CN115667928A - 用于生物分子、生物细胞器、生物颗粒、细胞和微生物检测的方法、系统、制品、试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本文公开了一种检测样品中靶分析物的存在的方法及其系统、制品和试剂盒，其中所述靶分析物包括生物分子、生物细胞器、生物颗粒、细胞和微生物。在某些实施方案中，检测靶分析物的方法包括以下步骤：(I)提供具有感测元件的多个探针颗粒，所述感测元件能够与结合到包被有另一感测元件的表面的靶分析物特异性相互作用，(ii)施加机械力(例如磁力)以去除非特异性结合的探针颗粒，以及(ill)通过颗粒密度、聚集体尺寸或颜色密度测量特异性结合的探针颗粒或非特异性结合的探针颗粒的量。在一个实施方案中，所述靶分析物是SARS‑CoV‑2。

Description

用于生物分子、生物细胞器、生物颗粒、细胞和微生物检测的 方法、系统、制品、试剂盒及其用途

相关申请的引用

本申请要求2020年5月29日提交的新加坡申请号10202005073Y的优先权，其公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及生物分子、生物细胞器、生物颗粒、细胞和微生物检测领域。具体而言，本发明涉及使用靶分析物-探针颗粒特异性相互作用在机械力作用下进行的靶分析物检测。

背景技术

对于病毒和微生物检测，目前可采用基于病毒RNA或DNA的技术，例如基于RT-PCR的测定(Ian M.Mackay等人,Nucleic Acids Res,2002,30(6):1292–1305)。目前可采用基于抗体的检测，例如1)酶联免疫吸附测定(ELISA，Eva Engvall和Peter Perlmann,JImmunol,1972,109(1):129-135),2)基于免疫金标记的测定，以及3)化学发光微粒免疫测定(Abbott Laboratories Inc.)。然而，这些方法可能需要荧光标记或酶附着，这可能会因标记而影响结果。

其他诊断方法，例如基于表面等离子共振(SPR)的测定，依赖于表面等离子共振信号。在基于SPR的测定中，表面非特异性相互作用的干扰可能导致假阳性信号。

需要开发具有不同检测原理的用于生物分子、生物颗粒、生物细胞器、细胞和微生物检测的方法，以克服或改善现有技术的一个或多个限制。

发明内容

提供了用于在广泛的环境条件下检测生物分子、生物颗粒、生物细胞器、细胞和微生物的通用的无荧光标记的方法，其基于特异性靶分析物-探针颗粒相互作用的机械选择而具有单分子灵敏度和增强的准确性。这种新方法能够对怀疑的人样品中的生物分子、生物颗粒、生物细胞器、细胞和微生物进行快速、低成本的集中或即时(point-of-care)诊断和家庭自我诊断。

此处描述的方法原理也适用于快速、准确和灵敏地检测任何单价或多价靶标，例如病毒、抗体、外泌体、抗体、病原体相关分子和污染物。所述方法可作为疾病诊断、生物药物开发和环境监测的新平台。

在一个方面，本公开涉及一种检测样品中靶分析物的存在的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将所述样品与包被有第一感测元件的表面一起孵育，其中所述第一感测元件能够与所述靶分析物特异性结合，并且其中在孵育的同时或孵育之后，当所述样品中存在所述靶分析物时，所述靶分析物与所述包被的表面上存在的所述第一感测元件结合；

b)将步骤(a)的所述包被的表面与多个探针颗粒一起孵育，其中所述探针颗粒包被有第二感测元件，所述第二感测元件能够与结合在所述包被的表面上的所述靶分析物特异性相互作用或能够与所述包被的表面上的所述第一感测元件特异性相互作用；

c)施加机械力以将步骤(b)的非特异性结合的探针颗粒从所述包被的表面分离；以及

d)测量反映所述包被的表面上特异性结合的探针颗粒的量的特性，其中所述特性选自由以下组成的组：颗粒密度、颜色密度、聚集体尺寸及其组合，或测量反映非特异性结合的探针颗粒的量的特性，其中所述特性选自由以下组成的组：颜色密度、聚集体尺寸及其组合。

有利地，所述方法可以是通用的，使得任何具有已知宿主受体的病毒和/或针对病毒表面蛋白的抗体、具有已知抗原或任何抗原的任何抗体都可以通过所述方法检测。所述方法不需要像在ELISA中那样使用荧光标记或酶附着就能在广泛的环境条件下检测广泛种类的靶分析物，包括微生物。因此，所述方法消除了荧光标记和光漂白的影响，避免了荧光检测或光吸收检测(ELISA)的设备成本。

进一步有利地，可以在所述方法中使用特异性靶分析物-探针颗粒相互作用来实现单靶标检测灵敏度，从而可以在小体积(<30μl)中检测到低至飞摩尔(femtomolar)的低浓度靶分析物，因此需要的样品量减少。这些特征进而使得能够进行疾病的早期诊断。

更进一步有利地，所述方法使用以通过施加机械力来进行选择的特异性靶分析物-探针颗粒相互作用，以确保检测的高准确度和高特异性。因此，与其他检测方法相比，所述方法中出现假阳性结果的可能性可被显著降低。可以使用一组探针颗粒或用不同的第一感测元件包被多孔板中不同孔的表面来进行平行正交检测，以提高检测的通量。进一步有利地，所述方法不需要使用洗涤步骤(如ELISA中所需的)。

更进一步有利的是，所述方法可用于通过IgG/IgM/IgA测试和中和活性评估二者来检测抗体。因此，所述方法可以在同一方法中同时实现IgG/IgM/IgA测试和中和抗体(Nab)测试。

更进一步有利地，所述方法产生不同类型的读出，允许所述方法在不同的临床环境中用于诊断，例如在家庭自我诊断中作为即时检测，或在中心实验室中作为实验室测试。

在另一方面，本公开涉及一种用于检测样品中靶分析物的存在的系统，所述系统包括：

a)包被有第一感测元件的表面，其中所述第一感测元件能够与所述靶分析物特异性结合；

b)多个探针颗粒，其中所述探针颗粒包被有第二感测元件，所述第二感测元件当所述靶分析物存在时能够与所述靶分析物特异性相互作用或能够与所述包被的表面上的所述第一感测元件特异性相互作用，从而在所述包被的表面上形成特异性结合的探针颗粒；

c)机械力，其能够将非特异性结合的探针颗粒从所述包被的表面分离；和

d)测量装置，其用于测量所述特异性结合的探针颗粒的特性，其中所述特性选自由以下组成的组：所述特异性结合的探针颗粒的颗粒密度、颜色密度、聚集体尺寸；或用于测量所述非特异性结合的探针颗粒的特性，其中所述特性选自由以下组成的组：所述非特异性结合的探针颗粒的颜色密度、聚集体尺寸。

有利地，所述系统可以针对生物分子、生物细胞器、生物颗粒、细胞和微生物的检测进行专门设计，以用于使用人样品例如血清、唾液、鼻拭子和尿液的实际临床试验。因此，系统可以允许检测患者样品中的靶病毒并检测由特定病毒感染诱导的抗体。

在另一个方面，本公开涉及一种用于检测样品中靶分析物的存在的制品，所述制品包括：

至少一个测试孔，其包括包被有第一感测元件的底表面，所述第一感测元件被配置为与所述样品中的所述靶分析物结合，其中所述测试孔被配置为接收包含在一种或多种液体介质中的样品和探针颗粒，所述探针颗粒包被有被配置为与选自由所述第一感测元件和所述靶分析物组成的组中的一种结合的第二感测元件，使得所述探针颗粒取决于所述样品中所述靶分析物的存在而特异性结合到所述包被的表面；和

通道，其在距所述底表面一定距离处连接到所述测试孔以允许所述通道和所述测试孔之间的流体连通，其中所述通道被配置为在对探针颗粒施加外力后接收所述测试孔中的非特异性结合的探针颗粒，所述外力将所述非特异性结合的探针颗粒移离所述底表面。

在另一个方面，本公开涉及一种用于检测样品中靶分析物的存在的试剂盒，所述试剂盒包括：

如本文所公开的制品；

包被有第二感测元件的探针颗粒，所述探针颗粒被包含在溶液中；和

被配置为对所述探针颗粒施加外力的仪器。

有利地，所述试剂盒可允许进行高通量筛选，从而在短时间内快速检测大量样品。所述试剂盒还可以提供对所靶向的分析物或治疗剂的低成本和快速诊断，这可以适用于临床环境中的应用，例如需要大批量、廉价且快速诊断的中心实验室测试。

进一步有利地，所述试剂盒可易于使用，因为归因于特异性靶分析物-探针颗粒相互作用和去除包被的表面上的非特异性结合的探针颗粒所需的特定力，靶分析物的检测具有高特异性，因此导致在使用试剂盒时排除了洗涤步骤。因此，所述试剂盒的使用可以是省时的。

进一步有利地，所述试剂盒可以容易地用作中心实验室测试试剂盒或即时诊断试剂盒或家庭自我诊断试剂盒。

有利地，所述试剂盒可以允许探针颗粒和测试样品的正确混合以及将混合物引入测试孔中并去除非特异性结合的探针颗粒，而无需借助像微量移液器这样的精密实验室设备。这使得测试可以由非专业人员在非实验室环境中进行。通过与基于智能手机的成像或肉眼检测相结合，所述试剂盒可实现即时检测和家庭自我检测。

在另一个方面，本公开涉及一种使用如本文公开的试剂盒的方法，所述方法包括以下步骤：

将包含在一种或多种液体介质中的样品和探针颗粒引入制品中；

对所述探针颗粒施加所述外力以使所述非特异性结合的探针颗粒移离所述测试孔的所述底表面并进入所述通道；

分析选自由所述测试孔和所述通道组成的组中的至少一个中的所述探针颗粒，从而确定所述样品中所述靶分析物的存在。

在另一方面，本公开涉及如本文所述的系统、或制品或试剂盒用于检测生物分子、生物细胞器、生物颗粒、细胞或微生物的用途。

有利地，所述系统或制品或试剂盒的用途可以针对生物分子、生物细胞器、生物颗粒、细胞或微生物的检测进行专门设计，以用于使用人样品例如血清和尿液的实际临床试验。因此，所述系统或制品或试剂盒的用途可以允许检测患者样品中的靶病毒或检测由特定病毒感染诱导的抗体。

进一步有利地，可以以高通量规模使用所述系统、或制品或试剂盒，从而在短时间内快速检测大量样品。如果需要，所述系统或制品或试剂盒的使用也可以大规模地进行，或者可以很容易地视需要扩大到更大的规模。

定义

本文使用的下列词语和术语应具有所示含义：

当与探针颗粒关联使用时，术语“非特异性结合”或“非特异性地结合”是指探针颗粒未强力地结合(即，既不直接结合也不经由中间的靶分析物颗粒结合)至包被的表面，因此将通过施加机械力而被更快地去除。

当与探针颗粒关联使用时，术语“交联”或“连接”是指探针颗粒特异性地结合(直接结合或经由中间的靶分析物颗粒结合)至包被的表面，因此很难在校准检测时间内通过施加机械力而被去除。

术语“交联测定”或“连接测定”是指这样的测定：其中存在探针颗粒与包被的表面的特异性结合(直接结合或经由中间的靶分析物颗粒结合)，因此很难在校准时间内通过施加机械力来去除探针颗粒。此外，对于“交联测定”或“连接测定”而言，在包被的表面上存在的特异性结合的探针颗粒越多，在样品中检测到的靶分析物浓度水平越高。

当与探针颗粒关联使用时，术语“阻断”或“分离”是指由于样品中存在与探针颗粒竞争或阻止探针颗粒结合到包被的表面的靶分析物，因而探针颗粒与包被的表面之间不存在特异性结合。

术语“阻断测定”或“分离测定(un-linking assay)”是指这样的测定：其中由于样品中存在与探针颗粒竞争或阻止探针颗粒结合到包被的表面的靶分析物，因而探针颗粒与包被的表面之间不存在特异性结合。此外，对于“阻断测定”或“分离测定”而言，在包被的表面上的特异性结合的探针颗粒越多，在样品中检测到的靶分析物浓度水平越低。

术语“探针颗粒”是指这样的颗粒：当对所述颗粒施加机械力时，所述颗粒可以被扰动(吸引或排斥)，导致其解离或运动。

术语“非诱饵(non-bait)分子”是指源自生物细胞器、病毒、细胞或微生物的生物分子、或生物颗粒、或材料或产物，当将其包被在表面上时，其不能使一种或多种靶分析物颗粒交联到所述表面。

除非另有说明，否则术语“包括”、“包含”、“含有”及其语法变体旨在表示“开放性”或“包括性”语言，使得它们包括列举的要素但也允许包括另外的、未列举的要素。

如本文所用，在制剂的组分浓度的上下文中，术语“约”通常意指所述值的+/-5％，更通常所述值的+/-4％，更通常所述值的+/-3％，更通常所述值的+/-2％，甚至更通常所述值的+/-1％，并且甚至更通常所述值的+/-0.5％。

在整个本公开中，某些实施方案可以以范围形式公开。应当理解，范围形式的描述仅是为了方便和简洁，不应理解为对所公开范围之范围的硬性限制。因此，范围描述应被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对例如1至6的范围描述应被认为已经具体公开了例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及该范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这均适用。

具体实施方案

现将公开检测样品中靶分析物的存在的方法的示例性、非限制性的实施方案。

检测样品中靶分析物的存在的方法包括以下步骤：

a)将所述样品与包被有第一感测元件的表面一起孵育，其中所述第一感测元件能够与所述靶分析物特异性结合，并且其中在孵育的同时或孵育之后，当所述样品中存在所述靶分析物时，所述靶分析物与所述包被的表面上存在的所述第一感测元件结合；

b)将步骤(a)的所述包被的表面与多个探针颗粒一起孵育，其中所述探针颗粒包被有第二感测元件，所述第二感测元件能够与结合在所述包被的表面上的所述靶分析物特异性相互作用或能够与所述包被的表面上的所述第一感测元件特异性相互作用；

c)施加机械力以将步骤(b)的非特异性结合的探针颗粒从所述包被的表面分离；以及

d)测量反映所述包被的表面上特异性结合的探针颗粒的量的特性，其中所述特性选自由以下组成的组：颗粒密度、颜色密度、聚集体尺寸及其组合，或测量反映非特异性结合的探针颗粒的量的特性，其中所述特性选自由以下组成的组：颜色密度、聚集体尺寸及其组合。

检测样品中靶分析物的存在的方法可以包括以下步骤：

a)将所述样品与包被有第一感测元件的表面一起孵育，其中所述第一感测元件能够与所述靶分析物特异性结合，并且其中在孵育的同时或孵育之后，当所述样品中存在所述靶分析物时，所述靶分析物与所述包被的表面上存在的所述第一感测元件结合；

b)将步骤(a)的所述包被的表面与多个探针颗粒一起孵育，其中所述探针颗粒包被有第二感测元件，所述第二感测元件能够与结合在所述包被的表面上的所述靶分析物特异性相互作用或能够与所述包被的表面上的所述第一感测元件特异性相互作用；

c)施加机械力以将步骤(c)的非特异性结合的探针颗粒从所述包被的表面分离；以及

d)测量反映所述包被的表面上特异性结合的探针颗粒的量的特性，其中所述特性选自由以下组成的组：颗粒密度、颜色密度、聚集体尺寸及其组合。

检测样品中靶分析物的存在的方法可以包括以下步骤：

a)将所述样品与包被有第一感测元件的表面一起孵育，其中所述第一感测元件能够与所述靶分析物特异性结合，并且其中在孵育的同时或孵育之后，当所述样品中存在所述靶分析物时，所述靶分析物与所述包被的表面上存在的所述第一感测元件结合；

b)将步骤(a)的所述包被的表面与多个探针颗粒一起孵育，其中所述探针颗粒包被有第二感测元件，所述第二感测元件能够与结合在所述包被的表面上的所述靶分析物特异性相互作用或能够与所述包被的表面上的所述第一感测元件特异性相互作用；

c)施加机械力以将步骤(b)的非特异性结合的探针颗粒从所述包被的表面分离到第二表面上，并在对所述第二表面施加机械力的情况下将所述非特异性结合的探针颗粒凝聚成所述第二表面上的聚集体；以及

e)测量反映非特异性结合的探针颗粒的量的特性，其中所述特性选自由以下组成的组：颜色密度、聚集体尺寸及其组合。

通过遵循上述步骤，可以测量特异性结合的探针颗粒和非特异性结合的探针颗粒二者。非特异性结合的探针颗粒的测量可以与特异性结合的探针颗粒的测量负相关。

样品可以是液体样品。样品可以来源于或获自人、动物、生物细胞器、病毒、细胞、微生物或环境。样品可以包括血液、尿液、唾液、痰、血清、源自细胞或组织的液体。

可以稀释或连续稀释样品。可以过滤样品以去除污染物。样品可以进行预处理以去除、减少或破坏将与靶分析物竞争结合在包被的表面上的分子，或与靶分析物竞争结合探针颗粒的分子，或与靶分析物竞争结合包被的表面和探针颗粒两者的分子。预处理可以包括选自包括以下的组的处理步骤：均匀化、裂解、提取、涡旋、搅拌、稀释、加热、加压、离心、生物分离、透析、色谱、分级分离、纯化、分离、精制、回收、浓缩及其组合。预处理可以包括向样品中添加一种或多种液体介质。一种或多种液体介质可以允许靶分析物从样品的组分释放。例如，一种或多种液体介质可以裂解病毒、或微生物或细胞，并允许靶分析物从病毒、微生物或细胞的细胞内组分释放。此外，一种或多种液体介质可以使溶液的特性均匀化。

表面可以是硬表面。表面可以是无孔表面。表面可以选自由以下组成的组：玻璃、硼硅酸盐玻璃、石英、聚合物和金属包被的表面。表面可以选自由以下组成的组：盖玻片、板、ELISA板、微量滴定板和多孔板。与探针颗粒相比，表面对于可见光区域中的特定波长的电磁波可以具有较低的光散射特性。表面可以是透明的。

包被有第一感测元件的表面可认为是预包被表面或预包被有第一感测元件的表面。包被在表面上的第一感测元件可以与包被在探针颗粒上的第二感测元件相同或不同。

第一感测元件和第二感测元件可以独立地选自由以下组成的组：生物分子、生物颗粒、源自生物细胞器、病毒、细胞或微生物的材料和产物。第一感测元件和第二感测元件可以独立地选自由以下组成的组：碳水化合物、多糖、脂质、蛋白质、肽、核酸、抗体、抗原、激素、酶和化学化合物。第一和第二感测元件可以是识别抗原的不同表位的一对抗体。

靶分析物可以具有多个结合位点用于与第一感测元件和第二感测元件结合。靶分析物可溶于水性介质或溶剂中。靶分析物可以在与包被的表面一起孵育之前分散在液体介质中。液体介质可以提高靶分析物的溶解度。液体介质可以使包含靶分析物的样品溶液的特性(例如pH和盐浓度)均匀化。

靶分析物可选自由以下组成的组：细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、原生动物、藻类、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、蛋白质、抗体、抗原、细胞、外泌体、病原体相关分子、污染物、生物标志物、靶受体、细胞内物质、细胞外物质、衍生自生物细胞器、病毒、细胞、微生物的产物、改性生物材料及其组合。靶分析物可以是多价的。靶分析物可以是病毒。靶分析物可以是COVID-19病毒。靶分析物可以是SARS-COV-2受体结合结构域蛋白。靶分析物可以是SARS-COV-2中的其他蛋白质，例如核衣壳蛋白。靶分析物也可以是SARS-COV-2的RNA。

探针颗粒可以是非磁性的、磁性的或超顺磁性的。探针颗粒可以是生物颗粒或非生物颗粒。探针颗粒可以是球状的。非磁性探针颗粒可以是聚合物或玻璃。

磁性或超顺磁性探针颗粒可以选自由以下组成的组：铁、钴、镍、其合金、其氧化物以及其组合。磁性或超顺磁性探针颗粒可以是铁磁性的、顺磁性的或铁淦氧磁性(ferrimagnetic)的。探针颗粒可以是包封有纳米级磁性或超顺磁性颗粒的聚苯乙烯珠。当探针颗粒为磁性或超顺磁性颗粒时，它们可以通过使用磁针形式的永磁体或电磁体施加的磁力而凝聚成聚集体。

探针颗粒可以是不透明的、半透明的或有色的。探针颗粒可以能够散射电磁波。与包被的表面和周围介质相比，探针颗粒对于可见光区域中特定波长的电磁波可以表现出更高的光散射特性，因此，可以作为可被定性或定量分析的有色斑块而被观察到。

探针颗粒的尺寸可以在约8nm至约100,000nm、约10nm至约100,000nm、约100nm至约100,000nm、约1,000nm至约100,000nm、约10,000nm至约100,000nm、约8nm至约10nm、约8nm至约100nm、约8nm至约1,000nm、约8nm至约10,000nm、约10nm至约100nm、约10nm至约1,000nm、约10nm至约10,000nm、约100nm至约1,000nm、约100nm至约10,000nm或约1,000nm至约10,000nm的范围内。

当探针颗粒的尺寸在约100nm至约100,000nm的范围内时，探针颗粒可以在显微镜下被看见，因此，探针颗粒的颗粒密度可以通过以单颗粒分辨率进行显微镜成像而被定量地确定。

机械力可以由永磁体、电磁体、离心机、声学装置、超声波、激光束、流体运动、流体浮力或重力产生。机械力可以由诸如原子力谱、光镊、磁镊、声力谱、微针、离心机或生物膜之类的仪器产生。机械力可以是通过施加磁场产生的磁力。机械力可以在约0.01pN至约100pN、约0.1pN至约100pN、约1pN至约100pN、约10pN至约100pN、约50pN至约100pN、约75pN至约100pN、约0.01pN至约0.1pN、约0.01pN至约1pN、约0.01pN至约10pN、约0.01pN至约50pN、约0.01pN至约75pN、约0.1pN至约1pN、约0.1pN至约10pN、约0.1pN至约50pN、约0.1pN至约75pN、约1pN至约10pN、约1pN至约50pN、约1pN至约75pN、约10pN至约50pN、约10pN至约75pN或约50pN至约75pN的范围内。

有利地，产生的机械力可以用作区分非特异性结合的探针颗粒和特异性结合的探针颗粒的选择工具，因此减少了假阳性的可能性。特异性靶分析物-探针颗粒相互作用可导致探针颗粒与包被的表面的交联或探针颗粒从包被的表面的分离。当特异性靶分析物-探针颗粒相互作用导致探针颗粒与包被的表面交联时，探针颗粒通过靶分析物特异性结合到包被的表面。当特异性靶分析物-探针颗粒相互作用导致探针颗粒通过靶分析物与包被的表面交联时，其应用可以用于病毒检测。当靶分析物阻止探针颗粒与包被的表面特异性结合时，靶分析物导致探针颗粒从包被的表面分离，因此探针颗粒是非特异性结合的。当靶分析物导致探针颗粒从包被的表面分离时，其应用可以用于中和抗体检测。由于非特异性结合通常比特异性结合弱得多，因此通过非特异性结合而结合的探针颗粒在暴露于机械力一段校准时间后将大部分解离。通过在施加机械力之后对包被的表面上剩余的结合的探针颗粒(主要是特异性结合的探针颗粒)进行定量，可以准确地确定靶分析物的存在，而无需人工扩增。

当所测量的特性是由特异性结合的探针颗粒形成的颜色密度，或聚集体尺寸，或颜色密度和聚集体尺寸两者时，步骤(d)可以进一步包括步骤(d0)，即在步骤(d)之前通过在包被的表面的另一侧施加磁力使包被的表面上的特异性结合的探针颗粒凝聚成聚集体。由特异性结合的探针颗粒形成的聚集体的测量可以增强检测信号，所述检测信号可以由人肉眼检测或使用智能手机相机进行量化。

步骤(d0)可以通过在包被的表面的另一侧放置磁针形式的永磁体或电磁体来进行。由于包被的表面一侧上的特异性结合的探针颗粒与包被的表面另一侧上的磁针之间的距离短(相当于包被的表面的厚度)，磁针可产生足够的力，将特异性结合的探针颗粒吸引到一起形成聚集体。施加的磁力可以在0.01pN到100pN的范围内。

在测量非特异性结合的探针颗粒特性的情况下，步骤(c)进一步包括提供第二表面以接触从包被的表面分离的非特异性结合的探针颗粒；以及通过在第二表面的一侧施加机械力将非特异性结合的探针颗粒在第二表面的另一侧凝聚成聚集体；其中所述机械力是磁力。因此，如果仅测量特异性结合的探针颗粒的特性，则该步骤是任选的。施加的磁力可以在0.01pN到100pN的范围内。可以测量聚集体的颜色密度、或聚集体尺寸、或颜色密度和聚集体尺寸。由非特异性结合的探针颗粒形成的聚集体的测量可以增强眼睛或智能手机相机的检测信号。

第二表面可以是硬表面。第二表面可以是无孔表面。第二表面可以选自由以下组成的组：玻璃、硼硅酸盐玻璃、石英、聚合物和金属包被的表面。第二表面可以是盖玻片、板或外壳。与探针颗粒相比，第二表面对于可见光区域中特定波长的电磁波可以具有较低的光散射特性。第二表面可以是透明的。

可以通过在第二表面的一侧放置磁针形式的永磁体或电磁体来在第二表面的另一侧将非特异性结合的探针颗粒凝聚成聚集体。由于位于第二表面一侧的非特异性结合的探针颗粒与位于第二表面另一侧的磁针之间的距离短(相当于第二表面的厚度)，磁针可以产生足够的力以将非特异性结合的探针颗粒吸引在一起形成聚集体。施加的磁力可以在0.01pN到100pN的范围内。

在包被的表面的一侧或第二表面的一侧上形成的聚集体对于可见光区域中的特定波长的电磁波可表现出强的光散射特性，因此，可以分别在包被的表面的一侧或第二表面的一侧上作为聚集物的有色块而被看见。因此，可以通过以下来测量聚集体的颜色密度：在照相机或智能手机相机或肉眼下观察包被的表面的该侧或第二表面的该侧，并且通过软件颜色分析或分析所记录的图像中的散射光的强度来进行量化。当分别使用交联/连接测定或封闭/分离测定时，在包被的表面一侧形成的聚集体的颜色密度可以与样品中的靶分析物浓度正相关或负相关。当分别使用封闭/分离测定或交联/连接测定时，在第二表面一侧形成的聚集体的颜色密度可以与样品中的靶分析物浓度正相关或负相关。

如果仅使用肉眼观察在包被的表面的一侧或第二表面的一侧上形成的聚集体，则颜色密度的测量可以是定性分析。如果将在包被的表面的一侧或在第二表面的一侧上形成的聚集体的可视化与对由聚集体散射的光的强度进行的分析相结合，则颜色密度的测量可以是定量分析。如果在包被的表面的一侧或在第二表面的一侧上形成的聚集体不足以形成可见的有色斑块，则颜色密度的测量可能缺乏灵敏度。当仅使用肉眼和/或智能手机相机测量颜色密度或聚集体尺寸来进行所述方法时，所述方法可适用于中心实验室或家庭自我诊断或即时检测。

可以通过以下方式测量在包被的表面的一侧或第二表面的一侧上形成的聚集体的聚集体尺寸：在照相机或智能手机相机或肉眼下观察包被的表面的一侧或第二表面的一侧，并量化聚集体的覆盖区域分数。当分别使用交联/连接测定或封闭/分离测定时，在包被的表面一侧形成的聚集体的聚集体尺寸可以与样品中的靶分析物浓度正相关或负相关。当分别使用封闭/分离测定或交联/连接测定时，在第二表面一侧形成的聚集体的聚集体尺寸可以与样品中的靶分析物浓度正相关或负相关。如果在第二表面的一侧或在第二表面的一侧上形成的聚集体的可视化与聚集体的覆盖面积分数的定量相结合，则聚集体尺寸的测量可以是定量分析。与聚集体的颜色密度的测量相比，聚集体的聚集体尺寸的测量可能更加准确。当仅使用肉眼和/或智能手机相机和/或显微镜测量聚集体的聚集体尺寸来进行所述方法时，所述方法可适用于中心实验室或家庭自我诊断或即时检测。

用于步骤(a)的将包被的表面与样品一起孵育的孵育时间可以在约1秒至约90分钟、约1分钟至约90分钟、约10分钟至约90分钟、约50分钟至约90分钟、约70分钟至约90分钟、约1秒至约1分钟、约1秒至约10分钟、约1秒至约50分钟、约1秒至约70分钟、约1分钟至约10分钟、约1分钟至约50分钟、约1分钟至约70分钟、约10分钟至约50分钟、约10分钟至约70分钟或约50分钟至约70分钟的范围内。

用于步骤(b)的将探针颗粒与包被的表面一起孵育的孵育时间可以在约10秒至约90分钟、约1分钟至约90分钟、约10分钟至约90分钟、约50分钟至约90分钟、约70分钟至约90分钟、约10秒至约1分钟、约10秒至约10分钟、约10秒至约50分钟、约10秒至约70分钟、约1分钟至约10分钟、约1分钟至约50分钟、约1分钟至约70分钟、约10分钟至约50分钟、约10分钟至约70分钟或约50分钟至约70分钟的范围内。

当在步骤(d)中测量的特性是特异性结合的探针颗粒的颗粒密度时，可以通过以下方式进行测量：在显微镜、或照相机、或智能手机相机、或肉眼下观察包被的表面并通过手动或用软件分析计数器计数包被的表面上特异性结合的探针颗粒的数量、或分析覆盖面积分数或记录的图像的强度来进行定量。可以通过使用软件分析计数器来计数在包被的表面例如微量滴定板中孔的底部上积累的特异性结合的探针颗粒的数量来进行定量。这可以通过拍摄微量滴定板底部的图像并使用软件分析计数器处理图像来完成。

当分别使用交联/连接测定或封闭/分离测定时，颗粒密度可以与样品中的靶分析物浓度正相关或负相关。如果仅使用肉眼观察包被的表面上的特异性结合的探针颗粒，则步骤(d)中特异性结合的探针颗粒的颗粒密度的测量可以是定性分析。如果包被的表面上特异性结合的探针颗粒的可视化与包被的表面上特异性结合的探针颗粒的计数相结合，则步骤(d)中特异性结合的探针颗粒的颗粒密度的测量可以是定量分析。

步骤(d)中的特异性结合的探针颗粒对于可见光区域中特定波长的电磁波可以表现出强的光散射特性，因此，可以在包被的表面上作为特异性结合的探针颗粒的有色斑块而被观察到。因此，特异性结合的探针颗粒的颜色密度的测量可以通过在智能手机相机或肉眼下观察包被的表面并通过软件颜色分析或分析记录的图像中的散射光强度进行定量来完成。当分别使用交联/连接测定或封闭/分离测定时，颜色密度可以与样品中的靶分析物浓度正相关或负相关。

如果仅使用肉眼观察包被的表面上的特异性结合的探针颗粒，则步骤(d)中特异性结合的探针颗粒的颜色密度的测量可以是定性分析。如果包被的表面上特异性结合的探针颗粒的可视化与对由包被的表面上特异性结合的探针颗粒散射的光的强度进行的分析相结合，则步骤(d)中特异性结合的探针颗粒的颜色密度的测量可以是定量分析。如果包被的表面上特异性结合的探针颗粒的数量不足以形成可见的有色斑块，则步骤(d)中特异性结合的探针颗粒的颜色密度的测量可能缺乏灵敏度。

与测量颜色密度或聚集体尺寸相比，使用显微镜测量步骤(d)中的颗粒密度特性可能更加准确。然而，显微镜的使用可能需要能够获得显微镜并且具有训练有素的人员。因此，当步骤(d)使用显微镜测量颗粒密度特性来进行所述方法时，所述方法可以适合在中心实验室中应用。可替选地，如果仅使用肉眼和/或智能手机相机测量颗粒密度，则可以不需要使用显微镜，因此无需使用笨重或昂贵的仪器。因此，当步骤(d)仅使用肉眼和/或仅智能手机相机测量颗粒密度的特性来执行所述方法时，所述方法可以适用于家庭自我诊断或即时检测。

与测量颗粒密度或聚集体尺寸相比，步骤(d)中颜色密度特性的测量可以更方便。然而，当靶分析物的浓度低时，步骤(d)中特异性结合的探针颗粒的量可能低，因此可能不会在包被的表面上呈现可见的有色斑块，从而导致低灵敏度。当执行所述方法使得步骤(d)仅使用肉眼和/或仅智能手机相机测量颜色密度的特性时，所述方法可以适用于中心实验室或家庭自我诊断或即时检测。

步骤(a)和步骤(b)可以同时进行，由此将样品和多个探针颗粒的混合物与包被的表面一起孵育。

此处，一种或多种液体介质可以在混合成混合物之前添加到样品和探针颗粒中。在将混合物与包被的表面一起孵育之前，可以稀释或连续稀释混合物。一种或多种液体介质可以提高靶分析物在混合物中的溶解度，或使包含靶分析物的样品溶液的特性(例如，pH和盐浓度)均匀化。一种或多种液体介质可以允许靶分析物从样品的组分释放。例如，一种或多种液体介质可以裂解病毒、或微生物或细胞，并允许靶分析物从病毒、微生物或细胞的细胞内组分释放。

孵育混合物与包被的表面的孵育时间可以在约1分钟至约60分钟,10分钟至约60分钟、约20分钟至约60分钟、约30分钟至约60分钟、约40分钟至约60分钟、约1分钟至约10分钟、约1分钟至约20分钟、约1分钟至约30分钟、约1分钟至约40分钟、约10分钟至20分钟、约10分钟至30分钟、约10分钟至约40分钟、约20分钟至约30分钟、约20分钟至约40分钟或约30分钟至约40分钟的范围内。

当步骤(a)和步骤(b)同时进行时，这可以被视为一个步骤，导致了总孵育时间的减少，从而提高了所述方法的通量。

所述方法的总持续时间可以在约20分钟至约90分钟,40分钟至约90分钟、约50分钟至约90分钟、约60分钟至约90分钟、约80分钟至约90分钟、约20分钟至约40分钟、约20分钟至约50分钟、约20分钟至约60分钟、约20分钟至约80分钟、约40分钟至约50分钟、约40分钟至约60分钟、约40分钟至约80分钟、约50分钟至约60分钟、约50分钟至约80分钟或约60分钟至约80分钟的范围内。

有利地，所述方法可以是通用的，使得任何具有已知宿主受体的病毒和/或针对病毒表面蛋白的抗体、具有已知抗原或任意抗原的任何抗体都可以通过所述方法检测。所述方法不需要像在ELISA中那样使用荧光标记或酶附着就能在广泛种类的环境条件下检测广泛种类的靶分析物，包括微生物。因此，所述方法消除了荧光标记和光漂白的影响，避免了荧光检测或光吸收检测(ELISA)的设备成本。

进一步有利地，可以在所述方法中使用特异性靶分析物-探针颗粒相互作用来实现单靶标检测灵敏度，从而可以在小体积(<30μl)中检测到低至飞摩尔的低浓度靶分析物，因此需要的样品量减少。这些特征进而使得能够进行疾病的早期诊断。

更进一步有利地，所述方法使用可通过施加机械力来进行选择的特异性靶分析物-探针颗粒相互作用，以确保检测的高准确度和高特异性。因此，与其他检测方法相比，所述方法中出现假阳性结果的可能性可以显著降低。可以使用一组探针颗粒或用不同的第一感测元件包被多孔板中不同孔的表面来进行平行正交检测，以提高检测的通量。进一步有利地，所述方法不需要使用洗涤步骤(如ELISA中所需的)。

更进一步有利的是，所述方法可用于通过IgG/IgM/IgA测试和中和活性评估来检测抗体。因此，所述方法可以在同一方法中同时实现IgG/IgM/IgA测试和中和抗体(Nab)测试。

更进一步有利地，所述方法产生不同类型的读出，这允许所述方法在不同的临床环境中用于诊断，例如在家庭自我诊断中作为即时检测，或在中心实验室中作为实验室测试。

现在将公开系统的示例性、非限制性的实施方案。

一种用于检测样品中靶分析物的存在的系统，所述系统包括：

a)包被有第一感测元件的表面，其中所述第一感测元件能够与所述靶分析物特异性结合；

b)多个探针颗粒，其中所述探针颗粒包被有第二感测元件，所述第二感测元件当所述靶分析物存在时能够与所述靶分析物特异性相互作用或能够与所述包被的表面上的所述第一感测元件特异性相互作用，从而在所述包被的表面上形成特异性结合的探针颗粒；

c)机械力，其能够将非特异性结合的探针颗粒从所述包被的表面分离；和

d)测量装置，其用于测量所述特异性结合的探针颗粒的特性，其中所述特性选自由以下组成的组：所述特异性结合的探针颗粒的颗粒密度、颜色密度、聚集体尺寸；或

用于测量所述非特异性结合的探针颗粒的特性，其中所述特性选自由以下组成的组：所述非特异性结合的探针颗粒的颜色密度、聚集体尺寸。

所述系统还可包括用于接触所述非特异性结合的探针颗粒的第二表面。第二表面可以是硬表面。第二表面可以是无孔表面。第二表面可以选自由以下组成的组：玻璃、硼硅酸盐玻璃、石英、聚合物和金属包被的表面。第二表面可以是盖玻片、板或外壳。与探针颗粒相比，第二表面对于可见光区域中特定波长的电磁波可以具有较低的光散射特性。第二表面可以是透明的。

样品可以是液体样品。样品可以来源于或获自人、动物、生物细胞器、病毒、细胞、微生物或环境。样品可以包括血液、尿液、唾液、痰、血清、源自细胞或组织的液体。

可以稀释或连续稀释样品。可以过滤样品以去除污染物。样品可以进行预处理以去除、减少或破坏将会与靶分析物竞争结合在包被的表面上的分子，或与靶分析物竞争结合探针颗粒的分子，或与靶分析物竞争结合包被的表面和探针颗粒两者的分子。预处理可以包括选自包括以下的组的处理步骤：均匀化、裂解、提取、涡旋、搅拌、稀释、加热、加压、离心、生物分离、透析、色谱、分级分离、纯化、分离、精制、回收、浓缩及其组合。预处理可以包括向样品中添加一种或多种液体介质。一种或多种液体介质可以允许靶分析物从样品的组分释放。例如，一种或多种液体介质可以裂解病毒、或微生物或细胞，并允许靶分析物从病毒、微生物或细胞的细胞内组分释放。此外，一种或多种液体介质可以使溶液的特性均匀化。

表面可以是硬表面。表面可以是无孔表面。表面可以选自由以下组成的组：玻璃、硼硅酸盐玻璃、石英、聚合物和金属包被的表面。表面可以选自由以下组成的组：盖玻片、板、ELISA板、微量滴定板和多孔板。与探针颗粒相比，表面对于可见光区域中特定波长的电磁波可以具有较低的光散射特性。表面可以是透明的。

包被有第一感测元件的表面可认为是预包被表面或预包被有第一感测元件的表面。包被在表面上的第一感测元件可以与包被在探针颗粒上的第二感测元件相同或不同。

第一感测元件和第二感测元件可以独立地选自由以下组成的组：生物分子、生物颗粒、源自生物细胞器、病毒、细胞或微生物的材料和产物。第一感测元件和第二感测元件可以独立地选自由以下组成的组：碳水化合物、多糖、脂质、蛋白质、肽、核酸、抗体、抗原、激素、酶和化学化合物。第一和第二感测元件可以是识别抗原的不同表位的一对抗体。

靶分析物可以具有多个结合位点用于与第一感测元件和第二感测元件结合。靶分析物可溶于水性介质或溶剂中。靶分析物可以在与包被的表面一起孵育之前分散在液体介质中。液体介质可以提高靶分析物的溶解度。液体介质可以使包含靶分析物的样品溶液的特性(例如pH和盐浓度)均匀化。

靶分析物可选自由以下组成的组：细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、原生动物、藻类、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、蛋白质、抗体、抗原、细胞、外泌体、病原体相关分子、污染物、生物标志物、靶受体、细胞内物质、细胞外物质、衍生自生物细胞器、病毒、细胞、微生物的产物、改性生物材料及其组合。靶分析物可以是多价的。靶分析物可以是病毒。靶分析物可以是COVID-19病毒。靶分析物可以是SARS-COV-2受体结合结构域蛋白。靶分析物可以是SARS-COV-2中的其他蛋白质，例如核衣壳蛋白。靶分析物也可以是SARS-COV-2的RNA。

探针颗粒可以是非磁性的、磁性的或超顺磁性的。探针颗粒可以是生物颗粒或非生物颗粒。探针颗粒可以是球状的。非磁性探针颗粒可以是聚合物或玻璃。

磁性或超顺磁性探针颗粒可以选自由以下组成的组：铁、钴、镍、其合金、其氧化物以及其组合。磁性或超顺磁性探针颗粒可以是铁磁性的、顺磁性的或铁淦氧磁性的。探针颗粒可以是包封有纳米级磁性或超顺磁性颗粒的聚苯乙烯珠。当探针颗粒为磁性或超顺磁性颗粒时，它们可以通过使用磁针形式的永磁体或电磁体施加的磁力而凝聚成聚集体。

探针颗粒可以是不透明的、半透明的或有色的。探针颗粒可以能够散射电磁波。与包被的表面和周围介质相比，探针颗粒对于可见光区域中特定波长的电磁波可以表现出更高的光散射特性，因此，可以作为可被定性或定量分析的有色斑块而被观察到。

探针颗粒的尺寸可以在约8nm至约100,000nm、约10nm至约100,000nm、约100nm至约100,000nm、约1,000nm至约100,000nm、约10,000nm至约100,000nm、约8nm至约10nm、约8nm至约100nm、约8nm至约1,000nm、约8nm至约10,000nm、约10nm至约100nm、约10nm至约1,000nm、约10nm至约10,000nm、约100nm至约1,000nm、约100nm至约10,000nm或约1,000nm至约10,000nm的范围内。

当探针颗粒的尺寸在约100nm至约100,000nm的范围内时，探针颗粒可以在显微镜下被看见，因此，探针颗粒的颗粒密度可以通过以单颗粒分辨率进行显微镜成像而被定量地确定。

机械力可以由永磁体、电磁体、离心机、声学装置、超声波、激光束、流体运动、流体浮力或重力产生。机械力可以由诸如原子力谱、光镊、磁镊、声力谱、微针、离心机或生物膜之类的仪器产生。机械力可以是通过施加磁场产生的磁力。

机械力可以在约0.01pN至约100pN、约0.1pN至约100pN、约1pN至约100pN、约10pN至约100pN、约50pN至约100pN、约75pN至约100pN、约0.01pN至约0.1pN、约0.01pN至约1pN、约0.01pN至约10pN、约0.01pN至约50pN、约0.01pN至约75pN、约0.1pN至约1pN、约0.1pN至约10pN、约0.1pN至约50pN、约0.1pN至约75pN、约1pN至约10pN、约1pN至约50pN、约1pN至约75pN、约10pN至约50pN、约10pN至约75pN或约50pN至约75pN的范围内。

有利地，所述系统可以针对生物分子、生物颗粒、生物细胞器、病毒、细胞和/或微生物的检测进行专门设计，以用于使用人样品例如血清和尿液的实际临床试验。因此，系统可以允许检测患者样品中的靶病毒并检测由特定病毒感染诱导的抗体。

现在将公开制品、试剂盒和使用所述试剂盒的方法的示例性、非限制性实施方案。

图12示出了说明根据示例实施方案的用于检测样品中靶分析物的存在的试剂盒1200的透视图的图。靶分析物包括但不限于病毒、抗体、外泌体、抗体、病原体相关分子和污染物。样品可以是液体样品并且可以包括一种或多种源自或获自人、动物、微生物或环境的组分。

试剂盒1200包括制品1202，在图12中表示为孔板1204和水箱1206。孔板1204可以是透明的并且可以由选自由玻璃和聚合物组成的组的材料制成。孔板1204可以具有类似于商业多孔板的尺寸以实现规模化(scaling)。孔板1204包括多个测试孔1208。这些测试孔1208至少在测试孔1208的底表面1210处包被有第一感测元件。第一感测元件被配置为结合样品中的靶分析物。每个测试孔1208被配置为通过测试孔1208的开口1212接收包含在一种或多种液体介质中的样品和探针颗粒。

水箱1206包括外壳1214和覆盖外壳1214的孔的塞1216。外壳1214被配置为在将包含样品和探针颗粒的液体介质引入测试孔1208后接收孔板1204。然后插入塞1216以覆盖外壳1214的孔，以防止水箱1206的泄漏并使环境污染的可能性最小化。

孔板1204包括从测试孔1208的开口1212向外延伸的壁1218。外壳1214包括四个面向孔板1204的内表面并且这些内表面之一面向壁1218和测试孔1208。在内表面和壁1218之间界定的空间之间，在测试孔1208的外部形成通道。在使用试剂盒1200时，外力施加在测试孔1208内的探针颗粒上，其将非特异性结合的探针颗粒(即，不特异性结合包被的底表面1210的探针颗粒)移离测试孔1208的底表面1210。通道被配置为在外力施加后从测试孔1208接收这些非特异性结合的探针颗粒。在使用磁体施加力的情况下，测试孔1208的直径可以小于测试孔的高度或与其相当，以向结合的探针颗粒施加均匀的机械力。1212。外壳1214含有透明液体1220以允许非特异性结合的探针颗粒移动到通道中。在一实施方案中，透明液体1220可以包含有磷酸盐缓冲盐水(PBS)和牛血清白蛋白(BSA)。

试剂盒1200进一步包括包含在探针颗粒溶液1222中的探针颗粒。如图12所示，探针颗粒溶液1222包含在微量离心管1224中。需要注意的是，探针颗粒可以在储存过程中冷冻干燥。探针颗粒溶液1222在上样到测试孔1208之前与样品混合。探针颗粒是包被有第二感测元件的磁性或超顺磁性颗粒。第二感测元件被配置为结合第一感测元件或靶分析物，使得探针颗粒取决于样品中靶分析物的存在而特异性地结合到测试孔1208的包被的底表面1210。因此，可以通过分析(例如，计数、估计、图像处理)特异性和/或非特异性结合的探针颗粒来确定靶分析物的存在。

具体而言，如果试剂盒1200用于交联测定，则第二感测元件被配置为结合靶分析物。因此，如果样品中存在靶分析物，则探针颗粒将通过靶分析物特异性结合到包被的底表面1210，从而导致在测试孔1208中特异性结合的探针颗粒的量较大并且非特异性结合的探针颗粒的量较少。另一方面，如果样品中不存在靶分析物，则探针颗粒将不会特异性结合到包被的底表面1210，导致在测试孔1208中没有特异性结合的探针颗粒而有较大量的非特异性结合的探针颗粒。

相反，如果试剂盒1200用于阻断测定，则第二感测元件被配置为结合第一感测元件。因此，如果样品中存在靶分析物，则探针颗粒将与包被的底表面1210分离，从而导致在测试孔1208中特异性结合的探针颗粒的量较少而非特异性结合的探针颗粒的量较大。另一方面，如果样品中不存在靶分析物，则探针颗粒将特异性结合到包被的底表面1210，导致在测试孔1208中特异性结合的探针颗粒的量较大而非特异性结合的探针颗粒的量较少。

第一感测元件和第二感测元件可以独立地选自由以下组成的组：碳水化合物、多糖、脂质、蛋白质、肽、核酸、抗体、抗原、激素、酶和化学化合物。应当注意的是，包被在测试孔1208的底表面1210上的第一感测元件可以与包被在探针颗粒上的第二感测元件相同或不同。

试剂盒1200进一步包括被配置为对探针颗粒施加外力的仪器。所述仪器在图12中表示为包括多个细磁针1228的磁针阵列1226。这些磁针1228被配置为在分析特异性和/或非特异性结合的探针颗粒以确定靶分析物的存在的步骤之前，对结合的探针颗粒施加力并控制分离的非特异性结合的探针颗粒移动到制品1202中的通道中。

在替选实施方案中，孔板1204可以包括系统对照孔和空白对照孔，它们接收包括样品和探针颗粒的液体介质。系统对照孔和空白对照孔的添加确保了试剂盒1200正常工作，从而产生准确的结果。具体地，系统对照孔包被有靶分析物，所述靶分析物可以直接结合包被在探针颗粒上的第二感测元件，从而无论样品是否含有靶分析物，都始终产生阳性结果。另一方面，空白对照孔包被有不与靶分析物特异性结合的非诱饵分子，因此无论样品是否含有靶分析物，都始终产生阴性结果。换言之，如果系统对照孔在测定期间未显示阳性结果而空白对照孔未显示阴性结果，则试剂盒1200可能没有正常工作并且产生的结果可能不准确。

在替选实施方案中，孔板1204可以包括接收包括样品和探针颗粒的液体介质的阳性对照孔和阴性对照孔，其中样品被制备成分别包括和排除靶分析物。阳性对照孔和阴性对照孔的添加确保了试剂盒1200正常工作，从而产生准确的结果。具体地，阳性对照孔接收含有靶分析物的液体介质，使得分别在交联和阻断测定中，探针颗粒可以通过靶分析物特异性结合到包被的底表面1210，或探针颗粒因靶分析物而与包被的底表面1210分离。另一方面，阴性对照孔接收不含靶分析物的液体介质，使得分别在交联和阻断测定中，探针颗粒因不存在靶分析物而不能特异性结合到包被的底表面1210，或探针颗粒因不存在靶分析物而能够特异性结合到包被的底表面1210。换言之，如果阳性对照孔在测定期间未显示阳性结果而阴性对照孔未显示阴性结果，则试剂盒1200可能没有正常工作并且产生的结果可能不准确。

在替选实施方案中，施加在探针颗粒上的外力可以通过除磁针的磁力之外的其他手段或方法产生，包括但不限于重力、离心和流体运动。

有利地，该试剂盒1200包含多个测试孔1208，其允许并行进行多个测试，从而提高时间和成本效率。该试剂盒1200非常适合作为实验室测试试剂盒在中心实验室中使用，在这种情况下需要廉价和高通量的测试。

图13A-13F示出了当试剂盒1200用于交联测定时图12的试剂盒1200或其一部分的示意图。

图13A示出了在将样品和探针颗粒引入测试孔1208后孔板1204的侧视图。在引入步骤之前，样品和探针颗粒被包含在各自的测试管1224中并进行孵育。随后将孔板1204放置在平的水平表面上，以允许样品和探针颗粒的孵育在相应的测试孔1208内发生。

图13B示出了在测试孔1208内的孵育步骤期间孔板1204的侧视图。如图13A所示，探针颗粒沉至测试孔1208中的底表面1210，形成了与测试孔1208的底表面1210相邻的可见层1302。

图13C示出了封闭在水箱1206中的孔板1204的侧视图。在测试孔1208内的孵育步骤完成后，将孔板1204插入预填充有透明液体1220的外壳1214中，使得孔板1204完全浸没在透明液体1220中。在将孔板1204插入外壳1214期间，外壳1214相对于水平面倾斜约30度以防止透明液体1220溢出。然后用塞1216密封外壳1214以防止当水箱1206放置在水平表面上且测试孔1208朝上(如包括水平线和向上箭头的第一参考提示1304所示)时透明液体1220泄漏。

如图13C所示，外壳1214包括面向测试孔的内表面，这里表示为内表面1306。孔板1204包括从测试孔1208的开口1212向外延伸的壁1218。在内表面1306和测试孔1208外部的壁1218之间界定的空间形成了通道(这里表示为通道1308)。如该图所示，通道1308在距底表面1210一定距离处连接到测试孔1208。具体地，通道1308在邻近测试孔1208的开口1212处连接到测试孔1208，允许通道1308和测试孔1208之间进行流体连通。

图13D示出了封闭在水箱1206中的孔板1204的侧视图和透视图，其中孔板1204和水箱1206都面朝下。在将孔板1204插入水箱1206中之后，将水箱1206翻转180度，使得测试孔1208的开口1212面朝下，如包括水平线和向下箭头的第二参考提示1310所示。接下来，将磁针阵列1226放置在水箱1206下方以施加磁力，以将探针颗粒向下拉向测试孔1208的开口1212。结果是，非特异性结合的探针颗粒在磁针1228的尖端上方的测试孔1208外部的通道1308中形成聚集体1312。

图13E示出了封闭在水箱1206中的孔板1204的侧视图和透视图，其中使用磁针阵列1226使聚集体1312移动通过通道1308。这里，水箱1206在磁针阵列1226上方滑动，同时面朝下以将非特异性结合的探针颗粒的聚集体1312从测试孔1208移出至探针颗粒阱1314。探针颗粒阱1314是在测试孔1208的开口1212之间的壁1218上形成的浅凹痕，以防止非特异性结合的颗粒移回测试孔1208。

在这个阶段，可以分析特异性结合到测试孔1208中的包被的底表面1210的探针颗粒以确定样品中靶分析物的存在。检测方法包括：

a)基于测试孔1208中特异性结合的探针颗粒产生的散射光强度的颜色检测方法。下面参考图14A解释使用所述方法获得的结果的示例。

b)通过将制品1202放置在显微镜台上进行成像的显微镜检测方法。下面参考图14B解释使用所述方法获得的结果的示例。

除了上述方法(a)和(b)之外，可以分析测试孔1208中的探针颗粒聚集体的尺寸以确定样品中靶分析物的存在。所述方法需要另外的步骤，如下面参照图13F更详细解释的，包括将试剂盒1204与水箱1206一起翻转。探针颗粒阱1314防止解离的非特异性结合的颗粒移回测试孔1208。可替选地，可以分析已经移动到测试孔1208之外的解离的探针颗粒的聚集体的尺寸以确定靶标的存在。在这种情况下，不需要将试剂盒与水箱一起翻转，因此也不需要探针颗粒阱1314。

图13F示出了封闭在水箱1206中的孔板1204的侧视图和俯视图，其中孔板1204和水箱1206都面朝上。在将非特异性结合的探针颗粒的聚集体1312移动远离测试孔1208后，水箱1206被翻转180度恢复，使得测试孔1208的开口1212面朝上。由于探针颗粒阱1314的存在，在水箱1206被翻转180度恢复之后，已经落入探针颗粒阱1314的解离的非特异性结合的探针颗粒被阻止移回至孔中。

然后将磁针1228放置在测试孔1208的底表面1210下方以将特异性结合的探针颗粒聚集成小聚集体1316。这些聚集体1316的尺寸指示了保留在底表面1210上的特异性结合的探针颗粒的量，并且可以对其进行分析以确定样品中是否存在靶分析物。下面参照图14C解释使用软件分析计数器获得的结果的示例。

应注意的是，基于探针颗粒聚集体的方法也可以对探针颗粒阱1314中的非特异性结合的探针颗粒的聚集体1312进行。可替选地，当测试孔面朝下时，也可以分析非特异性结合的探针颗粒的聚集体1608，而无需将微流体板翻转180度恢复的额外步骤。

有利地，将非特异性结合的探针颗粒的聚集体1312从测试孔1208移出至探针颗粒阱1314提高了分析期间特异性结合的探针颗粒和非特异性结合的探针颗粒1312之间的可区分度。

图14A示出了与含有不同浓度的靶分析物的液体介质一起孵育的孔板1204的图像。图14A的结果对应于实施例4中的结果。在此，完成了如上参考图13E所述的步骤，并且使用智能手机相机捕获的图像进行分析以确定试剂盒1200在不同溶液条件下对样品中不同浓度的核衣壳抗原靶分析物的灵敏度。

孔板1204包括三个阴性对照测试孔1208。孔板1204顶部A中的四个测试孔包含的探针颗粒溶液1222是使用匀化缓冲液作为溶液，混以含有靶分析物和探针颗粒的样品(制备为三种不同浓度(0pM、1pM和10pM))而制备的。孔板1204的中间部分B中的四个测试孔包含的探针颗粒溶液1222是使用中鼻甲拭子作为溶液，混以含有靶分析物的样品(制备为三种不同浓度(0pM、1pM和10pM))而制备的。孔板1204的底部C中的四个测试孔包含的探针颗粒溶液1222是使用唾液作为溶液，混以含有靶分析物的样品(制备为三种不同浓度(0pM、1pM和10pM))而制备的。阴性对照孔1208对应于0pM的靶分析物。

如图14A所示，阴性对照孔1208中的散射光强度最低，表明试剂盒1200工作正常。测试孔中的散射光强度随着靶分析物浓度的增加而增加，这表明随着核衣壳抗原靶分析物浓度的增加，更多的探针颗粒已经与在测试孔1208底表面1210中包被的第一感测元件结合。

图14B示出了在显微镜下观察到的测试孔1208的放大图像。此处，完成了如上参照图13E描述的步骤，并使用由4x显微镜物镜记录的测试孔1208的高分辨率图像进行分析。如图14B所示，探针颗粒1404(由图像上的多个点表示)特异性地结合到测试孔1208的底表面1210。这些探针颗粒1404可以使用软件进行量化，从而对样品中的靶分析物提供高度量化的评估。

图14C示出了说明探针颗粒数量的归一化分数与归一化的探针颗粒聚集体尺寸之间的关系的图。在此，完成了如上参照图13F所描述的步骤，并且使用由智能手机相机拍摄的聚集体1316的图像进行分析以确定样品中是否存在靶分析物。

X轴代表“探针颗粒数量的归一化分数”，Y轴代表“归一化的探针颗粒聚集体尺寸”。如图所示，探针颗粒的数量随着聚集体1316尺寸的增加而增加。换言之，从智能手机相机拍摄的图像中获得的聚集体1316的尺寸可用于估计保留在测试孔1208中的探针颗粒的数量。此后，基于保留在测试孔1208中的探针颗粒的数量，可以对样品中的靶分析物进行定量评估以确定样品中是否存在靶分析物。

图15示出了说明根据另一示例实施方案的用于检测样品中靶分析物的存在的试剂盒1500的透视图的图。靶分析物包括但不限于病毒、抗体、外泌体、抗体、病原体相关分子和污染物。样品可以是液体样品并且可以包括一种或多种源自或获自人、动物、微生物或环境的组分。

试剂盒1500包括在图15中表示为微流体板1502的制品。微流体板1502可以是透明的并且可以由选自由玻璃和聚合物组成的组的材料制成。微流体板1502包括两个测试孔1504。测试孔1504至少在测试孔1504的底表面1506处包被有第一感测元件。第一感测元件被配置为结合样品中的靶分析物。每个测试孔1504被配置为在测试孔1504的开口1508处接收包含在一种或多种液体介质中的样品和探针颗粒。

微流体板1502进一步包括系统对照孔1510和空白对照孔1512，它们接收包括样品和探针颗粒的液体介质。系统对照孔1510和空白对照孔1512的添加确保了试剂盒1500正常工作，从而产生准确的结果。具体地，系统对照孔1510包被有靶分析物，所述靶分析物可以直接结合包被在探针颗粒上的第二感测元件，从而无论样品是否含有靶分析物，都始终产生阳性结果。另一方面，空白对照孔包被有不与靶分析物特异性结合的非诱饵分子，因此无论样品是否含有靶分析物，都始终产生阴性结果。换言之，如果系统对照孔在测定期间未显示阳性结果而空白对照孔未显示阴性结果，则试剂盒1500可能没有正常工作并且产生的结果可能不准确。

微流体板1502进一步包括入口1514，其允许引入一种或多种含有样品和探针颗粒的液体介质。微流体板1502进一步包括上样通道1516，其将液体介质从入口1514传送到测试孔1504、系统对照孔1510和空白对照孔1512。

微流体板1502进一步包括连接到每个孔的去除通道1524。在使用试剂盒1500时，将外力施加在孔内的探针颗粒上，该外力使非特异性结合的探针颗粒(即，未与包被的底表面1506特异性结合的探针颗粒)移动远离孔的底表面1506。去除通道1524被配置为在施加外力后从孔接收这些非特异性结合的探针颗粒。

微流体板1502进一步包括连接到去除通道1524的探针颗粒阱1526。探针颗粒阱1526是朝向去除通道1524的远端形成的浅凹痕，以防止非特异性结合的颗粒移回孔中。

微流体板1502进一步包括连接到探针颗粒阱1526的废物储存器1528。吸收垫1530可以设置在废物储存器1528内。吸收垫1530和废物储存器1528被配置为防止液体介质从微流体板1502泄漏。微流体板1502进一步包括连接到废物储存器1528的通口1532。在通过入口1514引入液体介质后，通口1532为微流体板1502内的压缩空气提供了出口。

试剂盒1500进一步包括包含在探针颗粒溶液1534中的探针颗粒。如图15所示，探针颗粒溶液1534包含在滴瓶1536中。探针颗粒是包被有第二感测元件的磁性或超顺磁性颗粒。第二感测元件被配置为结合第一感测元件或靶分析物，使得探针颗粒取决于样品中靶分析物的存在而特异性地结合到测试孔1504的包被的底表面1506。因此，可以通过分析(例如，计数、估计、图像处理)特异性和/或非特异性结合的探针颗粒来确定靶分析物的存在。

具体而言，如果试剂盒1500用于交联测定，则第二感测元件被配置为结合靶分析物。因此，如果样品中存在靶分析物，则探针颗粒将经由靶分析物而特异性结合到包被的底表面1506，从而导致在测试孔1504中特异性结合的探针颗粒的量较大并且非特异性结合的探针颗粒的量较少。另一方面，如果样品中不存在靶分析物，则探针颗粒将与包被的底表面1506不连接，导致在测试孔1504中没有特异性结合的探针颗粒并且有大量的非特异性结合的探针颗粒。

相反，如果试剂盒1500用于阻断测定，则第二感测元件被配置为结合第一感测元件。因此，如果样品中存在靶分析物，则探针颗粒将与包被的底表面1506分离，从而导致在测试孔1504中特异性结合的探针颗粒的量较少并且非特异性结合的探针颗粒的量较大。另一方面，如果样品中不存在靶分析物，则探针颗粒将特异性结合到包被的底表面1506，导致在测试孔1504中特异性结合的探针颗粒的量较大并且非特异性结合的探针颗粒的量较少。

第一和第二感测元件可以选自由以下组成的组：碳水化合物、多糖、脂质、蛋白质、肽、核酸、抗体、抗原、激素、酶和化学化合物。应当注意的是，包被在测试孔1504的底表面1506上的第一感测元件可以与包被在探针颗粒上的第二感测元件相同或不同。

滴瓶1536连接到注射器1538，注射器1538包括筒1540和柱塞1542，其被配置为在滴瓶1536和微流体板1502之间转移液体介质。如图15所示，筒1540包含含在用于测试的样品溶液1544中的样品。过滤器1546被配置为设置在筒1540中以从液体介质中去除微粒。

试剂盒1500进一步包括被配置为对探针颗粒施加外力的仪器。所述仪器在图15中表示为包括多个细磁针1550的磁针阵列1548。这些磁针1550被配置为在分析特异性和/或非特异性结合的探针颗粒以确定靶分析物的存在的步骤之前，控制对结合的探针颗粒施加的力并控制非特异性结合的探针颗粒移动到微流体板1502中的去除通道1524中。

在替选实施方案中，施加在探针颗粒上的外力可以通过除磁针之外的其他手段或方法产生，包括但不限于永磁体、电磁体、离心机、声学方法、超声方法、激光束或重力。

有利地，该试剂盒1500非常适合作为家庭自我诊断试剂盒或即时检测(POCT)试剂盒，因为无需使用笨重或昂贵的仪器(例如显微镜)即可获得结果。具体地，测试孔1504中产生的散射光的强度和使用磁针1550在测试孔1504或探针颗粒阱1526内部形成的聚集体的强度可以很容易地通过肉眼确定或基于通过智能手机相机拍摄的图像进行分析。

图16A-16F示出了当试剂盒1500用于交联测定时图15的试剂盒1500或其一部分的示意图。

图16A示出了三幅图像，说明了在包括样品和探针颗粒的液体介质的制备中涉及的步骤。在第一幅图像中，注射器1538将样品溶液1544通过过滤器1546推入滴瓶1536中，在那里样品溶液1544与探针颗粒溶液1534混合。在第二幅图像中，注射器1538和滴瓶1536向上翻转以去除滴瓶1536中的空气。在第三幅图像中，含有探针颗粒溶液1534和样品溶液1544的液体介质已准备好，并且滴瓶1536可以与注射器1538一起连接到微流体板1502的入口1514。

图16B显示了在将液体介质引入测试孔1504后微流体板1502的侧视图。微流体板1502被放置在平的水平表面上，以允许样品和探针颗粒的孵育在测试孔1504内发生。包括水平线和向上箭头的第一参考提示1602在图16B中示出以指示微流体板1502面朝上。

图16C示出了在测试孔1504内的孵育步骤期间微流体板1502的侧视图。如图16C所示，探针颗粒沉至测试孔1504中的底表面1506，形成了与测试孔1504的底表面1506相邻的可见层1604。

图16D示出了面朝下的微流体板1502的侧视图。在测试孔1504内的孵育步骤完成后，将微流体板1502翻转180度，使得测试孔1504的开口1508面朝下，如包括水平线和向下箭头的第二参考提示1606所示。接下来，将磁针阵列1548放置在微流体板1502下方以对探针颗粒施加磁力。解离的非特异性结合的探针颗粒被向下拉向测试孔1504的开口1508。结果，非特异性结合的探针颗粒在磁针尖端上方形成聚集体1608，然后通过使微流体板相对于磁针1550滑动而经由去除通道1524将聚集体1608移出测试孔之外。

图16E示出了面朝下的微流体板1502的侧视图，其中使用磁针阵列1548使聚集体1608移动通过去除通道1524。此处，微流体板1502在磁针阵列1548上方滑动，同时面朝下以将非特异性结合的探针颗粒的聚集体1608移出测试孔1504，移至探针颗粒阱1526。

在这个阶段，可以分析结合到测试孔1504中的包被的底表面1506的特异性结合的探针颗粒以确定样品中靶分析物的存在。检测方法包括：

a)基于测试孔1504中特异性结合的探针颗粒产生的散射光的强度的颜色检测方法。

b)通过将微流体板1502放置在显微镜台上进行成像的显微镜检测方法。

除了上述方法(a)和(b)之外，可以分析测试孔1504或探针颗粒阱1526中的探针颗粒聚集体的尺寸以确定样品中靶分析物的存在。所述方法需要额外的步骤，如下面参照图16F所更详细解释的。

图16F示出了用于在测试孔1504中进行的磁聚集步骤的面朝上的微流体板1502的侧视图。在将非特异性结合的探针颗粒的聚集体1608从测试孔1504移开后，微流体板1502被翻转180度恢复，使得测试孔1504的开口1508面朝上。结果是，非特异性探针颗粒落入探针颗粒阱1526中，阻止它们移回测试孔。

然后将磁针1550放置在测试孔1504的底表面1506下方以将特异性结合的探针颗粒聚集成小聚集体1610。这些聚集体1610的尺寸表示保留在底表面1506上的特异性结合的探针颗粒的量，并且可以对其进行分析以确定样品中是否存在靶分析物。

需要说明的是，基于探针颗粒聚集体的方法也可以对探针颗粒阱1526中的非特异性结合的探针颗粒的聚集体1608进行。可替选地，当测试孔面朝下时，也可以分析非特异性结合的探针颗粒的聚集体1608，而无需将微流体板翻转180度恢复的额外步骤。

有利地，将非特异性结合的探针颗粒的聚集体1608从测试孔1504移出至探针颗粒阱1526提高了分析期间特异性结合的探针颗粒和非特异性结合的探针颗粒1608之间的可区分度。

现在将公开使用系统、或制品或试剂盒的示例性、非限制性实施方案。

如本文所述的系统、或制品或试剂盒用于检测生物分子、生物细胞器、生物颗粒、细胞或微生物的用途。

生物颗粒可以是病毒或病毒样颗粒或外泌体。生物颗粒可能是SARS-CoV-2。生物分子可以是蛋白质、抗体、抗原、DNA或RNA。微生物可以是病理性的。

有利地，所述系统或制品或试剂盒的用途可以针对生物分子、生物细胞器、生物颗粒、细胞或微生物的检测进行专门设计，以用于使用人样品例如血清和尿液的实际临床试验。因此，所述系统或制品或试剂盒的用途可以允许检测患者样品中的靶病毒或检测由特定病毒感染诱导的抗体。

进一步有利地，可以以高通量规模使用所述系统、或制品或试剂盒，从而在短时间内快速检测大量样品。如果需要，所述系统或制品或试剂盒的使用也可以大规模地进行，或者可以很容易地视需要扩大到更大的规模。

附图简要说明

附图图示了所公开的实施方案并且用于解释所公开的实施方案的原理。然而，应当理解，这些附图只是为了说明的目的而设计的，而不是作为对本发明的限制的定义。

图1A是本发明的检测方法的一般概念的示意图，其中(1)表示感测元件，(2)表示靶分析物，并且(3)表示探针颗粒。

图1B是本公开的检测方法的示意图，其中在靶分析物存在的情况下，特异性靶分析物-探针颗粒相互作用导致探针颗粒交联到包被的表面，导致如(a)所示的阳性结果。若不存在靶分析物，则将导致如(b)所示的阴性结果。标记(7)表示靶分析物，(8)表示感测元件，并且(9)表示探针颗粒。

图1C是本公开的检测方法的示意图，其中特异性靶分析物-探针颗粒相互作用导致探针颗粒与包被的表面分离，导致如(a)所示的阳性结果。若不存在靶分析物，则将导致如(b)所示的阴性结果。标记(11)表示靶分析物，(12)表示感测元件，并且(13)表示探针颗粒。

图2是用于检测模拟病毒靶分析物的概念验证实验程序的示意图。标记(15)表示ACE2包被的表面，(16)表示靶分析物(RBD包被的模拟病毒)，并且(17)表示超顺磁性探针颗粒(ACE2包被的)。

图3是描述了图2程序的实验结果的图像，其中对于多种模拟病毒靶分析物浓度，在多孔板底部发现了特异性结合的超顺磁性探针颗粒。

图4是说明在图2中描述的程序中相对于模拟病毒靶分析物浓度而言特异性结合的超顺磁性探针颗粒的数量的实验结果的数据，其中：(a)分析在不同模拟病毒靶分析物浓度条件下所得的包被的表面的图像的两个示例，(b)具有不同模拟病毒靶分析物浓度的实验的十个示例试验，(c)样品中100fM和1pM的模拟病毒分析物浓度的实验的示例试验，(d)用于确定方法的交叉反应性水平的两个示例试验。

图5是用于检测抗体靶分析物(CR3022，SARS-CoV-2的抗体)的概念验证实验程序的示意图。

图6是一组图像，描绘了针对多种抗体分析物浓度的图5的程序的实验结果。

图7是说明了相对于检测抗体靶分析物的实验中的抗体靶分析物(CR3022，针对SARS-CoV-2的抗体)浓度而言特异性结合的超顺磁性探针颗粒数量的实验结果的数据。未使用抗体靶分析物(即0M)的对照实验的实验结果数据用于比较。

图8A是描绘了对在包被的表面上特异性结合的探针颗粒的颜色密度进行可视化和随后定量的图像。标记“+”表示含有阳性结果的孔，而标记“-”表示含有阴性结果的孔。

图8B是描绘了使用显微镜对在包被的表面上特异性结合的探针颗粒的颗粒密度进行可视化和随后定量的图像。

图8C是描绘了由特异性结合的探针颗粒在包被的表面上形成的聚集体的聚集体尺寸的可视化和定量的图像。箭头表示在包被的表面上形成为斑点的聚集体。

图8D是描绘了由非特异性结合的探针颗粒在第二表面上形成的聚集体的聚集体尺寸的可视化和定量的图像(聚集体的位置由白色箭头指示)。黑色箭头表示特异性结合的探针颗粒在包被的表面上的位置。

图9A是说明了所述方法在抗SARS-CoV-2受体结合结构域(抗-SARS-CoV-2RBD)抗体检测中的临床验证的数据，其中给出了在COVID-19和登革热恢复期患者血浆样品中检测到的抗体水平的定量结果。

图9B是说明了所述方法在抗SARS-CoV-2受体结合结构域(抗-SARS-CoV-2RBD)抗体检测中的临床验证的数据，其中将图9A中所述的本公开的方法中获得的结果与在COVID-19和登革热恢复期患者的同组血浆样品上使用ELISA滴度测定得到的定量结果进行直接比较。

图10A是说明了对于针对SARS-CoV-2受体结合结构域(SARS-CoV-2RBD)的IgG抗体的初步检测结果的图像。标记“w/o”表示不存在靶分析物，作为阴性对照。

图10B是说明了图10A的对应定量结果的数据。标记“w/o”表示不存在靶分析物，作为阴性对照。

图11A是说明了孔的包被的玻璃表面上特异性结合的探针颗粒用于检测SARS-CoV-2核衣壳抗原(靶分析物)的结果的图像。标记“w/o”表示不存在靶分析物，作为阴性对照。

图11B是说明了针对特定样品时图11A的对应显微镜成像结果的图像。标记“w/o”表示不存在靶分析物，作为阴性对照。

图11C是说明了图11B的对应定量结果的数据。标记“w/o”表示不存在靶分析物，作为阴性对照。

图11D是说明了使用市售的PANBIOTM COVID-19Ag快速测试设备对指定的靶分析物浓度进行SARS-CoV-2核衣壳抗原(靶分析物)检测的图像。标记“w/o”表示不存在靶分析物，作为阴性对照。

图12示出的图说明了根据示例实施方案的用于检测样品中靶分析物的存在的试剂盒的透视图。

图13A示出了在将样品和探针颗粒引入测试孔后孔板的侧视图。

图13B示出了在测试孔内的孵育步骤期间孔板的侧视图。

图13C示出了封闭在水箱中的孔板的侧视图。

图13D示出了封闭在水箱中的孔板的侧视图和透视图，其中孔板和水箱都面朝下。

图13E示出了封闭在水箱中的孔板的侧视图和透视图，其中使用磁针阵列使聚集体移动通过通道。

图13F示出了封闭在水箱中的孔板的侧视图和俯视图，其中孔板和水箱都面朝上。

图14A示出了在非特异性结合的珠已被力分离并移出测试孔外后的孔板的智能手机相机图像。在力施加步骤之前，已经用不同溶液条件下(顶部四个孔：工作缓冲液；中间四个孔：中鼻甲样品；底部四个孔：唾液样品)的不同核衣壳蛋白浓度的液体介质孵育孔。

图14B示出了在显微镜下可视的测试孔的放大图像。

图14C示出了说明探针颗粒量的归一化分数与归一化的探针颗粒聚集体尺寸之间关系的图。

图15示出的图说明了根据另一示例实施方案的用于检测样品中靶分析物的存在的试剂盒的透视图。

图16A示出的三个图像说明了在制备包含样品和探针颗粒的液体介质过程中涉及的步骤。

图16B示出了在将液体介质引入测试孔后微流体板的侧视图。

图16C示出了在测试孔内的孵育步骤期间微流体板的侧视图。

图16D示出了面朝下的微流体板的侧视图。

图16E示出了面朝下的微流体板的侧视图，其中使用磁针阵列使聚集体移动通过去除通道。

图16F示出了用于在测试孔中进行的磁聚集步骤的面朝上的微流体板的侧视图。

附图详细说明

图1A是本公开的检测方法的示意性总体概念。首先，将第一感测元件(1)预包被在一表面(例如盖玻片)上。然后将包被的表面(4)与可能含有靶分析物的样品一起孵育。如果测试样品中存在靶分析物(2)，则靶分析物(2)将结合到包被的表面(4)上。此后，将包被有第二感测元件的探针颗粒(3)上样到包被的表面(4)上并进行孵育，以允许结合在包被的表面上的靶分析物(2)和探针颗粒(3)之间发生特异性相互作用。最后，向探针颗粒(3)施加机械力作为选择步骤，以将非特异性结合的探针颗粒从包被的表面(4)分离。为了确定靶分析物(2)的存在，测量包被的表面上特异性结合的探针颗粒的数量。经选择的特异性靶分析物结合表面可用于其他下游分析，例如测序。

图1B是本公开的检测方法的示意图，其中在靶分析物存在的情况下，特异性的靶分析物-探针颗粒相互作用导致探针颗粒交联到包被的表面。首先，将第一感测元件(8)预包被在表面(例如盖玻片)上。然后将包被的表面与可能含有靶分析物的样品一起孵育。如果测试样品中存在靶分析物(7)，靶分析物(7)将结合到包被的表面上。此后，将包被有第二感测元件的探针颗粒(9)上样到表面上并进行孵育，以允许结合在包被的表面上的靶分析物(7)和探针颗粒(9)之间发生特异性相互作用。在这种情况下，如果测试样品中存在靶分析物(7)(阳性结果)，则探针颗粒(9)可以经由特异性的靶分析物-探针颗粒相互作用而交联到包被的表面，如(a)中所示。在没有靶分析物(7)的情况下(阴性结果)，探针颗粒(9)将非特异性地结合到包被的表面，如(b)中所示。此后，向探针颗粒(9)施加机械力作为选择步骤，以将非特异性结合的探针颗粒从包被的表面分离。在如(b)中没有靶分析物(7)的情况下，探针颗粒(9)由于非特异性结合而较弱地与包被的表面结合，因此，在施加机械力后将从包被的表面去除。相比之下，对于如(a)中经由特异性的靶分析物-探针颗粒相互作用而交联到包被的表面的探针颗粒(9)，它们能够承受一定的机械力并保持与包被的表面的结合。为了确定靶分析物(7)的存在，测量包被的表面上特异性结合的探针颗粒的数量。

图1C是本公开的检测方法的示意图，其中特异性的靶分析物-探针颗粒相互作用导致探针颗粒从包被的表面分离。首先，将第一感测元件(12)预包被在表面(例如盖玻片)上。然后将包被的表面与可能含有靶分析物(11)的测试样品一起孵育。如果测试样品中存在靶分析物(11)，则分析物(11)将结合到包被的表面上。此后，将包被有第二感测元件的探针颗粒(13)上样到表面上并进行孵育，以允许结合在包被的表面上的靶分析物(11)和探针颗粒(13)之间发生特异性相互作用。在这种情况下，如果样品中存在靶分析物(11)，则靶分析物(11)将阻止探针颗粒(13)经由如(a)中所示的特异性的靶分析物-探针颗粒相互作用而交联到包被的表面，因此靶分析物(11)导致探针颗粒(13)从包被的表面分离。在没有靶分析物(11)的情况下，探针颗粒(13)将与包被的表面交联，如(b)所示。此后，向探针颗粒(13)施加机械力作为选择步骤，以将非特异性结合的探针颗粒从包被的表面分离。在如(b)中没有靶分析物(11)的情况下，由于探针颗粒(13)与包被的表面的交联，探针颗粒(13)强力地结合到包被的表面上，因此施加机械力后探针颗粒(13)将不会从包被的表面去除。相反，对于如(a)中由于存在中间的靶分析物(11)而与包被的表面未相连的探针颗粒(13)，探针颗粒(13)因此不能承受机械力并将从包被的表面去除。为了确定靶分析物(11)的存在，测量包被的表面上剩余的探针颗粒的数量。

图2是用于检测模拟病毒靶分析物的概念验证实验程序的示意图，其中在模拟病毒靶分析物存在的情况下，特异性的模拟病毒靶分析物-超顺磁性探针颗粒的相互作用导致超顺磁性探针颗粒交联到包被的表面，导致如(a)所示的阳性结果。若不存在模拟病毒靶分析物，则将导致如(b)所示的阴性结果。标记(15)表示ACE2包被的表面，(16)表示靶分析物(RBD包被的模拟病毒)，并且(17)表示超顺磁性探针颗粒(ACE2包被的)。

图3是描述了图2程序的实验结果的图像，其中在针对多种模拟病毒靶分析物浓度(0pM(对照)、100fM、1pM和10pM)检测模拟病毒靶分析物的实验中，在施加磁力形式的机械力以去除非特异性结合的超顺磁性探针颗粒后，在多孔板的底部发现特异性结合的超顺磁性探针颗粒。可以用肉眼直接观察到结果，并通过表面的强度变化来区分结果(在该情况中为由实箭头(→)所示的增加的孔底部不透明区域，这是由于针对不同浓度模拟病毒靶分析物的表面上特异性结合的超顺磁性探针颗粒的密度不同造成的)。没有任何超顺磁性探针颗粒的区域由虚线箭头(→)所示。

图4是说明了在图2中描述的程序中特异性结合的超顺磁性探针颗粒的数量相对于模拟病毒靶分析物浓度的实验结果的数据，其中：(a)在0pM(对照，左)和10pM(右)模拟病毒靶分析物条件下所得的包被的表面的两个示例分析图像，(b)利用0pM(对照)和10pM模拟病毒分析物进行实验的十个示例试验。对于每对箱线图，如“汇编的”下的灰色区域和“试验1”至“试验10”的虚线区域所表示的，左侧(较低)的箱线图代表对照，右侧的箱线图(较高)代表测试值。所有试验都清楚地表明在样品中检测到10pM模拟病毒靶分析物，(c)清楚地检测到样品中的100fM和1pM模拟病毒靶分析物的实验的示例试验。类似实验重复超过5次，(d)用以确定所述方法的交叉反应性水平的两个示例试验。结果清楚地表明，所述方法能够从其他非靶标分析物中特异性地检测出靶模拟病毒分析物。“NA”表示中性抗生物素蛋白包被的顺磁珠。

图5是用于检测抗体靶分析物(CR3022，SARS-CoV-2的抗体)的概念验证实验程序的示意图，其中在抗体靶分析物存在的情况下，特异性抗体靶分析物-超顺磁性探针颗粒相互作用导致超顺磁性探针颗粒从包被的表面分离，导致如(a)所示的阳性结果。若不存在抗体靶分析物，则将导致如(b)所示的阴性结果。

图6是描绘了图5程序的实验结果的一组图像，其中在检测抗体靶分析物(CR3022，SARS-CoV-2的抗体)的实验中，针对不同抗体靶分析物浓度((a)0M、(b)100pM、(c)1nM、(d)10nM、(e)100nM和(f)1μM)，在施加磁力形式的机械力以去除非特异性结合的超顺磁性探针颗粒后的特异性结合的超顺磁性探针颗粒。

图7是说明了在检测抗体靶分析物的实验中，相对于抗体靶分析物(CR3022，针对SARS-CoV-2的抗体)浓度而言特异性结合的超顺磁性探针颗粒数量的实验结果的数据。未使用抗体靶分析物(即0M)的对照实验的实验结果的数据用于比较。

图8A是描绘了适用于即时检测的对包被的表面上特异性结合的探针颗粒进行可视化和后续定量的图像，其中包被的表面有多个孔，允许同时测试一种或多种样品、阳性及阴性对照。由于特异性结合的探针颗粒在包被的表面上形成有色斑块，因此可以通过在可视化过程中肉眼测量颜色密度而对测试结果进行定性分析。标记“+”表示含有阳性结果的孔，而标记“-”表示含有阴性结果的孔。

图8B是描绘了使用显微镜对包被的表面上特异性结合的探针颗粒进行可视化和随后定量的图像。可以对单位面积上特异性结合的探针颗粒的颗粒密度进行定量。这是一种通过测量颗粒密度来对测试结果进行定量分析的形式，准确度高并且适用于基于中心实验室的测试。

图8C是描绘了当与基于智能手机的成像一起使用时，适用于中心实验室的测试或即时检测的对包被的表面上特异性结合的探针颗粒形成的聚集体进行可视化和定量的图像，其中包被的表面有多个孔，允许同时测试一种或多种样品、阳性及阴性对照。这是一种通过测量聚集体尺寸或聚集体的颜色密度来进行定量分析的形式，其中当分别使用交联/连接测定或阻断/分离测定时，聚集体尺寸和颜色密度与样品中的靶分析物浓度正相关或负相关。箭头表示在包被的表面上形成为斑点的聚集体。

图8D是描绘了当与基于智能手机的成像一起使用时，适用于中心实验室的测试或即时检测的对第二表面上的非特异性结合的探针颗粒形成的聚集体进行可视化和定量的图像，其允许同时测试一种或多种样品、阳性及阴性对照。这是一种通过测量聚集体尺寸或聚集体的颜色密度(白色箭头表示聚集体)进行定量分析的形式，其中当分别使用阻断/分离测定或交联/连接测定时，聚集体尺寸和颜色密度与样品中的靶分析物浓度正相关或负相关。由于第二表面可以是包围第一表面的透明外壳的形式，特异性结合的探针颗粒(黑色箭头表示经包被的多孔板的孔中的特异性结合的探针颗粒)也通过第二表面可被观察到，因此也可以测量特异性结合的探针颗粒的可视化和定量。

图10A是说明了检测针对SARS-CoV-2受体结合结构域(SARS-CoV-2RBD)的IgG抗体的初步结果的图像，其中(顶行)图像是针对不同浓度的CR3022抗体(靶分析物)的包被的表面上特异性结合的探针颗粒获得的，(底行)图像是针对不同连续稀释水平的含CR3022抗体(靶分析物)的人血清获得的。标记“w/o”表示不存在靶分析物，作为阴性对照。

图10B是说明了图10A的对应定量结果的数据，其中在针对SARS-CoV-2受体结合结构域(SARS-CoV-2RBD)的IgG抗体的实验中，检测了每100x100μm²面积的包被的表面上的特异性结合的探针颗粒，其中左图为在不同浓度的CR3022抗体(靶分析物)下针对包被的表面上特异性结合的探针颗粒获得的颗粒密度数据，右图为针对不同连续稀释水平的含CR3022抗体(靶分析物)的人血清获得颗粒密度数据。标记“w/o”表示不存在靶分析物，作为阴性对照。

图11A是说明了用于检测SARS-CoV-2核衣壳抗原(靶分析物)的孔的包被的玻璃表面上特异性结合的探针颗粒的结果的图像，其中SARS-CoV-2核衣壳抗原以指定浓度掺入到匀化缓冲液中(顶部四个孔)，用匀化缓冲液预处理的中鼻甲样品(中间四个孔)和用匀化缓冲液预处理的唾液样品(底部四个孔)中。标记“w/o”表示不存在靶分析物，作为阴性对照。

图11B是说明了在检测SARS-CoV-2核衣壳抗原(靶分析物)的实验中，图11A的中鼻甲样品(顶行)和唾液样品(底行)的特异性结合的探针颗粒的相应显微镜成像结果(使用4倍放大镜头)的图像。标记“w/o”表示不存在靶分析物，作为阴性对照。

图11C是说明了图11B的对应定量结果的数据，其中检测了每100x100μm²面积的包被的表面上的特异性结合的探针颗粒以检测SARS-CoV-2核衣壳抗原(靶分析物)，其中SARS-CoV-2核衣壳抗原以指定浓度掺入中鼻甲样品(左图)和唾液样品(右图)中。标记“w/o”表示不存在靶分析物，作为阴性对照。

图11D是说明了使用市售的PANBIOTM COVID-19Ag快速测试设备对指定的靶分析物浓度进行SARS-CoV-2核衣壳抗原(靶分析物)检测的图像。标记“w/o”表示不存在靶分析物，作为阴性对照。

实施例

实施例1：检测模拟SARS-CoV-2病毒分析物

为了证明检测的可行性，通过用一层SARS-CoV-2受体结合结构域蛋白(RBD)包被微小球形聚苯乙烯颗粒而制备的模拟SARS-CoV-2病毒粒子被用作如图2所示的实验的靶分析物(16)，以模拟真实病毒生物粒子。模拟病毒粒子的直径为约200nm，在20nm至400nm的真实病毒生物粒子范围内。所用的包被的表面(15)是包被有一层受体蛋白ACE2作为感测元件的盖玻片。超顺磁性探针颗粒(17)同样包被有一层受体蛋白ACE2作为感测元件。选择受体蛋白ACE2是因为已知它能够与包被在模拟病毒粒子上的RBD结合。

将包被的盖玻片(15)与10μl含有浓度为100fM、1pM和10pM的RBD包被的模拟病毒粒子的液体唾液样品在室温孵育30分钟，以使RBD包被的模拟病毒粒子(16)结合到包被的盖玻片(15)上。所用液体样品的体积足以完全覆盖包被的盖玻片(15)的表面。进行了对照实验，其中包被的盖玻片(15)与10μl不含包被的模拟病毒粒子(即0M的RBD包被的模拟病毒粒子)的液体唾液样品一起孵育。

此后，将足量的ACE2包被的超顺磁性探针颗粒(17)上样到盖玻片上并在室温孵育10分钟。使用超顺磁性阵列将盖玻片暴露于pN级的选择机械力，以将非特异性结合的ACE2包被的超顺磁性探针颗粒从ACE2包被的盖玻片分离。对于上述样品孵育持续时间、施加的机械力水平和施加力的持续时间，针对模拟病毒靶分析物和实施例所展示的相应感测元件进行校准。当使用不同的感测元件或针对不同的分析物时，这些参数可能会发生变化。对于每个系统，应在应用前预先校准这些值。

已结合有靶模拟病毒靶分析物(16)(即RBD包被的模拟病毒粒子)的包被的盖玻片(15)将与超顺磁性探针颗粒(17)交联，导致当暴露于如图2的(a)所示的选择机械力时，表面上的特异性结合的探针颗粒的密度与对照相比要高得多。

盖玻片上的样品孔可以如图3所示地用肉眼直接观察，也可以在显微镜下用4倍物镜观察，以记录高分辨率图像。在用光学显微镜记录图像的情况下，包被的表面上剩余的超顺磁性探针颗粒可以通过使用专门编写的软件自动计数颗粒数量来进行定量，如图4所示。根据结果，对于浓度为100fM至10pM的靶分析物而言，超顺磁性探针颗粒的数量与对照获得的数量具有显著差异。此外，图4的(d)的结果表明所述方法能够从其他非靶向的分析物中特异性地检测出模拟病毒靶分析物。

结果用作本公开的初步概念验证，证明了低浓度靶分析物的检测限可低至亚皮摩尔水平。基于此结果，本公开的方法可应用于临床环境，以对人样品中的病毒进行准确诊断。

实施例2：检测抗体分析物

还测试了本公开在抗体检测中的能力。在本实验中，CR3022(一种可以结合SARS-CoV-2受体结合结构域蛋白(RBD)的抗体)被用作如图5所示的靶分析物(21)。所用的包被的表面(20)是包被有一层RBD作为它的感测元件的盖玻片。超顺磁性探针颗粒(22)包被有一层受体蛋白ACE2作为感测元件。选择受体蛋白ACE2是因为已知它能够与RBD结合。由于还已知靶抗体分析物CR3022(21)能够与RBD结合，因此靶分析物(21)将阻止超顺磁性探针颗粒(22)结合在包被的盖玻片(20)上。

将包被的盖玻片(20)与10μl含有浓度为100pM、1nM、10nM、100nM和1μM的CR3022抗体的液体血清样品在室温孵育，以使CR3022(21)与RBD包被的盖玻片(20)结合60分钟。所用液体样品的体积足以完全覆盖包被的盖玻片(20)的表面。进行了对照实验，其中包被的盖玻片(20)与10μl不含抗体CR3022(即0M CR3022)的液体血清样品一起孵育。

此后，将ACE2包被的超顺磁性探针颗粒(22)上样到盖玻片上并在室温孵育10分钟。使用磁体阵列将盖玻片暴露于pN级的选择机械力，以将非特异性结合的ACE2包被的超顺磁性探针颗粒从RBD包被的盖玻片分离。

对于上述样品孵育持续时间，施加的机械力水平和施加力的持续时间，针对血清中使用的特定感测元件进行校准。当使用不同的感测元件或使用不同的介质时，这些参数可能会发生变化。对于每个系统，应在应用前预先校准这些值。

已结合有靶分析物CR3022(21)的包被的盖玻片(20)将阻止超顺磁性探针颗粒(22)与RBD包被的盖玻片(20)交联，因此导致在施加机械力后，保留在包被的表面上的超顺磁性探针颗粒的量较少。因此，靶分析物CR3022(21)抑制了超顺磁性探针颗粒(22)在包被的盖玻片(20)上的稳定结合。如图5的(a)所示，在暴露于选择机械力后，超顺磁性探针颗粒(22)被去除，导致了阳性结果，该结果由在表面上留下的超顺磁性探针颗粒数量减少所指示。在包被的盖玻片(20)无靶分析物(21)结合的对照实验中，在暴露于如图5的(b)所示的选择机械力后，超顺磁性探针颗粒(22)将稳定地结合在包被的表面(20)上，这导致了由更多超顺磁性探针颗粒留在表面上所指示的阴性结果。

将盖玻片置于使用4x物镜的显微镜下，以观察包被的表面上特异性结合的超顺磁性探针颗粒，如图6所示。根据这些结果，对于浓度在1nM至1μM(图6的(c)至图6的(f))的靶分析物而言，包被的表面上特异性结合的超顺磁性探针颗粒的数量显著低于对照的包被的表面上特异性结合的超顺磁性探针颗粒的数量(图6的(a))。

包被的表面上特异性结合的超顺磁性探针颗粒的详细定量如图7所示。结果清楚地表明，对于浓度在1nM至1μM的靶抗体分析物而言，包被的表面上特异性结合的超顺磁性探针颗粒的数量显著低于对照的包被的表面上特异性结合的超顺磁性探针颗粒的数量，因此作为本公开的初步概念验证，证明了在未稀释血清中低浓度靶抗体分析物的检测限可低至纳摩尔水平。

基于此结果，本公开的方法可应用于临床环境，以对人样品中的病毒抗体进行准确诊断。

实施例3：检测临床样品中的抗SARS-CoV-2RBD抗体

抗体检测：本公开的方法已应用于对人血浆(样品)中抗受体结合结构域蛋白(RBD)IgG抗体(靶分析物)进行检测和定量。验证实验共使用了22份恢复期血浆样品。在这些样品中，从由COVID-19康复的17名患者中收集了18份血浆样品。一名患者在不同日期捐赠了两份样品，即样品#10和#11。样品#11在患者入院后90天时收集。所有其他样品均在入院后29天至59天之间收集。除了COVID-19恢复期患者样品外，还使用本发明的方法检测了4份来自出现登革热症状并确认为SARS-CoV-2阴性的患者的血浆样品(样品#19至#22)中的抗RBD抗体水平。尽管提供样品#20和#22的患者被检测为登革热阴性，但这4份样品(样品#19至#22)用作阴性对照。

对所有样品中抗RBD抗体水平进行的定量显示在图9A中。将针对所测量的样品得到的包被的表面上特异性结合的探针颗粒的颗粒密度与结果设置为0的市售SARS-CoV-2阴性人血清(Sigma Aldrich，US)，以及结果设置为100的掺入1μM SAD-S35抗RBD抗体的血清(Acro Biosystems)进行比较。根据图9A所示的结果，发现登革热患者样品#19至#22是一致的，产生的信号在0附近，表明这些患者样品中不存在抗RBD抗体。对于COVID-19患者样品，如图9A中样品#1至#18的结果所示，测量到显著不同的抗RBD抗体水平。例如，发现患者样品#5中的抗体强度超过1μM SAD-S35，读数为约127，而许多其他样品(如#3、#7-11、#13等)的读数与阴性对照相当，表明患者血浆中不存在这种特异性抗体。

使用当前的金标准ELISA滴度测定测量了相同COVID-19患者样品中的抗体水平。由ELISA滴度测定得到的定量结果由450nm波长处光密度的半最大吸光度表示。将图9A中所示的本公开的方法产生的数据相比于图9B中所示的ELISA滴度测定产生的结果作图。根据图9B所示的结果，观察到滴度值越大，所述方法产生的信号越高。当用于定量人血浆中的抗RBD抗体时，本公开的方法显示出具有与ELISA滴度测定相似的准确性。

定量滴度抗体测定：本公开的方法可用于执行经典的定量滴度测定，其中对样品进行多次稀释，直到产生的信号低于某个预设值。所述方法可以包括标准抗体作为附加定量水平的参考信号。

在该实验中，将经充分表征的RBD结合性IgG抗体CR3022(Creative Biolabs)作为靶分析物，以不同浓度溶解在预先稀释的人血清样品(Sigma Aldrich,US)中。将市售的人血清与实验室配制的匀化工作缓冲液以1:49的比例混合(即人血清稀释50倍)，以制备预稀释的人血清。将包被有RBD(第二感测元件)的探针颗粒(超顺磁性微珠)与50μl的预稀释人血清/CR3022混合物在试管中孵育15分钟，使探针颗粒与预稀释人血清中的CR3022靶分析物连接。此后，通过使用磁体将超顺磁性探针颗粒捕获至试管中并使用微量移液管去除预稀释的人血清溶液，来将预稀释的人血清与探针颗粒分离。此后，将探针颗粒重悬于试管中的50μl实验室制备的匀化的工作缓冲液中，并将30μl重悬后的混合物上样到测试孔中，孵育30分钟，然后进行分析。

基于图10A中所示的结果，本公开的方法显示出能够检测和定量浓度低至约10pM(其比CR3022靶分析物与RBD感测元件的解离常数低约1000倍)的CR3022靶分析物的存在。考虑到人血清被预稀释50倍，它对应于约500pM CR3022靶分析物(相当于约0.1μg/mLCR3022靶分析物)。如图10B所示，本公开的方法也可用于进行滴度测定。使用本公开的方法进行的测试需要约45分钟，而典型的定量ELISA测定需要2到3小时，因为它涉及多轮缓冲液交换。此外，使用本公开的方法进行的测试仅需要30μl预先稀释的人血清溶液(稀释50倍)；因此只需要少量的原始人血清，其可以通过指刺法提取血滴而方便地获得。尽管获得的数据是基于溶解在商购的人血清中的特定RBD结合性IgG抗体(靶分析物)，但预期同样的原理也适用于其他RBD结合性IgG抗体，或其他针对不同抗原的抗体作为靶分析物，其中样品可以从由指刺法采集的全血样品中提取。

实施例4：检测人唾液和中鼻甲掺入样品中的SARS-CoV-2核衣壳抗原

在本实验中，采用识别SARS-CoV-2核衣壳抗原(靶分析物)的不同表位的一对抗体作为第一感测元件和第二感测元件，并分别包被在一表面和探针颗粒上。配制匀化缓冲液以匀化与抗原预混的唾液样品和中鼻甲样品。下文将与匀化缓冲液混合的样品称为预处理的样品。匀化缓冲液还可以促进核衣壳抗原从SARS-CoV-2病毒粒子释放。该实验是基于从健康人供体获得的唾液和中鼻甲样品进行的，其中样品中掺入了不同浓度的核衣壳抗原。

图11A所示的结果来源于在12孔板中进行的实验，其中底部玻璃表面包被有属于如上所述的抗SARS-CoV-2核衣壳抗体对的抗体。用该对中的另一种抗体包被探针颗粒(超顺磁性微珠)(Invitrogen，US)以用作探针颗粒。将探针颗粒与匀化缓冲液、用匀化缓冲液预处理的唾液样品或中鼻甲样品混合，并将30μl的混合物上样到每个孔中。孵育30分钟后，使用磁体阵列对探针颗粒施加机械力，以将非特异性结合的探针颗粒从包被的表面分离。此后，使用智能手机相机(如图11A所示)或显微镜(如图11B所示)检测包被的表面上特异性结合的探针颗粒。对于显微镜检测，对每100×100μm²面积的包被的表面上的特异性结合的探针颗粒的颗粒密度进行定量。

图11A的结果表明，可以使用智能手机相机直接观察特异性结合的探针颗粒，以检测从特异性结合的探针颗粒散射的淡黄色光，其中特异性结合的探针颗粒可作为黄色斑块而被观察到。散射的淡黄色光的强度可以指示孔中包含的特异性结合的探针颗粒的相对量。图11A的结果显示，在匀化缓冲液(顶部4个孔)、用匀化缓冲液预处理的中鼻甲样品(中间4个孔)或匀化缓冲液预处理的唾液样品(底部4个孔)中，对于10pM、1pM和0pM(标记为“w/o”，阴性对照)的不同靶分析物浓度而言，颜色密度存在视觉上可感知的差异。

图11B的结果示出了使用4倍放大物镜时测试孔的包被的玻璃表面的显微图像。在显微图像中观察到特异性结合的探针颗粒为微小的暗点，其中特异性结合的探针颗粒的颗粒密度随着核衣壳抗原(靶分析物)浓度的降低而降低。基于每100×100μm²面积的包被的表面上的颗粒密度，图11B的特异性结合的探针颗粒的颗粒密度的对应定量见图11C。对于预处理的唾液和鼻甲样品，观察到的信噪比(样品孔中特异性结合的探针颗粒的密度与阴性对照孔(即，标记为“w/o”的孔)中特异性结合的探针颗粒的密度之比)大于3，证明了本公开的方法的灵敏度。SARS-CoV-2变体(UK变体，B1.1.7)的核衣壳抗原也获得了类似的结果(数据未示出)。

图11A至11C的结果证明，当使用智能手机相机或显微镜对唾液和中鼻甲样品针对超低病毒载量(即靶分析物浓度)(低至约1fM(约10⁵/mL))进行可视化和定量时，本公开的方法可用于检测≥1pM SARS-CoV-2核衣壳抗原的存在，假设条件是大部分核衣壳抗原被匀化缓冲液释放。可实现的这一超低病毒载量与使用当前RT-qPCR检测方法的检测限相当，其中相比之下，本公开的方法更快、更便宜且更易于操作。

在图11D所示的另一对比中，观察到市售的PANBIO^TM COVID-19Ag快速测试设备仅检测到掺入到PANBIO^TM抗原检测试剂盒工作缓冲液中的>10pM核衣壳抗原(靶分析物)。因此，基于本公开的方法的核衣壳抗原检测的灵敏度比PANBIO^TM抗原检测试剂盒高至少10倍。虽然所提供的数据是从唾液和中鼻甲样品获得的，但预期对于鼻咽拭子样品也可以获得类似的检测灵敏度。

工业实用性

本文公开的方法、系统、制品和试剂盒可用于广泛种类的诊断应用，例如临床测试、环境监测、中心实验室测试和家庭自我诊断，以检测样品中的靶分析物的存在。所述方法、系统、制品和试剂盒提供了使用特异性靶分析物-探针颗粒相互作用的单靶标检测灵敏度，使得在纳摩尔至飞摩尔范围内的低浓度靶分析物可被检测到，因此所需样品量减小，这进而使得能够进行临床测试中疾病的早期诊断。

明显的是，在本领域技术人员阅读上述公开内容后，在不背离本发明的精神和范围的情况下，本发明的多种其他改进和修改将对于本领域技术人员而言是明显的，并且旨在将所有这些改进和修改均涵盖在所附权利要求的范围内。

Claims (25)

1.一种检测样品中靶分析物的存在的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将所述样品与包被有第一感测元件的表面一起孵育，其中所述第一感测元件能够与所述靶分析物特异性结合，并且其中在孵育的同时或孵育之后，当所述样品中存在所述靶分析物时，所述靶分析物与所述包被的表面上存在的所述第一感测元件结合；

b)将步骤(a)的所述包被的表面与多个探针颗粒一起孵育，其中所述探针颗粒包被有第二感测元件，所述第二感测元件能够与结合在所述包被的表面上的所述靶分析物特异性相互作用或能够与所述包被的表面上的所述第一感测元件特异性相互作用；

c)施加机械力以将步骤(b)的非特异性结合的探针颗粒从所述包被的表面分离；以及

d)测量反映所述包被的表面上特异性结合的探针颗粒的量的特性，其中所述特性选自由以下组成的组：颗粒密度、颜色密度、聚集体尺寸及其组合，或测量反映非特异性结合的探针颗粒的量的特性，其中所述特性选自由以下组成的组：颜色密度、聚集体尺寸及其组合。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一感测元件与所述第二感测元件相同或不同，并且其中所述第一感测元件和所述第二感测元件独立地选自由以下组成的组：源自微生物的生物分子、生物颗粒、材料或产物，或其中所述第一感测元件和所述第二感测元件独立地选自由以下组成的组：碳水化合物、多糖、脂质、蛋白质、肽、核酸、抗体、抗原、激素、酶或化学化合物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述靶分析物可溶于水性介质或溶剂中，并且其中在与所述包被的表面一起孵育之前，将所述靶分析物分散在液体介质中。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述探针颗粒是非磁性、磁性或超顺磁性颗粒，并且其中所述探针颗粒的尺寸在8nm至100,000nm的范围内。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述机械力由永磁体、电磁体、离心机、声学装置、超声波、激光束、流体运动、流体浮力或重力产生，并且其中所述机械力在0.01pN至100pN的范围内。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中当所测量的特性是颜色密度、或聚集体尺寸、或颜色密度和聚集体尺寸时，步骤(d)进一步包括步骤(d0)：在步骤(d)之前通过在所述包被的表面的另一侧施加磁力使所述包被的表面上的所述特异性结合的探针颗粒凝聚成聚集体。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述步骤(c)进一步包括提供第二表面以接触从所述包被的表面分离的非特异性结合的探针颗粒；以及

通过在所述第二表面的一侧施加机械力使所述非特异性结合的探针颗粒在所述第二表面的另一侧凝聚成聚集体；

其中所述机械力是磁力。

8.根据权利要求7所述的方法，其进一步包括测量所述聚集体的颜色密度、或聚集体尺寸、或颜色密度和聚集体尺寸。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述磁力由磁针形式的永磁体或电磁体产生，并且其中所述磁力在0.01pN至100pN的范围内。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中当同时进行步骤(a)和步骤(b)时，将所述样品和所述多个探针颗粒的混合物与所述包被的表面一起孵育。

11.一种用于检测样品中靶分析物的存在的系统，所述系统包括：

a)包被有第一感测元件的表面，其中所述第一感测元件能够与所述靶分析物特异性结合；

b)多个探针颗粒，其中所述探针颗粒包被有第二感测元件，所述第二感测元件当所述靶分析物存在时能够与所述靶分析物特异性相互作用或能够与所述包被的表面上的所述第一感测元件特异性相互作用，从而在所述包被的表面上形成特异性结合的探针颗粒；

c)机械力，其能够将非特异性结合的探针颗粒从所述包被的表面分离；和

d)测量装置，其用于测量所述特异性结合的探针颗粒的特性，其中所述特性选自由以下组成的组：所述特异性结合的探针颗粒的颗粒密度、颜色密度、聚集体尺寸；或用于测量所述非特异性结合的探针颗粒的特性，其中所述特性选自由以下组成的组：所述非特异性结合的探针颗粒的颜色密度、聚集体尺寸。

12.根据权利要求11所述的系统，其进一步包括用于接触所述非特异性结合的探针颗粒的第二表面；和用于测量所述非特异性结合的探针颗粒的特性的测量装置，其中所述特性选自由以下组成的组：颜色密度、聚集体尺寸及其组合。

13.一种用于检测样品中靶分析物的存在的制品，所述制品包括：

至少一个测试孔，其包括包被有第一感测元件的底表面，所述第一感测元件被配置为与所述样品中的所述靶分析物结合，其中所述测试孔被配置为接收包含在一种或多种液体介质中的样品和探针颗粒，所述探针颗粒包被有被配置为与选自由所述第一感测元件和所述靶分析物组成的组中的一种结合的第二感测元件，使得所述探针颗粒取决于所述样品中所述靶分析物的存在而特异性结合到所述包被的表面；和

通道，其在距所述底表面一定距离处连接到所述测试孔以允许所述通道和所述测试孔之间的流体连通，其中所述通道被配置为在对所述探针颗粒施加外力后接收所述测试孔中的非特异性结合的探针颗粒，所述外力将所述非特异性结合的探针颗粒移离所述底表面。

14.根据权利要求13所述的制品，其中所述通道包括探针颗粒阱，所述探针颗粒阱被配置为在去除施加在所述探针颗粒上的外力之后容纳所述通道接收的非特异性结合的探针颗粒。

15.根据权利要求13或14所述的制品，其进一步包括系统对照孔，所述系统对照孔包括包被有所述靶分析物的底表面，其中所述系统对照孔被配置为接收所述样品和探针颗粒。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的制品，其进一步包括空白对照孔，所述空白对照孔包括包被有阻止与所述靶分析物的结合的非诱饵分子的底表面，其中所述空白对照孔被配置为接收所述样品和探针颗粒。

17.根据权利要求13至15中任一项所述的制品，其进一步包括阴性对照孔，所述阴性对照孔包括包被有所述第一感测元件的底表面，其中所述阴性对照孔被配置为接收不存在所述靶分析物的一种或多种液体介质。

18.根据权利要求13至17中任一项所述的制品，其中所述通道在与所述测试孔的开口相邻处连接到所述测试孔，所述开口形成在所述测试孔的顶部部分。

19.根据权利要求18所述的制品，其进一步包括外壳，所述外壳包括被配置为面向所述测试孔的内表面，并且其中所述通道包括在所述外壳的所述内表面和从所述测试孔的所述开口向外延伸的壁之间界定的空间。

20.一种用于检测样品中靶分析物的存在的试剂盒，所述试剂盒包括：

根据权利要求13至19中任一项所述的制品；

包被有第二感测元件的探针颗粒，所述探针颗粒被包含在溶液中；和

被配置为对所述探针颗粒施加外力的仪器。

21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述仪器包括磁针，并且所述探针颗粒包括磁性颗粒或超顺磁性颗粒。

22.根据权利要求20或21所述的试剂盒，其进一步包括注射器，用于将所述样品引入滴瓶中以与含有所述探针颗粒的溶液混合从而形成一种或多种液体介质，并将所述一种或多种液体介质转移到所述制品中。

23.一种使用根据权利要求20至22中任一项所述的试剂盒的方法，所述方法包括以下步骤：

将包含在所述一种或多种液体介质中的所述样品和所述探针颗粒引入所述制品的所述测试孔中；

对所述探针颗粒施加所述外力以使非特异性结合的探针颗粒移离所述测试孔的所述底表面并进入所述通道；

分析选自由所述测试孔和所述通道组成的组中的至少一个中的探针颗粒，从而确定所述样品中所述靶分析物的存在。

24.根据权利要求23所述的使用所述试剂盒的方法，其中对所述探针颗粒施加所述外力的步骤包括：

将所述制品上下颠倒；以及

使用磁针控制所述非特异性结合的探针颗粒向所述通道中的移动。

25.根据权利要求11或12所述的系统或根据权利要求13至19中任一项所述的制品或根据权利要求20至22中任一项所述的试剂盒用于检测生物分子、生物细胞器、生物颗粒、细胞或微生物的用途。

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