JPH02118451A - 細胞性検体スクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野］ 本発明は細胞性検体スクリーニング方法に関し、さらに
詳しくは、抗原抗体反応を利用し、モノクローナル抗体
産生細胞のスクリーニング等の細胞工学、［２びに免疫
診断等のバイオテクノロジーや医療の分野に適用できる
細胞性検体スクリーニング方法に関するしのである。

［従来技術とその課題〕 近年、細胞融合技術によって化学的に純粋なモノクロー
ナル抗体を多１１１に得る方法が開発され、病気の診断
や治療に使用され始めている。モノクローナル抗体を作
成する方法は、＋＋ｔ１１＋ｖｓ細胞とリンパ球とを細
胞融合させて得られているハイブリドーマの中から１」
的とする抗体のみを産生じている融合細胞をスクリーニ
ングし、これを培養することによってなされている。従
来のスクリーニング方法はハイブリドーマを限界希釈し
て１個１個に分離し、小穴のあいた容器の穴の中で別々
に増殖しながら、目的の抗体を産生じている細胞を選び
だすことによって行なわれていた。公知のように、１つ
の細胞は１種類の抗体のみを産生ずるから、目的とする
細胞をスクリーニングするには非常に多数の細胞を検査
しなければならない。このように、従来のスクリーニン
グ方法は多大の労力と時間が必要であった。

一方、いわゆるセルソータの名称でリンパ球等の細胞を
蛍光色素等を標識して光学的、電気的にふるい分けする
方法が実用され、臨床検査等で用いられている。このス
クリーニング方法はリンパ球を１個程度含む液滴を超音
波で連続的につくり、この液滴を帯電させて、その電荷
量及び蛍光標識の有無から細胞を選別する方法である。

セルソータはこのように、曳雑な工程を経るため、多ｈ
１の検体が必要で、かつ検体の調整が難しく、装置も高
い等の理由によって、極めて微量のハイブリドーマのス
クリーニングには適していない。

従って、簡便かつ迅速にハイブリドーマのスクリーニン
グが出来る方法の開発が急がれている。

本発明者らは、ウィルス抗原や細胞を極めて高い感度で
検出できるレーザ磁気免疫測定法等の研究を行い、その
成果を先に特願昭６１−２２４５６７．６１−２５２４
２７．６１−２５４１６４．６２−２２０６３．６２−
１５２７９１，６２−１５２７９２．６２−１８４９０
２．６２−２６４３１９．６２−２６７４８１．６３−
６０５０として特許出願している。これらの新しい免疫
測定法は抗原抗体反応の有無の検１」冒こレーザ光を利
用し、標識材料として磁性微粒子を用いる点に特徴があ
りビッグラムの超微量検出が可能である。

本発明者らは上述の測定方法に基づき、磁性微粒子を抗
Ｉ′ｉ；ｔあるいは抗体に標識し、初めて、ウィルスの
検出等を行った。このカましいレーザ磁気免疫１１１１
１定法は従来最も検出感度が高いとされているＲ１Ａ法
よりも、検出感度が高いことが確認されつつある。たと
えば、本発明者らがロ本ウィルス学会第３５回総会（昭
和６２年１１月講演番号４０１１「新しく開発した免疫
測定装置を用いたウィルスの検出実験」）で発表したよ
うに、不活性化したインフルエンザウィルスΔ、Ｂ　４
（ｐをウィルスのモデルとして用いて、ウィルス検出実
験を行ったところ、ｌ−中に１個程度のウィルスが存在
する場合でも検出できた。

本発明者らは、さらに検討した結果、このレーザ磁気免
疫測定法がウィルスや細胞等のスクリーニングにおいて
ターゲットの細胞等の確認、定量に非常に有効であるこ
とを確認し、レーザ磁気免疫測定法の応用として、磁性
微粒子をウィルス、癌細胞あるいはリンパ球などの検体
に標識することによって、ウィルスや細胞を分離する方
法を研究し、その成果を先に特願昭６３−１０２９１６
．６３−１０２９１９として特８′１：出願している。

これらの方法によれば効率的にウィルスやｔｌ（１胞を
捕集したり分離することが出来る。しかしながら、抗体
産生細胞等の微ｍの生理活性物質を産生ずる細胞のスク
リーニングの場合は、抗体産生能等の活性が損なわれ易
（、また極めて少数の細胞をスクリーニングする必要が
あるので、さらに技術の改良が望まれる。

本発明は、」二足の事情に鑑みてなされたもので、その
目的は細胞融合技術により得たハイブリドーマ、癌細胞
、エイズやＩＥ　Ｂウィルスに感染したリンパ球等の細
胞性検体スクリーニング方法を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本願の第１の発明に従うと細胞性検体にターゲット細胞
性検体のみに特５′４的に反応する磁性体標識抗体を作
用させる第１工程と、前記第１工程で未反応の該磁性体
標識抗体を前記ターゲット細胞性検体との比重の差を利
用して分離・除去する第２工程と、前記第２工程で除去
されずに残った細胞の内、磁力に反応する細胞のみを選
択的に回収する第３工程とを少なくとも含むことを特徴
とする細胞性検体スクリーニング方法が提供される。

また、本願の第２の発明に従うと、細胞性検体にターゲ
ット細胞性検体のみに特異的に反応する磁性体標識抗体
を作用させる第１工程と、前記第１工程後に磁力に反応
する全ての物質を回収する第２工程と、前記磁性体標識
抗体と結合したターゲット細胞性検体を該磁性体標識抗
体から解離する第３工程と、未反応の磁性体標識抗体を
磁力により該ターゲット細胞性検体浮′ｉ！ｉｌＪｇか
ら除去し、該ターゲット細胞性検体のみを選択的に回収
する第４工程とを少なくとも含むことを特徴とする細胞
性検体スクリーニング方法が提供される。

なお、第１の発明と第２の相５へ点は、第１の発明の場
合は回収されたターゲット細胞性検体が磁性体標識抗体
と結合したままの状態であるのに対して、第２の発明で
は、回収されたターゲツトＸ１１１胞性検体には磁性微
粒子が結合していない点にある。

本発明の細胞性検体のスクリーニング方法は、典型的に
は細胞融合技術により得たハイブリドーマや癌細胞ある
いはリンパ球などの細胞性検体のスクリーニングに適用
できるが、種々のウィルスまたは酵素、ホルモン等の生
理活性物質のような生物性単位（検体）のスクリーニン
グにも適用できる。従って、本明細書においては、細胞
性検体はこれら生物性単位を含めることができる。

［作用］ 本発明によれば、ターゲット細胞性検体は抗原抗体反応
で磁性体標識抗体と結合し、磁気標識されているから、
外部磁力で確実に誘導回収することが出来る。磁性体標
識抗体とターゲット細胞性検体を抗原抗体反応させると
、必然的に未反応の磁性体標識抗体が細胞性検体浮遊液
中に／ｊ在することになる。未反応の磁性体標識抗体は
ターゲット細胞性検体の数よりも大過剰であるので、タ
ーゲラＩ・細胞性検体の生理活性物質産生能、例えば抗
体産生能に悪影響を及ぼす恐れがある。従って、本発明
には該未反応の磁性体標識抗体の分離工程が不可決であ
る。該分離工程はターゲット細胞性検体と磁性体標識抗
体との大きさの違いを利用した遠心分離、あるいは外部
磁力との応答の相違を利用した磁気泳動による分離等、
種々の方法が適用できる。該未反応の磁性体標識抗体の
分離工程は、抗原抗体反応工程の直後ないしターゲット
細胞性検体の回収工程の前あるいは後の工程において実
施することができる。一方、磁性体標識抗体がターゲ、
１・Ｘ１１１胞性検体と結合することによって、ターゲ
ット細胞性検体は磁気（票識されることになるから、タ
ーゲット細胞性検体の検出が容易になる。例えば、本発
明者らが先に発明した前記レーザ磁気免疫測定法によれ
ば、数個程度の細胞でも検出可能である。従って、レー
ザ免疫測定法でターゲラ１−細胞性検体を確認、定■１
後ターゲ、１・細胞性検体回収工程に進めば効率的にタ
ーゲットの細胞性検体が回収できる。

また、本発明によればターゲット細胞性検体は磁気標識
されたままの状態で回収することは勿論のこと、ターゲ
ットの細胞性検体に結合した磁性体標識抗体を解離して
ターゲットの細胞性検体単独で回収することが出来る。

この磁性体標識抗体の解離工程には例えばターゲットの
細胞性検体の浮遊液のｐｌ＋　　を；′Ｊ１１．１節す
ることによって、容易に実施できる。もらろん、この工
程ではターゲットの細胞性検体に損傷を与えないように
することが必要である。例えば、短時間ｐＨを酸性にし
て該結合を解離させ、磁性体標識抗体を磁気分離した後
直らにｐＨを中性に戻す操作が好ましい。磁気分離には
永久磁石あるいは電磁石を細胞性検体浮遊１１ｋに作用
させ、磁石あるいは容器の何れかを移動することによっ
て、磁性体標識抗体を遊動・分離できる。また、本発明
者らが先に出願した磁性体片に検体を磁気吸着させて回
収する特願昭６３１０２９１９ｒ検体捕集方法及び捕集
装置」、あるいは別途特許出願中の傾斜１ｉｆｔ’Ｒ中
で検体を細胞性検体１７遊液とともに回収する「細胞性
検体スクリーング方法」がこの目的に最もふされしい。

以−１−―説明したように、本発明に従えば目的とする
ターゲット細胞を簡ｒ１１かっ迅速に選別することがで
きる。

以下に図面を参照して本発明をより具体的に詳述するか
、以下に示すものは本発明の一実施例に過ぎず、本発明
の範囲を同等制限するものではない。

［実施例１］ 本実施例は細胞性検体としてノ＼イブリドーマ細胞を用
いた例である。

第１図は本発明に従う細胞性検体スクリーニング方法の
第１の実施例を示す模式図であって、（ａ）は磁性体標
識抗体添加工程、（Ｌ、）は抗原抗体反応工程、（ｃ）
は遠心分離工程、（ｄ）は磁気分離工程、（ｅ）は回収
工程後のターゲット細胞の状態を示す。

図中符号ｌは磁性体標識抗体、２は回収したいターゲッ
ト細胞、２−１〜２−４はその他の細胞、３は容器、４
はターゲット細胞とその他の細胞が浮遊した細胞浮遊ｉ
ｆＫ、５は磁石である。ターゲット細胞２及びその他の
細胞２−１〜２−４はマウスから取り出され、種々の抗
体を産生じているプラズマ細胞とミエローマ細胞とを細
胞融合して得られたハイブリドーマである。

次に、本発明の細胞性検体スクリーニング方法を説明す
る。磁性体標識抗体添加工程（ａ）においては、予め、
前記ハイブリドーマをＰＢＳ溶液で１ｍ１２当り数１０
０個程鹿の濃度に希釈した１＋１１胞を平光１１に４を
容器３の中に１ｍ＆用意しておき、目的とする抗体を結
合させた磁性体標識抗体を該容器に１０μρ添加する。

抗原抗体反応工程（１））においては、３７°Ｃで２時
間インキュベートする遠心分離工程（ｃ）においては、
前記工程後の細胞浮遊液を１５０　Ｏｒｐｍ、　　５分
間の低速遠心にかけ、未反応の磁性体標識抗体と細胞と
を分離する。磁性体標識抗体は大きさが約４０ｎｍであ
り、一方、細胞は数１１　ｎの大きさがあるので、細胞
は沈澱し、未反応の磁性体標識抗体は上ｉｆｔに留まる
。磁気分離・回収工程（（＋）においては、前記工程の
沈澱物を容器に回収し、好ましくはＰＢＳで再浮遊させ
、外部磁力に反応する細胞のみを分離し、回収する。

この磁気分離・回収工程には、本発明者らが出願中の傾
斜磁界中で検体を細胞性検体浮ｊｐ液とともに回収する
「細胞性検体スクリーニング方法」の適用が好ましい。

［実施例２１ 第２図は本発明に従う細胞性検体スクリーニング方法の
第２の実施例を示す模式図であって、（ａ）は磁性体標
識抗体添１ノロ工程、（ｂ）は抗原抗体反応工程、（ｃ
）は磁気分離工Ｊ５：、、（ｄ）磁力に反応する全ての
物質の回収工程、（ｃ）ぼ抗原抗体結合解離工程、（ｒ
）は磁気分離用工程、（ｇ）は中和工程である。

本実施例の磁性体標識抗体添加工程（ａ）、抗原抗体反
応工程（ｂ）は」二連の実施例と同じ方法で行った。磁
気分離工程（ｃ）、回収工程（（１）においては、外部
磁力に反応する細胞のみを磁石５によって誘導・分離し
、別の容器に回収する。本磁気分離・回収工程には、本
発明者らが出願中の上記「細胞性スクリーニング方法」
の適用が好ましい。抗原抗体結合解離工程（ｃ）におい
ては、　Ｏ，１Ｍグリシン−塩酸緩衝液からなる抗原抗
体結合解離剤６を加えて、溶液のｐＨを２．３になるよ
うに調整し、ターゲット細胞と結合した磁性体標識抗体
を解離させる。磁気分離工程（ｆ）においては、前記工
程後直ちに解離した磁性体標識抗体及び未反応の磁性体
標識抗体を磁石５によって分離・除去し、中和工程（ｇ
）においては、直ちに緩ｉｊｉ　ｉ（ｋ　ｌ−リスから
なる中和剤７を加えて、溶液のｐＩ”［を中性に戻す。

本発明は抗原抗体結合を解離する工程に特徴がある。本
実施例では細胞浮遊液を一度酸性にするため、ターゲッ
ト細胞に出来る限り損傷を与えないように、短時間で上
記工程（ｃ）〜（Ｒ）を終えることが望ましい。

［発明の効果］ 以」ユ詳述したように、本発明に従う細胞性検体スクリ
ーニング方法によれば、標識物質として磁性微もχ子を
用いているから、抗ｆｉｌ抗体反応で磁性体（；１１識
抗体と結合した１ターゲ・ノドの細胞性検体を外部磁力
によって、自在に誘導・誘導できターゲットの細胞性検
体単独あるいは磁性体標識抗体と結合した状態でターゲ
ットの細胞性検体を回収できる。

本発明の細胞性検体スクリーニング方法は前述のレーザ
磁気免疫測定法と組み合わされることによ−）′Ｃ２特
に効果が発揮される。本発明によれば、ターゲットの細
胞性検体は磁性体標識抗体と結合した状態で回収するこ
ともできるから、先に本発明者らが発明した、レーザ磁
気免疫測定法によって、ターゲットの細胞性検体のｆｆ
ｔが測定できる。

レーザ磁気免疫測定法は前述のとおり、検出感度がピコ
グラム台と非常に高感度であるから、数個程度の細胞が
検出出来る。

ｆｉ来のハイブリドーマのスクリーニングの場合、未選
別のハイブリドーマを培養し、細胞数を増やしたｉ（、
産生された抗体を検出することによってスクリーニング
がなされていた。このため、数千の検体を一つ一つスク
リーニングする多大の労力と長時間がかかっていた。す
なわち、数千の細胞を検査していた。これに対して本発
明の細胞性検体のスクリーニング方法をハイブリドーマ
のスクリーニングに適用した場合、従来のように産生さ
れた抗体を検出するのではなく、培養前のハイブリドー
マを選択的に分離回収するスクリーニング方法であるか
ら、スクリーニングの原理が全く異なっている。即し、
抗体を検出してスクリーニングするのではなく、抗体産
生細胞そのものを直接回収・検出してスクリーニングす
るから、目的とするターゲット細胞の検出は一度でよい
ことになる。このように、本発明の細胞性検体のスクリ
ーニング方法は非常に画期的であって、スクリーニング
の労力、時間を十分の一以下に減少できた。

したがって、この特徴を利用することによって、モノク
ローナル抗体産生細胞の迅速かつ簡便なスクリーニング
が出来るので、細胞工学や医学に貢献するところが非常
に大きい。

もちろん、本発明の細胞性検体のスクリーニング方法は
、細胞に限らず、培養不能の未知の極めて微量のウィル
スを直接検出できるので、ウィルス学に貢献するところ
が非常に大きい。例えば、非Δ、非Ｂの肝炎ウィルスの
発見に寄与できる。

また、癌細胞等の細胞レベルの早期診断にも有効であり
、癌細胞から遊離して血液等の体液中に転移しつ−〕あ
る極微量の癌細胞の回収ができる。さらに、抗原抗体反
応によって特異的に結合する酵素、ホルモン等の微量の
生理活性物質を本発明の方法によって回収することがで
きる。

このように、本発明が医学・医療分野や分子生物学等の
理学分野、細胞工学、遺伝子工学等のババイオテクノロ
ジーの分Ｉｌ！）で果たす効果は３１り知れない。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の詳細な説明する、細胞スクリーニング
方法の第１の実施例を示す模式図、第２図は第２実施例
を示す模式図である。 ■・・・・・磁性体標識抗体、２・・・・・・ターゲッ
ト細胞、２−１〜２−４・・・・・その他の細胞、３・
・・・・・容２ｔ、４・・・・・・細胞ン平）Ｉｌ液、
５・・・・・・磁石、６・・・・・・抗原抗体解１雛剤
、７・・・・・中和剤。 第 図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）細胞性検体にターゲット細胞性検体のみに特異的
   に反応する磁性体標識抗体を作用させる第１工程と、前
   記第１工程で未反応の該磁性体標識抗体を前記ターゲッ
   ト細胞性抗体との比重の差を利用して分離・除去する第
   ２工程と、前記第２工程で除去されずに残った細胞性検
   体の内、磁力に反応する細胞性検体のみを選択的に回収
   する第３工程とを少なくとも含むことを特徴とする細胞
   性検体のスクリーニング方法。
2. （２）細胞性検体にターゲット細胞性検体のみに特異的
   に反応する磁性体標識抗体を作用させる第１工程と、前
   記第１工程後に磁力に反応する全ての物質を回収する第
   ２工程と、前記磁性体標識抗体と結合したターゲット細
   胞性検体を該磁性体標識抗体から解離する第３工程と、
   未反応の磁性体標識抗体を磁力により該ターゲット細胞
   性検体の浮遊液から除去し、該ターゲット細胞性検体の
   みを選択的に回収する第４工程を少なくとも含むことを
   特徴とする細胞性検体スクリーニング方法。