CN107407675B

CN107407675B - 生物传感器盒的制造

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Publication number: CN107407675B
Application number: CN201680018666.7A
Authority: CN
Inventors: R.M.L.范里伊肖特; E.皮特斯
Original assignee: Koninklijke Philips NV
Current assignee: Koninklijke Philips NV
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2016-03-25
Publication date: 2020-03-17
Anticipated expiration: 2036-03-25
Also published as: JP2018509628A; WO2016151143A1; EP3274714A1; US20180067110A1; US10690663B2; JP6594995B2; EP3274714B1; CN107407675A

Abstract

本发明涉及一种加工装置（110）及制造这种装置的方法。在优选的实施例中，将磁性粒子（MP）、基质材料和挥发性载体的混合物沉积在反应表面（113）的结合位点（112）上。然后将沉积的混合物干燥，同时通过磁场（B）将磁性粒子（MP）从反应表面（113）拉开。因此可以防止磁性粒子与结合位点的非特异性结合。

Description

生物传感器盒的制造

技术领域

本发明涉及包括磁性粒子，特别是生物传感器盒的加工装置。此外，本发明涉及制造这种装置的方法。

背景技术

WO 2006/134546 A2、WO2006/079998和Bruls等人（“Rapid integratedbiosensor for multiplexed immunoassays based on actuated magneticnanoparticles”，Lab Chip，2009,9,3504-3510 - 2009年10月13日）公开了具有感测表面的磁性生物传感器，感测表面涂覆有结合位点，结合位点可以特异性结合到由磁珠携带或用磁珠标记的目标组分。文献进一步公开了用于动态地区分分别特异性地或非特异性地结合到结合位点的各磁珠的各种步骤。

发明内容

有利地，提供允许以更高准确度检测相关分析物的手段。

这个目的由根据权利要求1的方法和根据权利要求7的加工装置来解决。优选实施例在从属权利要求中公开。

根据第一方面，本发明涉及一种用于制造包括磁性粒子的加工装置的方法。该方法包括以下步骤：

a）将包含磁性粒子、第一材料和第二材料的一定量的液体混合物沉积到加工装置的表面（“沉积表面”）上。在下文中将第一材料称为“基质材料”，因为它在装置完成后用作一种基质，第二材料将被称为“挥发性载体”，因为它主要用作磁性粒子的载体和在后来蒸发的基质材料。

“基质材料”可以是例如糖化合物（例如蔗糖、海藻糖、葡聚糖、山梨糖醇等及其组合）或具有高于室温的玻璃化转变温度的更广泛意义上的无定形玻璃化材料，或聚合物。

如文献中所知，“挥发性物质”比水更易挥发。例如，如果基质材料是聚合物，则可以使用有机溶剂。

因此，在去除挥发性物质之后，通常保留“玻璃状基材”（基质）。

“沉积表面”可以由任何类型的材料制成，例如COP（“环烯烃共聚物”）、聚苯乙烯、PMMA、玻璃、纤维素。

b）将上述混合物的磁性粒子拉到混合物内的所需位置。

c）通过去除挥发性载体干燥混合物。

该方法的步骤可以以列出的或任何其它适当的顺序执行。特别地，牵拉步骤b）可以（至少暂时地）与沉积步骤a）并行地执行，与干燥步骤c）并行地进行，或者与沉积步骤a）和干燥步骤c）并行地进行。最优选地，其与干燥步骤c）并行执行。

加工装置通常可以用于任何目的，特别是使用由装置包括的磁性粒子来加工样品或物质。这种加工的典型示例是借助于特异性结合到目标分子的磁性粒子来检测生物样品中的目标分子。

术语“磁性粒子”应包括永久磁性粒子以及可磁化粒子，例如超顺磁珠。磁性粒子的尺寸通常在3 nm至50μm之间，特别是在100 nm至2μm之间，或特别是约500 nm。此外，磁性粒子可以包括用于实际相关的目标组分的结合分子。

术语“干燥”意味着，在去除挥发性载体后，初始液体混合物固化，留下基质材料和磁性粒子。在典型应用中，混合物包括磁性粒子和其它组分，在挥发性载体（例如水）蒸发后该其它组分产生固定磁性粒子并保持生物组分稳定的基质。

将磁性粒子拉到混合物内所需的位置可以通过适当的磁场来实现，通常要求所述磁场在磁性粒子的位置具有非零梯度。作为补充或替代，牵拉可以通过重力和/或惯性力或离心力的作用来实现。在这种情况下，基质材料和磁性粒子根据其密度彼此分离，较高密度的材料相对于有效力的方向采取低于较低密度材料的位置。在磁性粒子具有比基质材料更高密度的典型情况下，干燥可以例如以沉积表面、基质材料和磁珠的颠倒排列（相对于重力从顶部到底部）来进行。

由于给定的设计或加工准则，磁性粒子可以被拉到混合物内任何需要的位置。特别地，混合物的磁性粒子可以从沉积表面拉开。这产生了包括不会立即接触沉积表面的磁性粒子的加工装置，因为磁性粒子例如由磁场从它拉开，其中这种构造在干燥步骤期间被固定或“冻结”。结果是，防止磁性粒子与沉积表面的接触具有若干优点，这将在下面关于本发明的具体实施例更详细地讨论。

换句话说，术语“离开（拉开）”是指磁性粒子离表面足够远，以不与其（化学地和/或物理地）有特异性和非特异性结合（或相互作用）。特别优选的是，在该过程中珠不触及表面。

根据该方法的优选实施例，可以在牵拉步骤b）期间产生的磁场具有基本垂直于沉积表面的非零梯度。然后，磁性粒子将倾向于形成基本上平行于沉积表面延伸的链。

通常，沉积表面可以是适合于加工装置的预期应用的固体的任何类型的表面，例如盒的覆盖物（或层合物）上的表面。在优选的实施例中，上面沉积了混合物的表面可以是称为“反应表面”的表面，因为在加工装置的使用期间发生物理和/或化学反应。此外，所述反应表面可以至少局部地涂覆有能特异性结合目标物质的结合位点。反应表面可以例如包括涂覆有这种结合位点的一个或多个斑点。结合位点可以特别地是可以特异性结合样品中的目标组分的分子，例如结合到相关抗原的抗体。

关于将上述结合位点如何能够与磁性粒子组合使用以检测样品中的目标物质的方式存在几种可能性。在竞争测定中，磁性粒子可以例如具有与目标物质竞争结合位点的表面分子。给定样品中目标物质的浓度越高，磁性粒子结合到反应表面的机会越少。因此，结合到反应表面的磁性粒子的定量测定将允许确定目标物质的浓度。另一个示例是夹心测定法，其中需要目标物质将结合位点联结到磁性粒子。

在本发明的另一个实施例中，在沉积步骤a）之前用（优选可逆地）结合到“结合点”的阻断物质处理沉积表面。在这种情况下，术语“结合点”被用作沉积表面上的任何实体的通用表达，测定组分可以永久或暂时地结合到该实体，“结合点”包括用于具有或不具有分析物的磁珠的（特异性和非特异性）结合位点。使用阻断物质的处理防止磁性粒子与在沉积表面上的所述结合点形成不期望的（特异性的或非特异性的）结合，同时它们仍然在步骤a）中施加的液体混合物内自由移动。通过减少这种不期望的结合的数量，可以由于空白（即，当没有相关分析物可用时的测定响应）的减少来增加测定的检测水平。阻断物质可以至少部分地停留在结合点以在将要用加工装置执行实际测定期间防止（非）特异性结合。

挥发性载体可以是适用于随手应用与基质材料和磁性粒子相容的任何物质。特别地，挥发性载体可以是或包括水性液体如水。干燥步骤c）可以简单地包括水从混合物的自然发生的蒸发，可能通过升高温度和/或强制通风来辅助或加速这种蒸发。

根据第二方面，本发明涉及一种加工装置，特别涉及一种生物传感器盒，其包括以下部件：

- 表面（即具有表面的部件或主体，在下文中所述表面称为“沉积表面”）。

- 设置在所述沉积表面上的基质材料层。

- 设置在基质材料的（适当的）子区域中的磁性粒子（例如，在基质层的顶部）。因此，磁性粒子在基质材料中具有非均匀分布，在所述子区域中具有较高的浓度，并且在基质材料的（非空）剩余部分中具有较低的浓度。优选地，所述子区域外的磁性粒子的浓度为零。

加工装置可以特别地通过上述方法制造。因此，对于该方法及其变型的解释说明也适用于加工装置，反之亦然。加工装置的优点在于，可以使用磁性粒子的不均匀分布来有利地影响在该装置中执行的加工步骤。

根据第二方面的加工装置或根据第一方面的方法制造的加工装置的优选实施例，磁性粒子形成基本平行于沉积表面定向的链。在该方法中，该条件在干燥步骤c）完成后将被特别地满足，但也可在其它步骤中实现。

在另一个优选实施例中，磁性粒子与沉积表面相距一定距离。因此，基质材料布置在沉积表面与磁性粒子之间，其优点在于防止磁性粒子与表面的不期望的结合。换句话说，术语“离开（拉开，远离）”是指磁性粒子离表面足够远，不与其（化学和/或物理）相互作用。在该实施例中，包括磁珠的子区域可以特别地是基质材料的顶层，或者与表面不接触的任何其它区域，使得磁性粒子不与其相互作用。

在方法和/或加工装置的另一个实施例中，基质材料包括选自蔗糖、盐、缓冲组分、阻断组分和测定试剂中的至少一种材料。

另外或替代地，基质材料可选地是水溶性的。

根据该方法和/或（一个或多个）加工装置的另一个实施例，加工装置可以包括允许对结合到装置的反应表面的磁性粒子进行光学检测的光学部件。所述光学部件可以例如包括上面形成有反应表面的透明体，其中所述主体被适当地成形以将来自光源的光引导到反应表面和/或引导源自反应表面（例如通过反射）的光到（例如外部）光传感器。在这种情况下，加工装置可以特别地被设计为一种盒，其通过例如在WO 2008/155716A1或WO 2008/115723A1（其通过引用并入本文中）中详细描述的受抑全内反射（FTIR）进行光学检测，或者例如使用楔形光学结构在结合斑点处的“双折射检测”（例如参见WO 2009/125339 A2，其通过引用并入本文中）进行光学检测。其它示例包括单珠的光学检测（例如参见WO 2011/036634A1，其通过引用并入到本文中）。

在本发明的另一实施例中，磁性粒子可以设置在目标位置的上游，其中术语“上游”应当相对于加工装置中的流体的预期流动来理解。“目标位置”可以是加工装置内的任何位置，其中在用装置执行测定期间期望存在磁性粒子。磁性粒子优选地安置在这样的位置，以使得磁性粒子被填充加工装置的流体正好输送到目标位置。目标位置可以例如是可特异性结合样品的目标物质的结合位点的斑点。

附图说明

参考下文描述的实施例，本发明的这些和其它方面将是显而易见的。

在图中：

图1示意性地示出了包含磁性粒子的液滴在反应表面上的沉积，并且通过磁场将所述磁性粒子从表面拉开；

图2示意性地示出了在完成图1所示的步骤之后获得的盒；

图3示出了使用不同制造方法的测试中结合到反应表面的磁珠的照片；

图4是表示图3的测试中的结合磁性粒子的计数（纵轴）的图。

图5是从明视野显微镜拍摄的图，示出了在使用本发明之后具有磁性粒子链的干燥斑点。

图6是从明视野显微镜拍摄的图，示出了没有使用本发明的没有任何磁性粒子链的干燥斑点。

相同的附图标记在附图中指出为相同或相似的部件。

具体实施方式

体液中标记分子的特异性检测可以例如在生物传感器平台中实现，生物传感器平台例如可以是Magnotech®技术或本申请人开发的单珠检测。标记分子的一个示例是用于检测心血管疾病的肌钙蛋白I（cTnI）。检测技术基于与盒的“反应表面”上的“磁性粒子”（例如超顺磁性纳米粒子或珠粒）的光学检测相组合的免疫测定。所提到的平台通过在表面附近产生一个消逝的光学场，使用全内反射（TIR）照明。

在上述技术的典型实施例中，盒可以包括基部（由流体结构、反应腔室、反应斑点和光学检测组成），层合体（用于封闭盒并将磁珠置于反应腔室中）和（用于从血液样品中的血浆部分过滤细胞部分的）血液容器。磁珠设置在层合体的顶部上，层合体放置在盒的顶部上，使得珠子在反应腔室内。为了降低盒的成本并简化生产过程，珠可以替代地放置在反应腔室的基部部分上存在的反应斑点的顶部上。

在WO 2009/024922 A1（其通过引用并入本申请）中，描述了用于使用磁场将磁珠存储在反应位点附近的方法，以确保珠子靠近传感器表面以进行快速反应和相互作用。然而，在某些应用中，观察到在干燥过程中存在磁珠与基部的相互作用（通常是非特异性的）。非特异性结合的磁性粒子可以随后降低检测水平（LoD）和减小动态范围。

为了解决上述问题，本发明的一个实施例提出将磁珠从反应表面拉开，例如通过在干燥期间在包括磁珠的液滴上施加磁场或通过沉降（即重力）。这将磁珠定位到液滴顶部，防止与反应表面相互作用。在去除磁场之后，干燥的珠滴的玻璃态可以防止磁珠与反应表面相互作用。此外，磁体的构造通常产生基本上平行于反应表面的磁珠链，其被从表面向上拉（参见图5，与图6相比）。所述链可以在干燥后检测到，例如，在明视野显微镜图像中，并且允许将所获得的干燥体与通过常规步骤获得的主体进行区分。

图1示意性地示出了根据上述构思的实施例的通过盒110的基部111的截面。基部111具有反应表面113，反应表面113在x、y方向上延伸并且携带检测斑点，检测斑点具有用于目标分子的结合位点112（通常反应表面具有多个这样的检测斑点，检测斑点具有用于相同或不同目标分子的结合位点）。此外，包含磁性粒子MP、“基质材料”和挥发性载体（例如水）的混合物的液滴D已经沉积在结合位点112上。

该图还示出了磁场发生器，这里是永久磁体120，其在液滴D上方布置（在z方向上），其轴线在平行于反应表面113的x方向上延伸。调整磁体120与反应表面113的距离，使得在液滴D内产生基本上平行于反应表面并且具有基本上垂直于所述表面（即指向z方向）的场梯度的磁场B。由于所述场梯度，磁性粒子MP被吸引朝向磁体120，即从反应表面113拉开，并收集在液滴D的顶表面。因此，防止磁性粒子MP与结合位点112之间的接触并且因此防止了磁性粒子MP与结合位点112的不希望的结合。

在盒的典型实施例中，磁体120与磁珠MP之间的距离小于约10 mm，以将磁珠适当地拉到液滴的一侧。然而，为防止磁珠迁移到液滴之外，该距离应该不会太小（例如<1 mm）。

也可以使用垂直于反应表面的磁场（即在z方向上延伸）。然而，所得到的磁性粒子链通常在液滴内垂直于反应表面（即在z方向）占据更大的深度。当施加平行于反应表面的磁场时（如图1所示），磁珠链将占据更小的深度，这在具有垂直于反应表面的有限厚度的液滴中是优选的（液滴 D直径通常在约50μm至约100μm之间）。

当图1的构造保持一段时间时，液滴D的挥发性载体将最终蒸发。该过程可选地通过液滴D的温度（中等）增加和/或沿着液滴D的干燥空气的通风来支持。

可选地，可以应用额外的阻断步骤以进一步降低磁珠非特异性结合到反应表面的机会。阻断步骤可以特别包括惰性蛋白质（例如BSA，酪蛋白）的添加，该惰性蛋白质在结合点内和结合点外均（可逆地）结合（非特异性）到结合点。因为结合斑点内的区域可能含有蛋白质（例如作为结合位点112的抗体），所以其基本上已被阻断。

图2示出了完全去除挥发性载体之后的情况。形成固体物质，其包括在紧邻反应位点112上方的基质材料MX的主体和在所述基质材料的顶部内的一层磁性粒子MP。因此，在磁性粒子MP与结合位点112之间的空间分隔已被永久固定。此外，基质材料MX的典型玻璃体防止结合位点（例如蛋白质，抗体）降解。最终将层合体或覆盖物114附连到基部111以便闭合盒110的（一个或多个）反应腔室、通道等（这些细节在附图中未示出）。

在替代实施例中，层合体或覆盖物114在干燥之前且施加所述磁场之前或期间或之后被施加到基部部分111上。在这种情况下，可选地通过施加朝向覆盖物114的表面（并远离表面的基部部分111）的吸引磁性粒子MP的适当磁场，覆盖物114可以进一步被布置成将磁性粒子MP保持或附连到其表面上。在该实施例中，可以将磁性粒子施加在覆盖物114的表面上的液体混合物或液滴D中（而不是在基部111上）。此后，可以将覆盖物114与基部111组装，在组装期间或正好组装之后施加磁场，将混合物D的磁性粒子MP拉到混合物D的期望位置处（例如朝向覆盖物114的表面），最后干燥。替代地，液滴D可以插入在已经相互组装的覆盖物114与基部111之间，并且之后实施本发明。

当使用盒110时，将在反应腔室中填充液体样品（未示出），将磁性粒子MP和基质材料MX溶解在结合位点112上方。然后可以继续检测样品中的目标组分（或任何预期的测定）。

在盒110使用期间，可能出现的问题是，如果盒的填充速度慢，则磁珠MP被拉到反应腔室的出口，即远离结合位点112。并非将具有基质材料MX（基质材料MX具有磁珠MP）的液滴沉积在结合位点112上方，这些组分因此可选地安置在结合位点112 “上游”位置处，以补偿填充期间的位移。作为补充或替代，液滴的定位可以基本上保持原样，但是磁珠在液滴中的分布改变，使得珠子集中在位于“上游”的子区域中。这可以在干燥过程中通过磁场将磁珠滴中的珠子拉向反应腔室的入口（其可以例如在图1、图2中的加工装置的左侧），在图1的布置的修改中实现。在填充盒期间，珠子继而再次被朝向出口运输，然而它们现在止于结合位点112的上方。

当将磁珠施加到覆盖物114（腔室的顶部）时，也可以使用上述方案，其中珠粒再分散体也是重要的。因此，基质材料、挥发性载体和磁珠的液滴也可沉积在覆盖物114上并被干燥，同时磁场将磁性粒子拉到液滴内的“上游”位置。

在所描述的步骤的具体实施例中，磁珠MP已经以约50 nl的量在抗体斑点112顶部的基部部分111上配给。磁珠包含在含有缓冲成分、盐和蔗糖等的溶液中。配给后，磁珠在约37℃下干燥约30分钟。在该干燥过程中，使用产生平行于反应表面的场的磁体在约5 mm距离施加外部磁场。在干燥阶段之后，去除磁场，并使用正常步骤加工该盒。

使用单珠检测技术来测量用于不同制备步骤的非特异性结合的减少。该技术提供了显示结合到该表面的磁珠的量的表面特异性图像。磁珠的量可以直接转换为FTIR信号变化。

图3显示了在空白样品（不含目标分析物的血浆池）的洗涤阶段期间通过单磁珠成像获得的反应表面的四个图像。图像中的每个暗斑点对应于结合到反应表面的磁珠。四幅图像的制备条件如下：

- 图像A（左上图）示出了没有任何阻断处理并且在干燥期间不施加磁场而获得的反应表面。

- 图像B（右上图）显示了没有任何阻断处理但在干燥期间施加磁场而获得的反应表面。

- 图像C（左下图）示出了进行了阻断处理而在干燥期间不施加磁场获得的反应表面。

- 图像D（右下图）示出了进行了阻断处理并且在干燥期间施加磁场获得的反应表面。

图3的图像清楚地表明，在干燥阶段施加磁场会降低磁珠与反应表面的非特异性相互作用时间。当紧随磁场之后施加阻断步骤时，非特异性相互作用的量进一步降低并且恢复到通常仅在将磁珠按计量配给在层合体上时才能看到的水平，因此在干燥期间不与表面相互作用。

图4以图示出了用于图3所示的四种不同构造A、B、C和D的磁珠计数的结果（纵轴表示计数的珠数）。阴影线条“in_Sp”对应于印刷抗体斑点的相关区域（ROI）内的磁珠计数（面积校正）。白条“out_Sp”对应于印刷斑点外的区域。

磁珠计数用于测试“D”的构造，与磁珠在层合体上按计量配给时和因此当加工期间磁珠与表面不存在相互作用时所见的珠数不相上下。

与其中磁珠设置在盒盖上的技术相比，当在“脏基质”（即血液）中进行测量时，所描述的方案具有优点。这是因为将磁珠放置在反应/结合表面的顶部减少了变化，并提高了测定性能。这是由于血液细胞使得珠粒从层合体到反应/结合表面的输送变得困难所致。

总之，已经描述了本发明的实施例，其中磁性粒子、基质材料和挥发性载体的混合物沉积在反应表面的结合位点上。然后将沉积的混合物干燥，同时通过磁场将磁性粒子从反应表面拉开。因此可以防止磁性粒子与结合位点的非特异性结合。

虽然已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是这样的说明和描述将被认为是说明性的或示例性的而不是限制性的；本发明不限于所公开的实施例。本领域技术人员通过研究附图、公开内容和所附权利要求，可以理解和实现对实施要求保护的发明的其它变型。在权利要求书中，“包括”一词并不排除其它元素或步骤，并且一个或一个（不定冠词“一”或“一个”）不排除多个。单个处理器或其它单元可以实现权利要求中所描述的若干项目的功能。在相互不同的从属权利要求中记载某些措施的事实并不表示这些措施的组合不能有利地使用。权利要求中的任何附图标记不应被解释为限制范围。

Claims

1.一种制造包括磁性粒子（MP）的加工装置（110）的方法，所述方法包括以下步骤：

a）将包含磁性粒子（MP）、基质材料（MX）和挥发性载体的液体混合物（D）沉积到所述装置的表面（113）上；

b）将所述混合物（D）的磁性粒子（MP）从所述表面拉开到所述混合物内的所需位置；

c）通过去除挥发性载体来干燥所述混合物（D），

其中所述所需位置包括所述混合物的液滴的顶部，或者离该表面足够远以使得所述磁性粒子不与所述表面相互作用的任何其它区域。

2.根据权利要求1所述的方法，

其特征在于，在步骤b）中，所述混合物（D）的磁性粒子（MP）被磁场（B）牵拉。

3.根据权利要求2所述的方法，

其特征在于，所述磁场（B）的非零梯度被定向成基本上垂直于所述表面（113）。

4.根据权利要求1所述的方法，

其特征在于，所述表面是反应表面（113），该反应表面至少局部地涂覆有能够特异性结合目标物质的结合位点（112）。

5.根据权利要求1所述的方法，

其特征在于，所述表面（113）在所述沉积步骤c）之前用结合到结合点的阻断物质进行处理。

6.根据权利要求1所述的方法，

其特征在于，所述挥发性载体包含水性液体。

7.一种加工装置，特别是生物传感器盒（110），包括：

- 表面（113）；

- 设置在所述表面（113）上的基质材料层（MX）；

- 设置在所述基质材料（MX）的子区域中的离所述表面（113）一定距离的磁性粒子（MP），

其中所述子区域包括所述基质材料的顶层，或者离该表面足够远以使得所述磁性粒子不与所述表面相互作用的任何其它区域。

8.根据权利要求7所述的加工装置（110），

其特征在于，所述磁性粒子（MP）形成基本平行于所述表面（113）定向的链。

9.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求7所述的加工装置（110），

其特征在于，所述磁性基质材料（MX）包含至少一种选自蔗糖、盐、缓冲组分、阻断组分和测定试剂的材料。

10.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求7所述的加工装置（110），

其特征在于，所述基质材料（MX）是水溶性的。

11.根据权利要求7所述的加工装置（110），

其特征在于，其包括光学部件（111），该光学部件允许结合到所述装置（110）的反应表面（113）的磁性粒子（MP）的光学检测。

12.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求7所述的加工装置（110），

其特征在于，所述磁性粒子（MP）相对于所述加工装置（100）中的流体的预期流动而言设置在目标位置的上游。

13.根据权利要求12所述的方法或加工装置（110），

其特征在于，所述目标位置包括可以特异性结合目标物质的结合位点（112）。

14.加工装置（110），其包括表面和以干燥状态存储的磁性粒子，所述磁性粒子位于远离所述表面处并且根据磁性粒子链布置，其中远离所述表面处包括所述基质材料的顶层，或者离该表面足够远以使得所述磁性粒子不与所述表面相互作用的任何其它区域。