CN104471380A - 分析装置以及分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供分析装置及分析方法。为了定量极微量的生物体分子而用磁微粒特异性捕捉生物体分子并对生物体分子进行荧光标识。磁微粒针对支承基板的高效率的固定反应和磁微粒的凝聚的消除是课题。为了将磁微粒吸引至支承基板而在支承基板背面设置切换接通/断开的磁场产生装置，并在支承基板表面设置保持磁微粒的粘接层。首先在支承基板表面的磁场断开的状态下将磁微粒的分散溶液放置于支承基板表面。接下来，接通磁场而将液中的磁微粒吸引至支承基板表面。使与支承基板碰撞的磁微粒固定于支承基板表面的粘接层，并且断开磁场。由此，能够保持磁微粒不变地消除凝聚，并能够使支承基板上的磁微粒层为一层。

Description

分析装置以及分析方法
技术领域
本发明涉及使用了磁微粒的生物体分子分析方法以及生物体分子分析装置。
背景技术
近几年，在癌诊断的领域中，为了早期知晓癌症发病的前兆而研究了各种癌标记物，也进行了实用化。癌症标志物是指来自癌细胞的分泌型生物体因子，与癌症的发展一起增加且在血中、尿中显现。例如，公知有激素、细胞因子等蛋白质、微RNA(Micro RNA)等核酸。早期的癌症中这些癌症标志物的量较小而难以检测，原本表达量少的癌症标志物存在的情况也相同。目前，主流的高灵敏度的癌症标志物检测方法是使用了抗体的免疫测定法，已知有ELISA法、纳米粒子检验等方法。最近，虽然是研究阶段，但作为更高灵敏度的免疫测定法，开发了能以单分子够检测的数字ELISA(非专利文献1)。在检测血液中的癌症标志物的情况下，能够从患者采取的血液量有限，要求从其中尽量多地捕捉并检测极微量的癌症标志物。例如，在从50μl的血浆中进行检测的情况下，早期的癌症中癌症标志物为10-16～10-12M的浓度范围，从而需要定量在50μl中有3000分子的靶分子的检测灵敏度。这样，要求能够检测低浓度的癌症标志物的超高灵敏度的检测装置。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Rissin DM et al,Nature Biotecnology(自然生物技术),Jun28(6)；p595-599(2010)
发明内容
发明所要解决的课题
为了定量极微量的生物体分子，用磁微粒特异性地捕捉生物体分子并对生物体分子进行荧光标记。将被磁微粒捕捉的生物体分子固定于支承基板而进行检测。利用磁场将捕捉到液体中浮游的生物体分子的磁微粒引向支承基板表面。在磁场的存在下，由于磁微粒本身带磁，所以在支承基板表面上微粒彼此相互吸引，从而磁微粒凝集。若磁微粒凝集，则在支承基体上磁微粒沿与板的表面的垂直的方向重合。另外，凝聚的微粒将荧光标记卷入内部。
像这样重叠的磁微粒、或者在内部卷入有荧光标记的磁微粒有在荧光观察时无法精度良好地计数的问题。
用于解决课题的方案
为了将磁微粒吸引至支承基板而在支承基板背面设置可切换接通/断开的磁场产生装置，在支承基板表面设置保持磁微粒的粘接层。首先，在支承基板表面的磁场断开的状态下将磁微粒的分散溶液放置于支承基板表面。接下来，接通磁场而将液中的磁微粒吸引至支承基板表面。使与支承基板碰撞的磁微粒固着于支承基板表面的粘接层，再断开磁场。
发明的效果
根据本发明，能够将液中的大部分磁微粒吸引至支承基体表面，并能够由粘接层保持。进而，通过将磁场设为断开的状态，能够消除磁微粒彼此的凝聚，并能够使支承基板的磁微粒层为一层。通过使磁微粒为一层，对支承基体上的荧光色素的对焦能够容易进行，通过防止磁微粒的凝聚所引起的荧光色素的吞没来提高定量性。由于通过使用了本发明的生物体分子分析能够大幅度提高解析对象的生物体分子捕获率，从而与以往技术相比，能够进行高灵敏度的检测。此外，不需要具有复杂构造的仪器，从而与以往技术相比，非常简便，通过与自动控制单元组合可得到生产率的大幅度提高。
附图说明
图1是用于说明本实施例的解析方法的一个例子的图。
图2是用于说明本实施例的解析方法所使用的仪器的结构的一个例子的图。
图3是用于说明本实施例的解析方法所使用的仪器的结构的一个例子的图。
图4是用于说明本实施例的抗原分子的捕捉方法和抗原分子的荧光标记的方法的一个例子的图。
图5是用于说明本实施例的核酸片段的捕捉方法和核酸片段的荧光标记的方法的一个例子的图。
图6是用于说明本实施例的生物体分子分析装置的结构的一个例子的图。
图7是用于说明使用了本实施例的磁铁的磁微粒固定方法的一个例子的图。
图8是使用本实施例的磁铁而进行了固定的磁微粒的显微镜观察图像。
具体实施方式
本发明的一个实施例的核酸分析仪器中，解析对象的生物体分子被磁微粒捕捉，并具有用于以二维的方式呈现该微粒的平滑的支承基板，在支承基板的表面存在用于固定带抗体的磁微粒的粘接层。作为支承基板，很好透过磁力的较薄的石英玻璃基板、硅基板等较好，根据粘接层的种类适当使用堆积有金属薄膜的石英玻璃基板、硅基板。用于固定以蛋白质修饰了的磁微粒的粘接面是疏水性的粘接层、或者导入有生物素的粘接层，作为疏水性的粘接剂，使用烷基自组装膜。另外，作为可逆地切换粘接层的粘接力的强弱的粘接剂，公开了使用光响应性的偶氮苯。对于用于固定于支承基板的官能团而言，若基板是石英或者氧化处理后的硅基板则官能团使用硅烷醇基，若基板是金属堆积基板则官能团使用硫醇基，若基板是氧化钛堆积基板则官能团使用磷酸基。在支承基板的正下方设置有用于将带生物体分子的磁微粒引向粘接层的磁场产生装置，并且磁场产生装置具有切换磁场的接通/断开或强弱的功能。磁场产生装置能够从电磁铁、可动式永久磁铁、可动式电磁铁、在支承基板与磁铁之间具备可动式磁场遮挡板的永久磁铁、或者电磁铁选择。该仪器通过以在固定有拍摄装置的状态下能够扫描并荧光观察支承基板整个面的方式在可动工作台上设置支承基板而进行使用。
对观察顺序进行说明。首先，在支承基板上配置含有捕捉有目的的生物体分子的磁微粒的反应液，接着，接通磁场产生装置而产生磁场，将反应液内的全部磁微粒引向支承基体上，并将与粘接层接触的磁微粒固定在支承基板上。对于在第一次中未与粘接层接触的磁微粒而言，通过反复操作磁场的接通/断开、或强弱，来增加磁微粒与粘接层的碰撞机会。在将磁微粒固定于粘接层后，通过流动清洗液来冲洗浮游的未反应的荧光标记抗体。对固定在支承基板上的磁微粒和与其结合的被荧光标记了的抗原照射激发光并进行拍摄。通过对观察到的亮点数进行计数来求出目的的生物体分子浓度。
对于使用具有使粘接层的粘接力可逆变化的功能的仪器的观察顺序而言，在固定磁微粒时，对偶氮苯照射紫外光而使之预先成为顺式，并在切断磁场的状态下放入一定量的反应液。之后产生磁场，而将反应液中的磁微粒引向支承基体上，与粘接层接触的磁微粒固定在支承基板上。在将磁微粒固定于粘接层后，通过流动清洗液来冲洗浮游的未反应的荧光标记抗体。对固定在支承基板上的磁微粒和与其结合的被荧光标记了的抗原照射激发光而进行拍摄，并通过对观察到的亮点数进行计数来求出目的的生物体分子浓度。在观察结束后，通过对支承基板施加可见光或热，来使偶氮苯亲水化而从支承基板剥离磁微粒。对于紫外光、可见光照射准备与检测系统不同的光源和波长分离滤波器，而能够对支承基板整个面进行照射。作为施加热的方法，在流路流通加热后的温水。清洗结束后，再次照射紫外光而返回顺式，放入新的试料而以相同的方式进行固定以及观察。为了减少第二次之后的试料的带入，反复实施清洗。或者，通过在每次测定时改变用于标识的荧光色素的波长和检测滤波器来除去污染。
实施例中，公开解析对象的生物体分子是肽、蛋白质、核酸片段组。公开如下一种免疫学的分析方法，其特征在于，准备解析对象的抗原，使结合有针对抗原的抗体的磁微粒及被荧光体标记了的抗体与上述解析对象的抗原结合，对被标记了的荧光体进行检测。或者，公开一种核酸分析方法，其特征在于，准备解析对象的核酸片段组，使具有已知的碱基序列且进行了荧光体标记的核酸分子与上述解析对象的核酸片段组杂交，对杂交的核酸分子检测被标记的荧光体进行。
另外，实施例中，就上述生物体分子分析方法而言，公开了一种核酸分析方法，其特征在于，上述荧光体标记是包括按照每种解析对象的生物体分子的种类而配合比例不同的多种荧光体的微粒。另外，实施例中，就上述生物体分子分析方法而言，公开了一种生物体分子分析方法，其特征在于，对于特定的分子种类以外的分子种类使用相同的荧光体标记，对每种上述分子计算荧光亮点数，并且计算每种特定的分子种类的亮点数相对于总亮点数的比，从而对上述每种特定的分子种类的存在量进行评价。另外，实施例中，就上述核酸分析方法而言，公开了一种生物体分子分析方法，其特征在于，包括对解析对象的生物体分子群实施共有的荧光体标记、并使由荧光波长或荧光强度不同于上述荧光体的荧光体标记的生物体分子特异性结合反应的工序，通过计算前者与后者的荧光体的亮点数的比，来对上述解析对象的生物体分子的每种种类的存在量进行评价。
另外，实施例中，公开了一种生物体分子分析装置，其特征在于，具备：二维地展开并固定解析对象的生物体分子的仪器；搭载有仪器的生物体分子分析装置；用于测定上述荧光体的荧光的机构。
以下，参照附图对上述以及其它的本发明的新的特征和效果进行说明。此处，为了完全理解本发明，对特定的实施方式进行详细的说明，但本发明不限于此处记载的内容。
实施例1
使用图1对本实施例的解析方法以及仪器的结构的一个例子进行说明。首先，预先用磁微粒捕捉欲检测的生物体分子，接着用荧光标记贴标签。这些反应全部在常温下、在缓冲液中进行，磁微粒和生物体分子的反应、荧光标记和生物体分子的反应哪一个都可以在先进行，也可以同时进行。捕获的磁微粒的制作法、荧光标记的方法在实施例3和实施例4中详细记载。
本实施例中，以欲检测的生物体分子是抗原101、利用带抗体的磁微粒102来捕捉抗原101并且利用荧光标记抗体103来贴标签的方法为例，并使用图1对反应方法进行说明。首先，在反应容器110内放入带抗体的磁微粒102，预先充分搅拌。向该溶液倒入放入有欲检测的抗原101的溶液，之后充分混合而保温几分钟。此时，通过使反应容器上下旋转、或振动搅拌来加速反应。混合的比率以带抗体的磁微粒102与抗原101相比过剩的方式混合。进一步，向该反应液放入荧光标记抗体103，之后保育几分钟。在这样反应后的混合液中，存在大量的未反应的磁微粒102和荧光标记抗体103，并在其中少量存在磁微粒102、抗原101以及荧光标记抗体103的混合体。以下将该混合液称为反应液A。通过在支承基板上二维地展开反应液A，而进行荧光检测来测定抗原量。
接下来使用图1对荧光检测用的仪器的结构进行说明。该仪器具有用于二维呈现磁微粒102的平滑的支承基板104，在支承基板104的表面存在用于固定磁微粒102的粘接层105。作为支承基板104，良好地透过磁力的薄石英玻璃基板、硅基板等是好的，根据粘接层105的种类适当使用堆积有金属薄膜的石英玻璃基板、硅基板。由蛋白质修饰的磁微粒102良好地吸附于疏水性的层，从而通过将烷基固定于支承基板104的表面来形成粘接层105。作为粘接剂，能够使用带官能团的烷基链。对于官能团而言，若支承基板104的材质是石英或者氧化处理后的硅基板则官能团使用硅烷醇基，若支承基板104的材质是金堆积基板则官能团使用硫醇基，若支承基板104的材质是氧化钛堆积基板则官能团使用磷酸基。若进行反应，则官能团被固定于支承基板104，烷基链因烷基链稀疏水的相互作用而密集，从而在支承基板104表面形成自集成膜(SAM)。通过该方法能够在支承基板104上均匀地疏水化。在支承基板104的正下方设置有用于向粘接层105吸引磁微粒102的磁场产生装置106。进一步，磁场产生装置106带切换磁场的接通/断开或强弱的功能。该仪器以能够扫描支承基板104整个面的方式在可动工作台107上设置而进行使用。
以下，对仪器的作用和观察顺序进行说明。首先，在支承基板104上通过移液器108载置反应液A。通过作成包围支承基板104上的四方的侧壁，能够严密地调整每单位支承基板面积的溶液量，与保持原样地载置液滴的方法相比，能够使液厚均匀。就是说，能够使磁微粒102的固定均匀。在磁场产生装置106接通的状态下，由于从放入的位置开始吸引磁微粒102，所以不均匀地固定。因此，当放入反应液A时断开，并在放入后接通磁场产生装置106而产生磁场，而将反应液A内的全部磁微粒102吸引至支承基体104上。与粘接层105接触的磁微粒102在支承基板104上固定。本研究中使用的带抗体的磁微粒102是顺磁性体，从而通过从外部给予磁场来进行磁性化。但是，若各个磁微粒102磁性化，则相互吸引且以串珠状地连接的方式凝聚。因此若在从外部给予了磁场的状态下进行观察，则磁性微粒102相对于支承基板104朝向垂直方向具有立体的构造，从而在观察时焦点难以对准，或者荧光标记抗体103被卷入凝聚体内部，由此激发光变得不均匀而损害本来的定量性。因此，断开磁场，而消除磁微粒102彼此的凝聚，从而仅固定于粘接层105的磁微粒102在支承基板104上呈现，能够形成一层磁微粒层。该情况下，未与粘接层105接触的磁微粒不在支承基板104上呈现，但若通过反复进行磁场的接通/断开、或者强弱来增加碰撞机会，则将绝大多数的磁微粒102固定于粘接层105。在将磁微粒102固定于粘接层105后，通过流动清洗液能够冲洗浮游的未反应的全部荧光标记抗体103。其中，对于未反应的荧光标记抗体103而言，也可以预先在反应容器110内进行。对在支承基板104上固定一层的磁微粒102和与其结合的荧光标记后的抗原101照射激发光而进行拍摄。通过计算观察到的亮点数能够求解抗原浓度。
实施例2
接下来，使用图2对与流路组合的荧光检测用的仪器的结构进行说明。该仪器与实施例1同样地具有用于二维呈现磁微粒201的平滑的支承基板203，在支承基板203的表面设置用于固定磁微粒201的粘接层204，并在支承基板203的正下方设置能够切换用于向粘接层204吸引磁微粒201的磁场的接通/断开、或者强弱的磁场产生装置205。进而，在支承基板203的四方设置侧壁206，并在其上用平滑且透明的罩部件207进行覆盖。例如，作为侧壁206的材料，能够使用PDMS(聚二甲基硅氧烷)，罩部件207的材料能够使用石英。在侧壁的两个位置安装用于出入溶液的软管208。作为软管208的材料，能够使用硅橡胶。在支承基板203的正下方设置用于向粘接层204吸引磁微粒201的磁场产生装置205。该仪器以能够扫描支承基板203整个面的方式在可动工作台209上设置而进行使用。或者，在物镜210侧附加可动机构而进行扫描。
以下，对仪器的作用和观察顺序进行说明。首先，在磁场断开的状态下放入一定量的反应液A。之后产生磁场，而将反应液A中的磁微粒201吸引至支承基板203上。并将与粘接层204接触的磁微粒201固定在支承基板203上。在将该磁微粒201固定于粘接层204后，通过流动清洗液211，能够冲洗浮游的未反应的全部荧光色素202。对在支承基板203上固定一层的磁微粒201和与其结合的荧光色素202照射激发光而进行拍摄。通过计算观察到的亮点数能够求出生物体分子浓度。
实施例3
接下来，使用图3对具有使粘接层304的粘接力可逆变化的功能的仪器的结构进行说明。该仪器与实施例2同样地具备用于二维呈现磁微粒302的平滑的支承基板303，在支承基板303的表面设置用于固定磁微粒302的粘接层304，并在支承基板303的正下方设置能够切换用于向粘接层304吸引磁微粒302的磁场的接通/断开、或者强弱的磁场产生装置305。进一步，在支承基板303的四方设置侧壁306，并在其上用平滑的罩部件307进行覆盖。在侧壁306的两个位置安装用于出入溶液的软管。在支承基板303的正下方设置用于向粘接层304吸引磁微粒302的磁场产生装置305。进而，由使粘接层304的粘接力可逆变化的物质形成。例如，将利用温度、热而将表面的水润湿性从疏水性变化为亲水性或者从亲水性变化为疏水性的物质用作粘接剂。通过使粘接层304的粘接力可逆地变化，在观察后能够从固定有磁微粒302的支承基板303剥离清洗磁微粒302，并且通过再次恢复吸附力能够观察新的试样。就是说，能够多次再利用支承基板303。作为实现再利用的粘接剂，能够使用光响应性的烷基偶氮苯。偶氮苯具有在两个偶氮基上附有两个苯环的构造，若照射紫外光308则异构化为顺式体，通过给予可见光310或热而异构化为更加稳定的反式体。例如，准备在烷基链的一端结合有偶氮苯、在另一端结合有与基板侧反应的官能团的带官能团的烷基偶氮苯。若基板是石英或者氧化处理后的硅基板则官能团使用硅烷醇基，若基板是金堆积基板则官能团使用硫醇基，若基板是氧化钛堆积基板则官能团使用磷酸基。若进行反应，则官能团固定于基板，烷基链因烷基链疏水的相互作用而密集，从而在基板表面形成自集成膜(SAM)。通过该方法能够在基板上均匀地导入偶氮苯。在固定磁微粒302时向偶氮苯照射5分钟左右紫外光308而使之成为顺式。
以下，对仪器的作用和观察顺序进行说明。首先，在磁场断开的状态下放入一定量的反应液A。之后产生磁场，而将反应液A中的磁微粒302吸引至支承基体上。与粘接层304接触的磁微粒302固定在支承基板303上。在将该磁微粒302固定于粘接层304后，通过流动清洗液309，能够冲洗浮游的未反应的全部荧光标记抗体。对在支承基板303上固定一层的磁微粒302和与其结合的荧光标记后的抗原照射激发光而进行拍摄。通过计算观察到的亮点数能够求出抗原浓度。
通过对固定有观察结束了的磁微粒302的支承基板303给予可见光310或热，来使偶氮苯亲水化而从支承基板303剥离磁微粒302。可见光310的照射准备与检测系统不同的光源和波长分离滤波器，能够对支承基板303整个面进行照射。为了给予热，对流路流通加热至35℃以上的温水。在任一个亲水化的方法中，通过一边流动含有表面活性剂的水溶液一边进行，能够得到更高的磁微粒302的除去效果。清洗结束后，再次照射5分钟左右紫外光308使之成为顺式，放入新的试样而同样地进行固定以及观察。
在像这样反复进行固定和除去的情况下，在上一次固定的荧光色素301残留，而在第二次之后的定量时有被合算的可能性。为了防止该情况，预先要求能够完全除去磁微粒302或将磁微粒302除去至允许的量的清洗条件。在对极微量的试样进行定量的情况下，存在几个亮点的差别对定量结果产生较大影响的情况。此时，通过每次测定改变用于标记的荧光色素301的波长和检测滤波器，能够完全除去污染。
实施例4
使用图4对本实施例的试样调整方法进行说明。在欲检测的生物体分子是抗原401的情况下，预先用带抗体402的磁微粒403进行捕捉，进一步用荧光标记抗体405贴标签。这些反应全部在常温下、反应用缓冲液(Tris缓冲液(pH8.0)，50mM NaCl，0.1％Tween20)中进行。带抗体402的微粒和抗原401的反应、以及荧光标记抗体405和抗原401的反应哪一个都可以在先进行，也可以同时进行。抗原401能够使用任何种类，抗体402选择对抗原401特异性高的物质较好。例如，在作为抗原401而选择前列腺癌症的肿瘤标记符亦即PSA(前列腺特异抗原)的情况下，需要PSA抗体。PSA抗体分别需要与磁微粒侧结合和荧光色素标记。抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，与抗原401的种类对照地选择适当的抗体。
在抗体402与磁微粒403结合的情况下，准备能够保持抗体402的活性不变地结合的蛋白质A、或者蛋白质G修饰的磁微粒403。这些磁微粒403是在市场上出售的，能够容易得到。例如，能够利用作为顺磁性微粒的Ademtech公司的蛋白质A修饰Adem-磁珠(φ300nm)。对蛋白质A修饰磁微粒403混合约10倍以上的PSA抗体并进行保育。接下来，由磁铁捕捉磁微粒403后除去溶液并利用清洁的缓冲液使之悬浮。反复进行该操作直至能够除去未反应的抗体402。作为磁微粒403，能够使用链霉亲和素的修饰磁微粒403。例如，能够利用Ademtech公司的链霉亲和素修饰Adem-磁珠(φ100nm，φ200nm，φ300nm)。在使用该磁微粒403的情况下，使用生物素化后的抗体402，使抗体402结合于磁微粒403表面。使用的磁微粒403的直径优选选自比激发波长小的直径，能够防止磁微粒403的散射光所引起的背景的增加。
荧光标记抗体405在市场上出售各种种类。例如，公知有FITC、Alexa(注册商标)、CY5等。但是，本研究中为了能够检测至少一分子的抗原401，优选利用亮度较高、且消光时间较长的荧光色素。作为这样的荧光色素，例如能够使用几百分子的荧光色素与一个枝状的碳链结合的树枝型荧光色素、量子点404。
对本实施例中使用了量子点404的抗体的荧光标记方法进行说明。量子点404是直径几纳米至几十纳米的半导体微粒。与以往的荧光色素相比，高寿命且高亮度，并且因粒径不同而产生不同的波长的荧光。量子点404在市场上由多个制造商出售，并由各种官能团修饰。作为能够结合任意的荧光标记抗体405的量子点404，例如能够利用Invitrogen公司的Qdot(注册商标)抗体标记试剂盒。该试剂盒中通过使在表面导入有硫醇基的量子点404、和还原了二硫键的荧光标记抗体405混合反应，能够在荧光标记抗体405标记量子点404。
使用如上制作出的带抗体402的磁微粒403和荧光标记抗体405来进行抗原401的捕捉和检测。首先，在反应容器内放入带抗体402的磁微粒403，预先充分搅拌。向该溶液倒入放入有欲检测的抗原401的溶液，之后充分混合而保育1个小时。此时，通过使反应容器上下旋转、或振动搅拌来加速抗原401和抗体402的反应。混合的比率以带抗体402的磁微粒403与抗原401相比变得过剩的方式混合。具体而言，相对于假定的抗原量而放入100至10000倍量的带抗体402的磁微粒403。接下来，向该反应液放入荧光标记抗体，进一步保育几分钟。荧光标记抗体405也相同地以相对于抗原量变得过剩的方式投入100至10000倍量。通过分别过量放入，来提高与抗原401的碰撞频度，并提高抗原401的捕捉率和荧光标记率。与实施例3的反应液相同地对像这样反应后的混合液进行观察，并对抗原401进行定量。
实施例5
使用图5对本研究的试样调整方法进行说明。在欲检测的生物体分子是核酸片段的情况下，由磁微粒507捕捉检测对象的试样核酸片段501，进而利用具有互补序列的带荧光色素506的核酸片段505对试样核酸片段501贴标签。这些反应是杂交所引起的特异性反应，在反应用缓冲液(PBS缓冲液(pH7.4)，50mM～1M NaCl，0.1％Tween20)中进行。带核酸的磁微粒507和试样核酸片段501的反应、以及带荧光色素506的核酸片段505和试样核酸片段501的反应哪一个都可以在先进行，也可以同时进行。核酸片段505能够使用单链的DNA、RNA。作为具体的解析对象以微RNA为例，说明详细内容。
微RNA是20mer左右的单链的核酸片段。最简单的检测方法是对试样核酸片段501直接进行荧光标记的方法。该情况下，在试样核酸片段501的3’末端侧结合生物素化dUTP，而制作生物素化后的试样核酸片段501。使抗生物素蛋白标记的量子点与该试样核酸片段501反应。同样，预先制作带有试样核酸片段501的互补链的磁微粒507，并使之和与量子点反应后的试样核酸片段501反应。根据荧光色素504测定被磁微粒507捕获的试样核酸片段501的量。
当欲测定全部的微RNA总量中特定的微RNA量时，预先在作为试样核酸片段501的微RNA的末端通过连接附加含有共有序列503和捕捉序列508的核酸片段。共有序列503是指与种类无关用于对全部微RNA进行荧光标记的序列，捕捉序列是指用于被磁微粒507捕捉的序列。共有序列以及捕捉序列与欲测定的试样的Tm值对应而能够任意合成GC含量和碱基长度。以下，将含有共有序列和捕捉序列的核酸片段称作标签片段502。首先，准备在共有序列的互补链标记有荧光色素504的片段和在试样核酸片段501的互补链标记有荧光色素506的片段。将这些与附加有标签分子502的试样核酸片段501混合并使之杂交。此时，在存在多种试样核酸片段501的情况下，对每个种类准备试样核酸片段501的互补链，并预先进行分别不同波长的荧光标记。利用带捕捉序列的磁微粒507捕捉像这样荧光标记后的试样核酸片段501。该反应也通过杂交来进行。将补足有荧光标记后的试样核酸片段501的磁微粒507固定于支承基板上的粘接层，而与实施例1、2相同地进行亮点观察。此时，共有序列数侧的荧光亮点相当于微RNA的全数，试样侧的荧光亮点数相当于试样核酸片段501的分子数。将两者的亮点数的比判断为各种核酸试样分子的存在比率在欲调查仅特定的核酸分子的表达量时也有效。
磁微粒507是市场上出售的，能够容易得到。例如，能够使用作为顺磁性微粒的Ademtech公司的链霉亲和素的修饰磁微粒。例如，能够利用Ademtech公司的链霉亲和素修饰Adem-磁珠(φ100nm，φ200nm，φ300nm)。在使用该磁微粒的情况下，使用生物素化后的核酸片段，而使核酸与磁微粒507表面的抗生物素蛋白509结合。使用的磁微粒507的直径优选选自比激发波长小，能够防止磁微粒507的散射光所引起的背景的增加。荧光色素在市场上出售各种种类。例如，公知有FITC、Alexa(注册商标)、CY5等。但是，本研究中为了能够检测至少一分子的试样核酸片段501，优选利用亮度较高、且消光时间较长的荧光色素。作为这样的荧光色素，例如，能够使用几百分子的荧光色素与一个枝状的碳链结合的树枝型荧光色素、量子点。对本实施例中使用了量子点的核酸片段的荧光标记方法进行说明。例如，能够利用Invitrogen公司的链霉亲和素修饰Qdot(注册商标)。量子点和核酸片段的结合在混合后保育30分钟以上即可，在反应后利用临界值(cutoff)50kDa的核酸纯化柱除去未反应的核酸片段。
使用如上制作的带捕捉序列的磁微粒507和荧光色素标记核酸片段来捕捉试样核酸片段501。首先，在反应容器内放入带捕捉序列的磁微粒507，预先充分搅拌。向该溶液倒入放入有欲检测的试样核酸片段501的溶液，之后充分混合而保育6个小时。此时，通过使反应容器上下旋转、或振动搅拌来加速杂交反应。混合的比率以磁微粒507与目的的核酸片段相比变得过剩的方式混合。具体而言，相对于假定的试样分子数而放入100至10000倍量的磁微粒507。与实施例1、2相同地观察如上处理后的反应液。
实施例6
本实施例中，参照图6对生物体分子分析装置的优选的结构的一个例子进行说明。本实施例的生物体分子分析装置具备：向用于二维地展开生物体分子的支承基板601供给解析对象的生物体分子溶液、清洗液的机构；用于将磁微粒吸引至支承基板上的机构；用于将磁微粒保持在支承基板上的机构；用于对支承基板中清洗液进行加热的温度调节的机构；向支承基板照射光的机构；对带荧光标记的分子的荧光体的荧光进行测定的发光检测机构；以及扫描支承基板601的机构。
更具体而言，将支承基板601放置在可动工作台604上，使设有流路的流路部件在其上贴合，从而形成反应腔605。就流路部件而言，例如能够使用PDMS(聚二甲基硅氧烷)。输液泵607与注入口606连接，从解析对象的生物体试样溶液槽602、清洗液槽603依次向支承基板601供给生物体试样溶液和清洗液，使用后废弃于废液槽612。若生物体试样溶液进入反应室内，则磁场产生装置608产生磁场，向支承基板601表面吸引磁微粒。被吸引的磁微粒与支承基板表面的粘接层接触，并固定。从输液泵607向反应腔605内放入清洗液并进行清洗。清洗后，进行荧光检测。激发光源609能够根据使用的荧光体的种类而适当选择。例如，在作为荧光标记用的荧光色素而使用量子点的情况下，光源能够用532nm(YAG激光)、或者水银灯来对应。从激发光源609产生的激发滤波器616和激发光通过透镜617，由分色镜610导向物镜611，并向支承基板601上照射。从支承基体601上的带荧光标记的分子发出的荧光相反地进入与激发光同轴的光路，由物镜611聚集后通过分色镜610，并通过成像透镜比613而成像在二维CCD照相机614的感光面上。激发光的散射光由吸收滤波器615除去。为了提高定量性，需要增加观察的亮点数。通过使可动工作台604动作，扫描支承基板601整个面，能够增加亮点数。如上述那样，通过利用输液泵607、注入口606、激发光源609以及荧光检测单元、磁场产生装置608、可动工作台604组装生物体分子分析装置，能够进行自动分析从而实现高速化。
实施例7
本实施例中，关于用于磁微粒701的固定的磁铁与支承基板的配置，参照图7，对优选在与实施例1～5的组合中使用的一个结构进行说明。本发明中使用的装置由于对平滑的支承基板702的表面进行扫描，从而单位面积固定的磁微粒701越多在生产率的方面越有利。另一方面，若单位面积的磁微粒701过多，则变得多层化，不在物镜的焦点深度内的磁微粒701增加，检测数降低。因此，为了实现高效的检测，优选磁微粒701高密度地固定，且形成薄的层。因此，发明了使用具有与支承基板702平行的磁力线704的强力的磁铁703来对磁微粒701进行固定的固定方法。
配置方法如下述。如图7所示，首先，在支承基板702上载置磁微粒701，接下来在磁场产生装置703上配置支承基板702。预先调查磁铁703的磁力线的朝向和强度，并以支承基板702表面的中央部分的磁力线704的方向平行的方式配置有支承基板702。进一步，通过进行几秒钟固定反应，能够如图8所示线状地固定磁微粒701。专心研究以上的配置位置的结果，可知通过将支承基板702配置于磁铁703的表面并且尽量配置于两极间的中央部分，通过使用比支承基板702大的磁铁703，进一步通过使用磁通密度较高的磁铁703，能够更加均匀且迅速地进行固定。
固定原理如下述。如图7所示，通常的磁铁在两极间形成描绘弧那样的磁力线704。此时，在磁铁703表面的中央部分，在两极间形成平行地连接的带状的磁力线704。由于本实施例中使用的磁微粒701具有顺磁性，所以通过从外部给予磁场来分别磁化，随着平行的磁力线704而磁微粒701彼此形成串珠状的直链(图8)。此时，在磁铁703的中心产生的平行的磁力与在两极产生的磁力相比，非常弱。因此，配置的磁微粒701优选以不被向两极拉拽的方式与极充分空开距离。就是说，优选在两极的中央部分配置，通过充分空开距离能够减少固定的偏斜。此处所述的充分是指，例如，能够通过将4mm见方的支承基板702的中心离各极的距离设为40mm来实现。另外，在磁铁703的中心部产生的平行磁场为了在支承基板702上固定磁微粒701，而需要与磁铁703垂直的磁力成分。因此，通过选择具有比较强力的磁力的磁铁703能够提高固定速度。这在高密度固定磁微粒701的方面也有利，具体而言优选0.1T以上的表面磁通量密度。本实施例中使用了φ8cm且0.5T的钕磁铁和4mm见方的支承基板702。若在磁铁703的极附近吸引磁微粒，则磁微粒的链沿与支承基板垂直的方向延伸。实际上，向相同体积内(4×4×0.13mm)导入等量(20pM)的磁微粒701(φ300nm)，并分别给予与支承基板702平行的磁通量和与支承基板702垂直的磁通量，该情况下，对于在支承基板702表面的相同焦点深度内的磁微粒密度而言，平行的磁通量一方约高8倍。由此能够确认到平行的磁通量对磁微粒的高密度固定有效。
符号的说明
101、401—抗原，102、201、302、403、507—磁微粒，103、405—荧光标记抗体，104、203、303、406、601—支承基板，105、204、304、407、511—粘接层，106、205、305、608—磁场产生装置，107、209、604—可动工作台，108—移液器，109、210、611—物镜，110—反应容器，202、301、504、506—荧光色素，206、306—侧壁，207、307—罩部件，208—软管，211、309—清洗液，308—紫外光，310—可见光，311—捕捉分子，402—抗体，404—量子点，501—试样核酸片段，502—标签分子，503—共有序列，505—核酸片段，508—捕捉序列，509—抗生物素蛋白，510—支承基体，602—生物体试样溶液槽，603—清洗液槽，605—反应腔，606—注入口，607—输液泵，609—激发光源，610—分色镜，612—废液槽，613—成像透镜，614—二维CCD照相机，615—吸收滤波器，616—激发滤波器，617—透镜，701—磁微粒，702—支承基板，703—磁铁，704—磁力线(磁通量)。

Claims (16)

1.一种分析装置，其为使用荧光色素对生物体关联分子进行定量的分析装置，
具备：支承基体；设为用于在该支承基体上对捕捉有生物体关联分子的磁微粒进行粘接的粘接层；激发荧光色素的激发机构；检测荧光的检测机构；以及能够对所述支承基体切换磁力的接通/断开、或磁力的强弱的磁场产生机构。
2.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，
设有使支承基体移动的可动工作台。
3.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，
在支承基体上具备流路，该流路具备连接有输液泵的取水口和排水口。
4.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，
作为所述荧光色素而使用量子点。
5.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，
作为所述粘接层的材料，使用从烷基链状分子、生物素分子中任一个选择的物质。
6.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，
作为所述粘接层的材料，使用响应热、光而在疏水性与亲水性间可逆变化的物质。
7.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，
作为所述磁场产生装置，使用电磁铁、可动式永久磁铁、组合有可动式磁场遮挡物的电磁铁、以及组合有可动式磁场遮挡物的永久磁铁中任一个。
8.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，
作为所述检测机构，使用反射型光学显微镜。
9.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，
使用同时识别两种以上的荧光色素的反射型光学显微镜。
10.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，
所述生物体关联分子是抗原分子，所述磁微粒的捕捉通过抗原抗体反应来实施。
11.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，
所述生物体关联分子是核酸分子，所述磁微粒的捕捉通过杂交来实施。
12.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，
所述荧光色素包括根据解析对象的生物体分子的每个种类而配合比例不同的多种荧光体。
13.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，
对特定的生物体关联分子以外的生物体关联分子使用相同的荧光色素，对每种所述生物体关联分子计算荧光亮点数后，算出每种特定的生物体关联分子的亮点数相对于总亮点数的比，从而对每种所述特定的生物体关联分子的存在量进行评价。
14.一种分析方法，其为使用荧光色素对生物体关联分子进行定量的分析方法，
在设有粘接层的支承基体上配置磁微粒，所述粘接层用于对捕捉有生物体关联分子的磁微粒进行粘接，
通过磁力，使磁微粒与支承基体碰撞，
断开磁力或者使磁力变弱，
激发荧光色素而检测荧光。
15.根据所述权利要求1～13中任一项所述的生物体分子分析装置，其特征在于，
在将所述磁微粒固定于所述支承基板时所使用的磁场产生机构配置为，给予与支承基板表面平行的磁通量。
16.根据所述权利要求1～13中任一项所述的生物体分子分析装置，其特征在于，
所述磁场产生装置给予支承基板的表面磁通量密度为0.1T以上。
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