JPH02151766A - レーザ磁気免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫測定法に関する
ものである。更に詳述するならば、本発明は極めて微量
の検体から特定の抗体または抗原（以下、ターゲット検
体と記す）を定量的に検出可能なレーザ磁気免疫測定法
に関するものである。

従来の技術 後天性免疫不全症候群、成人工細胞白血病等のような新
型ウィルス性疾病、あるいは各種ガンの早期検査法とし
て、抗原抗体反応を利用した免疫測定法の開発が、現在
、世界的規模で推進されている。

従来から知られる微量免疫測定法としては、ラジオイム
ノアッセイ法（以下、ＲＩＡ法と記す）、酵素イムノア
ッセイ法（ＥＩＡ法）、蛍光イムノアッセイ法（ＦＩＡ
法）等が既に実用化されている。これらの方法は、それ
ぞれアイソトープ、酵素、蛍光物質を標識として付加し
た抗原または抗体を用い、これと特異的に反応する抗体
または抗原の有無を検出する方囁である。

Ｒ１Δ法は、標識化されたアイソトープの放射線量を測
定することにより抗原抗体反応に寄与した検体量を定量
するものであり、ピコグラム程度の超微量測定が可能な
現在唯一の方法である。しかしながら、この方法は放射
性物質を利用するので、特殊設備を必要とし、また、半
減期等による標識効果の減衰等を考慮しなければならな
いので、実施には大きな制約がある。更に、放射性廃棄
物処理が社会問題となっている現状を考慮すると、その
実施は自ずと制限される。

一方、酵素、蛍光体を標識として用いるＥＩＡ法、ＦＩ
Ａ法は、抗原抗体反応に寄与した検体量を、発色や発光
を観測することにより検出する方法であり、ＲｒＡ法の
如き実施上の制約はない。

しかしながら、ＥＩＡ法、ＦＩＡ法は未反応の標識体を
完全に分離することが困難であるため、バックグランド
が高く、検出限界はナノグラム程度であった。

また、レーザ光を利用して抗原抗体反応の有無を検出す
る方法として、例えば、主に肝臓癌の検出を目的として
開発されたＡＦＰ（アルファ・フェトプロティン）を利
用した方法がある。この従来のレーザ光散乱法の根本的
欠点は、検体が分散された溶液の１部分のみをレーザ照
射して検出するために、これ以上に検出感度を高めるこ
とは原理的に望外のものである。また、このような本質
的欠点があるため、多量の検体を必要としていた。

上述のように、従来の免疫測定法のうち高い検出感度を
有するＲＩＡ法は放射性物質を使用するためにその実施
については多くの制約があり、実施容易なＥＴＡ法、Ｆ
ＩＡ法等は感度が低く精密な定量的測定ができない問題
があった。

これらの問題に対処するために本発明者らは、従来の方
法とは原理を異にする免疫測定法の研究を行い、先に特
願昭６１−２２４５６７．６１−２５２４２７、６１−
２５４１６４、６２−２２０６２、６２−２２０６３、
６２−１５２７９１　．６２−１５２７９２、６２−１
８４９０２、６２２６４３１９．６２−２６７４８１と
してレーザ磁気免疫測定法及び測定装置についての発明
を特許出願した。これらの新しい免疫測定法は標識材料
として磁性微粒子を用いる点に特徴があり、アイソトー
プを用いないでピコグラムの超微量検出が可能である。

検出方法には、レーザ光の散乱光、透過光、反射光、干
渉光、回折光の何れを利用してもよい。本発明者らが提
供した磁性微粒子を抗原あるいは抗体に標識して行う免
疫測定法によれば、極く微量のターゲットでも検出する
ことができる。例えば、本発明者らが日本ウィルス学会
第３５回総会（昭和６２年１１月　講演番号４０１１ｒ
新しく開発した免疫測定装置を用いたウィルスの検出実
験」）で発表したように、不活性化したインフルエンザ
ウィルスＡ、Ｂ型をウィルスのモデルとして用いて、ウ
ィルス検出実験を行ったところ、Ｌ＋ｎｉ２中に推定１
個程度のウィルスが存在する場合でも検出できた。

発明が解決しようとする課題 一般に、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、ＦＩＡ法等の現在実用化
されている標識法は、検出感度を向上させるために、検
体の調整の際、洗浄を繰り返し行って未反応の標識体を
除去しなければならない煩わしさがある。

また本発明者らが先に提案した免疫測定法においても検
体の調整の際、ターゲット検体と磁性体標識体とを抗原
抗体反応させた後、未反応の該磁性体標識体を分離する
工程が必要であった。

これらの測定法に対して非標識法である微粒子凝集法（
ＰＡ）は検体調整が簡便ではあるが感度が著しく低い欠
点があった。

このため、検出感度が高い標識法において、未反応の標
識材料を分離・除去しないで、ターゲット検体のみを選
択的に検出することができる測定法の確立が望まれてい
た。

本発明の目的は、ＲＩＡ法以上の検出感度並びに精度を
有しながら、検体調整が簡便で、かつ実施上の制限のな
い新規な測定方法を提供することにある。

課題を解決するための手段 本発明では、蛍光色素が付与された非磁性体微粒子にタ
ーゲットとす°る検体を捕捉する第１工程と、前記ター
ゲット検体に対する抗体あるいは抗原が固相化された磁
性体標識体を第１工程で処理された非磁性体微粒子に抗
原抗体反応させる第２工程と、外部磁力によって磁性体
標識体をレーザ照射点に局部濃縮する第３工程と、該局
部濃縮点にレーザを照射して磁性体標識体と結合した非
磁性体微粒子の蛍光色素を励起させ、該蛍光を検出する
第４工程とからなるレーザ磁気免疫測定法によって、前
記課題を解決した。

ここでターゲット検体とは、検出しようとする特定の抗
体または抗原を指す。

蛍光色素が付与された非磁性体微粒子にターゲット検体
を捕捉する第１工程においては、検体を特異的に捕捉す
る方法のみならず検体を非特異的に捕捉する方法も適用
できる。この検体を非磁性体微粒子に捕捉する第１工程
（検体捕捉工程）には、本発明者らが先に特願昭６３−
１０２９１２「レーザ磁気免疫法を実施するために検体
調整方法」で用いた方法を転用できる。すなわち、非磁
性体微粒子の表面を活性化してターゲット検体を非特異
的に吸着する方法や、非磁性体微粒子の表面上に予め既
知の抗体あるいは抗原を固定しておきターゲット検体を
抗原抗体反応によって特異的に結合させる方法を利用す
ることができる。前者の非特異的な方法は、スクリーニ
ング検査や、患者のうがい液からインフルエンザウィル
スを検出するような場合に有効である。うがい液にはウ
ィルスは多くても数百側程度しか存在しないし、また、
Ａ型、Ｂ型等の複数の変異株があるから、まずウィルス
を特定せずに確実に前記非磁性体粒子に捕捉する目的に
適している。また後者の特異的な方法は、非特異反応を
できる限り排除して特定のウィルスのみを確実に検出す
る精密検査に適している。

本発明の方法に使用される非磁性体微粒子は、非磁性体
であって蛍光色素が付与できるものであれば各種のもの
を利用できる。蛍光色素は一般に非磁性体微粒子の表面
を該蛍光色素で染色する方法で付与できるが、該蛍光色
素の励起に用いるレーザ光に対して透明な材料で非磁性
体微粒子を作成すれば、蛍光色素を該材料に予め混入す
る方法も適用可能である。なお、該非磁性体微粒子は、
先に提案した特願昭６３−１０２９１２の場合とは異な
り、遠心分離しないため重量については特段の制限は無
い。微粒子の寸法に関しては、検体に応じて適当な値を
選択すべきである。また、測定の定量性、再現性の観点
から粒径が均一なものが好ましい。例えばウィルスを検
出する場合は、従来の微粒子凝集法（ＰＡ）にも用いら
れている直径数μｍ以下で粒径分布幅の少ない微小球が
、該非磁性体微粒子として適当である。粒径が数μｍを
越えると１つの非磁性体微粒子に多数のウィルスが結合
する場合があり、また粒径の分布幅が広くなるとウィル
スの数と該非磁性体微粒子の数とが比例しなくなり、ウ
ィルスの定量が困難になる。

該非磁性体微粒子には、例えば、アクリルポリマービー
ズ、ポリスチレンビーズ等の有機材料製の粒子や、シリ
カ微粒子等の無機材料製の粒子などを利用できる。これ
らの粒子は均一粒径のものが入手容易である点でも好ま
しい。蛍光色素にはあらゆるものか適用可能であるが、
検出感度を向上させるためには、蛍光の量子収率の高い
ものが好ましい。例えば、クマリン誘導体やキサテン系
、ローダミン系、オキサジン系、シアニン系、メロ７ア
ニン系等の蛍光色素が適当である。

本発明の測定方法の第２工程においては、第１工程で処
理されたターゲット検体を捕捉した非磁性体微粒子に対
して磁性体標識体を特異的に反応させることが極めて重
要である。磁性体標識体が非磁性体微粒子に非特異的に
吸着することを防ぐために、第２工程の抗原抗体反応は
ＨＥＰＥＳ緩衝液等の吸着抑制剤が添加された溶液中で
行われることが好ましい。抗体としてはモノクローナル
抗体の使用が特に好ましい。磁性体標識体は、マグネタ
イトやγ−フェライト等の各種化合物磁性体あるいは鉄
、コバルト等の金属磁性体等種々の強磁性材料からなる
磁性微粒子を核として、該磁性微粒子の周りにデキスト
ラン等の糖あるいはプロティンＡ等の蛋白を被覆し、更
にこれらの糖や蛋白にターゲット検体と特異的に反応す
る抗体あるいは抗原を結合させることによって得られる
。

言うまでもないことであるが、本発明に用いる磁性体標
識体は蛍光不純物の混入あるいは蛍光汚染について最大
の配慮がなされなければならない。

何故ならば、後述の第４工程においては、非磁性体微粒
子と反応していない未反応の磁性体標識体も局部濃縮さ
れてレーザ照射を受けるから、該磁性体標識体が蛍光汚
染されているとｉ！１１１定の妨害となるためである。

次に、本発明の測定方法の第３工程においては、本発明
者らが先に出願した、特願昭６２−１５２７９２．６２
−１８４９０２に記載のレーザ磁気免疫装置が好適に用
いられる。このレーザ磁気免疫装置は、検査容器の開口
水面上に配置された高透磁性材料からなる細い磁極片と
、検査容器を挟んで磁極片と対向する位置に設置された
電磁石とからなるものである。

これらの装置によれば、ターゲット検体を介して磁性体
標識体と結合した非磁性体微粒子を傾斜磁界中でレーザ
照射位置に効率的に局部濃縮することが出来る。

本発明の測定方法の第４工程では、前記局部濃縮点にレ
ーザを照射し、ターゲット検体と結合した非磁性体微粒
子の蛍光色素を励起させ、該蛍光を検出する。この第４
工程においては、２通りの方法が適用できる。その１つ
はパルス状のレーザで蛍光色素を励起する方法である。

この方法に用いるレーザには、高出力の半導体の短光パ
ルスレーザあるいは、モード同期Ａｒレーザによるシン
クロナスボンピングの色素レーザやＮｄ：ＹＡＧ等の固
体レーザの中から目的にあったものを選択することがで
きる。この方法で用いるレーザのパルス幅は、数十０秒
から数ビフ秒であることが望ましい。レーザパルスから
一定時間後の蛍光を測定すれば、レーザパルス光は減衰
し存在しないから散乱光の影響を除去することが出来る
。他の１つの方法は、蛍光色素を連続励起させる場合で
あって、Ｈｅ−Ｎｅ、Ｈｅ−Ｃｄ等の通常の気体レーザ
も使用可能である。レーザ光源は使用する蛍光色素の波
長によって選択されるべきである。この場合、レーザの
散乱光が妨害となるから励起された蛍光のみを分光測光
することが重要である。

蛍光の検出は、光電子増倍管あるいは半導体ダイオード
等積々のものが使用可能であるが、超高感度の検出には
光電子増倍管を用いてフォトカウンティングする方法が
好ましい。

第４工程において用いられる蛍光検出光学系は、レーザ
照射位置からの蛍光のみを検出するようにスリットが配
置されたものを用いると良い。このようにスリットを配
置すると未反応の非磁性体微粒子の影響をより確実に回
避できる。

色囲 本発明のレーザ磁気免疫測定法では、予め蛍光色素が付
与された非磁性体微粒子にターゲット検体が捕捉された
後に、さらに該ターゲット検体に磁性体標識体が抗原抗
体反応させられる。その結果、ターゲット検体は蛍光色
素と磁性体とで２重に標識されることになる。このよう
に調整された検体浮遊液中には、非磁性体微粒子にター
ゲット検体を介して結合した磁性体標識体（以下、ター
ゲット検体結合体と略称する）と、未反応の非磁性体微
粒子と、未反応の磁性体標識体とが混在している。

この検体浮遊液に外部磁力を作用させると、未反応の磁
性体標識体とターゲット検体結合体が、レーザ照射位置
に誘導・濃縮される。

そして、この濃縮点にレーザが照射されると未反応の非
磁性体微粒子をレーザに照射する確率が低下し、ターゲ
ット検体と結合した非磁性体微粒子の蛍光色素のみが励
起される。

この状態でレーザ光の波長と異なる蛍光を測光すれば、
ターゲット検体と結合していない非磁性体微粒子や磁性
体標識体の影響は受けず、また塵埃や容器等からの散乱
光の影響を除けるので高感度・高精度にターゲット検体
を検出出来る。

実施例 以下に図面を参照して本発明をより具体的に詳述するが
、以下に示すものは本発明の一実施例に過ぎず、本発明
の技術的範囲を同等制限するものではない。

（実施例１） 第１図は本発明の一実施例を説明する行程図であって、
（ａ）は蛍光色素で染色された非磁性体微粒子を夜中に
分散する工程、（ｂ）は非磁性体微粒子にターゲット検
体を捕捉する工程、（ｃ）は磁気標識工程、（ｄ）は局
部濃縮・測定工程である。

本実施例においては、実験上安全性の高い不活化したイ
ンフルエンザウィルスを用いて本発明の原理確認を行っ
た。

まず平均粒径１μｍの単分散アクリルポリマーからなる
非磁性体微粒子Ｉの表面をローダミンＢ（波長５２０　
ｎｍ）からなる蛍光色素２で染色後、抗体の活性低下を
防ぐためにＢＳＡをコートした。ついで、この上にイン
フルエンザウィルスに対する高度免疫抗血清を抗体３と
して固相化した。このように作成された非磁性体微粒子
を凍結乾燥保存しておき、使用時に反応容器に入れＨＥ
　Ｐ　Ｅ　Ｓ緩衝液中に分散したく液中分散工程（ａ）
）。

次に、前記液中分散工程で得られた非磁性体微粒子分散
液にターゲット検体４としてのインフルエンザウィルス
（Ａ／石川用Ｈ３Ｎ２））を加えて、３７°Ｃ，２時間
のインキュベートの条件でウィルスを非磁性体微粒子に
捕捉した（検体捕捉工程（ｂ））。

次に、このものをさらに磁性体標識体５を添加して、タ
ーゲット検体４との間で抗原抗体反応させた（磁気標識
行程（Ｃ））。磁性体標識体５には、デキストランで被
覆された平均粒径４０ｎｍのマグネタイトからなる磁性
微粒子５ａに、フェレ２トを免疫して得られる抗血清か
ら単離したＩｇＧ抗体５ｂを共有結合したものを用いた
。この磁気標識は、３５°Ｃ１２，５時間のインキュベ
ートの条件で行った。

以上の工程で処理された溶液を全量検査容器６に移し、
本発明者らが先に提案した傾斜磁界発生装置（例えば、
特願昭６２−１８４９０２参照）にセットした。そして
検査容器６の直下にある電磁石７を励磁して、検査容器
６の直上に設置された磁極片８に磁界を集中させたとこ
ろ、磁極片８直下の水面にターゲット検体結合体Ａ（タ
ーゲット検体４を介して非磁性体微粒子１と磁性体標識
体５が結合したもの）と、未反応磁性体標識体Ｃ（未反
応の磁性体標識体５）が局部濃縮されたく局部濃縮工程
）。

次に該局部濃縮点に発振波長４４１．６ｎｍ、出力２０
ｎ４のＨｅ−Ｃｄレーザを照射し、非磁性体微粒子ｌの
蛍光色素を連続励起した。スリットとレンズ系により局
部濃縮点からの蛍光のみを分光器に導き、蛍光をフォト
ンカウンティング法で検出した。分光器を通すことによ
って、レーザ散乱光を（ｕｔＬ、蛍光のみを連続的に計
測できた。

その結果、未反応の非磁性体微粒子Ｂ及び未反応の磁性
体標識体Ｃを分離・除去しないでインフルエンザウィル
スを検出することが確認された。

実施例２ 検体調整工程は実施例１と同じであるが、蛍光色素とし
てローダミン已に代えて、メロシアニン系色素（波長６
００　ｎｍ台、蛍光寿命２０ｎｓ程度）を用いて、測定
工程をパルスレーザで行った。すなわち、モード同期Ａ
ｒレーザにより色素レーザ（ローダミン６Ｇ、出力ＩＷ
）を励起し、波長５９０ｎｍ、パルス幅１０ｐｓで前記
蛍光色素を励起し、遅延時間１ｎｓ後の蛍光をフォトン
カウンティング法で検出した。第２図はレーザ励起パル
ス及び蛍光の時間変化を示す。レーザ励起パルスが消滅
した後の蛍光を測定すれば容器や塵埃等からの散乱の影
響を回避することが出来る。実施例１の場合に比べると
、本実施例ではパルスレーザの出力が大きく、分光測光
しないために検出感度が約１桁向上した。

（実施例３） 検体調整工程は実施例１と同じであるが、蛍光色素とし
てローダミンＢに代えて、アクリジン色素（蛍光寿命Ｉ
ｏｎｓ程度）を用いて、測定工程を半導体パルスレーザ
で行った。すなわち、局部濃縮点に波長４２０　ｎｍ、
パルス幅５０ｐｓ、出力１　ｍｌのレーザダイオードか
ら出射されたレーザパルスで蛍光色素を励起し、遅延時
間ｌｎｓ後の蛍光をアバランシェ・フォトダイオード（
Ａ　Ｐ　Ｄ）で検出した。この実施例においても高い検
出感度を達成できた。

なお、前記実施例２．３で蛍光色素を代えたのはレーザ
光源の波長に合わせるためである。言うまでもないこと
であるが、レーザ光源は蛍光色素の吸収波長よりも短波
長のものを使用する必要がある。

また、実施例１において、磁気標識工程（Ｃ）後、磁気
吸引されるもののみを磁石で回収して、検査容器に移す
方法も適用できる。この場合、バ、フグランドとなる蛍
光の影響を極力排除することが出来る。

さらに、スクリーニング検査のように、多数の検体を効
率的に検査する場合は、ウィルスの捕捉、磁気標識、局
部濃縮、測定を同一の容器で検体を移さずに行うことも
できる。すなわち、本発明の方法においても、例えば、
ＥＩＡや微粒子凝集法に用いられている。９６穴の連結
容器（マイクロプレート）を用いて、検体の調整から測
定まで行うことが出来る。

発明の効果 以上詳述したように、本発明のレーザ磁気免疫１ｉｌｉ
定方法では、ターゲット検体を捕捉する非磁性体微粒子
に予め蛍光色素を付加すると共にターゲット検体を磁気
標識して、ターゲット検体に２車の標識を施したうえで
、ターゲット検体を磁力を用いて局部濃縮し、そこにレ
ーザ照射して蛍光色素を励起するので、未反応の標識体
を分離せずに検体を測定することか可能になった。

すなわち本発明の特徴的な構成によって、従来のＲＩＡ
法、ＥＩＡ法、ＥＩＡ法、及び本発明者らが先に提案し
たレーザ磁気免疫測定法等では不可避であった、未反応
の標識体を洗浄・分離する工程が不用になる。しかも標
識法の特徴である高感度の検出を行うことができる。

このように本発明のレーザ磁気免疫測定方法は、高感度
であるうえに検体調整がきわめて簡単なので、自動化を
容易に図ることができる。

加えて、本発明のレーザ磁気免疫測定法では、ターゲッ
ト検体を捕捉した非磁性体微粒子を磁気標識して局部濃
縮するので、バックグランドの影響か小さく、Ｓ／Ｎ比
の高い高感度検出が初めて可能になった。

また本発明のレーザ磁気免疫測定法では、蛍光染色され
た非磁性体微粒子を用いるので直接ターゲット検体を蛍
光染色した場合は、検体が損傷して磁気標識の際に抗原
抗体反応の特異性が損なわれる懸念があるのに対して、
そのような懸念を回避できる。そのうえウィルスのよう
に微小なターゲット検体を検出する場合は、ウィルスよ
りも１桁程度大きな非磁性体微粒子を用いることによっ
て、蛍光強度を増して検出感度を向上させることができ
る。また、ターゲット検体を直接蛍光染色する場合は、
検体浮遊液中に蛍光色素が流出しないように配慮しなけ
ればならないが、蛍光染色した非磁性体微粒子を用いる
ことによりそのような操作は不要となり、この点でも検
体調整を単純化できた。

本発明の方法は、特に集団検診に最適であり、各種の感
染症のスクリーニング検査に有効である。

また、本発明は実施例に上げたウィルスの検出に止まら
ず、癌の早期診断、アレルギー、細菌等の検査や従来Ｒ
ＩＡ法が適用されていたペプチドホルモン等の種々のホ
ルモンあるいは種々の酵素、ビタミン、薬剤などの測定
にも応用することか原理的に可能である。さらに従来は
限定された施設でＲＩＡ法によらなければ実施できなか
った精密な測定を、−数的な環境で広〈実施することが
可能となる。このように、本発明が医学・医療の分野で
果たす効果は計り知れない。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の検体調整方法の一実施例を説明する工
程図であって、第１図中（ａ）は非磁性体微粒子を液中
分散する工程、（ｂ）は検体を捕捉する工程、（ｃ）は
磁気標識工程、（ｄ）は局部濃縮 ・測定工程、 第２図は実施例２におけるし 一ザ励起パルス及び蛍光の時間変化を示す図である。 ・非磁性体微粒子、 ２・・・蛍光・色素、 ・・抗体、 ・ターゲラ ト検体、 ・・磁性体標識体、 ｂ　・・・ 抗体。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）蛍光色素が付与された非磁性体微粒子にターゲッ
   トとする検体を捕捉する第１工程と、前記ターゲット検
   体に対する抗体あるいは抗原が固相化された磁性体標識
   体を前記第１工程で処理された非磁性体微粒子に抗原抗
   体反応させる第２工程と、外部磁力によって磁性体標識
   体をレーザ照射点に局部濃縮する第３工程と、該局部濃
   縮点にレーザを照射して磁性体標識体と結合した非磁性
   体微粒子の蛍光色素を励起させ、該蛍光を検出する第４
   工程とを含むレーザ磁気免疫測定法。
2. （２）前記第４工程において、パルスレーザで蛍光色素
   を励起し、該パルスレーザの消滅後に蛍光を測光するこ
   とを特徴とする請求項１記載のレーザ磁気免疫測定法。
3. （３）前記第４工程において、レーザで蛍光色素を連続
   的に励起しつつ、蛍光のみを分光測光することを特徴と
   する請求項１記載のレーザ磁気免疫測定法。