濃度測定法として利用すると、従来のラテ
ツクス凝集法によると測定に長い場合24時間以上
という長時間を要したが、本発明の方法では、1
時間程度で測定結果が得られる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 試料液中の抗原又は抗体の濃度を測定する方
    法であつて、前記の抗原又は抗体に特異的に結合
    し得る抗体又は抗原を固定化した磁気微粒子を前
    記試料液中に分散させることにより抗原−抗体反
    応を生起させ、抗原−抗体−磁気微粒子結合体を
    生成させ、 次に、試料液に磁界を適用して前記の抗原−抗
    体−磁気微粒子結合体の凝集塊を生成させ、 次に、磁界の適用を停止して、未反応の抗体又
    は抗原を固定化した磁気微粒子を試料液中に分散
    させ、 次に、試料液中に懸濁する前記凝集塊濃度を測
    定する、 工程を有する抗原・抗体濃度測定法。
JP61130506A 1986-06-05 1986-06-05 抗原・抗体の濃度測定法 Granted JPS62287159A (ja)

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