CN102066547A - 细胞筛选装置、及使用其的细胞筛选方法 - Google Patents

细胞筛选装置、及使用其的细胞筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种细胞筛选装置及细胞筛选方法，其用于一次性大量且短时间简便地筛选产生特定物质的细胞，进而通过细胞表面的特定物质与识别分子之间结合力的大小有效地进行细胞筛选。本发明使用一种细胞筛选装置及细胞筛选方法，其中，所述细胞筛选装置的特征在于，该细胞筛选装置具备细胞筛选容器和电源，所述细胞筛选容器由一对电极和具有多个微细孔的平板状的绝缘体构成，前述微细孔的底面配置有与特定物质具有结合性的识别分子，前述电源具有细胞固定用电源和细胞取出用电源；所述细胞筛选方法的特征在于，该细胞筛选方法使用了前述细胞筛选装置，向细胞筛选区域导入细胞，将前述细胞固定在前述微细孔内，使细胞表面的特定物质与前述识别分子发生结合反应后，将细胞表面的特定物质与前述识别分子没有结合或者结合力弱的细胞从前述微细孔中取出，或者，将前述细胞中细胞表面的特定物质与前述识别分子强力结合的细胞残留在微细孔内。

Description

细胞筛选装置、及使用其的细胞筛选方法
技术领域
本发明涉及用于有效地进行细胞筛选的细胞筛选装置、及使用其的细胞筛选方法。
本申请要求2008年4月15日在日本申请的日本特愿2008-105396号的优先权，并将其内容援引于此。
背景技术
近年来，作为疾病的诊断试剂、医药品的原料，在生物体内生成的抗体的利用受到瞩目。抗体是当病毒等异物侵入到生物体内时与该异物特异性结合的蛋白的一种。抗体通过与特定的病毒等异物结合，从而杀灭该病毒，或使其无毒化，具有保护生物体免受病毒等侵入的功能。这里，抗体所特异性结合的病毒等异物通常被称为抗原。另外，生物体内的抗体由位于脾脏、淋巴结中的细胞生成，据说其种类超过百万种。另外，位于脾脏、淋巴结中的生成抗体的细胞被称为淋巴细胞、B细胞、抗体形成细胞等。
另外，前述的诊断试剂、医药品利用了该抗体的“与特定物质特异性强力结合的性质”。特别是，利用了抗体的诊断试剂被称为免疫诊断试剂，利用了抗体的医药品被称为抗体医药等。
作为免疫诊断试剂的例子，被利用于用抗体检测侵入到生物体内的病毒等的感染症的诊断、通过检测与疾病相关性高的蛋白质等而进行的癌、心脏病、自身免疫病等的诊断中。特别是免疫诊断试剂，由于抗体与特定物质特异性结合，因此作为灵敏度高且可靠性高的诊断试剂被广泛利用在临床诊断的领域中。
另外，作为抗体医药的例子，有杀灭侵入到生物体内的病原菌、或者使引起疾病的蛋白质无毒化、或者抑制癌细胞的增殖、或者杀灭癌细胞、或者抑制过敏反应等的医药品。特别是抗体医药，由于抗体与特定物质特异性结合，因此被期待作为副作用少的医药品。
另外，免疫诊断试剂、抗体医药中使用的抗体通常仅由1种抗体构成，一般被称为单克隆抗体。
然而，抗体形成细胞若被取出到生物体外则无法增殖，该状态下无法在工业上大量生产抗体。因此，利用如下方法：使从生物体取出的抗体形成细胞与癌细胞那样无限增殖的细胞进行细胞融合，得到无限增殖且生成抗体的细胞(以下，称为融合细胞或杂交瘤)，从而在工业上大量生产抗体。以下的1)～3)示出了得到用于在工业上大量生产单克隆抗体的融合细胞的代表性例子。
1)对小鼠、大鼠等动物注射想要检测或治疗的异物即目标抗原，在动物的体内生成与该抗原特异性结合的抗体(以下，将本工序称为免疫)。
2)从通过1)免疫了的动物的脾脏、淋巴结中取出抗体形成细胞，在聚乙二醇等可提高细胞膜的流动性的介质中使其与癌细胞接触从而进行融合(PEG法)；或者，对进入电极间的溶剂中的抗体形成细胞和癌细胞施加交流电压使细胞接触后，施加直流脉冲电压，将2个细胞的接触的细胞膜暂时破坏并使膜再生从而进行融合(电融合法)(以下，将本工序称为细胞融合)。
3)从通过2)得到的融合细胞中，选择生成与目标抗原特异性强力结合的抗体的细胞(以下，将本工序称为细胞筛选)。
通常，抗体形成细胞可从免疫了的小鼠的脾脏中取出(以下，称为脾脏细胞)，其数量为1～2亿个左右。其中通过细胞融合而获得的融合细胞为几千个左右，进而，该融合细胞中生成与目标抗原特异性强力结合的抗体的融合细胞为几个左右。因此，在上述3)的细胞筛选的工序中，需要从几千个融合细胞中通过检测细胞所生成的抗体从而有效地调查其是否生成与目标抗原特异性强力结合的抗体。
作为检测细胞所生成的抗体的方法，通常采用免疫化学测定方法。其是基于抗体特异性识别抗原的抗原抗体反应而进行抗体检测的方法，由于其优异的精度、简便性、迅速性、经济性近年来备受瞩目。在免疫化学测定法中，作为检测方法应用非常多种类的标记，例如酶、放射性示踪剂、化学发光性及荧光性标记、金属原子及溶胶、稳定游离基、胶乳以及噬菌体。
在免疫化学测定方法中，使用酶的酶免疫(吸附)测定法(以下，称为ELISA法)也由于经济性及便利性特别优异而被广泛使用。ELISA法中，作为用于固定抗原或抗体的载体，例如使用聚苯乙烯制的96孔微量滴定板。在各孔内将抗原或抗体固定后，通过间接竞争法或直接竞争法等检测标记了的抗原或抗体，检测分析对象物的量。已知以往的ELISA法为简易且迅速的测定法，但测定需要花费几个小时左右。另外，作为能够一次检测的样品数，仅限于1个板的孔数。因此，寻求与以往的ELISA法相比能够在更短时间内测定大量样品的简易且迅速的测定方法。
与此相对，为了解决上述ELISA法的问题，报道了以下检测方法的例子：将与分析对象物(例如抗体)特异性反应的物质(例如抗原)固定在多孔质材料上(以下，称为固定化物质)，用前述多孔质材料过滤含有分析对象物的溶液，使分析对象物与前述多孔质材料上的前述固定化物质发生反应，接着，用前述多孔质材料，过滤同分析对象物竞争性地与前述固定化物质反应的被标记的物质，从而使前述被标记了的物质与前述固定化物质反应，测定与前述固定化物质反应了的前述被标记了的物质的量，由此检测分析对象物的量(例如，参照专利文献1)。
专利文献1记载的方法是利用了抗原抗体反应的分析对象物的检测方法，前述方法中的利用多孔质材料的过滤优选使用具有多个由壁部和底部构成的孔的板来进行，多孔质材料优选配置于孔的底部。这样的板由ミリポア公司以“MultiScreen”(注册商标)市售，已知有使用疏水性PVDF(聚偏氟乙烯)作为多孔质材料的“IP”、使用混合纤维素酯作为多孔质材料的“HA”、使用100％硝基纤维素作为多孔质材料的“NC”等。这些板具备96个孔。
另外，专利文献1记载的方法中，将分析对象物的溶液过滤后，将同分析对象物竞争性地与对前述固定化物质反应的被标记了的物质过滤，从而获得良好的检测灵敏度，且能够在30分钟左右的时间内进行检测。然而，前述专利文献1记载的方法中，由于使用前述具有多个由壁部和底部构成的孔的板来进行，因此存在难以一次性测定大量的样品的问题。这里，一般经常使用如前所述的96孔板。
另一方面，有制作融合细胞之前筛选生成目标抗体的抗体形成细胞后用于细胞融合的方法。作为产生该目标抗体的抗体形成细胞的筛选收集技术，现在，广泛应用利用磁珠方式的收集技术、利用流式细胞术的收集技术。
在磁珠方式中，采用表面结合有与位于目标细胞的表面的特定物质特异性反应的单克隆抗体的磁珠，通过抗原抗体反应使目标细胞选择性地与磁珠结合，并通过磁柱来筛选捕集珠子(以下，称为磁珠法)。该方法中回收率为90％左右，并且具有一次能够筛选109个左右的大量的目标细胞的优点(例如参照专利文献2、非专利文献1)。然而，该方法中，产生了不得不从通过抗原抗体反应而结合了目标细胞的磁珠中分离目标细胞的情况，存在其工序变得繁杂的问题。并且该方法中，由于利用是否通过抗原抗体反应发生结合来筛选细胞，因此无法根据抗原抗体反应中结合力的大小来筛选细胞。
另一方面，流式细胞术是使荧光标记的单克隆抗体与位于目标细胞的表面的特定物质通过抗原抗体反应而结合，并利用从抗体发出的荧光来识别细胞的方法(以下，称为流式细胞术法)。具体而言，向从喷嘴喷出的射流中流入细胞，对该射流施加超声波振动使其液滴化，在即将分离成液滴之前对水流赋予电荷，使含有目标细胞(即，被荧光标记的细胞)的液滴带正电或负电，通过使落下过程中带电的液滴在电场中发生偏转，从而捕集目标细胞。该方法中，可获得与磁珠方式同等或更好的纯度，并且通过组合多种激光和多种荧光波长能够同时检测6种左右不同的细胞(例如参照专利文献2)。然而，该方法需要昂贵的大型装置，因此存在难以简易且迅速地测定的问题。并且该方法中，由于利用是否通过抗原抗体反应发生结合来筛选细胞，因此无法以抗原抗体反应中结合力的大小为基准来筛选细胞。
此外，作为在制作融合细胞之前筛选生成目标抗体的脾脏细胞后用于细胞融合的方法，有如下方法：选择1个与某种抗原特异性反应的脾脏细胞，将所选择的脾脏细胞进行培养，使通过培养而增殖的脾脏细胞与癌细胞发生细胞融合，从而来制作融合细胞(例如参照专利文献3)；将用目标抗原进行免疫而获得的脾脏细胞、与细胞表面存在目标抗原的癌细胞混合，使脾脏细胞中的、存在与目标抗原特异性结合的抗体的脾脏细胞介由与癌细胞表面的目标抗原的特异性结合而选择性靠近，从而使两细胞发生细胞融合(例如参照专利文献4)。
然而，任一种方法均由于在细胞融合前进行细胞筛选，而导致细胞数极端减少。例如，据说生成目标抗体的小鼠脾脏细胞的比例不到全部脾脏细胞数(通常为约1×108个左右)的1％左右(约1×106个左右)。因此，在细胞筛选后采用的细胞融合法为以往的细胞融合法即PEG法(例如参照非专利文献2、非专利文献3)、电融合法(例如参照非专利文献3)时，它们的融合再生概率通常为0.2/10000左右，非常低，因此存在实质上难以获得融合细胞的问题。另外，由于在不同的容器等中进行细胞筛选和细胞融合的操作，因此还存在更换容器时细胞损失的可能性高的问题。这里，通常，融合再生概率是指，通过细胞融合生成的融合细胞数除以用于细胞融合的脾脏细胞数而得到的值。
另外，还报道了能够一次性大量筛选/捕集多种细胞的细胞分离系统的例子。(例如参照专利文献2)。
专利文献2记载的方法为如下方法：使用一种试剂盒，其含有：在特定的温度(转变温度)以上显示亲水性且在该温度以下显示疏水性的感温性载体、和在前述载体的表面附着的捕集细胞；该捕集细胞结合有具有针对目标细胞的抗原结合结构的物质，在温度调整至转变温度以上的含有目标细胞的水溶液中混合细胞分离试剂盒，通过抗原抗体反应使捕集细胞与目标细胞结合，从水溶液中分离带着结合了目标细胞的捕集细胞的载体，并转移到其他介质中，使该介质的温度为载体的转变温度以下而附着于载体上，使与目标细胞结合的捕集细胞从载体上脱离，将载体和结合有目标细胞的捕集细胞分离，通过调节pH等使目标细胞与捕集细胞的结合体解离，从而从捕集细胞中分离目标细胞。该方法中，通过将感温性高分子化合物与结合有与目标细胞发生抗原抗体反应的物质的捕集细胞组合，能够利用感温性高分子化合物分离大量的细胞。然而，存在将目标细胞从捕集细胞中分离的工序变得繁杂的问题。并且该方法中，由于利用是否通过抗原抗体反应发生结合来筛选细胞，因此无法以抗原抗体反应中结合力的大小为基准来筛选细胞。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2001-281250公报
专利文献2：日本特开2004-73112公报
专利文献3：日本专利第3799392号
专利文献4：日本特开2006-6250公报
非专利文献
非专利文献1：村上浩纪、菅原卓也著、《细胞工学概论》、初版、コロナ社、2001年9月10日、pp.181-198
非专利文献2：Kohler G.、Milstein C，Nature，256、pp.495-497、(1975)
非专利文献3：De St.Groth S.F.、Schedegger D.、J.Immunol.Methods、35、pp.1-21(1980)
非专利文献4：U.Zimmermann、G.Pilwat、H.Pohl、J.Biol.Phys.、Volume10，pp.43-50(1982)
发明内容
发明要解决的问题
本发明是鉴于上述以往的实际情况而提出的，目的在于提供一种细胞筛选装置及细胞筛选方法，其能够一次性大量且短时间简便地筛选产生特定物质的细胞，并且可根据细胞表面的特定物质与识别分子之间的结合力的大小有效地进行细胞筛选。
用于解决问题的方案
本发明发现，作为解决上述现有技术中的问题、课题的对策，通过使用下述细胞筛选装置和细胞筛选方法，能够解决上述现有技术的问题，从而完成了本发明。所述细胞筛选装置的特征在于，其具备细胞筛选容器、和对前述一对电极施加电压的电源，所述细胞筛选容器由相对配置的由导电构件形成的一对电极和隔着平板状的间隔物配置在前述一对电极间的平板状的绝缘体构成，所述绝缘体具有沿着前述相对配置的电极的方向贯通的多个微细孔，前述绝缘体配置在前述电极中任一者的电极面上，前述微细孔的底面配置有与特定物质具有结合性的识别分子；前述电源具有用于施加第1交流电压的第1交流电源即细胞固定用电源、和用于施加第2交流电压的第2交流电源即细胞取出用电源。细胞筛选方法的特征在于，该细胞筛选方法使用了前述细胞筛选装置，向前述细胞筛选容器的隔着前述间隔物而形成于前述一对电极间的进行细胞筛选的空间即细胞筛选区域导入细胞，通过前述第1交流电源施加前述第1交流电压而将前述细胞固定在前述微细孔内，使细胞表面的特定物质与前述识别分子发生结合反应后，通过沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用的特定的力，将前述细胞中细胞表面的特定物质与前述识别分子没有结合或者结合力弱的细胞从前述微细孔中取出，或者，通过沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用的特定的力，将前述细胞中细胞表面的特定物质与前述识别分子强力结合的细胞残留在微细孔中。
以下，对本发明进行详细说明。
本发明的细胞筛选装置具备细胞筛选容器和电源，所述细胞筛选容器由相对配置的由导电构件形成的一对电极和隔着平板状的间隔物配置在前述一对电极间的平板状的绝缘体构成，所述绝缘体具有沿着前述相对配置的电极的方向贯通的多个微细孔，前述绝缘体配置于前述电极中任一者的电极面上，前述微细孔的底面配置有对特定物质具有结合性的识别分子，所述电源对前述一对电极施加电压，且前述电源具有细胞固定用电源和细胞取出用电源。
另外，本发明的细胞筛选装置为如下细胞筛选装置：前述的细胞筛选装置所具备的电源中，细胞固定用电源由施加第1交流电压的第1交流电源构成，细胞取出用电源由施加第2交流电压的第2交流电源构成，并具有切换第1交流电源和第2交流电源的电源切换机构。
另外，本发明的细胞筛选装置为根据权利要求3所述的细胞筛选装置，其特征在于，前述电源具有细胞固定用电源、细胞取出用电源和细胞融合用电源，前述电源中，前述细胞固定用电源由施加第1交流电压的第1交流电源构成，前述细胞取出用电源由施加第2交流电压的第2交流电源构成，前述细胞融合用电源由施加直流脉冲电压的直流脉冲电源构成，并具有从前述第1交流电源、前述第2交流电源、前述直流脉冲电源中选择任意的1个、或任意的2个电源并进行连接的电源切换机构。
另外，本发明的细胞筛选装置为前述的细胞筛选装置，前述第1交流电源的交流频率为30kHz以上，且前述第2交流电源的交流频率小于20kHz。
另外，本发明的细胞筛选装置为前述的细胞筛选装置，与前述特定物质具有结合性的识别分子为抗原。
另外，本发明的细胞筛选装置为前述的细胞筛选装置，面向细胞筛选区域的前述电极的表面和/或配置有具有前述微细孔的平板状的绝缘体的电极的绝缘体表面配置有阳离子性聚合物，所述细胞筛选区域为前述细胞筛选容器的隔着前述间隔物而形成于前述一对电极间的、用于进行细胞筛选的空间，前述阳离子性聚合物为聚赖氨酸、或聚赖氨酸的衍生物、或含氨基聚合物。
另外，本发明的细胞筛选方法为使用了前述细胞筛选装置的细胞筛选方法，向前述细胞筛选区域内导入细胞，通过前述第1交流电源施加前述第1交流电压而将前述细胞固定在前述微细孔内，使配置在前述微细孔底面的前述识别分子与细胞表面的特定物质发生结合反应后，通过沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用的特定的力，将前述细胞中细胞表面的特定物质与前述识别分子没有结合或者结合力弱的细胞从前述微细孔中取出，或者，通过沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用的特定的力，将前述细胞中细胞表面的特定物质与前述识别分子强力结合的细胞残留在微细孔中。
另外，本发明的细胞筛选方法为使用了前述细胞筛选装置的细胞筛选方法，向前述细胞筛选区域内导入第1细胞，通过前述第1交流电源施加前述第1交流电压而将前述第1细胞固定在前述微细孔内，使前述第1细胞表面的特定物质与前述识别分子发生结合反应，通过沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用的特定的力，将前述第1细胞中细胞表面的特定物质与前述识别分子没有结合或者结合力弱的细胞从前述微细孔中取出，接着向前述细胞筛选区域内导入第2细胞，使其与前述微细孔内残留的前述第1细胞接触，通过前述电源切换机构切换到前述直流脉冲电源而施加前述直流脉冲电压，使前述微细孔内残留的前述第1细胞和与其接触的前述第2细胞发生细胞融合。
另外，本发明的细胞筛选方法为如下细胞筛选方法：前述沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用的特定的力为沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用的重力、磁力、向前述细胞筛选容器中导入的溶液的送液力、或通过利用前述电源切换机构切换为前述第2交流电源施加前述第2交流电压从而沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用的介电电泳力中的任意1种、或任意2种以上的组合。
另外，本发明的细胞筛选方法为如下细胞筛选方法：前述特定的力为沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用的送液力，通过改变向前述细胞筛选容器中导入的溶液的送液速度的大小来改变送液力的大小，从而筛选前述细胞表面的特定物质与前述识别分子没有结合或者结合力弱的细胞、和细胞表面的特定物质与前述识别分子强力结合的细胞。
另外，本发明的细胞筛选方法为如下细胞筛选方法：前述特定的力为沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用的介电电泳力，通过改变由前述第2交流电源施加的前述第2交流电压的大小和/或频率的大小来改变介电电泳力的大小，从而筛选前述细胞表面的特定物质与前述识别分子没有结合或者结合力弱的细胞、和细胞表面的特定物质与前述识别分子强力结合的细胞。
另外，本发明的细胞筛选方法为如下细胞筛选方法：将前述从微细孔中取出的细胞捕捉到配置有阳离子性聚合物的前述电极的细胞筛选区域侧的表面和/或配置有具有前述微细孔的平板状的绝缘体的电极的绝缘体表面。
另外，本发明的细胞筛选方法为如下细胞筛选方法：在前述第2细胞的表面固定识别前述第1细胞的特定物质的识别分子，通过前述特定物质与前述识别分子的结合从而使前述第1细胞与前述第2细胞结合。
另外，本发明的细胞筛选方法的特征在于，在施加沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用的前述特定的力的状态下，施加前述直流脉冲电压，从而使前述第1细胞与前述第2细胞进行细胞融合。
另外，本发明的细胞筛选方法为如下细胞筛选方法：前述特定物质为细胞表面的抗体，前述识别分子为抗原。
另外，本发明的细胞筛选装置的其他方式为如下细胞筛选装置：所述细胞筛选装置具备相对的第1及第2电极、和对该电极施加交流电压的电源装置，在前述第1电极的第2电极侧的表面配置具有微细孔的绝缘体，该微细孔抵接的电极露出部位以外的部分被绝缘体覆盖，另外第1电极及第2电极为该绝缘体和第2电极隔离配置，前述电极露出部位配置有识别分子，并且，前述电源装置对第1电极及第2电极施加频率不同的两种交流电压。
以下，用图来对本发明进行更详细的说明。
本发明的细胞筛选装置具备细胞筛选容器和电源，所述细胞筛选容器由相对配置的由导电构件形成的一对电极和隔着平板状的间隔物而配置于前述一对电极间的平板状的绝缘体构成，所述绝缘体具有沿着前述相对配置的电极的方向贯通的多个微细孔，前述绝缘体配置于前述电极中的任一者的电极面上，前述微细孔的底面配置有对特定物质具有结合性的识别分子，所述电源对前述一对电极施加电压，且前述电源具有细胞固定用电源、细胞取出用电源，或者前述电源也可以具有细胞固定用电源、细胞取出用电源、细胞融合用电源。
这里，首先，为了说明本发明的细胞筛选装置和细胞筛选方法，利用图1～图3对使用了本发明的细胞筛选装置的代表性细胞筛选方法的概略、即将细胞溶液导入到细胞筛选区域中进行细胞筛选的方法进行说明。
按照图1、图2、图3的顺序示出本发明的细胞筛选方法的步骤。首先，如图1所示，将含有细胞(50)的细胞溶液(2)装入到细胞筛选区域(1)中，将电源切换机构(7)与施加第1交流电压的第1交流电源(5)连接。第1交流电源为细胞固定用电源。此时，细胞向着形成于绝缘体(8)中的微细孔(9)移动并被固定在微细孔(9)中。本发明中将该细胞向着微细孔移动时起作用的力称为正的介电电泳力(10)。如图1所示，正的介电电泳力是指，对电极间施加特定频率的交流电压时，像上部电极(14)和被微细孔(9)覆盖的下部电极(15)那样存在电力线(12)的集中部位时，使细胞等电介质粒子向着该电力线的集中部位(11)的方向(即，微细孔的方向)移动的力。通常，介电电泳力与电介质粒子的体积、电介质粒子的介电常数与溶液的介电常数之差、施加电压的平方成比例，对细胞等施加高频率(例如30kHz以上)的交流电压时产生正的介电电泳力。
接着，如图2所示，通过使固定在微细孔中的细胞与微细孔的底面接触，从而使细胞表面的特定物质(33)与配置于微细孔底面(本发明的细胞筛选装置的其他方式中第1电极的、电极与微细孔抵接的电极露出部位)的识别分子(34)发生结合反应。接着，如图3所示，通过电源切换机构(7)将第1交流电源(5)切换到第2交流电源(6)，施加第2交流电压。第2交流电源为细胞取出用电源。此时，负的介电电泳力(21)对位于微细孔中的细胞起作用。这里，负的介电电泳力是指沿着将细胞从微细孔(9)中取出的方向作用的力，通常，若对细胞等施加低频率(例如低于20kHz)的交流电压，则产生负的介电电泳力。由此，能够利用负的介电电泳力将细胞强制性从微细孔中取出。此时，固定于微细孔中的细胞中，细胞表面的特定物质与识别分子没有结合或者结合力弱的细胞(17)从微细孔中被取出，细胞表面的特定物质与识别分子强力结合的细胞(18)利用细胞表面的特定物质与识别分子的结合力而残留在微细孔中，由此能够进行细胞筛选。另外，第1交流电源和第2交流电源只要具有分别施加第1交流电压和第2交流电压的功能，则各自也可以为其他电源，也可以用同一电源切换电压、频率而使用。
即，作为本发明中的进行细胞筛选的方式，将细胞导入到细胞筛选区域内，施加第1交流电压而将细胞固定在微细孔内后，使细胞表面的特定物质(例如抗体)与识别分子(例如抗原)发生结合反应，通过电源切换机构将第1交流电源切换到第2交流电源，施加第2交流电压，能够将细胞中细胞表面的特定物质与识别分子没有结合或者结合力弱的细胞从微细孔中取出，并使细胞表面的特定物质与识别分子强力结合的细胞残留在微细孔内，另外，能够筛选细胞表面的特定物质与识别分子没有结合或者结合力弱的细胞以及细胞表面的特定物质与识别分子强力结合的细胞，并且，通过改变第2交流电源的电压的大小，能够将作为筛选基准的结合力设定为任意值。
这里，本发明中结合力较大除了意味着识别分子对细胞表面的特定物质的结合力本身较大的情况以外，还意味着由于细胞表面的特定物质较多而结果与识别分子的结合力较大的情况，意味着两种情况中的任一种或两种。
接着，利用图对本发明的细胞筛选装置的构成进行详细说明。
图4是表示本发明的细胞筛选装置的示意图的图。本发明的细胞筛选装置由细胞筛选容器(13)和电源(4)构成。
细胞筛选容器如图4所示具有如下结构：通过在上部电极(14)与下部电极(15)之间配置间隔物(16)，从而确保细胞筛选区域(1)，形成有微细孔(9)的绝缘体(8)配置在下部电极的细胞筛选区域侧。
在本发明的细胞筛选装置的其他方式中，图4的配置有形成了微细孔(9)的绝缘体(8)的下部电极相当于第1电极，与该绝缘体隔离配置的上部电极相当于第2电极。当然，通过施加两种交流电压来进行细胞固定或细胞取出的本发明的细胞筛选装置中，上下配置哪个电极均可，除上下以外，也可以沿着左右方向配置。另外，通过将间隔物(16)配置在绝缘体(8)与电极(14)之间，使绝缘体与电极隔离，其结果是，确保细胞筛选区域(1)，保持液体，但例如通过使电极接近而具有表面张力、或者在壳体内的相对的面粘附电极而使其中具有空间等，也能够替代间隔物。
上部电极和下部电极的材质只要为导电构件且为化学稳定的构件，则没有特别限制，可以是将白金、金、铜等金属、不锈钢等合金、及ITO(Indium Tin Oxide：氧化铟锡)等透明导电性材料成膜而得到的玻璃基板等，但为了观察细胞筛选，优选使用将ITO等透明导电性材料成膜而得到的玻璃基板作为电极。另外，为了将与特定物质具有结合性的识别分子仅固定于微细孔的部分，更优选金电极。这种情况下，通过利用金-硫醇键等，能够仅使金电极的露出表面的部分带上识别分子。金-硫醇键是指分子末端具有SH基的硫醇化合物与金等金属表面结合而形成致密的取向性的单分子膜的牢固的结合。例如与特定物质具有结合性的识别分子为抗原时，由于金-硫醇键的结合力为抗原抗体反应的结合力的100万倍左右，因此能够更牢固地固定在微细孔的底面。另外，为金-硫醇键时，对细胞筛选容器的电极施加适当的电压，能够切断金-硫醇键，细胞筛选容器的再利用也容易。进而，利用金-硫醇键时，除了使用金电极以外，也可以通过化学结合或物理吸附将金纳米颗粒固定在ITO等透明电极等电极表面。
上部电极和下部电极的面积等尺寸没有特别限制，作为容易处理的尺寸，例如优选为纵70mm×横40mm×厚1mm左右的尺寸。将电源(4)介由导电线(3)连接到细胞筛选容器的上部电极和下部电极。电源(4)由用于对上部电极和下部电极的电极间施加第1交流电压的第1交流电源(5)、用于施加第2交流电压的第2交流电源(6)、及用于施加直流脉冲电压的直流脉冲电源(35)构成，第1交流电源和第2交流电源及直流脉冲电源能够通过电源切换机构(7)而适当切换使用。另外，第1电源为细胞固定用电源，第2电源为细胞取出用电源，直流脉冲电源为细胞融合用电源。这里，可根据需要设置第2电源和直流脉冲电源中的任一者或两者，电源(4)也可以仅由第1交流电源(5)构成，不会超出本发明的主旨。
另外，电源仅由第1交流电源构成时，也不需要电源切换机构(7)，只要将第1交流电源直接连接到上部电极和下部电极上即可。另外，电源切换机构优选能够从前述第1交流电源、前述第2交流电源、前述直流脉冲电源中选择任意1个、或任意2个电源而进行连接。由此，例如，如果在与前述第2交流电源连接的状态下连接前述直流脉冲电源，能够在施加沿着从微细孔中取出细胞的方向作用的负的介电电泳力的状态下，施加直流脉冲电压而进行细胞融合，能够更有效地进行细胞筛选。
间隔物是为了使上部电极和下部电极不直接接触而设置的，并且具有贯通孔，该贯通孔即为形成用于确保预先向细胞筛选容器中装入细胞溶液的空间、也即细胞筛选区域，其材质只要为绝缘材料即可，例如有玻璃、陶器、树脂等。另外，为了向细胞筛选容器中导入、排出细胞，间隔物中设置有导入细胞的导入流路(29)及与其连通的导入口(19)、和排出细胞的排出流路(30)及与其连通的排出口(20)。这样，间隔物是用于使电极和绝缘体隔离、保持液体的，例如通过使电极接近而具有表面张力、或者在壳体内的相对的面粘附电极而具有空间等，能够代替间隔物。
绝缘体(8)中形成有微细孔(9)。绝缘体(8)的材质例如只要是玻璃、陶器、树脂等绝缘材料，则没有特别限制，由于需要形成贯通的微细孔，因此优选树脂等比较容易加工的材料。作为在树脂中形成贯通的微细孔的方法，只要采用对要形成微细孔的位置照射激光的方法、使用具有用于在微细孔的位置形成贯通孔的针的模具进行成形的方法等已知的方法即可。另外，绝缘体使用UV固化性树脂等时，使用绘制有与微细孔相当的图案的曝光用光掩模，通过一般的光刻法(曝光)和蚀刻(显影)，也能够形成贯通的微细孔。在绝缘体中形成多个微细孔时，优选绝缘体使用UV固化性树脂，并通过利用一般的光刻法和蚀刻的方法来形成微细孔。
微细孔的形状和大小没有特别限制，本发明的细胞筛选装置的情况下，1个微细孔中固定1个细胞时，能够进行更有效的细胞筛选，因此优选与微细孔的平面形状内接的最大圆的直径为微细孔中固定的细胞直径(根据细胞的不同而异，为1μm～几十μm左右)的1～2倍左右的范围，并且微细孔的深度为微细孔中固定的细胞的直径以下。
利用图对其理由进行更详细的说明。如图6所示，与微细孔的平面形状内接的最大圆的直径大于微细孔中固定的细胞直径的2倍时，微细孔中进入多个细胞，而无法进行有效的细胞筛选。同样地，微细孔的深度大于微细孔中固定的细胞的直径时，微细孔中也会进入多个细胞，而无法进行有效的细胞筛选。
另外，如图7所示，与微细孔的平面形状内接的最大圆的直径小于微细孔中固定的细胞的直径时，微细孔中固定的细胞不与微细孔的底面接触，配置于微细孔底面的识别分子与细胞表面的特定物质无法结合，无法满足本发明的必要条件。
然而，如图8所示，与微细孔的平面形状内接的最大圆的直径比微细孔中固定的细胞大1～2倍左右、且微细孔的深度为微细孔中固定的细胞的直径以下时，基本上1个细胞进入1个微细孔的概率变高，使微细孔中固定的细胞与微细孔的底面可靠地接触，从而配置于微细孔底面的识别分子能够与细胞表面的特定物质结合，能够满足本发明的必要条件，因此能够进行有效的细胞筛选。
本发明的细胞筛选装置由于1个微细孔中固定1个细胞时能够进行更有效的细胞筛选，因此，优选前述的绝缘体中形成的多个微细孔在绝缘体的面中按照从任一个微细孔出发相邻的微细孔的位置均在相同位置的方式形成，即如图4的绝缘体(8)上形成的微细孔(9)所示，多个微细孔在绝缘体的面中以阵列状形成。这里，阵列状意味着微细孔的纵和横的间隔为大致等间隔地配置。
通过以阵列状配置微细孔，从而对电极间施加的电压所产生的电场在全部微细孔中大致均等地产生，因此微细孔中固定细胞的概率在各微细孔中也相等，1个微细孔中能够固定1个细胞的概率变高。另外，为了在1个微细孔中固定1个细胞，以阵列状形成的微细孔的间隔过窄或过宽有时均不合适。微细孔的间隔过窄时，1个微细孔中固定多个细胞的概率变高，结果是产生没有进入细胞的微细孔的概率有时变高。另外，微细孔的间隔过宽时，微细孔与微细孔之间残留细胞，产生没有进入细胞的微细孔的概率有时变高。因此，更具体而言，微细孔的相邻间隔优选在微细孔中固定的细胞直径的0.5～6倍的范围，进而，微细孔的间隔更优选为所固定的细胞的直径的1～2倍左右。
另外，本发明中的微细孔的形状并不限定于圆状，也可以为三角状、四角状等多角状。为三角状、四角状等多角状时，由于在角的部分电力线的集中程度增强，因此具有介电电泳力与圆状的微细孔相比更强、细胞被固定到微细孔中的概率变高的优点。但是，以阵列状配置微细孔的情况下，来自前后左右的微细孔的介电电泳力相等地起作用时，1个微细孔中能够固定1个细胞的概率更高，因此微细孔的形状优选为点对称，进而更优选为正方形。
图5是表示图4的细胞筛选容器的XX’剖面图的概略图。作为将上部电极(14)、间隔物(16)、绝缘体(8)、下部电极(15)按照图5那样粘合的方法，只要采用下述已知的方法即可：分别用粘接剂粘合、或者在加压的状态下加热而熔接的方法；用具有表面粘结性的PDMS(聚二甲基硅氧烷，poly-dimethylsiloxane)、硅橡胶片(silicon sheet)那样的树脂制作间隔物，并通过压接进行粘合的方法等。由此能够形成图5所示的细胞筛选区域(1)。
本发明中的细胞筛选容器在微细孔的底面配置了与特定物质具有结合性的识别分子。这里，作为特定物质与识别分子的组合的例子，例如当筛选表面存在作为特定物质的配体的细胞时，识别分子优选为受体，当筛选表面存在作为特定物质的糖链的细胞时，识别分子优选为凝集素，当筛选表面存在作为特定物质的抗体的细胞时，识别分子优选为抗原，当筛选表面存在作为特定物质的抗原的细胞时，识别分子优选为抗体，只要特定物质与识别分子能够选择性结合，则没有特别限制。另外，在微细孔的底面配置识别分子的方法，只要至少在微细孔的底面固定识别分子，则没有特别限制，可以使用酰胺键、生物素-亲和素结合、硫醇键那样的化学结合，也可以将含有与特定物质具有结合性的识别分子或与蛋白质等结合了的识别分子的溶液导入到细胞筛选容器中而使其物理吸附在细胞筛选容器上。
在识别分子的上述特定物质与识别分子结合的部位以外的部位，也可以结合使识别分子易于固定在微细孔底面的分子、蛋白质等。作为使识别分子易于固定在微细孔底面的分子，例如可以使用生物素、亲和素、氨基、硫醇基、二硫基、及含有它们的烷基链、聚乙二醇链等。另外，作为用于使识别分子易于固定在微细孔底面的蛋白，有BSA(牛血清白蛋白)、BCP(BCP：Blue Carrier Immunogenic Protein，蓝载体蛋白)、KLH(KEYHOLE LIMPET HEMOCYANIN，钥孔血蓝素)等。
另外，这样配置识别分子后，也可以使不参与细胞表面的特定物质和识别分子的结合反应的分子、蛋白质与微细孔的底面、绝缘体表面接触，而发生化学结合、物理吸附。
这里，将不参与细胞表面的特定物质和识别分子的结合反应的分子、蛋白质与绝缘体表面接触而发生化学结合、物理吸附称为封闭(blocking)。进行封闭的目的如下所述：用与细胞表面的特定物质和识别分子的结合反应无关的分子、蛋白质覆盖表面，以防止细胞和蛋白质非特异性吸附于表面。
通常，作为用于封闭的分子，有烷基链、聚乙二醇链等以及包含它们的分子等，作为用于封闭的蛋白质溶液，可列举出脱脂乳、BSA、酪蛋白等。
另外，这样的蛋白质通过表面电荷、疏水相互作用与塑料管、微孔板、玻璃珠、绝缘体等的表面发生非特异性吸附。另外，通常吸附蛋白质时，溶剂的pH值在比蛋白质的等电点偏碱侧比较好，因此，作为溶剂，可以使用磷酸缓冲生理盐水(PBS)、碳酸盐缓冲液(Na2CO3、NaHCO3)等。
通过这样进行封闭，从而使位于细胞表面的特定物质与识别分子更具选择性地结合，因此通过本细胞筛选法能够提高筛选效率。
另外，本发明中的电源具备第1交流电源，也可以根据需要具备第2交流电源和直流脉冲电源。
第1交流电源为细胞固定用电源，是为了使细胞向着绝缘体中形成的微细孔移动并固定而使用的。另外，第2交流电源为细胞取出用电源，是为了将细胞从绝缘体中形成的微细孔中通过介电电泳力取出、进行筛选而使用的。另外，直流脉冲电源为细胞融合用电源，是为了通过本发明筛选第1细胞后，以残留在微细孔中的第1细胞为对象、与接着导入的第2细胞通过电进行细胞融合而使用的。
本发明的细胞筛选装置中使用的第1交流电源只要能够将细胞固定在微细孔中，则没有特别限制，例如，可以是能够输出峰值电压为1V～20V左右、频率30kHz～3MHz左右、优选为1MHz～3MHz左右的正弦波、矩形波、三角波、梯形波等交流电压的交流电源等。
使用本发明的细胞筛选装置时，在1个微细孔中固定1个细胞时能够进行更有效的细胞筛选，作为用于在每1个微细孔中固定1个细胞的交流电压的波形，优选为矩形波。作为其理由，如图9～图12所示，关于交流电压的波形，与正弦波(图9)、三角波(图10)、梯形波(图11)相比，矩形波(图12)瞬时达到所设定的峰值电压(31)，因此细胞迅速向微细孔移动，细胞重叠进入微细孔的概率变低，因此每1个微细孔中固定1个细胞的概率变高。另外，电学上能够将细胞看作电容器，在矩形波的峰值电压不变的期间，难以对进入到微细孔中的细胞流过电流，因此难以产生电力线，进入有细胞的微细孔中难以产生介电电泳力，因此一旦细胞进入微细孔时，其他细胞进入该微细孔的概率变低，细胞依次进入到产生电力线并发生介电电泳力的空的微细孔中。
本发明的细胞筛选装置中使用的交流电压的波形优选不具有直流成分。这是因为，直流成分产生的静电力使得细胞受到偏向特定方向的力而移动，因此难以通过介电电泳力将细胞固定在微细孔中。另外，含有细胞的悬浮液中所含的离子在电极表面产生电反应而引起发热，由此引起细胞的热运动，因此无法通过介电电泳力来控制细胞的运动，难以将细胞吸引到微细孔中。
本发明的细胞筛选装置中使用的第2交流电源只要能够将细胞从微细孔中取出，则没有特别限制，例如可以是能够输出峰值电压为1V～20V左右、频率不到20kHz、优选为5kHz～10kHz左右的正弦波、矩形波、三角波、梯形波等交流电压的交流电源。
本发明的细胞筛选装置中使用的直流脉冲电源，只要能够产生可使微细孔或其附近彼此接触的第1细胞和第2细胞发生细胞融合的直流脉冲电压，则没有特别限制，例如，作为直流脉冲电压，只要是能够输出50V～1000V、脉冲宽10μsec～50μsec左右的直流脉冲电压的直流脉冲电源，则没有特别限制。
另外，本发明的细胞筛选装置中，也可以在前述细胞筛选容器中的面向前述细胞筛选区域的前述电极的表面和/或配置有具有前述微细孔的平板状的绝缘体的电极的绝缘体表面配置阳离子性聚合物。阳离子性聚合物使电极或绝缘体表面的负电荷和细胞表面存在的唾液酸的负电荷通过阳离子性聚合物所具有的正电荷而产生离子键。通过该方式，从而能够使利用本发明的细胞筛选方法从微细孔中取出的细胞附着在面向前述细胞筛选区域的电极的表面、或配置有具有前述微细孔的平板状的绝缘体的电极的绝缘体表面，从微细孔中取出的细胞再次被固定于微细孔中的概率变低，能够提高筛选效率。
作为阳离子性聚合物，例如有聚赖氨酸、聚赖氨酸的衍生物、含氨基聚合物等，只要是能够附着细胞的阳离子性聚合物，则没有特别限制，优选对细胞毒性低、细胞附着能力高的阳离子性聚合物。
另外，关于阳离子性聚合物，通过对细胞筛选容器的电极施加适当的电压，能够除去阳离子性聚合物，细胞筛选容器的再利用也容易。
接着，对本发明中的细胞筛选方法进行说明。
本发明的细胞筛选方法是使用前述细胞筛选装置的细胞筛选方法，所述细胞筛选方法是：将细胞导入到前述细胞筛选区域内，通过前述第1交流电源施加前述第1交流电压，利用介电电泳力将前述细胞固定在前述微细孔内，使配置于前述微细孔的底面的前述识别分子(例如抗原)与细胞表面的特定物质(例如抗体)发生结合反应后，通过沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用的特定的力，将前述细胞中细胞表面的特定物质与前述识别分子没有结合或者结合力弱的细胞从前述微细孔中取出，或者，通过沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用的特定的力，使前述细胞中细胞表面的特定物质与前述识别分子强力结合的细胞残留在微细孔中。
这里，特定的力为沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用的力，只要是和细胞表面的特定物质与微细孔底面的识别分子的结合力(pN～nN左右)大致同等程度的力，则没有特别限制，可以是向前述细胞筛选容器导入的溶液的送液力，或者利用通过前述电源切换机构切换为前述第2交流电源施加前述第2交流电压从而沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用的介电电泳力，也可以是相应于微细孔中固定的细胞的质量而作用的重力，或者预先使细胞表面附着磁性微粒等时也可以是磁力。
另外，如图19所示，作为与细胞表面的特定物质(33)和微细孔底面的识别分子(34)的结合力方向相反的特定的力，沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向对细胞作用送液力(39)时，只要向细胞筛选区域内(1)导入没有放入细胞的细胞溶液(2)即可。
另外，作为与细胞表面的特定物质(33)和微细孔底面的识别分子(34)的结合力方向相反的特定的力，图17中示出了沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用重力(36)的情况。如图17所示，在细胞筛选区域(1)的微细孔(9)中固定细胞时，为了使配置有具有微细孔的平板状的绝缘体的电极位于下侧地设置，在细胞表面的特定物质(33)与微细孔底面的识别分子(34)结合后，将细胞筛选容器(13)倒置，使配置有具有微细孔的平板状绝缘体的电极被设置于上侧即可。
另外，作为与细胞表面的特定物质(33)和微细孔底面的识别分子(34)的结合力方向相反的特定的力，图18中示出了沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用磁力(37)的情况。如图18所示，使用表面附着有磁性微粒(45)的细胞，并使细胞筛选容器(13)的配置有具有微细孔的平板状的绝缘体的电极按照位于下侧的方式设置，在细胞筛选容器的上侧设置磁性体(38)即可。另外，使细胞附着磁性微粒的方法，可以采用物理吸附、利用生物素-亲和素结合等化学结合等的已知的方法。
这些特定的力中，沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用的送液力，可通过改变向前述细胞筛选容器中导入的溶液的送液速度的大小而容易地改变送液力的大小。另外，沿着从前述微细孔中取出前述细胞的方向作用的介电电泳力，通过改变由前述第2交流电源施加的前述第2交流电压的大小和/或频率的大小，能够容易地改变介电电泳力的大小。即，能够任意地设定筛选前述细胞表面的特定物质与前述识别分子没有结合或者结合力弱的细胞、以及细胞表面的特定物质与前述识别分子强力结合的细胞时的、作为筛选基准的结合力。因此，在特定的力采用送液力或介电电泳力时，首次实现了以细胞表面的特定物质与识别分子之间的结合力的大小为基准而容易地筛选细胞，这在现有技术中是很困难的。
这里，作为特定的力的重力、磁力、送液力、介电电泳力的施加时间，只要能够筛选目标细胞，则没有特别限制。另外，施加重力、磁力、送液力、介电电泳力的时间达到某一定的时间时，通常将特定物质与识别分子的结合力分离开的比例变高，接近达到饱和，因此，在某一定的时间内，能够通过施加重力、磁力、送液力、介电电泳力的时间，任意设定筛选细胞表面的特定物质与前述识别分子强力结合的细胞时的、筛选基准。
另外，本发明的细胞筛选方法中，根据作为筛选对象的细胞、细胞表面的特定物质与前述识别分子的结合力，前述特定的力可以是重力、送液力、介电电泳力、磁力中的任一种力，或者也可以将任意2种以上的力组合。
另外，本发明的细胞筛选方法中，由于将前述细胞表面的特定物质与前述识别分子没有结合或者结合力弱的细胞从微细孔中取出，因此理想的是采用大于进行筛选的细胞的细胞直径的微细孔径。然而，根据本发明人等的研究结果，使用本细胞筛选方法进行细胞融合时，为了使融合再生概率变高，优选微细孔径和细胞直径大致相同大小。因此，接着后述那样的细胞筛选进行细胞融合时，如果微细孔径的大小与细胞直径的大小大致相同，则细胞非特异性吸附在微细孔的壁面，因此细胞筛选时可能难以将前述细胞表面的特定物质与前述识别分子没有结合或者结合力弱的细胞从微细孔中取出。这种情况下，通过改变含有细胞的溶液的浸透压和/或比重，能够更有效地将细胞从微细孔中取出。
例如，通过将溶剂从300mM的甘露糖醇溶剂置换成500mM的甘露糖醇溶剂，从而溶剂的浸透压变高，细胞直径变小，因此变得易于将细胞从微细孔中取出。另外，如果将溶剂从甘露糖醇置换成蔗糖，则由于蔗糖的比重大于甘露糖醇的比重，因此细胞受到浮力的作用，促进了采用负的介电电泳力、送液力、磁力从微细孔中取出细胞的效果。该方法除了蔗糖以外，将Ficoll等水溶性高分子添加到溶剂中同样也能够使细胞受到浮力的作用。
另外，本发明的细胞筛选方法中，这样的溶剂置换可以在任意时候实施，也能够在细胞筛选时将溶剂置换成别的溶剂而将前述细胞表面的特定物质与前述识别分子没有结合或者结合力弱的细胞从微细孔中取出后，再次将溶剂置换成原来的溶剂而使溶剂恢复原来的状态，能够任意选择细胞筛选的最优的溶剂条件和细胞融合的最优的溶剂条件。
以下，以利用前述第2交流电压的大小、即对细胞作用的介电电泳力的大小来筛选前述细胞表面的特定物质与前述识别分子的结合力大小从而筛选细胞的情况为例，用图进行更详细的说明。
图1～3和图13示出了本发明的细胞筛选方法的示意图。
图1中，向微细孔的底面固定有与特定物质具有结合性的识别分子(34)的前述细胞筛选区域内导入细胞，通过施加前述第1交流电压，将前述细胞固定在前述微细孔内。接着如图2所示，使细胞与微细孔的底面接触，使细胞表面的特定物质(33)与前述识别分子发生结合反应。接着如图3所示，通过施加第2交流电压，作用将细胞从微细孔中取出的力(负的介电电泳力)。这里，用图13进行详细说明的话，细胞中细胞表面的特定物质与识别分子强力结合的细胞(18)，由于细胞表面的特定物质与识别分子的结合力(22)大于负的介电电泳力(21)，因此细胞残留在微细孔中。另一方面，细胞中细胞表面的特定物质与识别分子没有结合或者结合力弱的细胞(17)，由于负的介电电泳力(21)大于细胞表面的特定物质与识别分子的结合力(22)，因此细胞从微细孔中被取出。即，通过调整负的介电电泳力的大小，能够调整细胞表面的特定物质与识别分子的结合力的筛选基准，从而筛选细胞。这里，负的介电电泳力的大小可以通过第2交流电源的电压、频率来控制，通过第2交流电源的电压进行控制最简单，因此优选。例如，作为第2交流电源的电压，如果在2.5V～10V的范围，则能够以电压施加时间30～40秒左右进行筛选，但为了对细胞没有损害并抑制细胞的活性降低，优选在介电电泳力起作用的范围内尽可能低的电压。
通过以上的步骤，利用前述第2交流电压的大小、即介电电泳力的大小筛选细胞表面的特定物质与前述识别分子的结合力的大小。
另外，本发明的细胞筛选方法是使用了前述细胞筛选装置的细胞筛选方法，也可以为以下叙述的细胞筛选方法。即如下细胞筛选方法：向前述细胞筛选区域内导入第1细胞，通过前述第1交流电源施加前述第1交流电压而将前述第1细胞固定在前述微细孔内。使前述第1细胞表面的特定物质与前述识别分子发生结合反应，通过前述特定的力将前述第1细胞中细胞表面的特定物质与识别分子没有结合或者结合力弱的细胞从前述微细孔中取出；接着，向前述细胞筛选区域内导入第2细胞，使其与前述微细孔内残留的前述第1细胞接触；通过前述电源切换机构切换到前述直流脉冲电源，施加前述直流脉冲电压，使前述微细孔内残留的前述第1细胞与所接触的前述第2细胞发生细胞融合。
通过这样的方式，能够在同一容器内连续地进行细胞筛选和细胞融合，因此，能够选择前述第1细胞(例如小鼠脾脏细胞)中细胞表面的特定物质(例如抗体)与识别分子(例如抗原)的结合力强的第1细胞，与第2细胞(例如小鼠癌细胞)进行细胞融合。因此，融合细胞数大幅度减少，且生成与抗原强力结合的抗体的融合细胞的比例变高，因而在细胞融合后，筛选生成与抗原强力结合的抗体的融合细胞的操作大幅度减少。另外，如果增加本发明的细胞筛选装置中的固定细胞的微细孔的数目(例如100万个～3000万个左右)，则能够在非常短时间内，对大量样品细胞对象利用细胞表面的特定物质与识别分子的结合力的评价来实施细胞的筛选和融合。
即，与作为前述现有技术的、通过ELISA法、专利文献1记载的方法等在细胞融合后评价各个融合细胞生成抗体的性能的方法，通过磁珠法、流式细胞术法、专利文献2～4记载的方法等在细胞筛选后在其他装置或容器内进行细胞融合的方法相比，无需分别准备细胞筛选用的装置及容器和细胞融合用的装置及容器，能够简易地在短时间内进行大量的细胞筛选和细胞融合。
另外，由于能够连续地在同一容器内实施细胞筛选和细胞融合，因此在能够迅速地进行有效操作的基础上，还能够维持细胞的活性。另外，还能够大幅度减少由于将细胞从细胞筛选容器转移到细胞融合容器中而产生的细胞的损失。另外，也无需流式细胞术那样高价且大型的装置，能够以廉价且小型的装置连续地进行细胞筛选和细胞融合。
另外，本发明的细胞筛选方法中，通过由第1交流电源施加的第1交流电压，强制性使细胞筛选后残留在微细孔内的第1细胞、与之后导入到细胞筛选区域的第2细胞接触，使第1细胞和第2细胞成对而进行细胞融合。因此，能够得到非常高的融合再生概率(本发明人等研究的本发明的融合再生概率在未进行细胞筛选时为20/10000～100/10000左右)，即使通过细胞筛选大幅度减少第1细胞数，也能够实质上得到融合细胞。在以往的方法即专利文献3记载的方法和专利文献4记载的方法中，细胞筛选后采用的细胞融合法为以往的细胞融合法即PEG法和电融合法，因此它们的融合再生概率通常为0.2/10000左右，非常低，因此存在实质上难以得到融合细胞的问题。采用本发明的细胞筛选方法，解决了这些问题，首次实现在细胞筛选后实质上得到融合细胞。由于在同一容器内进行细胞筛选和细胞融合的操作，因此像以往那样的进行容器的置换导致细胞损失的可能性也变低。
另外，对于通过本发明的细胞筛选装置筛选细胞后或者细胞融合后固定在微细孔内的细胞，只要调节溶液的pH值等，就能够容易地将识别分子与细胞表面的特定物质的结合切断，不需要像磁珠法或专利文献2记载的方法那样将目标细胞从磁珠或载体上分离的繁杂的工序，能够容易地回收所筛选的细胞、融合细胞。
进而，作为本发明的细胞筛选方法中的、沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用的特定的力，如果采用送液力或者沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用的介电电泳力，则通过改变向细胞筛选容器内导入的溶液的送液速度的大小、利用由第2交流电源施加的第2交流电压的大小和频率，能够容易地改变送液力、介电电泳力的大小。因此，在筛选细胞表面的特定物质与识别分子没有结合或者结合力弱的细胞、和细胞表面的特定物质与识别分子强力结合的细胞时，能够任意地设定作为筛选基准的结合力，首次实现了通过抗原抗体反应等的、前述细胞表面的特定物质与前述识别分子之间的结合力的大小而容易地筛选细胞，以及首次实现了以所筛选的细胞为对象与其他细胞进行细胞融合，从而解决了前述现有技术中的课题。
另外，本发明的细胞筛选方法中，也可以如本发明的细胞筛选装置中说明的那样，将从微细孔取出的细胞捕捉到配置有阳离子性聚合物的前述电极的细胞筛选区域侧的表面和/或配置有具有前述微细孔的平板状的绝缘体的电极的绝缘体表面。如前所述，阳离子性聚合物具有使电极、绝缘体表面的负电荷和细胞表面存在的唾液酸的负电荷通过阳离子性聚合物所具有的正电荷而产生离子键的作用。通过该方式，使通过本发明的细胞筛选方法筛选而从微细孔中取出的细胞附着到面向前述细胞筛选区域的电极的表面、或配置有具有前述微细孔的平板状的绝缘体的电极的绝缘体表面，从微细孔中取出的细胞被再次固定到微细孔内的概率变低，能够与微细孔中固定的细胞更明确地区别筛选，因此筛选效率提高。
另外，在本发明的细胞筛选装置中，在前述细胞筛选容器中的面向前述细胞筛选区域的前述电极的表面和/或配置有具有前述微细孔的平板状的绝缘体的电极的绝缘体表面没有配置阳离子性聚合物的情况下，也可以在通过本发明的细胞筛选方法筛选后，筛选从微细孔中取出的细胞和残留在微细孔内的细胞后，将含有阳离子性聚合物的溶液导入到细胞筛选区域，从而使从微细孔取出的细胞附着到面向前述细胞筛选区域的电极的表面、配置有具有前述微细孔的平板状的绝缘体的电极的绝缘体表面。通过该方式，在担心阳离子性聚合物对细胞有毒性的情况下，使从微细孔中取出的细胞附着到面向前述细胞筛选区域的电极的表面、或配置有具有前述微细孔的平板状的绝缘体的电极的绝缘体表面后，将不含阳离子性聚合物的溶液导入细胞筛选区域，通过置换细胞筛选区域内的溶液而除去过量的阳离子性聚合物，能够将对细胞的毒性抑制到最小限度，从而维持细胞活性。
将上述从微细孔中取出的细胞捕捉到配置有阳离子性聚合物的前述电极的细胞筛选区域侧的表面和/或配置有具有前述微细孔的平板状的绝缘体的电极的绝缘体表面的方法，在连续地进行本发明中的细胞筛选和细胞融合的情况下特别有效。即，通过特定的力将前述第1细胞中细胞表面的特定物质与识别分子没有结合或者结合力弱的细胞从前述微细孔中取出后，导入与第1细胞进行细胞融合的第2细胞时，通过向细胞筛选区域内送入含有第2细胞的溶液，能够防止从微细孔中取出的第1细胞再次进入微细孔内。另外，能够使微细孔内残留的第1细胞、即细胞表面的特定物质与识别分子结合力强的第1细胞与第2细胞更具选择性地进行细胞融合，从而进一步提高细胞融合后筛选融合细胞的效率。
以下，以下述情况为例用图进行更详细的说明：利用前述第2交流电压的大小、即沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用的介电电泳力的大小，筛选前述第1细胞的小鼠脾脏细胞的细胞表面的特定物质即抗体与前述识别分子即抗原的结合力的大小，从而筛选细胞表面存在与抗原更强力结合的抗体的小鼠脾脏细胞，导入作为前述第2细胞的小鼠癌细胞，在细胞筛选之后连续地进行细胞融合，从而来筛选生成与抗原更强力结合的抗体的融合细胞。
图20～图26示出了连续进行本发明的细胞筛选和细胞融合的方法的示意图。
图20中，向微细孔的底面固定有与特定的抗体(40)结合的抗原(41)的细胞筛选区域(1)导入小鼠脾脏细胞(42)，通过第1交流电源(5)施加第1交流电压，从而将小鼠脾脏细胞固定在微细孔(9)中。接着如图21所示，使小鼠脾脏细胞(42)与微细孔的底面接触，使位于细胞表面的抗体(40)与微细孔的底面固定的抗原(41)发生抗原抗体反应而结合。接着如图22所示，通过第2交流电源(6)施加第2交流电压，从而作用负的介电电泳力(21)作为将小鼠脾脏细胞从微细孔中取出的力。这里，对于微细孔中固定的小鼠脾脏细胞中细胞表面的抗体与抗原强力结合的细胞(18)，该抗原与抗体的结合力大于负的介电电泳力(21)，因此细胞残留在微细孔中。另一方面，对于小鼠脾脏细胞中细胞表面的抗体与抗原没有结合或者结合力弱的细胞(17)，负的介电电泳力(21)大于抗原与抗体的结合力，因此细胞从微细孔中被取出。即，通过调整负的介电电泳力的大小，从而能够调整细胞表面的抗体与抗原的结合力的筛选基准，而筛选小鼠脾脏细胞。进而，如图23所示，通过在绝缘体上配置聚赖氨酸等阳离子性聚合物(46)，从而将从微细孔中取出的小鼠脾脏细胞捕捉到绝缘体(8)上。接着，如图24所示，一边再次通过第1交流电源施加第1交流电压，一边向细胞筛选区域(1)中导入小鼠癌细胞(43)，如图25所示将小鼠癌细胞固定在微细孔中。此时，如图25所示，已经从微细孔中取出的小鼠脾脏细胞中细胞表面的抗体与抗原没有结合或者结合力弱的细胞(17)被阳离子性聚合物(46)捕捉到绝缘体(8)上，因此通过介电电泳而再次被固定到微细孔(9)中的概率非常低。即，小鼠癌细胞仅与通过负的介电电泳力而选择的、细胞表面存在与抗原强力结合的抗体的脾脏细胞接触。此后，如图26所示，通过直流脉冲电源(35)施加直流脉冲电压，使相互接触的小鼠脾脏细胞中细胞表面的抗体与抗原强力结合的细胞(18)和小鼠癌细胞(43)发生细胞融合。
通过以上的步骤，能够选择性地将细胞表面存在与抗原的结合力强的抗体的小鼠脾脏细胞与小鼠癌细胞进行细胞融合，所得到的融合细胞数大幅度减少，且生成与抗原强力结合的抗体的融合细胞的比例变大，因此细胞融合后筛选生成与抗原强力结合的抗体的融合细胞的操作大幅度减少。
进而，本发明的细胞筛选方法也可以为如下细胞筛选方法：在第2细胞的表面固定识别第1细胞的特定物质的识别分子，通过前述特定物质与前述识别分子的结合，将前述第1细胞与前述第2细胞结合。
通过该方式，能够通过微细孔的底面固定的识别分子和第2细胞的表面固定的识别分子这两者来筛选第1细胞，因此，本发明中，特别是在连续地进行细胞筛选和细胞融合的情况下，可获得进一步大大提高筛选效率的效果。这种情况下，微细孔的底面固定的识别分子和第2细胞的表面固定的识别分子可以是识别第1细胞的相同特定物质的同一识别分子，也可以是识别第1细胞的2种不同特定物质的不同的识别分子。
微细孔的底面固定的识别分子和第2细胞的表面固定的识别分子为识别第1细胞的相同特定物质的同一识别分子时，存在第1细胞非特异性地固定在微细孔中的情况等。在第1细胞非特异性地固定在微细孔中的情况等，由于被第2细胞的识别分子再次筛选，因此能够提高细胞筛选的精度而将第1细胞与第2细胞进行细胞融合，因此细胞筛选效率进一步提高。
另外，微细孔的底面固定的识别分子和第2细胞的表面固定的识别分子为识别第1细胞的2种不同特定物质的不同的识别分子时，例如，预先在微细孔的底面固定特定的抗原，来筛选表面存在与抗原很强结合的抗体的第1细胞。通过预先在第2细胞的表面固定用于筛选IgG抗体的抗IgG抗体，从而仅筛选表面存在很多与特定的抗原强力结合且为IgG类抗体(通常，作为单克隆抗体，使用IgG类抗体，而不使用IgM类抗体)的第1细胞。因此，能够使第1细胞和第2细胞发生细胞融合，因此细胞筛选效率进一步提高。这里，第2细胞上固定的识别分子不限于IgG抗体，只要在不脱离本发明的主旨的范围，则没有特别限定，可作任意变更。例如除上述例子以外，预先在微细孔中固定特定的抗原，来筛选表面存在与抗原强力结合的抗体的第1细胞。进而，通过预先在第2细胞的表面固定用于筛选第1细胞的表面存在的CD138的识别分子，从第1细胞中仅筛选与特定的抗原强力结合且由细胞分泌抗体型的浆细胞，并使第1细胞和第2细胞发生细胞融合。
进而，上述方式的情况下，微细孔和第1细胞通过微细孔中固定的识别分子与细胞表面的特定物质的结合而固定，并且，对于第1细胞和第2细胞，第1细胞表面的特定物质与第2细胞的表面固定的识别分子结合并接触，施加沿着从微细孔中取出第1细胞和第2细胞的方向作用的特定的力时，表面存在与微细孔中固定的识别分子强力结合的特定物质的第1细胞仅与表面固定有与第1细胞表面的特定物质强力结合的识别分子的第2细胞成对而残留在微细孔中。因此，通过在施加沿着从微细孔中取出的方向作用的特定的力的状态下施加直流脉冲电压，能够使细胞融合。由此，通过特定的力从微细孔中取出的第1细胞和第2细胞总是保持在从微细孔中取出的状态，因此特定物质与识别分子的结合弱的第1细胞与第2细胞发生细胞融合的概率减小，特定物质与识别分子的结合强的第1细胞与第2细胞发生细胞融合的概率变高，因此能够进一步提高融合细胞的筛选效率。
图27～图34中示出了本发明中的、通过用沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用的特定的力进行作用的状态下施加直流脉冲电压从而连续地进行细胞筛选和细胞融合的方法的示意图。
图27中，向微细孔的底面固定有与特定的抗体(40)结合的抗原(41)的细胞筛选区域(1)导入小鼠脾脏细胞(42)，通过第1交流电源(5)施加第1交流电压，将小鼠脾脏细胞固定在微细孔(9)中。接着如图28所示，使小鼠脾脏细胞(42)与微细孔的底面接触，使位于细胞表面的抗体(40)与微细孔的底面固定的抗原(41)发生抗原抗体反应而结合。接着如图29所示，通过第2交流电源(6)施加第2交流电压，作用负的介电电泳力(21)作为从微细孔(9)中取出小鼠脾脏细胞的力。这里，对于微细孔中固定的小鼠脾脏细胞中细胞表面的抗体与抗原强力结合的细胞(18)，其抗原与抗体的结合力大于负的介电电泳力，因此细胞残留在微细孔内。另一方面，对于小鼠脾脏细胞中细胞表面的抗体与抗原没有结合或者结合力弱的细胞(17)，负的介电电泳力大于抗原与抗体的结合力，因此细胞从微细孔中被取出。即，通过调整负的介电电泳力的大小，从而能够调整细胞表面的抗体与抗原的结合力的筛选基准，来筛选小鼠脾脏细胞。
进而，如图30所示，通过在绝缘体上配置聚赖氨酸等阳离子性聚合物(46)，从而使从微细孔中取出的小鼠脾脏细胞捕捉到绝缘体(8)上。接着，如图31所示，再次通过第1交流电源施加第1交流电压向细胞筛选区域导入固定有位于表面的抗IgG抗体(44)的小鼠癌细胞(43)，如图32所示，将小鼠癌细胞固定在微细孔内。此时，如图32所示，已经从微细孔中取出的小鼠脾脏细胞(17)被阳离子性聚合物(46)捕捉到绝缘体(8)上，因此通过介电电泳而被再次固定到微细孔中的概率非常低。即，小鼠癌细胞仅与通过负的介电电泳力而选择的、细胞表面存在与抗原强力结合的抗体的小鼠脾脏细胞接触。接着，如图32所示，小鼠脾脏细胞的细胞表面的抗体中IgG型的抗体(47)与位于小鼠癌细胞的表面的抗IgG抗体(44)发生抗原抗体结合。接着，如图33所示，通过第2交流电源(6)施加第2交流电压从而作用沿着从微细孔(9)中取出细胞的方向作用的负的介电电泳力(21)。此时，通过负的介电电泳力(21)，使小鼠癌细胞(43)与小鼠脾脏细胞中位于表面的IgG型抗体的比例少的小鼠脾脏细胞(48)分离，小鼠脾脏细胞中位于表面的IgG型抗体的比例多的小鼠脾脏细胞(49)保持与小鼠癌细胞(43)接触的状态而残留。此后，如图34所示，在通过第2交流电源(6)施加第2交流电压的状态下，即，在施加沿着从微细孔(9)中取出细胞的方向作用的负的介电电泳力(21)的状态下通过直流脉冲电源(35)施加直流脉冲电压，从而仅使相互接触的小鼠脾脏细胞与小鼠癌细胞进行细胞融合。
通过以上的步骤，能够选择性地使细胞表面呈现与抗原的结合力强的抗体、且表面存在很多抗体类为IgG的抗体的小鼠脾脏细胞与小鼠癌细胞进行细胞融合，所得到的融合细胞的数目进一步大幅度减少，并且所得到的融合细胞中，生成与抗原的结合力强且为IgG抗体的融合细胞的比例变高，因此细胞融合后筛选生成大量抗体的融合细胞的操作量进一步大幅度减少。
这里，在第2细胞的表面固定识别分子的方法，只要至少能在第2细胞的表面固定识别分子，则没有特别限制，例如，可以在与特定物质具有结合性的识别分子溶液中使第2细胞的表面与识别分子接触而发生物理吸附，也可以利用酰胺键、生物素-亲和素结合、硫醇键那样的化学结合。这里，也可以在上述特定物质的与识别分子结合的部位以外的识别分子的部位，结合用于使识别分子易于固定在第2细胞的表面的分子或蛋白质等，从而将识别分子固定在第2细胞的表面。作为用于使识别分子易于固定在第2细胞的表面的分子，例如可以使用生物素、亲和素、硫醇基、二硫基、及含有它们的烷基链、聚乙二醇链等。另外，作为用于使识别分子易于固定在第2细胞的表面的蛋白质，有BSA、BCP、KLH等。
发明的效果
根据本发明，能够发挥以下的效果。
1)根据本发明的细胞筛选装置和筛选方法，通过第1交流电源施加正的介电电泳力，能够在1个微细孔中固定1个细胞，通过沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用的特定的力，能够从微细孔中取出细胞并逐个进行筛选，能够一次性大量且短时间简便地筛选表面存在与识别分子强力结合的特定物质的细胞。
2)根据本发明的细胞筛选装置和筛选方法，特定的力采用送液力或介电电泳力，从而首次实现了以细胞表面的特定物质与识别分子之间结合力的大小为基准容易地筛选细胞，这在现有技术中是很困难的。
3)根据本发明的细胞筛选装置和筛选方法，对于通过由第1交流电源产生的正的介电电泳力而固定在微细孔中的第1细胞，通过沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用的特定的力，能够以细胞表面的特定物质与识别分子之间结合力的大小为基准从微细孔中取出细胞并逐个进行筛选，使第2细胞与微细孔内残留的第1细胞接触，通过直流脉冲电源施加直流脉冲电压，能够选择性地使表面存在与识别分子强力结合的特定物质的第1细胞与第2细胞进行细胞融合，能够以非常短时间实施以大量的细胞为对象的利用细胞表面的特定物质与识别分子的结合力的评价进行的细胞筛选和细胞融合。
4)根据本发明的细胞筛选装置和筛选方法，对于通过由第1交流电源产生的正的介电电泳力而固定在微细孔中的第1细胞，通过沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用的特定的力，能够以细胞表面的特定物质与识别分子之间结合力的大小为基准从微细孔中取出细胞并逐个进行筛选，使第2细胞与微细孔内残留的第1细胞接触，通过直流脉冲电源施加直流脉冲电压，通过由第1交流电源施加的第1交流电压使细胞筛选后残留于微细孔内的第1细胞与第2细胞强制接触，从而使第1细胞与第2细胞成对而进行细胞融合，因此与以往的细胞融合法(PEG法、电融合法)相比，能够得到非常高的融合再生概率，首次实现在细胞筛选后实质上得到融合细胞。
5)根据本发明的细胞筛选装置和筛选方法，无需分别准备细胞筛选用的装置及容器和细胞融合用的装置及容器，能够连续地在同一容器内实施细胞筛选和细胞融合，因此能够简易且以短时间进行大量的细胞筛选和细胞融合，在能够迅速地进行有效操作的基础上，还能够维持细胞的活性，还能够大幅度减少因将细胞从细胞筛选容器转移到细胞融合容器中而产生的细胞损失。
6)根据本发明的细胞筛选装置和筛选方法，也不需要高价且大型的装置，能够以廉价且小型的装置连续地进行细胞筛选和细胞融合。
7)根据本发明的细胞筛选装置和筛选方法，在细胞筛选后或者细胞融合后，不需要将细胞从载体上分离的繁杂的工序，能够容易地回收所筛选的细胞、融合细胞。
8)根据本发明的细胞筛选装置和筛选方法，能够在施加沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用的特定的力的状态下使第1细胞和第2细胞进行细胞融合，通过筛选而从微细孔中取出的不需要的细胞发生细胞融合的概率变低，能够利用细胞表面的特定物质与识别分子的结合力的评价以非常短时间实施融合细胞的筛选。
9)根据本发明的细胞筛选装置和筛选方法，能够选择性地使细胞表面呈现与抗原的结合力强的抗体、并且表面存在很多抗体类为IgG的抗体的小鼠脾脏细胞与小鼠癌细胞进行细胞融合，所得到的融合细胞的数目进一步大幅度减少，并且所得到的融合细胞中生成与抗原的结合力强、且为IgG抗体的融合细胞的比例变高，因此细胞融合后筛选生成结合力强的抗体的融合细胞的操作量进一步大幅度减少。
附图说明
图1是表示本发明中的基本的细胞筛选方法的概况的第1图。
图2是表示本发明中的基本的细胞筛选方法的概况的第2图。
图3是表示本发明中的基本的细胞筛选方法的概况的第3图。
图4是本发明中的细胞筛选装置的示意图及实施例1、2中使用的细胞筛选装置的示意图。
图5是图4所示的XX’剖面图。
图6是表示作为本发明中使用的微细孔的一个例子的、与微细孔的平面形状内接的最大圆的直径大于微细孔中固定的细胞的直径的2倍的情况的图。
图7是表示作为本发明中使用的微细孔的一个例子的、与微细孔的平面形状内接的最大圆的直径小于微细孔中固定的细胞的直径的情况的图。
图8是表示作为本发明中使用的微细孔的一个例子的、与微细孔的平面形状内接的最大圆的直径比微细孔中固定的细胞大1～2倍左右且微细孔的深度为微细孔中固定的细胞的直径以下的情况的图。
图9是表示作为本发明中所用的交流电压的波形的一个例子的、正弦波的代表性波形的图，横轴(X轴)表示时间，纵轴(Y轴)表示电压。
图10是表示作为本发明中所用的交流电压的波形的一个例子的、三角波的代表性波形的图，横轴(X轴)表示时间，纵轴(Y轴)表示电压。
图11是表示作为本发明中所用的交流电压的波形的一个例子的、梯形波的代表性波形的图，横轴(X轴)表示时间，纵轴(Y轴)表示电压。
图12是表示作为本发明中所用的交流电压的波形的一个例子的、矩形波的代表性波形的图，横轴(X轴)表示时间，纵轴(Y轴)表示电压。
图13是表示通过负的介电电泳力的大小筛选本发明中的细胞表面的特定物质与前述识别分子的结合力的大小的方法的概况的图。
图14是表示用于制作本实施例中采用的带微细孔的绝缘体一体型下部电极的一般的光刻法和蚀刻方法的概略图。
图15是实施例1中所示的、时间经过引起的抗体固定化聚苯乙烯珠的微细孔保持率与固定化抗体浓度的关系的图表，横轴(X轴)表示施加电压(单位为伏特(V))，纵轴(Y轴)表示珠保持率(％)。
图16是实施例2中所示的、施加电压引起的抗体固定化聚苯乙烯珠的微细孔保持率与固定化抗体浓度的关系的图表，横轴(X轴)表示施加电压(单位为伏特(V))，纵轴(Y轴)表示珠保持率(％)。
图17是本发明中的沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用重力时的示意图。
图18是本发明中的沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用磁力时的示意图。
图19是本发明中的沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用送液力时的示意图。
图20是表示本发明中的连续地进行细胞筛选和细胞融合的细胞筛选方法的概况的第1图。
图21是表示本发明中的连续地进行细胞筛选和细胞融合的细胞筛选方法的概况的第2图。
图22是表示本发明中的连续地进行细胞筛选和细胞融合的细胞筛选方法的概况的第3图。
图23是表示本发明中的连续地进行细胞筛选和细胞融合的细胞筛选方法的概况的第4图。
图24是表示本发明中的连续地进行细胞筛选和细胞融合的细胞筛选方法的概况的第5图。
图25是表示本发明中的连续地进行细胞筛选和细胞融合的细胞筛选方法的概况的第6图。
图26是表示本发明中的连续地进行细胞筛选和细胞融合的细胞筛选方法的概况的第7图。
图27是表示本发明中的连续地进行细胞筛选和细胞融合的细胞筛选方法中、在沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用特定的力的状态下进行细胞融合的概况的第1图。
图28是表示本发明中的连续地进行细胞筛选和细胞融合的细胞筛选方法中、在沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用特定的力的状态下进行细胞融合的概况的第2图。
图29是表示本发明中的连续地进行细胞筛选和细胞融合的细胞筛选方法中、在沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用特定的力的状态下进行细胞融合的概况的第3图。
图30是表示本发明中的连续地进行细胞筛选和细胞融合的细胞筛选方法中、在沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用特定的力的状态下进行细胞融合的概况的第4图。
图31是表示本发明中的连续地进行细胞筛选和细胞融合的细胞筛选方法中、在沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用特定的力的状态下进行细胞融合的概况的第5图。
图32是表示本发明中的连续地进行细胞筛选和细胞融合的细胞筛选方法中、在沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用特定的力的状态下进行细胞融合的概况的第6图。
图33是表示本发明中的连续地进行细胞筛选和细胞融合的细胞筛选方法中、在沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用特定的力的状态下进行细胞融合的概况的第7图。
图34是表示本发明中的连续地进行细胞筛选和细胞融合的细胞筛选方法中、在沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用特定的力的状态下进行细胞融合的概况的第8图。
附图标记说明
1：细胞筛选区域
2：细胞溶液
3：导电线
4：电源
5：第1交流电源
6：第2交流电源
7：电源切换机构
8：绝缘体
9：微细孔
10：正的介电电泳力
11：电力线的集中部位
12：电力线
13：细胞筛选容器
14：上部电极
15：下部电极
16：间隔物
17：细胞表面的特定物质与识别分子没有结合或者结合力弱的细胞
18：细胞表面的特定物质与识别分子结合的细胞
19：导入口
20：排出口
21：负的介电电泳力
22：细胞表面的特定物质与识别分子的结合力
23：ITO
24：Pyrex(注册商标)玻璃
25：抗蚀剂
26：曝光用光掩模
27：曝光
28：带微细孔的绝缘体一体型下部电极
29：导入流路
30：排出流路
31：峰值电压
32：显影液
33：特定物质
34：识别分子
35：直流脉冲电源
36：重力
37：磁力
38：磁性体
39：送液力
40：抗体
41：抗原
42：小鼠脾脏细胞
43：小鼠癌细胞
44：抗IgG抗体
45：磁性微粒
46：阳离子性聚合物
47：小鼠脾脏细胞的细胞表面的抗体中IgG型的抗体
48：小鼠脾脏细胞中表面存在IgG型的抗体的比例少的小鼠脾脏细胞
49：小鼠脾脏细胞中表面存在IgG型的抗体的比例多的小鼠脾脏细胞
50：细胞
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行详细说明。另外，本发明并不仅限于这些实施例，可以在不脱离发明主旨的范围内作出任意变更。
实施例
(实施例1)
图4示出了实施例1中使用的细胞筛选装置的示意图。大致划分的话，细胞筛选装置由细胞筛选容器(13)和电源(4)构成。细胞筛选容器如图4所示具有如下结构：在上部电极(14)与下部电极(15)之间配置间隔物(16)，以阵列状形成有多个微细孔的绝缘体(8)被夹在间隔物和下部电极间。另外如后所述，微细孔通过一般的光刻法和蚀刻形成于配置在下部电极(15)上的绝缘体中。
上部电极和下部电极使用在纵70mm×横40mm×厚1mm的Pyrex(注册商标)基板上由ITO形成膜(膜厚150nm)的电极。间隔物使用中央挖掉纵20mm×横20mm的形状的纵40mm×横40mm×厚1.5mm的硅橡胶片。另外，如图4所示，为了向细胞筛选容器中导入、排出细胞，间隔物中设置有导入细胞的导入流路(29)及与其连通的导入口(19)、和排出细胞的排出流路(30)及与其连通的排出口(20)。
另外，通过图14所示的利用光刻法和蚀刻的方法，制作与下部电极一体地形成的、具有多个微细孔的绝缘体(8)。
首先，按照5μm的膜厚用旋涂器在形成有ITO(23)膜的Pyrex(注册商标)玻璃(24)的ITO成膜面上涂布抗蚀剂(25)，自然干燥45分钟后，用热板进行预烘焙(80℃、15分钟)。抗蚀剂使用二甲苯系的负型抗蚀剂。接着，对纵30mm×横30mm的区域，用描绘有微细孔与微细孔的纵和横的间隔为20μm、且以纵1500个×横1500个的阵列状排列的直径φ8.5μm的微细孔图案的曝光用光掩模(26)，利用UV曝光机对抗蚀剂进行曝光(27)，用显影液(32)进行显影。曝光时间和显影时间按照微细孔的深度与抗蚀剂的膜厚相等即为5μm的方式进行调整，使ITO露出到微细孔的底面。显影后，用热板进行后烘焙(115℃、30分钟)，使抗蚀剂坚硬。
将这样制作的上部电极(14)、间隔物(16)、带微细孔的绝缘体一体型下部电极(28)如图5那样层叠并压接。图5是图4所示的细胞筛选容器的XX’剖面图。作为间隔物的硅橡胶片的表面具有粘结性，通过压接使得各部件密合，能够将含有细胞的细胞融合液A不会渗漏地装入到细胞筛选容器中。间隔物中挖空的面积为纵20mm×横20mm，因此该空间中存在的微细孔的数目为约100万个。
另外，在微细孔的底面的下部电极上固定通过以下的处理使雌二醇(E2)与牛血清白蛋白(BSA)结合而得到的E2-BSA抗原。即，将带微细孔的绝缘体一体型下部电极在E2-BSA抗原溶液(2.0μg/mL)中浸渍约12小时，使微细孔的底面的下部电极物理吸附E2-BSA抗原后，用纯水洗涤。接着，作为用于防止抗体的非特异性吸附进行的封闭，将带微细孔的绝缘体一体型下部电极在脱脂乳1％PBS溶液(含有0.01重量％的NaNO3)中浸渍约12小时，对微细孔的底面的下部电极用脱脂乳封闭后，用纯水洗涤。另外，通过该处理使形成微细孔的绝缘体也物理吸附E2-BSA抗原、脱脂乳中的成分并固定，在实际的操作中，如后所述，将聚苯乙烯珠装入微细孔中后进行抗原抗体反应，因此即使绝缘体表面固定有E2-BSA抗原，对本实施例也没有太大影响。
另外，对电极间施加电压的电源(4)由用于对上部电极和下部电极的电极间施加第1交流电压的第1交流电源(5)和用于施加第2交流电压的第2交流电源(6)、及用于施加直流脉冲电压的细胞融合用电源(35)构成，第1交流电源、第2交流电源、细胞融合用电源可以通过电源切换机构(7)适当切换而使用。另外，第1电源为细胞固定用电源，第2电源为细胞取出用电源。另外，这次的实施例中第1交流电源和第2交流电源使用NFCorporation制造的WF1966，细胞融合用电源使用NEPA GENECo.，Ltd.制造的LF101。
使用由上述带微细孔的绝缘体一体型下部电极构成的细胞筛选装置，进行后述的实验。另外，这次，作为细胞筛选的模型体系，使用直径6.0μm的聚苯乙烯珠(ポリサイエンス公司(Polysciences，Inc)制造、ポリビ一ズ(Polybead、注册商标)聚苯乙烯微球)。
对于上述聚苯乙烯珠，使0、0.1、1.0、2.0μg/mL的各浓度的抗E2-小鼠抗体溶液与聚苯乙烯珠表面接触而发生物理吸附后进行封闭，将抗E2-小鼠抗体固定。抗E2-小鼠抗体的固定化和封闭的方法通过与前述的在微细孔的底面的下部电极上固定E2-BSA抗原及封闭同样的方法进行。这里，可以推测，与越高浓度的抗E2-小鼠抗体溶液接触的聚苯乙烯珠，越多的抗E2-小鼠抗体固定在聚苯乙烯珠的表面。另外，以下将表面固定有该抗E2-小鼠抗体的聚苯乙烯珠称为抗体固定化聚苯乙烯珠。
从间隔物的导入口将上述以各抗体浓度固定抗体的抗体固定化聚苯乙烯珠的悬浮液600μL(珠浓度：约1.65×106个/mL)用1mL容量的分注器分别注入到细胞筛选区域中。例如，抗E2-小鼠抗体溶液的浓度为2.0μg/mL，导入到细胞筛选区域中的抗体固定化聚苯乙烯珠的数目为约9.91×105个，导入与细胞筛选区域中存在的微细孔数目即约100万个大致相同数量的抗体固定化聚苯乙烯珠。然后，静置5分钟左右，通过重力沉降使抗体固定化聚苯乙烯珠进入到细胞筛选区域中存在的微细孔的约37％中。即，最终进入到微细孔中的抗体固定化聚苯乙烯珠的数目约为3.68×105个。除此以外的抗体固定化聚苯乙烯珠残留在微细孔与微细孔之间的绝缘体上。
这里，在本实施例1及后述的实施例2中，将0、0.1、1.0、2.0μg/mL的各浓度的抗体固定化聚苯乙烯珠导入到细胞筛选区域中时，以最终微细孔内残留的抗体固定化聚苯乙烯珠的数目(即，原来进入微细孔内的抗体固定化聚苯乙烯珠数)为基准，计算以下所示的保持率(保持率＝微细孔中保持的抗体固定化聚苯乙烯珠数/原来进入微细孔内的抗体固定化聚苯乙烯珠数×100)。
另外，数出细胞筛选区域的十分之一的区域(细胞筛选区域内的任意的6mm×6mm的区域，本区域内存在约10万个微细孔)的微细孔中保持的抗体固定化聚苯乙烯珠的数目，将其乘以10倍，求出进入微细孔内的抗体固定化聚苯乙烯珠的数目(以下，实施例2也同样)。
接着，在室温下静置约40分钟，使进入微细孔中的抗体固定化聚苯乙烯珠与微细孔的底面接触，使抗体固定化聚苯乙烯珠的表面的抗体与微细孔的底面固定的抗原发生抗原抗体反应。接着，通过第2交流电源对电极间分别施加电压2.5、5.0、7.5、10、15Vpp、频率3MHz的交流电压，观察1分钟后的抗体固定化聚苯乙烯珠的状态。另外，聚苯乙烯珠与细胞不同，第2交流电压的频率高时(例如1MHz～3MHz)，作用负的介电电泳力，第2交流电压的频率低时(例如1kHz～10kHz)，作用正的介电电泳力。
此时，在用没有固定抗体的抗体固定化聚苯乙烯珠(用抗E2-小鼠抗体的浓度为0的抗E2-小鼠抗体溶液处理过的抗体固定化聚苯乙烯珠)的情况下，随着时间的经过，相对于原来进入微细孔内的抗体固定化聚苯乙烯珠，大部分的抗体固定化聚苯乙烯珠从微细孔中脱离，施加7.5V电压1分钟后，相对于原来进入微细孔内的抗体固定化聚苯乙烯珠(约3.45×105个)，只有0.7％(约2.42×103个)的抗体固定化聚苯乙烯珠保持在微细孔中。
另外，在用抗E2-小鼠抗体溶液的浓度为0.1μg/mL的较低浓度的抗E2-小鼠抗体溶液处理过的抗体固定化聚苯乙烯珠的情况下，施加7.5V电压1分钟后，相对于原来进入微细孔内的抗体固定化聚苯乙烯珠(约3.12×105个)，约5.0％(约1.56×104个)的抗体固定化聚苯乙烯珠保持在微细孔中。另外，如图15所示，随着提高施加电压，抗体固定化聚苯乙烯珠从微细孔中脱离的比例增加。
进而，在用抗E2-小鼠抗体溶液的浓度为2.0μg/mL的较高浓度的抗E2-小鼠抗体溶液处理过的抗体固定化聚苯乙烯珠的情况下，施加7.5V电压1分钟后，相对于原来进入微细孔内的抗体固定化聚苯乙烯珠(约3.68×105个)，40％(约1.47×105个)的抗体固定化聚苯乙烯珠保持在微细孔中。另外，如图15所示，随着提高施加电压，抗体固定化聚苯乙烯珠从微细孔中脱离的比例增加。
根据以上的结果可以认为，抗体固定化聚苯乙烯珠的表面固定越多的抗E2-小鼠抗体，则与微细孔的底面的抗原的结合力越强，因此通过第2交流电源的电压的大小，就能够简单地并且以30秒左右的短时间筛选抗体固定化聚苯乙烯珠的表面固定的抗体与微细孔的底面固定的抗原的结合力的大小。
(实施例2)
从间隔物的导入口将实施例1中所用的用0、0.1、0.5、2.0μg/mL的各浓度的抗E2-小鼠抗体溶液将抗E2抗体固定在表面的抗体固定化聚苯乙烯珠的悬浮液600μL(珠浓度：约1.65×106个/mL)用1mL容量的分注器分别导入细胞筛选区域后，静置约5分钟，使抗体固定化聚苯乙烯珠发生重力沉降，进而在室温下静置约40分钟，使进入微细孔中的抗体固定化聚苯乙烯珠与微细孔的底面接触，使抗体固定化聚苯乙烯珠的表面的抗体与微细孔的底面固定的抗原发生抗原抗体反应。接着，通过第2交流电源，对电极间施加电压2.5Vpp、频率3MHz的交流电压，观察相对于时间经过的抗体固定化聚苯乙烯珠的移动。
此时，在用没有固定抗体的抗体固定化聚苯乙烯珠(用抗E2-小鼠抗体的浓度为0的抗E2-小鼠抗体溶液处理过的抗体固定化聚苯乙烯珠)的情况下，随着时间的经过，相对于原来进入微细孔内的抗体固定化聚苯乙烯珠，很多抗体固定化聚苯乙烯珠从微细孔中脱离，1分钟后，相对于原来进入微细孔内的抗体固定化聚苯乙烯珠(约3.32×105个)，7.6％(约2.52×104个)的抗体固定化聚苯乙烯珠残留保持在微细孔中。另外，如图16所示，随着电压施加时间的经过，抗体固定化聚苯乙烯珠从微细孔脱离的比例增加。
另外，在用抗E2-小鼠抗体溶液的浓度为0.1μg/mL的较低浓度的抗E2-小鼠抗体溶液处理过的抗体固定化聚苯乙烯珠的情况下，1分钟后相对于原来进入微细孔内的抗体固定化聚苯乙烯珠(约3.41×105个)，37.5％(约1.28×105个)的抗体固定化聚苯乙烯珠保持在微细孔中。另外，如图16所示，随着电压施加时间的经过，抗体固定化聚苯乙烯珠从微细孔脱离的比例增加。
进而，在用抗体固定化聚苯乙烯珠中抗E2-小鼠抗体溶液的浓度为2.0μg/mL的比较高浓度的抗E2-小鼠抗体溶液处理过的抗体固定化聚苯乙烯珠的情况下，1分钟后相对于原来进入微细孔内的抗体固定化聚苯乙烯珠(约3.83×105个)，多达55.6％(约2.13×105个)的抗体固定化聚苯乙烯珠保持在微细孔中。另外，如图16所示，随着电压施加时间的经过，抗体固定化聚苯乙烯珠从微细孔脱离的比例增加。
根据以上的结果可以认为，与实施例1同样地，抗体固定化聚苯乙烯珠的表面固定越多的抗E2-小鼠抗体，则与微细孔的底面的抗原的结合力越强，因此通过第2交流电源的电压施加时间，就能够简单地并且以30秒左右的短时间筛选抗体固定化聚苯乙烯珠的表面固定的抗体与微细孔的底面固定的抗原的结合力的大小。
(实施例3)
使用与实施例1同样的细胞筛选装置，进行表面存在特定的抗体的脾脏细胞的筛选。细胞使用没有免疫的小鼠脾脏细胞A、和用E2抗原免疫了的小鼠脾脏细胞B。另外，用E2抗原免疫了的小鼠脾脏细胞B中存在E2抗体位于其细胞表面的细胞(以下，称为抗体存在细胞)。本实施例3为如下实例：通过用于决定负的介电电泳力的大小的第2交流电源的交流电压的大小，来识别该抗体存在细胞中存在的抗体与微细孔的底面固定的抗原的抗原抗体反应的结合力，从而筛选抗体存在细胞。
首先，将小鼠脾脏细胞A及小鼠脾脏细胞B分别悬浮到300mM浓度的甘露糖醇水溶液中，按照0.7×106个/mL的密度调整细胞悬浮液。
接着，用1mL容量的分注器将上述小鼠脾脏细胞A的细胞悬浮液600μL从间隔物的导入口注入。另外，对该细胞悬浮液中含有的小鼠脾脏细胞A的细胞数进行计数，结果约为4.11×105个。通过第1交流电源对电极间施加电压10Vpp、频率3MHz的矩形波交流电压，结果在2～3秒左右的非常短的时间内，以阵列状形成的多个微细孔中，约38％的微细孔实现每1个孔中大致固定了1个小鼠脾脏细胞A。即，微细孔中固定的小鼠脾脏细胞A的数目约为3.80×105个。
另外，与实施例1同样地，数出细胞筛选区域的十分之一的区域(细胞筛选区域内的任意的6mm×6mm的区域，本区域内约存在10万个微细孔)的微细孔中保持的脾脏细胞的数目，将其乘以10倍，求出微细孔中固定的脾脏细胞的数目(以下，通过同样的方法求出本实施例中的微细孔中固定的脾脏细胞的数目)。
接着，使小鼠脾脏细胞A与微细孔的底面接触，在室温下静置约40分钟。其间，如果小鼠脾脏细胞A的表面存在E2抗体，则与微细孔的底面固定的E2抗原发生抗原抗体反应而结合，如果小鼠脾脏细胞A的表面不存在E2抗体，则不与微细孔的底面固定的E2抗原发生抗原抗体反应而不结合。接着，通过第2交流电源对电极间施加电压5Vpp、频率10kHz的交流电压30秒钟，作用负的介电电泳力，结果观察到几乎全部的小鼠脾脏细胞A从微细孔中脱离的状态。接着，用1mL容量的分注器将300mM的浓度的甘露糖醇水溶液700μL从间隔物的导入口注入，将从该微细孔脱离的小鼠脾脏细胞A从排出口排出。然后，对微细孔内残留的细胞数进行计数，结果约为8.2×102个。即，导入到本细胞筛选装置中的小鼠脾脏细胞A中约0.2％(＝8.2×102/3.80×105×100)的小鼠脾脏细胞A保持在微细孔中。这可以推测，没有免疫的小鼠脾脏细胞A中几乎不存在其细胞表面存在E2抗体的抗体存在细胞，不与微细孔的底面固定的E2抗原发生抗原抗体反应，因此几乎全部的小鼠脾脏细胞A从微细孔中脱离。
接着，用1mL容量的分注器将上述小鼠脾脏细胞B的细胞悬浮液600μL从间隔物的导入口注入。另外，对该细胞悬浮液中含有的小鼠脾脏细胞B的细胞数进行计数，结果约为3.98×105个。通过第1交流电源对电极间施加电压10Vpp、频率3MHz的矩形波交流电压，结果在2～3秒左右的非常短的时间内，以阵列状形成的多个微细孔中，约36％的微细孔实现每1个孔中大致固定了1个小鼠脾脏细胞B。即，微细孔中固定的小鼠脾脏细胞B的数目为约3.62×105个。
接着，使小鼠脾脏细胞B与微细孔的底面接触，在室温下静置约40分钟。其间，如果小鼠脾脏细胞B的表面存在抗E2抗体，则与微细孔的底面固定的E2抗原发生抗原抗体反应而结合，如果小鼠脾脏细胞B的表面不存在E2抗体，则不与微细孔的底面固定的E2抗原发生抗原抗体反应而不结合。接着，通过第2交流电源对电极间施加电压5Vpp、频率10kHz的交流电压30秒钟，作用负的介电电泳力，结果观察到一些小鼠脾脏细胞B从微细孔脱离的状态。接着，用1mL容量的分注器将300mM的浓度的甘露糖醇水溶液700μL从间隔物的导入口注入，将从该微细孔中脱离的小鼠脾脏细胞B从排出口排出。然后，对微细孔内残留的细胞数进行计数，结果为约1.20×104个。即，导入到本细胞筛选装置中的小鼠脾脏细胞B中约3.3％(＝1.20×104/3.62×105×100)的小鼠脾脏细胞B保持在微细孔中。这可以推测，约存在3.3％的在电压5Vpp、频率10kHz的负的介电电泳力下不游离的通过抗原抗体反应而强力结合的小鼠脾脏细胞B。
接着，同样地用1mL容量的分注器将上述小鼠脾脏细胞B的细胞悬浮液600μL从间隔物的导入口注入。另外，对该细胞悬浮液中含有的小鼠脾脏细胞B的细胞数进行计数，结果为约4.18×105个。通过第1交流电源对电极间施加电压10Vpp、频率3MHz的矩形波交流电压，结果在2～3秒左右的非常短的时间内，以阵列状形成的多个微细孔中，约39％的微细孔实现每1个孔中大致固定了1个小鼠脾脏细胞A。即，微细孔中固定的小鼠脾脏细胞A的数目约为3.89×105个。
接着，使小鼠脾脏细胞B与微细孔的底面接触，在室温下静置约40分钟。其间，如果小鼠脾脏细胞B的表面存在E2抗体，则与微细孔的底面固定的E2抗原发生抗原抗体反应而结合，如果小鼠脾脏细胞B的表面不存在E2抗体，则不与微细孔的底面固定的E2抗原发生抗原抗体反应而不结合。接着，通过第2交流电源对电极间施加电压8Vpp、频率10kHz的交流电压30秒钟，作用负的介电电泳力，结果观察到一些小鼠脾脏细胞B从微细孔中脱离的状态。接着，用1mL容量的分注器将300mM的浓度的甘露糖醇水溶液700μL从间隔物的导入口注入，将从该微细孔脱离的小鼠脾脏细胞B从排出口排出。然后，对微细孔内残留的细胞数进行计数，结果约为4.67×103个。即，导入到本细胞筛选装置中的小鼠脾脏细胞B中约1.2％(＝4.67×103/3.89×105×100)的小鼠脾脏细胞B保持在微细孔中。这可以推测，约存在1.2％的通过比电压8Vpp、频率10kHz的负的介电电泳力强的抗原抗体反应而结合的小鼠脾脏细胞B。
根据以上内容可以确认，通过产生负的介电电泳力的第2交流电源的交流电压的大小，来识别位于表面的抗体与抗原的结合力，从而筛选表面存在抗体的细胞。
(比较例1)
与实施例3同样地进行表面存在特定的抗体的脾脏细胞的筛选。细胞使用没有免疫的小鼠脾脏细胞A、和用E2抗原免疫了的小鼠脾脏细胞B。本比较例为如下实例：使小鼠脾脏细胞A及小鼠脾脏细胞B中存在的抗体存在细胞与生物素化E2-BSA发生抗原抗体反应后，与链霉亲和素磁珠(MACS公司制造μMACS链霉亲和素试剂盒)反应(生物素-亲和素结合)，从而选择性地使抗体存在细胞与磁珠结合，用磁体筛选捕集与抗体存在细胞结合的磁珠，从而来筛选表面存在E2抗体的小鼠脾脏细胞。
与实施例3同样地，使用没有免疫的小鼠脾脏细胞A和用E2抗原免疫了的小鼠脾脏细胞B，分别悬浮到缓冲液(MACS公司制造μMACS链霉亲和素试剂盒)中，按照2.0×108个/mL的密度调整细胞悬浮液。接着，将调整后的各脾脏细胞与生物素化E2-BSA溶液混合而发生抗原抗体反应。此时，与生物素化E2-BSA溶液混合的小鼠脾脏细胞A的数目约为1.31×108个，小鼠脾脏细胞B的数目约为1.55×108个。其间，如果小鼠脾脏细胞的表面存在E2抗体，则与生物素化E2-BSA的E2抗原发生抗原抗体反应而结合，如果小鼠脾脏细胞的表面不存在E2抗体，则不与生物素化E2-BSA的E2抗原发生抗原抗体反应而不结合。
接着，将介由抗原抗体反应而生物素化的小鼠脾脏细胞与链霉亲和素磁珠混合，而产生生物素-亲和素结合。接着，用磁体将磁珠与细胞悬浮液分离。然后，数出与磁珠一起回收的小鼠脾脏细胞的数目，结果小鼠脾脏细胞A为约3.91×105个，小鼠脾脏细胞B的数目约为4.95×106个。另外，将与磁珠一起回收的小鼠脾脏细胞用缓冲液(MACS公司制μMACS链霉亲和素试剂盒)悬浮而得到的细胞悬浮液滴加到血细胞计数板上，从而对与磁珠一起回收的小鼠脾脏细胞的数目进行计数。
根据以上内容，在上述小鼠脾脏细胞A的情况下，约0.3％(＝3.91×105/1.31×108×100)的小鼠脾脏细胞A保持在磁珠上。这可以推测，没有免疫的小鼠脾脏细胞A中基本不含其细胞表面存在抗E2抗体的抗体存在细胞，因此不与生物素化E2抗原发生抗原抗体反应，因此，与链霉亲和素磁珠不产生生物素-亲和素结合，大部分的小鼠脾脏细胞A无法通过磁珠而回收。
另外，在上述小鼠脾脏细胞B的情况下，约3.2％(＝4.95×106/1.55×108×100)的小鼠脾脏细胞B保持在磁珠上。这可以推测，存在约3.2％的与生物素化E2抗原通过抗原抗体反应而结合的小鼠脾脏细胞B。
这样，本比较例中虽然能够通过是否与磁珠结合来筛选小鼠脾脏细胞，但无法根据磁珠上固定的抗原与脾脏细胞的表面存在的抗体的结合力筛选脾脏细胞。
(实施例4)
使用与实施例1同样的细胞筛选装置，使用小鼠脾脏细胞(直径约6μm)和小鼠癌细胞(直径约10μm)，对未利用微细孔进行小鼠脾脏细胞的筛选而进行细胞融合的情况、和利用微细孔进行小鼠脾脏细胞的筛选后进行细胞融合的情况进行了比较。以下示出实验操作，其中，全部实验器具和试剂类、细胞筛选容器的构成构件均灭菌后使用。另外，未利用微细孔进行小鼠脾脏细胞的筛选而进行细胞融合的细胞筛选装置使用实施例1的细胞筛选装置中微细孔的底面的下部电极未固定E2-BSA抗原的细胞筛选装置。
作为小鼠脾脏细胞，使用通过腹腔内注射E2-BCP(BCP：Blue Carrier Immunogenic Protein)复合体10次以上、每隔2周重复免疫的小鼠的脾脏细胞。以下，叙述从小鼠取出脾脏细胞的步骤。
首先，在密闭瓶中装入Kimtowel，用七氟烷(sevoflurane)(丸石制药制)使小鼠安乐死。将70％消毒用乙醇充分散布到小鼠上后，在洁净台内的解剖台上用注射针固定。接着用镊子将外皮掀起，用解剖用剪刀切入，首先切取外皮。接着用另外的新剪刀切开内皮，露出脾脏，一边用镊子将脾脏拉出到体外，一边用剪刀从小鼠的身体切出脾脏。预先在50mL离心管中装入10mL含有10％FBS(牛血清)的动物细胞培养用培养基(以下，称为培养基A)，将脾脏转移到其中并摇动以清洗表面。接着，将脾脏转移到φ9cmスミロン制皿的盖上，用2根镊子，除去摘出的脾脏周围附着的脂肪。在φ9cmスミロン制皿中加入10mL的培养基A，在网眼为40μm的细胞过滤网(Cell Strainer)(Falcon制)中将脾脏用新剪刀切割成4～5小片，用5mL泰尔茂注射器的尾部的平坦部将脾脏充分捣烂。细胞过滤网和泰尔茂注射器的尾部附着的脾脏细胞用培养基A冲洗。将皿中含有脾脏细胞的悬浮液转移到50mL离心管中，将皿用培养基A洗涤2次，洗涤液也混合到离心管内。将含有脾脏细胞的悬浮液在1500rpm、室温下离心分离5分钟后，用抽吸器抽吸上清，将脾脏细胞的颗粒弄碎。接着将弄碎的脾脏细胞悬浮到1mL的FBS中后，添加9mL红细胞破碎液(SIGMA制)并充分混合，在室温下静置3分钟，进行红细胞的破碎。再次将含有脾脏细胞的悬浮液在1500rpm、室温下离心分离5分钟后，用抽吸器抽吸上清，将细胞团块弄碎后，悬浮到20mL的培养基A中。用细胞过滤网，将含有脾脏细胞的悬浮液过滤到50mL离心管中，将该含有脾脏细胞的悬浮液中的10mL在1500rpm、室温下离心分离5分钟后，用抽吸器抽吸上清，将脾脏细胞的颗粒弄碎。立即将弄碎的脾脏细胞悬浮到10mL的无血清动物细胞培养用的培养基(以下，称为培养基B)中后，在1500rpm、室温下离心分离5分钟，用抽吸器抽吸上清后，将脾脏细胞的颗粒弄碎。接着，将脾脏细胞悬浮到含有300mM的甘露糖醇、0.1mM的CaCl2、0.2mM的MgCl2、0.1mg/mL的BSA的20mL的细胞融合液(以下，称为细胞融合液A)中后，在1500rpm、室温下离心分离5分钟，用抽吸器抽吸上清后，将脾脏细胞的颗粒弄碎。再次将脾脏细胞悬浮到少量的细胞融合液A中，用细胞过滤网过滤到50mL Falcon管内，用细胞融合液A稀释，准备了含有脾脏细胞的最终密度调整至0.8×106个/mL的小鼠脾脏细胞的细胞融合液A。另外，以300mM的甘露糖醇为主成分的细胞融合液A与细胞的浸透压基本等渗。
接下来叙述准备小鼠癌细胞的步骤。作为小鼠癌细胞的SP2/0(以下，称为骨髓瘤细胞。)通常使用按照1×106个/mL以下的密度悬浮到φ15cm悬浮培养用皿中的培养基A中、在37℃、5％的CO2孵化器内继代培养得到的细胞。在细胞融合的前一天，将骨髓瘤细胞悬浮到培养基A中，使骨髓瘤细胞的密度达到2.0×105个/mL，在φ15cm悬浮培养用皿中加入液量40mL的培养基A作为骨髓瘤培养液，利用总计10个皿进行培养。将骨髓瘤培养液从皿转移到离心管中，以1000rpm离心分离5分钟后，用抽吸器抽吸上清，将骨髓瘤的细胞团块弄碎。立即将50mL的培养基B添加到各管中并分散，使骨髓瘤细胞悬浮，收集到1根管中后，再次在1000rpm、室温下离心分离5分钟，用抽吸器抽吸上清，将骨髓瘤细胞的颗粒弄碎。将20mL的培养基B添加到各管中并分散，使骨髓瘤细胞悬浮，收集到1根管中后，再次在1000rpm、室温下离心分离5分钟，用抽吸器抽吸上清，将骨髓瘤细胞的颗粒弄碎。接着，将骨髓瘤细胞再悬浮到40mL的细胞融合液A中，在1000rpm、室温下离心分离5分钟，用抽吸器抽吸上清，将骨髓瘤细胞的颗粒弄碎。再次将骨髓瘤细胞悬浮到少量的细胞融合液A中，用细胞过滤网过滤到50mL Falcon管内，用细胞融合液A稀释，准备了含有最终密度调整至6.7×106个/mL的骨髓瘤细胞的细胞融合液A。
接着分别使用另外的融合容器，通过以下的(方法A)、(方法B)的方法进行细胞筛选和细胞融合。
(方法A)
使用如下的细胞筛选装置进行细胞融合：在实施例1的细胞筛选装置中使用微细孔的底面的下部电极上未固定E2-BSA抗原的细胞筛选容器的细胞筛选装置。在细胞筛选容器中将600μL(损失部分也考虑在内的话，小鼠脾脏细胞数为约50万个)上述含有小鼠脾脏细胞的细胞融合液A导入到细胞筛选区域，在细胞筛选区域内使脾脏细胞充分沉降。接着，通过第1交流电源对电极间施加电压10Vpp、频率3MHz的矩形波交流电压，对于约100万个微细孔中大致一半的50万个微细孔，以阵列状在大致每1个微细孔中固定了1个小鼠脾脏细胞。接着，将600μL(细胞的损失部分也考虑在内的话，骨髓瘤细胞数为约400万个)含有骨髓瘤细胞的细胞融合液A导入到细胞筛选区域。这种情况下，由于将小鼠脾脏细胞数的约8倍多的骨髓瘤细胞导入到了细胞筛选区域，因此推测，变成微细孔中固定的小鼠脾脏细胞上至少接触1个骨髓瘤细胞的状态。接着，通过电源切换机构将电源切换到直流脉冲电源(NEPA GENE Co.，Ltd.制、LF101)，对电极间施加1次电压100V、脉冲宽30μs的直流脉冲电压，进行细胞融合。
(方法B)
使用如下的细胞筛选装置进行细胞筛选和细胞融合：与实施例1的细胞筛选装置同样的、使用在微细孔的底面的下部电极上固定有E2-BSA抗原的细胞筛选容器的细胞筛选装置。准备如下细胞筛选容器：将600μL(小鼠脾脏细胞数约50万个)上述含有小鼠脾脏细胞的细胞融合液A导入到细胞筛选区域，在细胞筛选区域内使小鼠脾脏细胞充分沉降。接着，对细胞筛选容器的电极间通过第1交流电源施加电压10Vpp、频率3MHz的矩形波交流电压，对于约100万个微细孔中大致一半的50万个微细孔，以阵列状在大致每1个微细孔中固定了1个小鼠脾脏细胞。接着，将细胞筛选装置静置约2分左右，使微细孔的底面的下部电极上固定的E2-BSA与小鼠脾脏细胞表面存在的E2抗体进行抗原抗体反应。接着，通过电源切换机构切换到第2交流电源，对细胞筛选容器施加第2交流电压(电压15Vpp、频率10kHz的矩形波交流电压)，将未进行抗原抗体反应的小鼠脾脏细胞取出到微细孔附近的绝缘体上，从而进行细胞筛选。接着，在细胞筛选容器中，将600μL(小鼠骨髓瘤细胞数为约400万个)含有小鼠骨髓瘤细胞的细胞融合液A导入到细胞筛选区域，通过电源切换机构切换到直流脉冲电源，对电极间施加1次电压100V、脉冲宽30μs的直流脉冲电压，进行细胞融合。
将通过上述(方法A)、(方法B)进行了细胞融合的细胞悬浮液直接静置15分钟后，将细胞筛选容器内的细胞悬浮液用HAT培养基(成分为H：次黄嘌呤(hypoxanthine)、A：氨基蝶呤(aminopterine)、T：胸腺嘧啶核苷(thymidine)的培养基)稀释，转移到96孔板(Falcon制)中后，用CO2孵化器进行融合细胞的培养。另外，HAT培养基为仅选择性增殖融合细胞的培养基。6天后对各孔的融合细胞的集落数进行计数，算出融合再生概率。这里，融合再生概率是指各融合容器的“通过细胞融合生成的融合细胞的集落数/导入的小鼠脾脏细胞数”。进而将数出了集落数的HAT培养基全部更换，7天后通过ELISA法判断各孔的培养上清中有无具有E2亲和性的抗体。
ELISA法的评价方法如下进行。将E2-BSA固定到ELISA板上后，用1％脱脂乳封闭。然后与融合细胞的培养上清反应，使其与碱性磷酸酶标记抗小鼠IgG抗体结合。将未反应的酶标记抗体进行B/F分离后，分注作为显色底物的对硝基苯基磷酸(PNPP)，测定405nm下的荧光强度。将进行测定的孔中的、荧光强度为比背景明显高的值的孔判定为E2抗体阳性孔，算出E2抗体阳性孔率。这里，E2抗体阳性孔率是指各细胞筛选容器的“判定为E2抗体阳性的孔数/通过细胞融合生成的融合细胞的集落数”。如上述那样算出的各细胞筛选容器的融合再生概率和E2抗体阳性孔率如下所示。
(方法A)融合再生概率：16/10000、E2抗体阳性孔率：0.8％
(方法B)融合再生概率：7/10000、E2抗体阳性孔率：1.4％
根据以上的事实显示，与未进行细胞筛选(方法A)相比，利用本发明进行了细胞筛选(方法B)时，所得到的融合细胞数少(融合再生概率低)，但产生E2特异性抗体的融合细胞的比例高。由以上可知，在细胞融合前，通过沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用的特定的力，将细胞表面的特定物质与微细孔中固定的识别分子没有结合或者结合力弱的细胞从微细孔取出后进行细胞筛选，能够减少利用ELISA法进行评价的融合细胞数(ELISA板数)，能够更大幅度地减少筛选细胞的操作量和操作时间，更有效地进行单克隆抗体的开发。
(实施例5)
使用与实施例1同样的细胞筛选装置，进行与实施例4同样的实验。准备含有小鼠脾脏细胞的细胞融合液A和含有小鼠骨髓瘤细胞的细胞融合液A。其中，小鼠脾脏细胞的密度调整至1.6×106个/mL，小鼠骨髓瘤细胞的密度调整至6.7×106个/mL。
接着分别使用另外的融合容器，通过以下的(方法C)、(方法D)的方法进行细胞筛选和细胞融合。
(方法C)
使用如下的细胞筛选装置进行细胞融合：在实施例1的细胞筛选装置中使用微细孔的底面的下部电极未固定E2-BSA抗原的细胞筛选容器的细胞筛选装置。在细胞筛选容器中将600μL(损失部分也考虑在内的话，小鼠脾脏细胞数为约100万个)上述含有小鼠脾脏细胞的细胞融合液A导入到细胞筛选区域，在细胞筛选区域内使脾脏细胞充分沉降。接着，通过第1交流电源对电极间施加电压10Vpp、频率3MHz的矩形波交流电压，对于约100万个的微细孔，以阵列状在大致每1个微细孔中固定了1个小鼠脾脏细胞。接着将600μL(细胞的损失部分也考虑在内的话，骨髓瘤细胞数为约400万个)含有骨髓瘤细胞的细胞融合液A导入到细胞筛选区域。这种情况下，由于将小鼠脾脏细胞数目的约4倍多的骨髓瘤细胞导入到了细胞筛选区域，因此推测，变成微细孔中固定的小鼠脾脏细胞上至少接触1个骨髓瘤细胞的状态。接着，通过电源切换机构将电源切换到直流脉冲电源(NEPA GENE Co.，Ltd.制、LF101)，对电极间施加1次电压100V、脉冲宽30μs的直流脉冲电压，进行细胞融合。
(方法D)
使用与实施例4的方法B的细胞筛选装置同样地利用了在微细孔的底面的下部电极上固定有E2-BSA抗原的细胞筛选容器的细胞筛选装置，进行细胞筛选和细胞融合。
准备如下细胞筛选容器：将600μL(小鼠脾脏细胞数约100万个)上述含有小鼠脾脏细胞的细胞融合液A导入到细胞筛选区域，在细胞筛选区域内使小鼠脾脏细胞充分沉淀。接着，对细胞筛选容器的电极间通过第1交流电源施加电压10Vpp、频率3MHz的矩形波交流电压，对于约100万个的微细孔，大致每1个微细孔中以阵列状固定了1个小鼠脾脏细胞。接着，将细胞筛选装置静置约2分钟左右，使微细孔的底面的下部电极上固定的E2-BSA与小鼠脾脏细胞表面存在的E2抗体进行抗原抗体反应。接着，通过电源切换机构切换到第2交流电源，对细胞筛选容器施加第2交流电压(电压15Vpp、频率10kHz的矩形波交流电压)，将未进行抗原抗体反应的小鼠脾脏细胞取出到微细孔附近的绝缘体上，从而进行细胞筛选。接着，向细胞筛选容器中导入2次含有作为阳离子性聚合物之一的0.01％的聚L赖氨酸(SIGMA制、以下简略为PLL。)的细胞融合液A，将从微细孔中取出的小鼠脾脏细胞静电固定到绝缘体上。接着，导入4次细胞融合液A，除去过量的PLL成分后，将600μL(骨髓瘤细胞数为约400万个)含有小鼠骨髓瘤细胞的细胞融合液A导入到细胞筛选区域，通过电源切换机构切换到直流脉冲电源，对电极间施加1次电压100V、脉冲宽30μs的直流脉冲电压，进行细胞融合。
将通过上述(方法C)、(方法D)进行了细胞融合的细胞悬浮液直接静置15分钟后，与实施例4同样地将细胞筛选容器内的细胞悬浮液用HAT培养基稀释，转移到96孔板(Falcon制)中后，用CO2孵化器进行融合细胞的培养，6天后对各孔的融合细胞的集落数进行计数，算出融合再生概率。进而将数出了集落数的HAT培养基全部更换，与实施例4同样地在7天后通过ELISA法判断各孔的培养上清中有无具有E2亲和性的抗体。
如以上那样算出的各细胞筛选容器的融合再生概率和E2抗体阳性孔率如下所示。
(方法C)融合再生概率：27/10000、E2抗体阳性孔率：0.4％
(方法D)融合再生概率：2/10000、E2抗体阳性孔率：3.8％
由以上的事实显示，与未进行细胞筛选(方法C)相比，通过本发明进行细胞筛选并且将从微细孔中取出的脾脏细胞通过PLL静电固定到绝缘体上以防止再次固定到微细孔中(方法D)时，所得到的融合细胞数少(融合再生概率低)，但产生E2特异性抗体的融合细胞的比例比实施例4更高。由以上可知，在细胞融合前，通过沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用的特定的力，将细胞表面的特定物质与微细孔中固定的识别分子没有结合或者结合力弱的细胞从微细孔中取出而进行细胞筛选，进而继细胞筛选之后将从微细孔中取出的细胞捕捉到微细孔以外的部分以防止再次固定到微细孔部，从而能够进一步减少通过ELISA法进行评价的融合细胞数(ELISA板数)，能够更加大幅度地减少筛选细胞的操作量和操作时间，能够更有效地进行单克隆抗体的开发。
(比较例2)
将比较例1中筛选的小鼠脾脏细胞B通过通常的电融合法进行细胞融合。进行电细胞融合的电极使用电极间1mm的金制的线电极(NEPA GENE Co.，Ltd.制、MS金线电极)，该电极与细胞融合用电源(NEPA GENE Co.，Ltd.制、LF101)连接。
细胞使用比较例1中筛选的小鼠脾脏细胞B和小鼠骨髓瘤细胞。将小鼠抗体形成细胞B和小鼠骨髓瘤细胞以4∶1混合，将两种细胞悬浮到300mM浓度的甘露糖醇水溶液中，按照1.7×107个/mL的密度调整细胞悬浮液。在两种细胞悬浮液中添加0.1mM的氯化钙、0.1mM的氯化镁，以促进细胞融合中细胞膜的再生。
将上述细胞悬浮液40μL(小鼠抗体形成细胞数：约60万个、小鼠骨髓瘤细胞数：约15万个)注入电极间，使用细胞融合用电源，对电极间施加电压20Vpp、频率3MHz的正弦波交流电压。确认形成细胞串珠(Pearl Chain)后，为了进行细胞融合，而施加电压值200V、脉冲宽30μs的直流脉冲电压。静置10分钟后将细胞筛选容器内的细胞悬浮液加入到HAT培养基中。将加有细胞悬浮液的HAT培养基装入CO2孵化器中进行细胞培养，6天后对融合细胞进行计数，结果无法确认融合细胞。这是由于，通过筛选而残留的小鼠脾脏细胞B的数目少，通过细胞悬浮液的密度调整、离心分离，将小鼠脾脏细胞B转移到细胞融合用的电极上时进一步损失而变少，并且通常的电融合法的融合再生概率非常低，为0.2/10000左右，因此认为实质上没有得到融合细胞。
产业上的可利用性
根据本发明的细胞筛选装置和筛选方法，通过由第1交流电源施加的正的介电电泳力，能够在1个微细孔中固定1个细胞。另外，通过沿着将细胞从微细孔中取出的方向作用的特定的力，能够将细胞从微细孔中取出并逐个进行筛选，因此能够一次性大量且以短时间简便地筛选表面存在与识别分子强力结合的特定物质的细胞。因此本发明在医药品制造和临床诊断的领域中具有可利用性。

Claims (22)

1.一种细胞筛选装置，其特征在于，该细胞筛选装置具备细胞筛选容器和电源，所述细胞筛选容器由相对配置的由导电构件形成的一对电极和隔着平板状的间隔物配置在所述一对电极间的平板状的绝缘体构成，所述绝缘体具有沿着所述相对配置的电极的方向贯通的多个微细孔，所述绝缘体配置在所述电极中的任一者的电极面上，所述微细孔的底面配置有对特定物质具有结合性的识别分子，所述电源对所述一对电极施加电压，且所述电源具有细胞固定用电源和细胞取出用电源。
2.根据权利要求1所述的细胞筛选装置，其特征在于，在所述电源中，所述细胞固定用电源由施加第1交流电压的第1交流电源构成，所述细胞取出用电源由施加第2交流电压的第2交流电源构成，并具有切换所述第1交流电源和所述第2交流电源的电源切换机构。
3.根据权利要求1所述的细胞筛选装置，其特征在于，所述电源除了具有所述细胞固定用电源和所述细胞取出用电源以外，还具有细胞融合用电源。
4.根据权利要求3所述的细胞筛选装置，其特征在于，在所述电源中，所述细胞固定用电源由施加第1交流电压的第1交流电源构成，所述细胞取出用电源由施加第2交流电压的第2交流电源构成，所述细胞融合用电源由施加直流脉冲电压的直流脉冲电源构成，并具有从所述第1交流电源、所述第2交流电源、所述直流脉冲电源中选择任意1个、或任意2个电源并进行连接的电源切换机构。
5.根据权利要求2或权利要求4所述的细胞筛选装置，其特征在于，所述第1交流电源的交流频率为30kHz以上，且所述第2交流电源的交流频率不到20kHz。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的细胞筛选装置，其特征在于，与所述特定物质具有结合性的识别分子为抗原。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞筛选装置，其特征在于，面向细胞筛选区域的所述电极的表面和/或配置有具有所述微细孔的平板状的绝缘体的电极的绝缘体表面配置有阳离子性聚合物，所述细胞筛选区域为隔着所述间隔物而形成于所述细胞筛选容器的所述一对电极间的、用于进行细胞筛选的空间。
8.根据权利要求7所述的细胞筛选装置，其特征在于，所述阳离子性聚合物为聚赖氨酸、或聚赖氨酸的衍生物、或含氨基聚合物。
9.一种细胞筛选方法，其特征在于，该细胞筛选方法使用了权利要求1～8中任一项所述的细胞筛选装置，向所述细胞筛选区域内导入细胞，通过所述第1交流电源施加所述第1交流电压而将所述细胞固定在所述微细孔内，使配置在所述微细孔底面的所述识别分子与细胞表面的特定物质发生结合反应后，通过沿着从所述微细孔中取出所述细胞的方向作用的特定的力，将所述细胞中细胞表面的特定物质与所述识别分子没有结合或者结合力弱的细胞从所述微细孔中取出。
10.一种细胞筛选方法，其特征在于，该细胞筛选方法使用了权利要求1～8中任一项所述的细胞筛选装置，向所述细胞筛选区域内导入细胞，通过所述第1交流电源施加所述第1交流电压而将所述细胞固定在所述微细孔内，使配置在所述微细孔底面的所述识别分子与细胞表面的特定物质发生结合反应后，通过沿着从所述微细孔中取出所述细胞的方向作用的特定的力，将所述细胞中细胞表面的特定物质与所述识别分子强力结合的细胞残留在微细孔内。
11.一种细胞筛选方法，其特征在于，该细胞筛选方法使用了权利要求3～8中任一项所述的细胞筛选装置，向所述细胞筛选区域内导入细胞，通过所述第1交流电源施加所述第1交流电压而将所述细胞固定在所述微细孔内，使配置在所述微细孔底面的所述识别分子与细胞表面的特定物质发生结合反应后，通过沿着从所述微细孔中取出所述细胞的方向作用的特定的力将所述第1细胞中细胞表面的特定物质与所述识别分子没有结合或者结合力弱的细胞从所述微细孔中取出，接着向所述细胞筛选区域内导入第2细胞，使其与所述微细孔内残留的所述第1细胞接触，通过所述电源切换机构切换到所述直流脉冲电源并施加所述直流脉冲电压，使所述微细孔内残留的所述第1细胞和与其接触的所述第2细胞发生细胞融合。
12.根据权利要求9～11中任一项所述的细胞筛选方法，其特征在于，所述特定的力为沿着从所述微细孔中取出所述细胞的方向作用的重力。
13.根据权利要求9～11中任一项所述的细胞筛选方法，其特征在于，所述特定的力为沿着从所述微细孔中取出所述细胞的方向作用的磁力。
14.根据权利要求9～11中任一项所述的细胞筛选方法，其特征在于，所述特定的力为沿着从所述微细孔中取出所述细胞的方向作用的、向所述细胞筛选容器中导入的溶液的送液力。
15.根据权利要求9～11中任一项所述的细胞筛选方法，其特征在于，所述特定的力为沿着从所述微细孔中取出所述细胞的方向作用的介电电泳力，所述介电电泳力通过利用所述电源切换机构而切换为所述第2交流电源施加所述第2交流电压而起作用。
16.根据权利要求9～11中任一项所述的细胞筛选方法，其特征在于，所述特定的力为权利要求12～15中任一项所述的特定的力中2种以上的特定的力的组合。
17.根据权利要求14或权利要求16所述的细胞筛选方法，其特征在于，所述特定的力为沿着从所述微细孔中取出所述细胞的方向作用的送液力，通过改变向所述细胞筛选容器中导入的溶液的送液速度的大小来改变送液力的大小，从而筛选所述细胞表面的特定物质与所述识别分子没有结合或者结合力弱的细胞、和细胞表面的特定物质与所述识别分子强力结合的细胞。
18.根据权利要求15或权利要求16所述的细胞筛选方法，其特征在于，所述特定的力为沿着从所述微细孔中取出所述细胞的方向作用的介电电泳力，通过改变由所述第2交流电源施加的所述第2交流电压的大小和/或频率的大小来改变介电电泳力的大小，从而筛选所述细胞表面的特定物质与所述识别分子没有结合或者结合力弱的细胞、和细胞表面的特定物质与所述识别分子强力结合的细胞。
19.根据权利要求9～18中任一项所述的细胞筛选方法，其特征在于，将所述从微细孔中取出的细胞捕捉到权利要求7或8所述的配置有阳离子性聚合物的所述电极的细胞筛选区域侧的表面和/或配置有具有所述微细孔的平板状的绝缘体的电极的绝缘体表面。
20.根据权利要求11～19中任一项所述的细胞筛选方法，其特征在于，在所述第2细胞的表面固定识别所述第1细胞的特定物质的识别分子，通过所述特定物质与所述识别分子的结合，使所述第1细胞与所述第2细胞结合。
21.根据权利要求20所述的细胞筛选方法，其特征在于，在施加沿着从所述微细孔中取出所述细胞的方向作用的所述特定的力的状态下，施加所述直流脉冲电压，从而使所述第1细胞与所述第2细胞发生细胞融合。
22.一种细胞筛选装置，该细胞筛选装置具备相对的第1电极及第2电极、和对该电极施加交流电压的电源装置，在第1电极的第2电极侧的表面配置具有微细孔的绝缘体，该微细孔抵接的电极露出部位以外的部分被绝缘体覆盖，另外第1电极及第2电极为该绝缘体和第2电极隔离配置，所述电极露出部位配置有识别分子，并且，所述电源装置对第1及第2电极施加频率不同的两种交流电压。
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