CN113825842A - 靶分子的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的对结构体的表面靶分子及内部靶分子进行检测的方法包含:使分散有所述结构体的液体接触于具有多个孔的孔阵列、向所述孔内导入所述结构体;使密封液接触于所述孔阵列、将所述结构体封入在所述孔内;在所述孔内对所述结构体的内容物进行抽提;在所述孔内对存在于所述结构体的表面的至少1种所述表面靶分子进行检测;以及在所述孔内对存在于所述结构体的内部的至少1种所述内部靶分子进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及靶分子的检测方法。更具体地说,涉及对存在于结构体表面的表面靶分子及存在于结构体内部的内部靶分子进行检测的方法、结构体的评价方法及试剂盒。
本申请对在2019年5月21日于日本申请的日本特愿2019-095187号主张优先权,将其内容援引至此。
背景技术
通过定量地检测生物体试样中的靶分子来进行疾病的早期发现或给药的效果预测。一直以来,蛋白质的定量通过酶联免疫吸附检测(ELISA)等进行,核酸的定量通过实时PCR法等进行。
近年来,出于更早期地发现疾病等目的,更加精度良好地检测靶分子的需求提高。作为精度良好地检测靶分子的手法,例如在专利文献1、专利文献2及非专利文献1等中记载了在多个微小分区内进行酶反应的技术。这些手法被称作数字化测量。
在数字化测量中,将试样溶液分割成极多个的微小溶液。进而,对来自各微小溶液的信号进行二值化,仅辨别靶分子是否存在,然后测量靶分子数。根据数字化测量,与现有的ELISA或实时PCR法等相比,可以格外地提高检测灵敏度及定量性。
数字化PCR中,按照存在于1个微小液滴中的成为模板的核酸为0个或1个的方式,将PCR反应试剂与核酸的混合物进行稀释。数字化PCR中,为了提高核酸扩增的灵敏度,以及为了对多个微小液滴同时进行核酸扩增,优选各微小液滴的体积小。例如,专利文献3中公开了按照各孔的容积达到6nL(纳升)的方式形成的阵列状的反应容器。另外,专利文献1中公开了下述方法:向形成有多个深度为3μm、直径为5μm的孔的流路中流入试样而将试样导入至各孔中后,使用油将流路内的剩余试剂挤出,从而将试样导入至各孔内。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利第6183471号公报
专利文献2:日本特表2014-503831号公报
专利文献3:国际公开第2013/151135号
非专利文献
非专利文献1:Kim S.H.,et al.,Large-scale femtoliter droplet array fordigital counting of single biomolecules.,Lab on a Chip,12(23),4986-4991,2012.
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明的目的在于提供对存在于结构体的外部及内部的靶分子进行检测的技术。
用于解决技术问题的手段
本发明包含以下方式。
[1]一种对结构体的表面靶分子及内部靶分子进行检测的方法,其包含:
使分散有所述结构体的液体接触于具有多个孔的孔阵列、向所述孔内导入所述结构体;
使密封液接触于所述孔阵列、将所述结构体封入在所述孔内;
在所述孔内对所述结构体的内容物进行抽提;
在所述孔内对存在于所述结构体的表面的至少1种所述表面靶分子进行检测;以及
在所述孔内对存在于所述结构体的内部的至少1种所述内部靶分子进行检测。
[2]根据[1]所述的方法,其中,对所述结构体的内容物进行抽提、对所述表面靶分子进行检测、及对所述内部靶分子进行检测是在将所述结构体封入在所述孔内之后进行。
[3]根据[1]或[2]所述的方法,其中,对所述表面靶分子进行检测及对所述内部靶分子进行检测是在对所述结构体的内容物进行抽提之后进行。
[4]根据[1]~[3]中任一项所述的方法,其中,对所述表面靶分子进行检测及对所述内部靶分子进行检测是同时进行的。
[5]根据[1]~[4]中任一项所述的方法,其中,对所述表面靶分子进行检测及对所述内部靶分子进行检测是在同一条件下进行。
[6]根据[1]~[5]中任一项所述的方法,其中,所述表面靶分子及所述内部靶分子分别为选自核酸、蛋白质、糖、脂质或它们的复合体中的至少1种分子。
[7]根据[1]~[6]中任一项所述的方法,其中,所述表面靶分子包含蛋白质,所述内部靶分子包含核酸。
[8]根据[1]~[7]中任一项所述的方法,其中,对所述内部靶分子进行检测是利用核酸检测手法来进行。
[9]根据[8]所述的方法,其中,所述核酸检测手法为侵入裂解分析(InvasiveCleavage Assay)。
[10]根据[1]~[9]中任一项所述的方法,其中,对所述表面靶分子进行检测时所检测的信号与对所述内部靶分子进行检测时所检测的信号是可彼此区分的。
[11]根据[1]~[10]中任一项所述的方法,其中,所述结构体为选自病毒、外泌体、细胞、内质网中的任一种。
[12]根据[1]~[11]中任一项所述的方法,其中,所述结构体与捕获物形成复合体,所述捕获物是固相与针对所述结构体的特异性结合物质的结合体。
[13]根据[12]所述的方法,其中,所述特异性结合物质为抗体。
[14]根据[1]~[13]中任一项所述的方法,其中,对所述结构体的内容物进行抽提是在包含表面活性剂的液体中对结构体进行加热。
[15]根据[1]~[14]中任一项所述的方法,其中,在将所述结构体导入所述孔内时,在每1个所述孔中导入1个以下的所述结构体。
[16]一种结构体的评价方法,其包含:
利用[15]所述的方法检测所述每个孔中有无所述表面靶分子及所述内部靶分子;以及
根据所述表面靶分子的检测结果及所述内部靶分子的检测结果来对所述结构体进行评价。
[17]一种用于检测结构体的表面靶分子及内部靶分子的试剂盒,其包含:
具有多个孔的孔阵列;
从所述结构体中抽提内容物的试剂;
对存在于所述结构体的表面的至少1种所述表面靶分子进行检测的试剂;以及
对存在于所述结构体的内部的至少1种所述内部靶分子进行检测的试剂。
发明效果
根据本发明,可以提供对存在于结构体的外部及内部的靶分子进行检测的技术。
附图说明
图1为表示流体设备之一例的示意截面图。
图2为表示流体设备之一例的示意截面图。
图3为表示流体设备之一例的示意截面图。
图4为表示流体设备之一例的示意截面图。
图5为表示流体设备之一例的示意截面图。
图6为表示流体设备之一例的示意截面图。
图7A为表示结构体被收容在由孔和密封液L120所形成的微小分区中的样子的示意图。
图7B为表示在抽提工序后、内部靶分子被从结构体中抽提出来的样子的示意图。
图8A为表示结构体利用捕获物被导入及封入在孔中、收容在由孔和密封液所形成的微小分区中的样子的示意图。
图8B为表示在抽提工序后、内部靶分子被从结构体中抽提出来的样子的示意图。
图9为表示实施例2的荧光观察结果的照片。
图10为表示在实施例3中测定荧光信号的经时变化的结果的图表。
图11为表示在实施例4中测定荧光信号的经时变化的结果的图表。
具体实施方式
以下根据情况一边参照附图一边详细地说明本发明的实施方式。此外,附图中,相同或相当的部分带有相同或对应的符号,且重复的说明省略。此外,各图中的尺寸比有为了说明而夸张的部分,未必与实际尺寸一致。
[对结构体的表面靶分子及内部靶分子进行检测的方法]
本发明的一实施方式提供一种对结构体的表面靶分子及内部靶分子进行检测的方法,其包含:使分散有所述结构体的液体接触于具有多个孔的孔阵列、向所述孔中导入所述结构体;使密封液接触于所述孔阵列、将所述结构体封入在所述孔内;在所述孔内对所述结构体的内容物进行抽提;在所述孔内对存在于所述结构体的表面的至少1种所述表面靶分子进行检测;以及在所述孔内对存在于所述结构体的内部的至少1种所述内部靶分子进行检测。
此外,还可以将导入所述结构体表述为导入工序。同样地,可以将对所述结构体的内容物进行抽提表述为抽提工序。可以将对所述表面靶分子进行检测表述为表面靶分子检测工序。可以将对所述内部靶分子进行检测表述为内部靶分子检测工序。
在实施例中,如后所述,通过本实施方式的方法,可以对存在于结构体表面的至少1种表面靶分子、及存在于结构体内部的至少1种内部靶分子进行检测。
本说明书中,表面靶分子是指露出至结构体的表面而存在的分子,是作为检测对象的分子。另外,内部靶分子是指内包在结构体的内部、未露出至表面的分子、是作为检测对象的分子。为了检测内部靶分子,需要将内容物从结构体中抽提出来,使内部靶分子露出。
根据本实施方式的方法,还易于以1个结构体水平对表面靶分子及内部靶分子进行检测。
(结构体)
作为结构体,只要具有表面靶分子露出的表面、及包含内部靶分子的内部结构,则无特别限定,可以使用任意的结构体。作为具体的结构体,例如可举出病毒、外泌体、细胞及内质网等。作为细胞,可举出真核细胞、原核细胞等。作为真核细胞,可举出动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞及真菌细胞等。作为原核细胞,可举出细菌等。作为内质网,可举出作为细胞内小器官的内质网及由脂质膜构成的天然或人工的膜囊泡等。结构体可以存在于生物体试样中。作为生物体试样并无特别限定,可举出血清、血浆及尿等。
(孔)
孔阵列具有多个孔。各孔只要是具有能够收容上述结构体及在后述的所述结构体的内容物的抽提、表面靶分子的检测、内部靶分子的检测中使用的试剂的尺寸,则其形状及配置并无特别限定。
另外,孔可以无处理地进行使用,也可以根据目的、预先在孔内壁上固定对结构体的内容物进行抽提的抽提试剂、抗体及针对结构体的特异性结合物质等。
(流体设备)
图1为表示流体设备之一例的示意截面图。如图1所示,孔阵列140可以与具备流路130的流体设备100的流路130相邻地配置。如图1所示,流体设备100具备基板110和相向于基板110而配置的盖构件120(也可仅记为盖120)。盖构件120具有凸部121。凸部121的前端接触于基板110。流体设备100中,孔阵列140在基板110的一个面上与基板110一体成型、且与盖构件120相向。孔阵列140具有多个孔141。多个孔与流路130相连。盖构件120还可以焊接或粘接在基板110上。
孔141在基板110的表面具有开口。孔141的形状、尺寸及配置并无特别限定,优选在1个孔141中导入1个结构体。孔141优选是容积小的微小孔。例如,1个孔141的容积可以是10fL~100pL左右。流体设备100中,同样形状同样大小的多个孔141构成孔阵列140。同样形状同样大小只要是为了进行数字化测量所要求的程度地同一形状且同一容量即可,制造上的误差程度的不均是允许的。
孔141的直径例如可以为1~10μm左右。孔141的深度例如可以为1~10μm左右。另外,孔141的配置并无特别限定,例如可以排列成三角格子状、还可以排列成正方格子状、也可以无规地配置。
流体设备100中,通过凸部121的存在,在孔阵列140与盖构件120之间形成了空间。该空间构成流路130。流路130作为用于对分散有结构体的液体及密封液进行送液的路径发挥功能。流路130的形状、结构及容量等并无特别限定,流路130的高度,即基板110的表面与盖构件120相向于基板110的那一面之间的距离例如可以为500μm以下、还可以例如为300μm以下、还可以例如为200μm以下、还可以例如为100μm以下。
凸部121也可以与盖构件120一体地成形。盖构件120例如可以通过使用成形模具对热塑性树脂的流动体进行成形而成形为具有凸部121的板状。另外,还可以在盖构件120上形成有试剂的导入口122及排出口123。
盖构件120具有凸部121时,按照凸部121接触于基板110的孔141进行开口的面的方式将盖构件120与基板110重叠。结果,盖构件120与基板110之间的空间变成流路。盖构件120和基板110还可以通过激光焊接等进行焊接。
(流体设备的变形例1)
本实施方式的方法中使用的流体设备不限于上述的流体设备100。图4为表示流体设备之一例的示意截面图。如图4所示,流体设备200具备基板110和壁构件210(也可以仅记为壁部210)。流体设备200中,孔阵列140在基板110的一个面上与基板110一体成形。孔阵列140具有多个孔141。
流体设备200主要在没有盖构件120的方面与上述流体设备100不同。因此,流体设备200没有流路。
(流体设备的变形例2)
上述流体设备100中,盖构件120与凸部121是一体成形的。但是,盖构件120和凸部121也可分体地进行成形。
另外,在上述流体设备100及流体设备200中,孔阵列140在基板110的一个面上与基板110一体成形。但是,孔阵列也可以不与基板110一体成形。例如,还可以将与流体设备分体地成形的孔阵列140配置在流体设备的基板110上。或者,还可以在基板110的表面上层叠树脂层,利用刻蚀等在树脂层上形成孔阵列。
(流体设备的变形例3)
另外,在上述流体设备100中,孔阵列形成在基板110上。但是,也可以将孔阵列设置在盖构件120上。作为另一方面,还可以将与流体设备100分体地成型的孔阵列配置在流体设备100的盖构件120上。或者,还可以将树脂层层叠在盖构件120的表面上、利用刻蚀等在树脂层中形成孔阵列。或者,还可以在盖构件120的表面上直接形成孔阵列。
(流体设备的材质)
基板110例如使用树脂形成。树脂的种类并无特别限定,优选是对于试剂及密封液具有耐受性的树脂。另外,当所检测的信号为荧光时,优选自体荧光少的树脂。例如,可举出环烯烃聚合物、环烯烃共聚物、硅、聚丙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚乙酸乙烯酯、氟树脂及无定形氟树脂等,但不限于这些。
还可以在基板110的板厚方向的一个面上形成多个孔141。换而言之,还可以在基板110的一个面上形成在板厚方向上具有深度的多个孔141。作为使用了树脂的孔的形成方法,可举出注塑成形、热压印、光压印等。
或者,例如还可以在基板110上层叠氟树脂、利用刻蚀等对该氟树脂进行加工而形成孔阵列。作为氟树脂,例如可以使用CYTOP(注册商标)(旭硝子)等。
另外,流体设备具有盖构件120时,盖构件120的材质优选是自体荧光少的树脂,例如可以是环烯烃聚合物、环烯烃共聚物等热塑性树脂。
另外,盖构件120可以由不透过在对信号进行荧光观察时所检测的波长附近的波长的光的材料形成,也可以由完全不透光的材料形成。例如,盖构件120可以由添加有碳或金属粒子等的热塑性树脂形成。
(现有的靶分子的检测方法)
一边参照图1~图3,一边以使用流体设备100的情况为例来说明利用数字化测量对靶分子进行检测的现有方法。
首先,如图1所示,从流体设备100的导入口122导入试剂液L110,送液至流路130。试剂液L110包含靶分子。将试剂液L110所含靶分子的浓度调整至在孔141中、每1孔进入1分子以下的靶分子的浓度。送液至流路130的试剂液L110被收容在多个孔141的内部。
接着,如图2所示,将密封液L120从盖构件120的导入口122送液至基板110与盖构件120之间的流路130、将多个孔141分别地密封。作为密封液,例如可以使用油性的油。密封液L120将送液至流路130的试剂液L110中未被收容在孔141中的试剂液L110冲走而置换。由此,密封液L120将收容有包含靶分子的试剂液L110的多个孔141分别单独地密封,孔141成为独立的反应空间、即微小分区142。
接着,如图3所示,在孔141内进行规定的反应,观察所产生的信号。孔142R是检测到信号的孔、孔142是未检测到信号的孔。
现有的检测方法中,当对细胞或病毒等结构体中所含的核酸或蛋白质等靶分子进行检测时,预先将靶分子从结构体中抽提出来、混合在试剂液L110中进行送液。因此,在从结构体中抽提靶分子的阶段及送液工序中,靶分子有时会损失、减少。另外,有时靶分子不被收容在孔141内、而是滞留在流路130的内部、被密封液L120冲走,在反应工序中观测不到信号扩增反应、检测不到存在。结果,有时无法准确地检测结构体所含的靶分子。另外,在检测到了靶分子时,也无法将结构体与被检测到的靶分子相关联。
接着,一边参照图4~图6、一边以使用流体设备200的情况为例来对利用数字化测量对靶分子进行检测的现有方法进行说明。此时,可以使用国际公开第2016/006208号所公开的方法进行检测。
首先,如图4所示,向流体设备200的内部导入试剂液L110。试剂液L110包含靶分子。将试剂液L110中包含的靶分子的浓度调整为在孔141中、每1孔进入1分子以下的靶分子的浓度。试剂液L110被收容在多个孔141的内部。
接着,如图5所示,将密封液L120导入至流体设备200的内部。密封液L120的比重大于试剂液L110。因此,密封液L120沉降在比试剂液L110中未收容在孔141中的试剂液L110更低处、接触于孔阵列140。进而,密封液L120将收容有包含靶分子的试剂液L110的多个孔141分别单独地密封,孔141形成独立的反应空间、即微小分区142。
接着,如图6所示,在孔141内进行规定的反应,观察所产生的信号。孔142R是检测到信号的孔、孔142是未检测到信号的孔。
(本实施方式的检测方法)
接着,根据情况一边参照图1~3,一边以使用流体设备100的情况为例来说明本实施方式的方法。本实施方式的方法是对结构体的表面靶分子及内部靶分子进行检测的方法,其包含:使分散有结构体的液体接触于具有多个孔的孔阵列、将所述结构体导入至所述孔中;使密封液接触于所述孔阵列、将所述结构体封入在所述孔内;在所述孔内对所述结构体的内容物进行抽提;在所述孔内对存在于所述结构体的表面的至少1种所述表面靶分子进行检测;以及在所述孔内对存在于所述结构体的内部的至少1种所述内部靶分子进行检测。
根据本实施方式的方法,可以对结构体、表面靶分子及内部靶分子彼此相关联地进行检测。即,可以以1个结构体水平对表面靶分子及内部靶分子进行检测。利用本实施方式的方法检测到表面靶分子及内部靶分子时,可以说该表面靶分子及内部靶分子存在于1个结构体的表面及内部。
根据本实施方式的方法,可以检测包含表面靶分子及内部靶分子的两种以上的靶分子。另外,还可以检测多种的表面靶分子。进而,还可以检测多种的内部靶分子。
《结构体向孔中的导入》
本工序中,如图1所示,从流体设备100的导入口122导入试剂液L110,送液至流路130中。试剂液L110是分散有结构体的液体。试剂液L110包含用于检测表面靶分子及内部靶分子的试剂。在将试剂液L110送液至流路130的时间点,用于检测表面靶分子的试剂可以结合于表面靶分子、也可以不结合于表面靶分子。
现有的方法中,试剂液L110包含预先从结构体中抽提出的靶分子。而本实施方式的方法中,试剂液L110在包含结构体本身的方面与现有技术不同。即,试剂液L110包含结构体。
被送液至流路130的试剂液L110接触于孔阵列140。进而,试剂液L110被收容在孔141的内部。结果,结构体被导入至孔141中。
在导入工序中,被导入至1个孔中的结构体的数量并无特别限定,优选将1个以下、即0个或1个结构体导入至1个孔中。由此,能够以一个单位进行结构体的检测,即能够进行数字化测量。另外,并无必要将结构体导入至孔阵列的全部孔中。
将结构体导入至孔的手段并无特别限定,可以选择与所选结构体相应的适当手段。例如,可举出利用自重使结构体在流体设备内(流路内)沉降而分配到孔中的方法。或者,还可以利用通过后述方法捕获结构体的物质(捕获物),使捕获物结合于难以通过自重而沉降的结合体而形成复合体来进行送液。另外,通过预先使捕获物固定在孔中,使其捕获被送液的结构体而形成复合体,也可以提高结构体向孔中的导入效率。
还可以通过使比重小于试剂液L110的捕获物结合于结构体、对试剂液L110进行送液来将结构体导入至孔中。此时,可以以按照基板110处于上侧、盖构件120处于下侧的方式使流体设备100上下颠倒的状态来对试剂液L110进行送液,从而可以将结构体导入至孔中。另外,在使用流体设备的变形例3中说明过的流体设备时,可以将结构体导入至形成于盖构件120的孔中。此外,当结构体的比重小于试剂液L110的比重时,可以通过相同的方法将结构体导入至孔中。
使捕获物结合于结构体的工序可以在本实施方式方法的任意的时间点进行。例如该工序可以通过在将结构体导入至孔中之前、在样品管内使结构体与捕获物接触来进行。结构体与捕获物的接触可以通过在包含结构体的试剂液L110中添加捕获物来进行。另外,还可以使结构体与捕获物接触、之后与包含用于检测表面靶分子及内部靶分子的试剂的溶液混合。或者,还可以在将捕获物导入至孔中之后,将结构体导入至孔中,在孔内使捕获物与结构体接触,从而形成复合体。
捕获物是能够捕获结构体的物质。捕获物例如可以是固相与针对结构体的特异性结合物质的结合体。另外,特异性结合物质还可以是抗体。
作为固相,可举出粒子、膜及基板等。另外,针对结构体的特异性结合物质可以是至少1种。例如还可以是三种、还可以是四种、还可以是五种以上。
作为粒子,并无特别限定,可举出聚合物粒子、磁性粒子及玻璃粒子等。粒子优选是实施了用于避免非特异性吸附的表面处理的粒子。另外,为了对特异性结合物质进行固定化,优选表面具有羧基等官能团的粒子。更具体地说,可以使用JSR公司制的商品名“Magnosphere LC300”等。
或者,例如作为结构体使用病毒时,作为捕获物,还可以使用病毒能够附着的细胞(即具有病毒受体的细胞)。
作为特异性结合物质,可举出抗体、抗体片段、适配体及外源凝集素等。作为抗体片段,可举出Fab、F(ab’)2、Fab’、单链抗体(scFv)、二硫键稳定性抗体(dsFv)、二聚体V区域片段(Diabody)及包含CDR的肽等。抗体可以是单克隆抗体、也可以是多克隆抗体。另外,还可以是市售的抗体。
作为使特异性结合物质固定化在粒子表面上的方法并无特别限定,可举出利用物理吸附的方法、使用化学结合的方法、利用亲和素-生物素的结合的方法、及利用蛋白质G或蛋白质A与抗体的结合的方法等。作为利用物理吸附的方法,可以举出通过疏水性的相互作用或静电相互作用将特异性结合物质固定化在粒子表面上的方法。作为利用化学结合的方法,可举出使用交联剂的方法。例如,当粒子的表面具有羟基时,通过使交联剂与特异性结合物质所具有的羧基反应而进行活性酯化后、使羟基与该酯基反应,可以使特异性结合物质固定化在粒子表面上。另外,优选在特异性结合物质与粒子表面之间设置间隔物以使得不会阻碍特异性结合物质对靶分子的识别能力。
如上所述,可以使用捕获物来进行结构体向孔的导入。例如,可以将捕获物与结构体的复合体送液至流路而导入至孔中。
这里,优选在1个捕获物捕获0个或1个靶分子的条件下来形成捕获物与结构体的复合体。进而,优选构成为将0个或1个捕获物导入至1个孔内。由此,能够进行数字化测量。即,在本实施方式中,结构体的检测可以以1个单位进行。此时,可以以1个结构体水平检测表面靶分子及内部靶分子。
《结构体在孔中的封入》
本工序中,如图2所示,将密封液L120从盖构件120的导入口122送液至基板110与盖构件120之间的流路130。送液至流路130的密封液L120接触于孔阵列140。进而,密封液L120将已送液至流路130的试剂液L110中未被收容在孔141内的试剂液L110冲走而置换。由此,密封液L120将收容有包含结构体的试剂液L110的多个孔141分别单独地密封,孔141成为独立的反应空间,即微小分区142。
密封液是能够将导入至多个孔中的液体彼此按照不会互相混合的方式分别密封地形成液滴、即微小液滴的液体,优选是油性溶液、更优选是油。作为油,可以使用氟系油、有机硅系油、烃系油或它们的混合物等。更具体地说,可以使用Sigma公司制的商品名“FC-40”等。FC-40(CAS编号:86508-42-1)是氟化脂肪族化合物,25℃下的比重为1.85g/mL。
《结构物的内容物的抽提》
本工序中,在孔141内对结构体的内容物进行抽提。本工序中,从结构体中将包含内部靶分子的内容物抽提出来。在内容物的抽提时,可以从结构体中将全部的靶分子抽提出来,还可以将结构体中包含的靶分子的仅一部分抽提出来。
作为从结构体中抽提靶分子的方法并无特别限定,可以使用公知的手法。例如,可举出使用了热、超声波、光、磁力或电磁波等的物理性手法;使用了表面活性剂、抗生素、渗透压诱导剂或坏死-凋亡诱导剂等抽提剂的化学性手法、及这些手法的组合等。
作为表面活性剂,优选使结构体不稳定的物质。作为具体的表面活性剂,例如可举出Triton-X100(也称作聚乙二醇单-4-辛基苯基醚(n=约10))、十二烷基硫酸钠、NonidetP-40(也称作辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇)及Tween20(也称作聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酯)等。另外,作为抽提剂,还可以使用包含表面活性剂的试剂。作为包含表面活性剂的试剂,例如可举出BugBuster(Merck Millipore公司制)等。
更具体地说,作为抽提方法使用热时,只要是按照达到足以使结构体不稳定的温度的方式对结构体进行加热即可。通过使流体设备在优选70℃以上且90℃以下、更优选75℃以上且85℃以下、例如约80℃下加热至少5分钟、优选至少10分钟、例如约15分钟或约30分钟,可以将靶分子从结构体中抽提出来。
作为抽提方法使用热时,通过在包含表面活性剂的液体中加热结构体,也可以将结构体的内容物抽提出来。
使用抽提剂时,结构体及抽提剂可以在本实施方式方法的任意时间点接触。例如,可以将结构体及抽提剂在导入工序之前混合、接着对混合后的液体进行送液而导入至孔中。之后进行封入工序。
此时,还可以例如通过调整结构体与抽提剂的混合比等的方法来设计抽提条件,以使得在将孔密封之后、在孔内将靶分子从结构体中抽提出来。或者,还可以在将抽提剂导入至孔之后,对分散有结构体的液体进行送液,在孔内使它们接触。之后进行封入工序。
在将孔密封之后,抽提剂在孔内发挥作用,结构体破坏,内部靶分子被抽提出来。
抽提工序是在将孔密封之后、在孔内进行。由此,可以抑制靶分子的损失。结果,与将靶分子从结构体中抽提后、使用流路分配至微阵列的各孔中的现有方法相比,能够更加精度良好地对靶分子进行检测。
图7A是表示包含表面靶分子710及内部靶分子720的结构体700被收容在由孔141和密封液L120形成的微小分区142内的样子的示意图。
图7B是表示对图7A状态的结构体实施了抽提工序之后的样子的示意图。如图7B所示,在抽提工序后,从结构体700’中将内部靶分子720抽提出来。
图8A是表示包含表面靶分子710及内部靶分子720的结构体700利用捕获物800被导入及封入在孔内、被收容在由孔141和密封液L120形成的微小分区142内的样子的示意图。在捕获物800上,结合有针对结构体700的特异性结合物质810。
图8B为表示对图8A状态的结构体实施抽提工序之后的样子的示意图。如图8B所示,在抽提工序后,从结构体700’中将内部靶分子720抽提出来。
《表面靶分子检测工序》
本工序中,在孔141内对存在于结构体的表面的至少1种表面靶分子进行检测。
作为表面靶分子,可举出选自核酸、蛋白质、糖、糖蛋白、脂质或它们的复合体中的至少1种分子。作为核酸,可举出DNA、RNA、miRNA及mRNA等。作为蛋白质,可举出结构蛋白、膜蛋白及酶等。
结构体包含靶分子。本申请说明书中,结构体“包含”靶分子可以指结构体将靶分子内包、或者靶分子的一部分或全部存在于结构体的表面。
检测表面靶分子的方法可以对应于欲检测的靶分子的特性、使用公知的任意检测方法。例如,首先根据需要进行使源自靶分子的信号扩增至能够检测到的水平的反应(信号扩增反应),接着使用适当的手段对经扩增的信号进行检测。本实施方式中,检测表面靶分子的工序可以通过核酸检测手法来进行。
作为本实施方式的检测方法中能够使用的信号的例子,可举出荧光、化学发光、显色、电位变化及pH变化等。
信号扩增反应例如可以是生物化学反应、更加具体地为酶反应。作为一例,信号扩增反应是在包含用于信号扩增的酶的试剂液被收容在孔内的状态下、将流体设备在可获得所需的酶活性的一定温度条件下、例如60℃以上且75℃以下的一定温度、优选约66℃下维持规定时间、例如至少10分钟、优选约15分钟的等温反应。
作为信号扩增反应的例子,具体地使用核酸检测手法时,可举出InvasiveCleavage Assay(侵入裂解分析,ICA)法、环介导等温扩增(LAMP)法(注册商标)、5’→3’核酸酶法(TaqMan(注册商标)法)、荧光探针法等。特别优选使用ICA反应。
ICA反应与下述的原理相关:通过(1)核酸之间的互补性结合、(2)利用酶进行三链结构的识别及剪切这2个反应的循环来进行信号扩增。
ICA反应中,除靶分子以外的夹杂物对反应循环障碍的影响小。因此,在内容物从结构体中的抽提时,即便是存在于结构体内的除靶分子以外的各种成分被释放到微小分区内时,通过使用ICA反应,也可精度良好地对靶分子进行检测。例如,在信号扩增反应中使用ICA反应时,试剂液L110(分散结构体的液体)包含ICA反应所需的反应试剂及模板核酸。
使用ICA反应时,具体地说在试剂液L110中包含等位基因探针、ICA寡聚体、侧翼核酸内切酶-1(FEN-1)、荧光底物等ICA反应试剂。
作为试剂液L110,可以使用在使用流体设备进行的生物化学分析中使用的通常的液体,优选水性溶液。另外,还可以通过在试剂液L110中包含表面活性剂等而易于将液体封入在孔内。另外,试剂液L110也可包含在结构体的内容物的抽提中使用的抽提剂。但是,抽提剂由于有使进行生物化学反应的酶失活的情况,因此使试剂液L110中含有抽提剂并非易事。
在表面靶分子检测中的生物化学反应为ICA反应时,当在孔内存在靶分子时,通过利用等温反应进行的酶反应,荧光物质从消光物质中游离、对应于激发光发出规定的荧光信号。
或者,表面靶分子的检测还可以通过使针对表面靶分子的特异性结合物质结合于靶分子、对所结合的特异性结合物质进行检测来进行。
例如,当表面靶分子为蛋白质时,可以使用ELISA法进行检测。更具体地说,例如可以通过使用了荧光共振能量转移(FRET)原理的夹心ELISA来进行。
进行使用了FRET原理的夹心法时,首先准备用第一荧光物质(供体)进行了标记的第一特异性结合物质(例如抗体)和用具有与第一荧光物质的荧光波长重复的吸光波长的第二荧光物质(受体)进行了标记的第二特异性结合物质。接着,使表面靶分子(例如抗原)与第一特异性结合物质和第二特异性结合物质两者相接触,形成复合体。当形成复合体时,供体与受体的距离接近,通过供体的激发波长的照射,可以检测受体的荧光波长。
或者,还可以预先利用核酸片段对特异性结合物质进行标记,利用ICA反应检测核酸片段。作为特异性结合物质,例如可以使用抗体、抗体片段或适配体等。为了检测结合于靶分子的特异性结合物质,还可以利用例如辣根过氧化物酶(HRP)等酶对特异性结合物质直接地或间接地进行标记。使用2个以上的特异性结合物质时,可以对各种特异性结合分子以能够彼此区分的方式进行标记。
信号的观察方法可以根据所观察的信号的种类来选择公知的适当方法。例如,进行明视野观察时,沿垂直于设有孔阵列的基板的方向照射白色光。在观察荧光信号时,将对应于荧光物质的激发光向孔内照射,观察荧光物质发出的荧光。
《内部靶分子的检测》
本工序中,在孔141内对存在于结构体的内部的至少1种内部靶分子进行检测。
作为内部靶分子,与表面靶分子同样,可举出选自核酸、蛋白质、糖、糖蛋白、脂质或它们的复合体中的至少1种分子。例如,可以是表面靶分子包含蛋白质、内部靶分子包含核酸。
内部靶分子的检测可以与上述表面靶分子同样地进行。其中,优选内部靶分子的检测利用核酸检测手法进行。作为核酸检测手法,优选ICA法。
例如,可以使用核酸标记抗体对表面靶分子进行检测,利用ICA法对被核酸标记抗体标记了的核酸进行检测。另外,当内部靶分子为核酸时,可以利用ICA法检测该核酸。
如此,即便是表面靶分子与内部靶分子是不同的分子,通过进行标记,也可利用相同的原理进行检测。上述情况下,均可利用ICA法对表面靶分子及内部靶分子进行检测。因此,能够在相同条件下对表面靶分子及内部靶分子同时进行检测。
本实施方式的方法中,结构体的内容物的抽提、表面靶分子的检测及内部靶分子的检测优选在将结构体封入在孔中之后进行。由此,可以检测源自1个结构体的表面靶分子及内部靶分子。进而,还可以对结构体、表面靶分子及内部靶分子彼此相关联地进行检测。
表面靶分子及内部靶分子可以按照任一种顺序进行检测。另外,表面靶分子存在多种时,各个表面靶分子可以按照任一种顺序进行检测。另外,内部靶分子存在多种时,各个内部靶分子可以按照任一种顺序进行检测。另外,表面靶分子的检测及内部靶分子的检测可以同时进行,也可以独立地分别进行。
另外,表面靶分子的检测及内部靶分子的检测还可以在同一条件下进行。通过在同一条件下同时地进行表面靶分子的检测及内部靶分子的检测,可以简便地实施本实施方式的方法。
在表面靶分子的检测及内部靶分子的检测中,当同时检测2种以上的靶分子时、或者即便不是同时、而是在以各靶分子能够检测的状态共存的状况下依次进行检测等时,需要设计反应体系以使得表示各靶分子各自的存在的信号不会混同。此时,优选表面靶分子的检测中检测的信号与内部靶分子的检测中检测的信号能够彼此区分。
进而,当表面靶分子存在多种时,优选表示各个表面靶分子的存在的信号也可彼此区分。同样,当内部靶分子存在多种时,优选表示各个内部靶分子的存在的信号也可彼此区分。
例如,通过荧光信号进行检测时,通过使激发光或荧光的波长为不同的带宽,可以使信号能够彼此区分。或者,例如通过使用荧光信号和磁力信号等不同的信号,也可以使信号能够彼此区分。
本实施方式的方法可以按照结构体向孔的封入、表面靶分子的检测、结构体的内容物的抽提、内部靶分子的检测的顺序来实施。即,将结构体封入在孔中之后,对存在于结构体表面的表面靶分子进行检测。之后,对结构体的内容物进行抽提。由此,内部靶分子露出至孔的内部。之后,可以实施内部靶分子的检测。此时,即便是用于表面靶分子检测的信号与用于内部靶分子检测的信号相同时,也可根据检测的时间点,对表面靶分子和内部靶分子进行区分。
在结构物的内容物抽提之前进行表面靶分子的检测时,表面靶分子的检测在不发生内部靶分子的抽提的条件下进行。例如,可以在比结构物的内容物抽提时的温度更低的温度、更具体地说室温~约60℃范围的温度下进行表面靶分子的检测。
或者,还可以在结构物的内容物的抽提之后进行表面靶分子的检测及内部靶分子的检测。
或者,还可以将结构体在孔中的封入、结构体的内容物的抽提、表面靶分子的检测、内部靶分子的检测的各工序更改顺序地进行,也可以同时地进行任意两个工序。例如,可以在进行结构体向孔中的导入之后、结构体在孔中的封入工序之前进行抽提工序,此时,也可以同时进行导入工序和抽提工序。另外,如上所述,还可以在进行抽提工序之前进行表面靶分子检测工序或内部靶分子检测工序的一部分。
(结构体的检测)
本实施方式的方法可以进一步具备检测结构体的工序。结构体的检测可以在上述实施方式方法的任意时间点进行,例如可以在结构体向孔中的导入之后、结构体的内容物的抽提之前进行。或者,还可以在结构体的内容物的抽提之后检测结构体。
或者,还可以将表面靶分子的检测或内部靶分子的检测与结构体的检测同时地进行。当同时进行表面靶分子的检测、内部靶分子的检测、结构体的检测时,对于按照检测信号相互间不干涉的方式构成反应体系这一点,与上述情况是相同的。
结构体可以通过进行明视野观察等方法直接检测。或者,还可以利用与表面靶分子或内部靶分子相同的操作对结构体所含分子进行检测等方法,间接地对结构体进行检测。作为后者的例子,可举出使用对细胞膜进行染色的荧光色素、或识别病毒包被蛋白的抗体等来对结构体进行检测。
[结构体的评价方法]
本发明的一实施方式提供一种结构体的评价方法,其包含以下工序:使分散有结构体的液体接触于具有多个孔的孔阵列,向所述孔中导入每1孔为1个以下的所述结构体;使密封液与所述孔阵列接触,将所述结构体封入在所述孔内;在所述孔内对所述结构体的内容物进行抽提;在所述孔内对存在于所述结构体的表面上的至少1种表面靶分子进行检测;在所述孔内对存在于所述结构体的内部的至少1种内部靶分子进行检测;以及根据所述表面靶分子的检测结果及所述内部靶分子的检测结果,对所述结构体进行评价。
本实施方式的方法中,检测每孔中有无所述表面靶分子及所述内部靶分子。结果,能够对结构体、表面靶分子及内部靶分子彼此相关联地进行检测。即,可以以1个结构体水平检测表面靶分子及内部靶分子。“对结构体进行评价”是指如此地对结构体、表面靶分子及内部靶分子彼此相关联地进行检测。另外,通过评价结构体,还可以分析结构体的来源或状态等。
[试剂盒]
本发明的一实施方式提供一种用于检测结构体的表面靶分子及内部靶分子的试剂盒,其包含:具有多个孔的孔阵列;从所述结构体中抽提内容物的试剂;对存在于所述结构体的表面的至少1种所述表面靶分子进行检测的试剂;以及对存在于所述结构体的内部的至少1种所述内部靶分子进行检测的试剂。
孔阵列可以构成上述流体设备。对于从结构体中抽提内容物的试剂(即抽提剂)、对表面靶分子进行检测的试剂及对内部靶分子进行检测的试剂,与前述相同。
利用本实施方式的试剂盒,可以优选地实施结构体的表面靶分子及内部靶分子的检测。
实施例
以下,根据实施例更为详细地说明本发明。本发明不受这些实施例的任何限定。
[实施例1]
(病毒表面蛋白质及病毒内核酸的检测)
对结构体的表面靶分子及内部靶分子进行检测。作为结构体,使用作为病毒之一种的f1噬菌体(试剂名:Escherichia coli phage f1、独立行政法人制品评价技术基础机构,型号:NBRC20010)。另外,作为表面靶分子,对作为f1噬菌体(具有5’-ACGTTAAACAAAAAATCGTTTCTTATTTGGATTGGGATAAATAATATGGCTGTTTATTTTGTAACTGGCAAATTAGGCTCTGGAAAGACGCTCGTTAGCGTTGGTAAGATTCAGGATAAAATTGTAGCTGGGTGCAAAAT-3’(序列号1)的碱基序列作为内包DNA)的表面蛋白的包被蛋白进行检测。另外,作为内部靶分子,对f1噬菌体的基因组DNA上的碱基序列(5’-GTAACTGGCAAATTAGGCTCTGGAAAGACGCTCGTTAGC-3’、序列号2)进行检测。另外,结构体向孔中的导入时,使用具有抗体作为特异性结合物质的磁性珠粒作为捕获物。
《核酸检测试剂的制备》
制备下述表1所示组成的ICA反应液。该反应液用于在ICA反应中检测核酸。表1中,Alexa488及Redmond RED(表1中记为RED)为荧光色素,BHQ-1(表1中记为BHQ)及Eclipse为消光物质。
表1
接着,制备按照以容量比计达到1:1的方式混合ICA反应液和作为蛋白质抽提试剂的BugBuster(Merck Millipore公司制)而成的溶液(溶液A)。
《捕获物的制备》
制备捕获f1噬菌体的捕获物。具体地说,作为捕获物,制备固定有抗f1噬菌体抗体的磁性珠粒。
首先,在羧基修饰磁性珠粒(Magnosphere、LC300、JSR公司)溶液中添加抗f1噬菌体抗体(型号“Anti-M-13Phage Coat Protein”、Funakoshi公司),利用旋转器反应30分钟。接着,添加作为缩合剂的EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺)反应3小时,将抗f1噬菌体抗体固定在羧基修饰磁性珠粒上。
接着,为了将未反应的抗体和试剂除去,使用磁性支架对抗体固定化磁性珠粒进行磁力捕获。接着,反复3次利用PBS-T(含0.1%Tween20的PBS(Phosphate-bufferedsaline,磷酸盐缓冲盐水))进行的洗涤,制备抗体固定化磁性珠粒。由此,制备对f1噬菌体进行捕获的捕获物。
《核酸标记抗f1噬菌体抗体的制作》
使DNA片段(5’-TTTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATCTCACCCAAATTGGAACCATGCTGTATACAGTT-3’、序列号9)结合于抗f1噬菌体抗体(型号“Anti-M-13Phage CoatProtein”、Funak oshi公司),制作核酸标记抗f1噬菌体抗体。DNA片段的结合使用市售的试剂盒(商品名“Protein-Oligo Conjugation Kit”、Solulink公司)。
《f1噬菌体及抗体固定化珠粒的反应》
f1噬菌体的浓度作为以市售的f1噬菌体的混悬液浓度为100%时的稀释率来进行表示。按照总量达到100μL的方式将f1噬菌体(终浓度为0%或终浓度为1%)、100μg/mL的上述抗体固定化磁性珠粒、10ng/mL的上述核酸修饰抗f1噬菌体抗体进行混合,在旋转器上、在室温下反应1小时。这里,当存在f1噬菌体时,抗f1噬菌体抗体通过识别并结合f1噬菌体表面的包被蛋白而形成与抗体固定化磁性珠粒的复合体。
接着,使用磁性支架对磁性珠粒进行磁力捕获,将上清液的除去及添加PBS-T的操作反复进行3次,进行洗涤,最后将上清液除去。
《导入工序》
接着,向图1所示结构的流体设备送液混悬在上述溶液A(ICA反应液与BugBuster(Merck Millipore公司制)的混合液)中的抗体固定化磁性珠粒20μL,使其接触于孔阵列。结果,抗体固定化磁性珠粒被导入至孔中。
本实施例中使用的流体设备的孔的直径为5μm、孔的深度为3μm。另外,流路的高度为100μm。
《封入工序》
接着,送液作为密封液的FC-40(Sigma公司)150μL,使其接触于孔阵列。结果,各孔被分别地密封,抗体固定化磁性珠粒被封入。通过以上的操作,当抗体固定化磁性珠粒形成了与f1噬菌体的复合体时,在孔内密封了每1孔为1个以下的f1噬菌体。
《抽提工序》
接着,将上述流体设备置于加热板上,在66℃下反应15分钟。由此,在被密封的孔内,f1噬菌体的衣壳结构被破坏,作为f1噬菌体内容物的基因组DNA被抽提出来。
《表面靶分子检测工序及内部靶分子检测工序》
接着,将抽提工序后的上述流体设备置于加热板上,在66℃下反应15分钟。由此,同时检测到表面靶分子及内部靶分子。
更详细地说,等位基因探针1及ICA寡聚体1分别与基因组DNA上的碱基序列(序列号2)杂交,形成侧翼结构。接着,FEN-1识别侧翼结构,对等位基因探针1进行剪切。
接着,被释放出的等位基因探针1的片段杂交于RED-Eclipse,形成侧翼结构。接着,FEN-1识别侧翼结构,对RED-Eclipse进行剪切,结果,荧光物质和消光物质分离,产生Redmond RED的荧光信号。
同样地,等位基因探针2及ICA寡聚体2分别杂交于被核酸标记抗f1噬菌体抗体所修饰的DNA片段,形成侧翼结构。接着,FEN-1识别侧翼结构,对等位基因探针2进行剪切。
接着,被释放出的等位基因探针2的片段杂交于Alexa488-BHQ,形成侧翼结构。接着,FEN-1识别侧翼结构,对Alexa488-BHQ进行剪切,结果,荧光物质和消光物质分离,产生Alexa488的荧光信号。
《孔的荧光观察》
表面靶分子检测工序及内部靶分子检测工序之后,使用荧光显微镜BZ-710(KEYENCE公司)拍摄流体设备的各孔的荧光信号。使用10倍的物镜。
关于曝光时间,在Alexa488的荧光观察时是使用GFP的荧光滤光片、设为3000msec,在Redmond RED的荧光观察时是使用Texas Red的荧光滤光片、设为2000msec。
图9为表示荧光观察的结果的照片。图9中,“无噬菌体”表示病毒浓度为0%的f1噬菌体的结果,“有噬菌体”表示病毒浓度为1%的f1噬菌体的结果。
另外,“Alexa488”表示检测Alexa488荧光的结果、“RED”表示检测Redmond RED的荧光的结果、“叠置“表示将Alexa488荧光的检测结果与Redmond RED荧光的检测结果重合后的结果。下述表2表示检测到荧光的孔的数量。
表2
结果可知,检测到噬菌体的包被蛋白的32孔中有23孔中检测到了序列号2的核酸片段。即,检测到噬菌体的包被蛋白的孔中的约72%的孔中检测到了噬菌体的基因组DNA。结果表示,能够对结构体的表面靶分子和内部靶分子以高精度相关联地进行检测。
[实施例2]
(抽提试剂的浓度的探讨)
在抽提工序中,对从结构体中抽提内容物的试剂(抽提试剂)的浓度进行探讨。作为结构体,使用作为病毒之一种的f1噬菌体(试剂名:Escherichia coli phage f1、独立行政法人制品评价技术基础机构、型号:NBRC20010)。另外,作为内部靶分子,对f1噬菌体的基因组DNA上的碱基序列(序列号2)进行检测。
《核酸检测试剂的制备》
制备下述表3所示组成的ICA反应液。表3中,Alexa488为荧光色素,BHQ-1(表3中记为BHQ)为消光物质。
表3
接着,分别制备按照以容量比计达到ICA反应液:BugBuster=9:1、1:1、1:9的方式混合ICA反应液和作为蛋白质抽提试剂的BugBuster(Merck Millipore公司制)而成的溶液。另外,作为阴性对照,还准备了不含f1噬菌体的试样。
接着,将各试样置于实时PCR装置(型号“LightCycler480”、Roche公司)中,在65℃下反应60分钟,经时地测定Alexa488的荧光信号。
图10为表示测定荧光信号的经时变化的结果的图表。图10中,“9:1NC”表示以容量比计为ICA反应液:BugBuster=9:1混合有不含f1噬菌体的ICA反应液和BugBuster(MerckMillipore公司制)的试样的结果,“9:1噬菌体”表示以容量比计为ICA反应液:BugBuster=9:1混合有ICA反应液(包含f1噬菌体)和BugBuster(Merck Millipore公司制)的试样的结果,“1:1NC”表示以容量比计为ICA反应液:BugBuster=1:1混合有不含f1噬菌体的ICA反应液和BugBuster(Merck Millipore公司制)的试样的结果,“1:1噬菌体”表示以容量比计为ICA反应液:BugBuster=1:1混合有ICA反应液(包含f1噬菌体)和BugBuster(MerckMillipore公司制)的试样的结果,“1:9NC”表示以容量比计为ICA反应液:BugBuster=1:9混合有不含f1噬菌体的ICA反应液和BugBuster(Merck Millipore公司制)的试样的结果,“1:9噬菌体”表示以容量比计为ICA反应液:BugBuster=1:9混合有ICA反应液(包含f1噬菌体)和BugBuster(Merck Millipore公司制)的试样的结果。
结果可知,如果Bugbuster的容量比过高,则会阻碍ICA反应。
[实施例3]
(抽提工序的探讨)
本实施例中,进行从结构体中抽提内容物的条件的探讨。作为结构体,使用作为病毒之一种的f1噬菌体(试剂名:Escherichia coli phage f1、独立行政法人制品评价技术基础机构、型号:NBRC20010)。另外,作为内部靶分子,对f1噬菌体的基因组DNA上的碱基序列(序列号2)进行检测。
《核酸检测试剂的制备》
制备下述表4所示组成的ICA反应液。该反应液用于在ICA反应中检测核酸。表4中,Alexa488为荧光色素,BHQ-1(表4中记为BHQ)为消光物质。表4中,“MOPS”表示3-吗啉丙磺酸。
表4
接着,在各种条件下尝试噬菌体的内容物的抽提,制备以下的试样1~4。
·试样1:使用探针型超声波产生装置对噬菌体(10%)进行1分钟的超声波处理。
·试样2:在噬菌体(10%)中以容量比计添加50%的BugBuster(Merck Millipore公司制),在37℃下搅拌30分钟。
·试样3:将噬菌体(10%)在70℃下加热30分钟。
·试样4:在噬菌体(10%)中以容量比计添加50%的BugBuster(Merck Millipore公司制),在70℃下搅拌30分钟。
接着,在样品管中将上述的ICA反应液和试样1~4分别进行混合,制备噬菌体浓度为终浓度1%、容量为10μL的溶液。
另外,作为阴性对照,制备仅ICA反应液(试样5)、及ICA反应液和噬菌体的混合溶液(试样6)。另外,作为阳性对照,制备在ICA反应液中按照终浓度达到30pM的方式添加具有存在于f1噬菌体基因组DNA上的碱基序列(序列号2)的核酸片段而得到的溶液(试样7)。
接着,将这些试样置于实时PCR装置(型号“LightCycler480”、Roche公司)中,在66℃下反应60分钟,经时地测定Alexa488的荧光信号。
图11为表示测定荧光信号的经时变化的结果的图表。图11中,横轴表示反应时间(秒)、纵轴表示荧光强度(相对值)。图11中,“ICA”表示ICA溶液、“phage”表示噬菌体、“bug”表示BugBuster(Merck Millipore公司制)。
结果,在对噬菌体进行了超声波处理的试样1、在噬菌体中添加了BugBuster(Merck Millipore公司制)的试样2、对噬菌体施加了70℃的热处理的试样3、在噬菌体中添加了BugBuster(Merck Millipore公司制)且在70℃下进行了30分钟热处理的试样4、及阳性对照的试样7中,均检测到了荧光强度的增加。
另外,在对噬菌体进行了超声波处理的试样1、及在噬菌体中添加了BugBuster(Merck Millipore公司制)且在70℃下进行了30分钟热处理的试样4中,荧光强度的增加显著。另一方面,阴性对照的仅ICA反应液(试样5)中,几乎未观察到荧光强度的增加。另外,在ICA反应液及噬菌体的混合溶液(试样6)中,随着时间的经过,观察到荧光强度的增加,但与试样1~4相比,增加的程度是缓慢的。
产业上的可利用性
根据本发明,可以提供对存在于结构体的外部及内部的靶分子进行检测的技术。
符号说明
100,200流体设备、110基板、120盖构件、121凸部、122导入口、123排出口、130流路、140孔阵列、141孔、142微小分区、L110试剂液、L120密封液、142R检测到信号的孔、210壁构件、700,700’结构体、710表面靶分子、720内部靶分子、800捕获物、810特异性结合物质。
序列表
<110> 凸版印刷株式会社
<120> 靶分子的检测方法
<130> PC-29882
<150> JP2019-095187
<151> 2019-05-21
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 140
<212> DNA
<213> f1噬菌体
<400> 1
acgttaaaca aaaaatcgtt tcttatttgg attgggataa ataatatggc tgtttatttt 60
gtaactggca aattaggctc tggaaagacg ctcgttagcg ttggtaagat tcaggataaa 120
attgtagctg ggtgcaaaat 140
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> f1噬菌体
<400> 2
gtaactggca aattaggctc tggaaagacg ctcgttagc 39
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 称为等位基因探针1的合成的寡核苷酸
<400> 3
cgcgccgagg gcctaatttg ccagttac 28
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 称为等位基因探针2的合成的寡核苷酸
<400> 4
acggacgcgg aggattgctc acagaaagga 30
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 称为ICA寡聚体1的合成的寡核苷酸
<400> 5
gctaacgagc gtctttccag at 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 称为ICA寡聚体2的合成的寡核苷酸
<400> 6
gcatggttcc aatttgggtg at 22
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 称为Alexa488-BHQ的合成的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 被Alexa488修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 被BHQ-1修饰
<400> 7
ttctagccgg ttttccggct gagacctcgg cgcg 34
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 称为RED-Eculipse的合成的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 被Redmond Red修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 被Eculipse修饰
<400> 8
tcttcggcct tttggccgag agactccgcg tccgt 35
<210> 9
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 9
tttgtcactg ttcctccttt tgttttcctt tctgtgagca atctcaccca aattggaacc 60
atgctgtata cagtt 75
Claims (17)
1.一种对结构体的表面靶分子及内部靶分子进行检测的方法,其包含:
使分散有所述结构体的液体接触于具有多个孔的孔阵列、向所述孔内导入所述结构体;
使密封液接触于所述孔阵列、将所述结构体封入在所述孔内;
在所述孔内对所述结构体的内容物进行抽提;
在所述孔内对存在于所述结构体的表面的至少1种所述表面靶分子进行检测;以及
在所述孔内对存在于所述结构体的内部的至少1种所述内部靶分子进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,对所述结构体的内容物进行抽提、对所述表面靶分子进行检测及对所述内部靶分子进行检测是在将所述结构体封入在所述孔内之后进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,对所述表面靶分子进行检测及对所述内部靶分子进行检测是在对所述结构体的内容物进行抽提之后进行。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的方法,其中,对所述表面靶分子进行检测及对所述内部靶分子进行检测是同时进行的。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的方法,其中,对所述表面靶分子进行检测及对所述内部靶分子进行检测是在同一条件下进行。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的方法,其中,所述表面靶分子及所述内部靶分子分别为选自核酸、蛋白质、糖、糖蛋白、脂质或它们的复合体中的至少1种分子。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的方法,其中,所述表面靶分子包含蛋白质,所述内部靶分子包含核酸。
8.根据权利要求1~7中任一项所述的方法,其中,对所述内部靶分子进行检测是利用核酸检测手法来进行。
9.根据权利要求8所述的方法,其中,所述核酸检测手法为侵入裂解分析。
10.根据权利要求1~9中任一项所述的方法,其中,对所述表面靶分子进行检测时所检测的信号与对所述内部靶分子进行检测时所检测的信号是彼此可区分的。
11.根据权利要求1~10中任一项所述的方法,其中,所述结构体为选自病毒、外泌体、细胞、内质网中的任一种。
12.根据权利要求1~11中任一项所述的方法,其中,所述结构体与捕获物形成复合体,所述捕获物是固相与针对所述结构体的特异性结合物质的结合体。
13.根据权利要求12所述的方法,其中,所述特异性结合物质为抗体。
14.根据权利要求1~13中任一项所述的方法,其中,对所述结构体的内容物进行抽提是在包含表面活性剂的液体中对结构体进行加热。
15.根据权利要求1~14中任一项所述的方法,其中,在所述导入工序中,在每1个所述孔中导入1个以下的所述结构体。
16.一种结构体的评价方法,其包含:
利用权利要求15所述的方法检测所述每个孔中有无所述表面靶分子及所述内部靶分子的工序;以及
根据所述表面靶分子的检测结果及所述内部靶分子的检测结果来对所述结构体进行评价的工序。
17.一种用于检测结构体的表面靶分子及内部靶分子的试剂盒,其包含:
具有多个孔的孔阵列;
从结构体中抽提内容物的试剂;
对存在于所述结构体的表面的至少1种所述表面靶分子进行检测的试剂;以及
及对存在于所述结构体的内部的至少1种所述内部靶分子进行检测的试剂。
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