CN108473927A - 用于单细胞分离和分析物表征的数字微流体系统 - Google Patents

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Abstract

根据本文中的实施方案，提供了用于在数字微流体系统中捕捉感兴趣的细胞的方法，其包括利用液滴致动器将样品液滴转运到微孔装置。微孔装置包含具有多个微孔的基底，所述多个微孔通向微孔装置的液滴操作表面。样品液滴包含进入微孔的感兴趣的细胞。方法将捕捉珠引入微孔，并且在捕捉珠上固定化捕捉元件。方法利用液滴致动器将细胞裂解试剂液滴转运到微孔装置。细胞裂解试剂液滴的部分进入微孔，并且在温育期期间引起感兴趣的细胞释放分析物，所述分析物由捕捉珠上的捕捉元件捕捉。

Description

用于单细胞分离和分析物表征的数字微流体系统
对相关申请的交叉引用
本申请涉及并要求2016年3月28日提交的美国临时申请号62/314,071；2016年1月21日提交的美国临时申请号62/281,510；2015年12月1日提交的美国临时申请号62/261,786；和2016年7月6日提交的美国临时申请号62/358,968的优先权。所有上述申请的完整主题在此通过引用明确整体并入。
发明背景
单细胞水平数据(例如下一代测序数据)的重要性在极其多种医学和研究领域中越来越受到重视。因此，已经开发了许多用于分析单细胞的技术。许多这些技术的共同点是需要在后续处理和分析步骤中物理隔离单独的细胞并维持起源细胞信息。在一个实例中，已经使用基于通道的液滴流控技术在用于测序的样品中进行多个单细胞的自动化分离和条形码编码(barcoding)。然而，构建测序文库的一些下游方法步骤可能不是自动化的，并且需要手动工作流程。需要一种灵活的自动化平台，用于单细胞分离和后续的分析物表征(例如，制备测序就绪单细胞文库)。
定义
如本文所用，以下术语具有指示的含义。
就一个或多个电极而言，“激活”意指影响一个或多个电极的电状态的变化，其在存在液滴的情况下导致液滴操作。可以使用交流电(AC)或直流电(DC)来完成电极的激活。可以使用任何合适的电压，其实现期望的操作，如液滴操作。例如，可以使用大于约150V、或大于约200V、或大于约250V、或约275V至约1000V、或约300V的电压来激活电极。在使用AC信号的情况下，可以采用任何合适的频率，其实现期望的操作，如液滴操作。例如，可以使用频率为约1Hz至约10MHz、或约10Hz至约60Hz、或约20Hz至约40Hz、或约30Hz的AC信号来激活电极。
就液滴致动器上的珠而言，“珠”是指能够与液滴致动器上或附近的液滴相互作用的任何珠或颗粒。
“液滴”是指液滴致动器上的一定体积的液体。通常，液滴至少部分由填充剂流体为界。例如，液滴可以由填充剂流体完全包围或可以由填充剂流体和液滴致动器的一个或多个表面为界。作为另一个例子，液滴可由填充剂流体、液滴致动器的一个或多个表面和/或大气为界。作为又一个例子，液滴可由填充剂流体和大气为界。液滴例如可以是水性的或非水性的，或可以是包括水性和非水性成分的混合物或乳液。液滴可采用极其多种的形状；非限制性实例通常包括盘形、弹形、截球形、椭球体、球形、局部压缩球体、半球形、卵形、圆柱形、此类形状的组合以及在液滴操作期间形成的各种形状，诸如由于此类形状与液滴致动器的一个或多个表面的接触而合并或裂开或形成。对于可经受使用本公开方法的液滴操作的液滴流体的实例，参见于2007年10月25日公开的Eckhardt等，国际专利公开No.WO/2007/120241，名称为“Droplet-Based Biochemistry”，其全部公开内容通过引用并入本文。在各个实施方案中，液滴可包括生物样品，诸如全血、淋巴液、血清、血浆、汗液、泪液、唾液、痰、脑脊液、羊水、精液、阴道分泌物、浆液、滑膜液、心包积液、腹水、胸腔积液、渗出液、分泌液、囊液、胆汁、尿液、胃液、肠液、粪便样品、含有单个或多个细胞的液体、含有细胞器的液体、流化组织、流化有机体、含有多细胞有机体的液体、生物拭子和生物洗涤物。此外，液滴可包括试剂，诸如水、去离子水、盐水溶液、酸性溶液、碱性溶液、洗涤剂溶液和/或缓冲液。液滴可以包含核酸，如DNA、基因组DNA、RNA、mRNA或其类似物；核苷酸如脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其类似物诸如具有终止剂部分的类似物，诸如以下描述的那些：Bentley等人,Nature456:53-59(2008)；Gormley等人,国际专利公开号WO/2013/131962,名称为,“Improved Methods of Nucleic Acid Sequencing,”于2013年9月12日公开；Barnes等人,美国专利号7,057,026,名称为“Labelled Nucleotides,”于2006年6月公告；Kozlov等人,国际专利公开号WO/2008/042067,名称为,“Compositions and Methods for NucleotideSequencing,”于2008年4月10日公开；Rigatti等人,国际专利公开号WO/2013/117595,名称为,“Targeted Enrichment and Amplification of Nucleic Acids on a Support,”于2013年8月15日公开；Hardin等人,美国专利号7,329,492,名称为“Methods for Real-TimeSingle Molecule Sequence Determination,”于2008年2月12日公告；Hardin等人,美国专利号7,211,414,名称为“Enzymatic Nucleic Acid Synthesis:Compositions andMethods for Altering Monomer Incorporation Fidelity,”于2007年5月1日公告；Turner等人,美国专利号7,315,019,名称为“Arrays of Optical Confinements and UsesThereof,”于2008年1月1日公告；Xu等人,美国专利号7,405,281,名称为“FluorescentNucleotide Analogs and Uses Therefor,”于2008年7月29日公告；和Rank等人,美国专利公开号20080108082,名称为“Polymerase Enzymes and Reagents for Enhanced NucleicAcid Sequencing”于2008年5月8日公开，整个公开通过引用并入本文；酶诸如聚合酶、连接酶、重组酶或转座酶；结合配偶体诸如抗体、表位、链霉亲合素、亲和素、生物素、凝集素或碳水化合物；或其它生物化学活性分子。液滴内含物的其它实例包括试剂，诸如用于生物化学方案的试剂，诸如核酸扩增方案、基于亲和力的测定方案、酶促测定方案、测序方案，和/或生物流体分析方案。液滴可以包含一个或多个珠。
“液滴致动器”意指用于操控液滴的装置。对于适合于在本发明中使用的液滴致动器的各种结构组件的实例参见以下项：Pamula等人,美国专利号6,911,132,名称为“Apparatus for Manipulating Droplets by Electrowetting-Based Techniques,”于2005年6月28日公告；Pamula等人,美国专利公开号20060194331,名称为“Apparatuses andMethods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board,”于2006年8月31日公开；Pollack等人,国际专利公开号WO/2007/120241,名称为“Droplet-BasedBiochemistry,”于2007年10月25日公开；Shenderov,美国专利号6,773,566,名称为“Electrostatic Actuators for Microfluidics and Methods for Using Same,”2004年8月10日公告；Shenderov,美国专利号6,565,727,名称为“Actuators for MicrofluidicsWithout Moving Parts,”于2003年5月20日公告；Kim等人,美国专利公开号20030205632,名称为“Electrowetting-driven Micropumping,”于2003年11月6日公开；Kim等人,美国专利公开号20060164490,名称为“Method and Apparatus for Promoting the CompleteTransfer of Liquid Drops from a Nozzle,”于2006年7月27日公开；Kim等人,美国专利公开号20070023292,名称为“Small Object Moving on Printed Circuit Board”于2007年2月1日公开；Shah等人,美国专利公开号20090283407,名称为“Method for UsingMagnetic Particles in Droplet Microfluidics,”于2009年11月19日公开；Kim等人,美国专利公开号20100096266,名称为“Method and Apparatus for Real-time FeedbackControl of Electrical Manipulation of Droplets on Chip,”于2010年4月22日公开；Velev,美国专利号7,547,380,名称为“Droplet Transportation Devices and MethodsHaving a Fluid Surface,”于2009年6月16日公告；Sterling等人,美国专利号7,163,612,名称为“Method,Apparatus and Article for Microfluidic Control viaElectrowetting,for Chemical,Biochemical and Biological Assays and the Like,”于2007年1月16日公告；Becker等人,美国专利号7,641,779,名称为“Method andApparatus for Programmable Fluidic Processing,”于2010年1月5日公告；Becker等人,美国专利号6,977,033,名称为“Method and Apparatus for Programmable FluidicProcessing,”于2005年12月20日公告；Decre等人,美国专利号7,328,979,名称为“Systemfor Manipulation of a Body of Fluid,”于2008年2月12日公告；Yamakawa等人,美国专利公开号20060039823,名称为“Chemical Analysis Apparatus,”于2006年2月23日公开；Wu,美国专利公开号20110048951,名称为“Digital Microfluidics Based Apparatus forHeat-exchanging Chemical Processes,”于2011年3月3日公开；Fouillet等人,美国专利公开号20090192044,名称为“Electrode Addressing Method,”于2009年7月30日公开；Fouillet等人,美国专利号7,052,244,名称为“Device for Displacement of SmallLiquid Volumes Along a Micro-catenary Line by Electrostatic Forces,”于2006年5月30日公告Marchand等人,美国专利公开号20080124252,名称为“DropletMicroreactor,”于2008年5月29日公开；Adachi等人,美国专利公开号20090321262,名称为“Liquid Transfer Device,”于2009年12月31日公开；Roux等人,美国专利公开号20050179746,名称为“Device for Controlling the Displacement of a Drop BetweenTwo or Several Solid Substrates,”于2005年8月18日公开；以及Dhindsa等人,“VirtualElectrowetting Channels:Electronic Liquid Transport with Continuous ChannelFunctionality,”Lab Chip,10:832–836(2010)，以上项的全部公开内容通过引用并入本文。某些液滴致动器将包括在其间布置有液滴操作间隙的一个或多个基底和与一个或多个基底相关联(例如，在其上分层、附着到其和/或嵌入其中)并被布置为进行一个或多个液滴操作的电极。例如，某些液滴致动器将包括基部(或底部)基底、与基底相关联的液滴操作电极、在基底和/或电极顶上的一个或多个介电层以及任选地包括在基底顶上的一个或多个疏水层，介电层和/或形成液滴操作表面的电极。也可提供顶部基底，其通过通常称为液滴操作间隙的间隙与液滴操作表面分开。在顶部和/或底部基底上的各种电极布置在上面引用的专利和申请中讨论，并且某些新颖的电极布置在本公开的描述中讨论。在液滴操作期间，优选的是，液滴与接地或参考电极保持连续接触或频繁接触。接地或参考电极可与面向间隙的顶部基底、面向间隙的底部基底、在间隙中相关联。在将电极设置在两个基底上的情况下，用于将电极耦合至液滴致动器仪器以控制或监测电极的电触点可与一个或两个平板相关联。在一些情况下，在一个基底上的电极电耦合至其它基底，使得只有一个基底与液滴致动器接触。在一个实施方案中，导电材料(例如，环氧树脂，诸如可从Master Bond,Inc.,Hackensack,NJ商购获得的MASTERBONDTM聚合物体系EP79)提供一个基底上的电极之间的电连接以及在其它基底上的电通路，例如，顶部基底上的接地电极可通过此类导电材料耦合至底部基底上的电通路。在使用多个基底的情况下，可在基底之间设置间隔区以确定其间的间隙的高度并限定致动器上的分配储器。在一些情况下，可将一个或多个开口对准用于与一个或多个电极相互作用，例如对准而使得流经开口的液体将充分接近一个或多个液滴操作电极，以允许液滴操作由使用液体的液滴操作电极实现。在一些情况下，基部(或底部)基底和顶部基底可形成为一个整体部件。可以将一个或多个参考电极设置在基部(或底部)基底和/或顶部基底和/或间隙中。在上面引用的专利和专利申请中提供了参考电极布置的实例。在各个实施方案中，通过液滴致动器对液滴的操作可以是电极介导的(例如，电润湿介导或介电泳介导或库仑力介导的)。可用于本公开的液滴致动器的用于控制液滴操作的技术的实例包括使用引起流体力学流体压力的装置，诸如基于以下运行的那些装置：机械原理(例如，外部注射泵、气动隔膜泵、振动膜泵、真空装置、离心力、压电/超声波泵和声学力)；电或磁原理(例如，电渗流动、电动泵、铁磁流体插头、电水动力泵、使用磁力的吸引或排斥和磁流体动力泵)；热力学原理(例如，气泡生成/相位变化引起的体积膨胀)；其它种类的表面润湿原理(例如，电润湿和光电润湿以及化学、热、结构和放射性引起的表面张力梯度)；重力；表面张力(例如，毛细作用)；静电力(例如，电渗流动)；离心流动(基底被设置在压密盘上并旋转)；磁力(例如，振荡离子引起流动)；磁水动力学力；以及真空或压差。在某些实施方案中，可采用前述技术中的两种或多于两种技术的组合以进行本公开的液滴致动器中的液滴操作。同样地，前述技术中的一种或多种技术可用于将液体递送到液滴操作间隙中(例如，从另一装置中的储器或从液滴致动器的外部储器(例如，与液滴致动器基底相关联的储器和从储器至液滴操作间隙中的流动路径))。本公开的某些液滴致动器的液滴操作表面可由疏水性材料制成或可以被涂覆或处理以使所述液滴操作表面成为疏水性的。例如，在一些情况下，液滴操作表面的某些部分或全部可被用低表面能量材料或化学物来衍生化(例如，通过沉积或使用原位合成，使用化合物诸如溶液中的聚或全氟化化合物或可聚合单体进行)。在一些情况下，液滴操作表面可以包括疏水性涂层材料。此外，在一些实施方案中，液滴致动器的顶部基底包括导电的有机聚合物，其然后被涂覆有疏水性涂层或以其它方式处理以使液滴操作表面变成疏水性的。例如，沉积到塑料基底上的导电的有机聚合物可以是聚(3,4-乙烯二氧噻吩)聚(苯乙烯磺酸)(PEDOT:PSS)。导电有机聚合物和可选导电层的其它实例描述于Pollack等人，国际专利公开号WO/2011/002957，名称为“DropletActuator Devices and Methods”，于2011年1月6日公开，整个公开通过引用并入本文。例如，可以使用作为基底的印刷电路板(PCB)、玻璃、涂覆氧化铟锡(ITO)的玻璃和/或半导体材料来制造一个基底或两个基底。
“液滴操作”意指对在液滴致动器上的液滴的任何操控。液滴操作例如可包括：将液滴加载至液滴致动器中；从液滴源分发一个或多个液滴，将液滴分裂、分离或划分为两个或多于两个液滴；在任何方向上将液滴从一个位置传送至另一位置；将两个或多于两个液滴合并或组合为单个液滴；稀释液滴；混合液滴；搅动液滴；使液滴变形；保持液滴在适当的位置；温育液滴；加热液滴；蒸发液滴；冷却液滴；处置液滴；将液滴从液滴致动器转运出去；本文描述的其它液滴操作；和/或前述的任何组合。术语“合并”、“组合”等用于描述从两个或多于两个液滴形成一个液滴。应当理解，当此类术语关于两个或多于两个液滴使用时，可以使用足以导致两个或多于两个液滴被组合成一个液滴的液滴操作的任何组合。例如，可以通过转运液滴A以与静态液滴B接触、转运液滴B以与静态液滴A接触或转运液滴A和液滴B以彼此接触来实现“将液滴A与液滴B合并”。术语“分裂”、“分离”和“划分”并不旨在暗示相对于所得液滴的体积(即，所得液滴的体积可以是相同或不同的)或所得液滴的数量(所得液滴的数量可以是2个、3个、4个、5个或更多)的任何特定结果。术语“混合”是指导致在一个液滴内的一种或多种成分的更均匀分布的液滴操作。“加载”液滴操作的实例包括微透析加载、压力辅助加载、机器人加载、被动加载和移液管加载。液滴操作可以是电极介导的。在一些情况下，通过使用表面上的亲水性区域和/或疏水性区域和/或通过物理特征，诸如障碍物、间隙高度变化或表面缺口来进一步促进液滴操作。对于液滴操作的实例，参见上面在“液滴致动器”的定义下引用的专利和专利申请。阻抗或电容感测或成像技术有时可用于确定或确认液滴操作的结果。Sturmer等人的在2010年8月5日公布的名称为“CapacitanceDetection in a Droplet Actuator”的美国专利公开号20100194408中描述了此类技术的实例，其全部公开内容通过引用并入本文。一般而言，感测或成像技术可用于确认在特定电极处的液滴的存在或不存在。例如，在液滴分发操作后的分发液滴在目标电极处的存在确认液滴分发操作是有效的。同样地，在测定方案中的适当步骤时的检测点处液滴的存在可确认先前的一组液滴操作已经成功产生用于检测的液滴。液滴转运时间可以是非常快的。例如，在各个实施方案中，液滴从一个电极到下一个电极的转运可超过约1秒或约0.1秒或约0.01秒或约0.001秒。在一个实施方案中，电极以AC模式操作，但是切换到DC模式用于成像。对于类似于电润湿面积的液滴足迹面积，进行液滴操作有时是有帮助的(尽管不是绝对要求)；换言之，分别使用1个、2个和3个电极来有效地控制操作1x-、2x-、3x-液滴。若液滴足迹大于可用于在给定时间时进行液滴操作的电极的数量，则液滴尺寸和电极数量之间的差通常应不大于1；换言之，使用1个电极来有效地控制2x液滴并且使用2个电极来有效地控制3x液滴。当液滴包括珠时，液滴尺寸等于控制液滴(例如转运液滴)的电极的数量是有用的。
“填充剂流体”意指与液滴致动器的液滴操作基底相关联的流体，其中，流体与液滴相是充分不可混溶的，从而使液滴相经受电极介导的液滴操作。例如，液滴致动器的液滴操作间隙通常填以填充剂流体。填充剂流体可例如是或包括低粘度油(诸如硅油或十六烷填充剂流体)。填充剂流体可以是或包括卤化油(诸如氟化或全氟化油)。填充剂流体可填充液滴致动器的整个间隙或可涂覆液滴致动器的一个或多个表面。填充剂流体可以是导电或非导电的。填充剂流体可被选择以改善液滴操作和/或减少来自液滴的试剂或目标物质的损失、改善微液滴的形成、减少液滴之间的交叉污染、减少液滴致动器表面的污染、减少液滴致动器材料的降解等。适用于本文阐述的方法和装置的填料流体和填料流体配制剂的实例在以下专利中提供：Srinivasan等人，国际专利公开号WO/2010/027894，名称为“DropletActuators,Modified Fluids and Methods,”于2010年6月3日公开；Srinivasan等人,国际专利公开号WO/2009/021173，名称为“Use of Additives for Enhancing DropletOperations,”于2009年2月12日公开；Sista等人,国际专利公开号WO/2008/098236,名称为“Droplet Actuator Devices and Methods Employing Magnetic Beads,”于2009年1月15日公开；和Monroe等人,美国专利公开号20080283414,名称为“Electrowetting Devices,”于2008年11月20日公开，其全部公开通过引用并入本文，以及本文引用的其它专利和专利申请。氟化油可在一些情况下被掺杂有氟化表面活性剂(例如Zonyl FSO-100(Sigma-Aldrich)和/或其它氟化表面活性剂)。填充液通常是液体。在一些实施方案中，可以使用填充气体代替液体。
“储器”意指配置用于容纳、存储或供应液体的壳体和/或局部壳体。本公开的液滴致动器系统可包括接通盒储器和/或断开盒储器。接通盒储器可以例如包括(1)接通致动器储器，其是液滴操作间隙中或液滴操作表面上的储器；(2)断开致动器储器，其是在液滴致动器盒上但是在液滴操作间隙外面并且不与液滴操作表面接触的储器；或(3)混合储器，其具有接通致动器区域和断开致动器区域。断开致动器储器的实例是在顶部基底中的储器。断开致动器储器通常与被布置用于将液体从断开致动器储器流入液滴操作间隙(诸如流入接通致动器储器)中的开口或流动路径流体连通。断开盒储器可以是完全不是液滴致动器盒的一部分但是使液体流向液滴致动器盒的一些部分的储器。例如，断开盒储器可以是在操作期间与液滴致动器盒偶联的系统或对接站的一部分。类似地，断开盒储器可以是试剂存储容器或用于迫使流体流入接通盒储器或流入液滴操作间隙的注射器。使用断开盒储器的系统将通常包括流体通道装置，从而流体可从断开盒储器转移到接通盒储器中或液滴操作间隙中。
在整个说明书中参考液滴致动器的部件的相对位置(诸如液滴致动器的顶部基底和底部基底的相对位置)使用了术语“顶部”、“底部”、“在...上面”、“在...下面”和“在...上”。应当理解，液滴致动器起作用而不管其在空间中的方位。
当以任何形式(例如，液滴或连续体，无论是运动还是静态的)的液体被描述为“在电极、阵列、基体或表面上”、“在电极、阵列、基体或表面处”或“在电极、阵列、基体或表面上面”时，此类液体可以直接接触电极/阵列/基体/表面或可以接触被插入在液体与电极/阵列/基体/表面之间的一个或多个层或薄膜。在一个实例中，填充流体可以被认为是此类液体与电极/阵列/基体/表面之间的薄膜。
当液滴描述为“在液滴致动器上”或“加载到液滴致动器上”时，应当理解，液滴以下述方式排列在液体致动器上，所述方式便于使用液滴致动器以在液滴上进行一个或多个液滴操作，液滴以下述方式排列在液体致动器上，所述方式便于感测液滴的属性或来自液滴的信号，和/或液滴已在液滴致动器上经受液滴操作。
如在整个说明书中使用，术语“流控筒(fluidics cartridge)”、“数字流控筒”、“液滴致动器”和“液滴致动器筒”可以是同义的。
发明概述
根据本文中的实施方案，提供了用于在数字微流体系统中捕捉感兴趣的细胞的方法，其包括利用液滴致动器将样品液滴转运到微孔装置。微孔装置包含具有多个微孔的基底，多个微孔通向微孔装置的液滴操作表面。样品液滴包含进入微孔的感兴趣的细胞。方法将捕捉珠引入微孔，并且在捕捉珠上固定化捕捉元件。方法利用液滴致动器将细胞裂解试剂液滴转运到微孔装置。细胞裂解试剂液滴的部分进入微孔，并且在温育期期间引起感兴趣的细胞释放分析物，分析物由捕捉珠上的捕捉元件捕捉。
任选地，方法可以进一步包括利用液滴致动器在留下微孔中捕捉的感兴趣的细胞的至少一部分的情况下将样品液滴转运离开微孔装置。方法可以允许感兴趣的细胞的至少一部分沉降到微孔中。微孔装置的液滴操作表面可以包含微孔间的间隙区域，其是疏水的，使得基本上没有感兴趣的细胞或捕捉珠的残留物保留在微孔装置的液滴操作表面上。方法可以从微孔除去其上捕捉有分析物的捕捉珠。除去操作可以包括将磁体置于微孔附近以形成从微孔拉出捕捉珠的磁场。方法可以利用磁场移动捕捉珠到微孔以及离开微孔。
任选地，每个捕捉珠可以包括多个捕捉元件。多个捕捉元件可以包含捕捉序列和独特的条形码序列。捕捉序列可以是下列之一：i)用于捕捉总mRNA的多聚T序列，或ii)靶向一组感兴趣基因的多个转录物特异性捕捉序列。可以筛分(size)捕捉珠，使得仅捕捉珠之一适合(fits in)微孔之一。捕捉珠可以通过重力在微孔中沉积。捕捉珠可以是磁性的，并且利用磁吸引在微孔中沉积。
根据本文中的实施方案，提供了用于捕捉感兴趣的细胞的数字流控系统，系统包含液滴致动器，其包含液滴操作间隙。液滴致动器包含接近液滴操作间隙排列的液滴操作电极。微孔装置包含基底。微孔装置包含基底中形成的微孔。微孔通向微孔装置的液滴操作表面。微孔装置与液滴致动器偶联并且定位为使得微孔面向液滴操作间隙。控制器配置为执行程序指令以指引液滴致动器将样品液滴转运到微孔装置。样品液滴包含进入微孔的感兴趣的细胞。控制进一步将捕捉珠引入微孔，其中在捕捉珠上固定化捕捉元件，并且指引液滴致动器将细胞裂解试剂液滴转运到微孔装置。裂解试剂液滴的部分进入微孔，并且在温育期期间引起感兴趣的细胞释放分析物，分析物由捕捉珠上的捕捉元件捕捉。
任选地，基底可以包含其上布置的疏水层。疏水层可以在液滴操作表面上形成。液滴操作间隙可以配置为保留填充剂流体，其包含含有感兴趣的细胞的样品液滴。微孔可以具有一定的大小和间距，其尺寸为仅接受来自样品液滴中的感兴趣的细胞的单细胞并且仅接受单个捕捉珠。微孔可以具有30μm-50μm的深度。微孔可以具有3μm-60μm的直径。微孔可以彼此以不大于80μm的间隔分开。
在其它实施方案中，微孔装置包含具有多个细胞阱的第二基底，多个细胞阱通向微孔装置的液滴操作表面。细胞阱布置为接近微孔。例如，第二基底是微孔装置的顶部表面，而微孔在装置的底部表面上。在一个实施方案中，第二基底上的细胞阱直接位于第一基底上的微孔上方。样品液滴包括进入细胞阱的感兴趣的细胞。方法将捕捉珠引入微孔，并且在捕捉珠上固定化捕捉元件。方法利用液滴致动器将细胞裂解试剂液滴转运到微孔装置。
在一些实施方案中，涵盖用于在数字微流体系统中捕捉感兴趣的细胞的方法，方法包括：(a)利用液滴致动器将样品液滴转运到微孔装置，微孔装置包含具有多个微孔和多个细胞阱的第一基底，多个微孔通向微孔装置的液滴操作表面，多个细胞阱通向微孔装置的液滴操作表面，样品液滴包含进入细胞阱的感兴趣的细胞；(b)将捕捉珠引入微孔，其中在捕捉珠上固定化捕捉元件；并且(c)利用液滴致动器将细胞裂解试剂液滴转运到微孔装置，其中细胞裂解试剂液滴的部分进入微孔和细胞阱，并且在温育期期间引起感兴趣的细胞释放分析物，分析物由捕捉珠上的捕捉元件捕捉。
在一些实施方案中，筛分捕捉珠，使得仅捕捉珠之一适合微孔之一。在其它实施方案中，筛分细胞阱，使得仅感兴趣的细胞之一适合细胞阱之一。在其它实施方案中，方法还包括：(d)在温育期期间和/或之前，利用液滴致动器将与细胞裂解试剂液滴不混溶的流体转运到微孔装置，其中不混溶的流体不进入微孔和细胞阱，从而用细胞裂解试剂包囊具有单细胞的单珠。在一些实施方案中，方法还包括从微孔除去其上捕捉有分析物的捕捉珠。在一些实施方案中，除去操作包括将磁体置于微孔附近以形成从微孔拉出捕捉珠的磁场。在一些实施方案中，方法还包括利用磁场移动捕捉珠到微孔以及离开微孔。在一些实施方案中，每个捕捉珠包含多个捕捉元件。在一些实施方案中，多个捕捉元件包含捕捉序列和独特的条形码序列，其中捕捉序列任选是下列之一：i)用于捕捉总mRNA的多聚T序列，或ii)靶向一组感兴趣的基因的多个转录物特异性捕捉序列。
附图简述
图1A显示了根据本文中的实施方案的用于分离单细胞以表征分析物的液滴致动器的实例的透视图，所述液滴致动器包含微孔排列(例如微孔阵列)。
图1B显示了图1A的液滴致动器的俯视图并且显示了根据本文中的实施方案的用于分配和/或收集反应流体的流体储器的排列。
图2显示了根据本文中的实施方案的图1的微孔装置和液滴致动器的一部分的侧视图。
图3A显示了根据本文中的实施方案的制作图1和2中所示的微孔的过程的实例。
图3B显示了根据本文中的实施方案的制作图1和2中所示的微孔的过程的实例。
图3C显示了根据本文中的实施方案的制作图1和2中所示的微孔的过程的实例。
图3D显示了根据本文中的实施方案的制作图1和2中所示的微孔的过程的实例。
图4显示了微孔装置的一部分的照片；
图5A显示了图2的液滴致动器的侧视图并且显示了根据本文中的实施方案的使用微孔装置分离单细胞以表征分析物的过程。
图5B显示了图2的液滴致动器的侧视图并且显示了根据本文中的实施方案的使用微孔装置分离单细胞以表征分析物的过程。
图5C显示了图2的液滴致动器的侧视图并且显示了根据本文中的实施方案的使用微孔装置分离单细胞以表征分析物的过程。
图5D显示了图2的液滴致动器的侧视图并且显示了根据本文中的实施方案的使用微孔装置分离单细胞以表征分析物的过程。
图5E显示了图2的液滴致动器的侧视图并且显示了根据本文中的实施方案的使用微孔装置分离单细胞以表征分析物的过程。
图5F显示了图2的液滴致动器的侧视图并且显示了根据本文中的实施方案的使用微孔装置分离单细胞以表征分析物的过程。
图5G显示了图2的液滴致动器的侧视图并且显示了根据本文中的实施方案的使用微孔装置分离单细胞以表征分析物的过程。
图6A是液滴致动器的微孔装置的一部分的俯视图，其显示了根据本文中的实施方案的微孔中细胞和捕捉珠的共包囊。
图6B是另一种液滴致动器的微孔装置的一部分的俯视图，其显示了根据本文中的实施方案的微孔中细胞和捕捉珠的共包囊。
图7A显示了从RNA制备的cDNA的图，所述RNA从根据本文中的实施方案的使用非磁响应性条形码编码珠捕捉单细胞RNA的基于液滴致动器的方法回收。
图7B显示了根据本文中的实施方案从图7A的cDNA台上制备的文库插入物的片段大小分布的图。
图8A显示了根据本文中的实施方案对于每个独特条形码的人转录物和小鼠转录物的读段计数的图。
图8B显示了根据本文中的实施方案的第二项混合物种实验中对于每个独特条形码的人转录物和小鼠转录物的读段计数的图。
图9显示了根据本文中的实施方案的适合于在进行多路复用的单细胞文库构建方案中使用的液滴致动器的底部基底的实例的俯视图。
图10A显示了根据本文中的实施方案的制作液滴致动器的底部基底上的微孔阵列的方法的实例。
图10B显示了根据本文中的实施方案的制作液滴致动器的底部基底上的微孔阵列的方法的实例。
图10C显示了根据本文中的实施方案的制作液滴致动器的底部基底上的微孔阵列的方法的实例。
图11A显示了微通道装置的透视图并且显示了根据本文中的实施方案的用不混溶相对微孔的阵列加帽以形成隔离的反应区室的过程。
图11B显示了微通道装置的透视图并且显示了根据本文中的实施方案的用不混溶相对微孔的阵列加帽以形成隔离的反应区室的过程。
图11C显示了微通道装置的透视图并且显示了根据本文中的实施方案的用不混溶相对微孔的阵列加帽以形成隔离的反应区室的过程。
图11D显示了微通道装置的透视图并且显示了根据本文中的实施方案的用不混溶相对微孔的阵列加帽以形成隔离的反应区室的过程。
图11E显示了微通道装置的透视图并且显示了根据本文中的实施方案的用不混溶相对微孔的阵列加帽以形成隔离的反应区室的过程。
图12A显示了根据本文中的实施方案的微通道装置的一部分的俯视图，其分别显示了完全加载的微通道和相关的微孔，和油注射后“加帽的”微孔。
图12B显示了根据本文中的实施方案的微通道装置的一部分的俯视图，其分别显示了完全加载的微通道和相关的微孔，和油注射后“加帽的”微孔。
图13是根据本文中的实施方案的包含矩形形状的微孔的微通道装置1300的一部分的俯视图。
图14是根据本文中的实施方案的高度平行微通道阵列的一部分的俯视图。
图15A显示了根据本文中的实施方案的“正”孔结构的实例。
图15B显示了根据本文中的实施方案的“正”孔结构的实例。
图15C显示了根据本文中的实施方案的“正”孔结构的实例。
图15D显示了根据本文中的实施方案的“正”孔结构的实例。
图16A显示了根据本文中的实施方案的“正”孔结构的另一个实例。
图16B显示了根据本文中的实施方案的“正”孔结构的另一个实例。
图16C显示了根据本文中的实施方案的“正”孔结构的另一个实例。
图17显示了根据本文中的实施方案的包含液滴致动器的微流体系统的实例的方块图。
图18A-18B显示了在顶板中具有细胞阱结构的数字微流体装置，所述细胞阱结构允许感兴趣的细胞被物理捕获在含有珠的微孔上方。图18A提供了装置的侧视图，其中珠和细胞共定位。空心矩形是固定到顶盖的细胞捕获结构，浅灰色点是捕获在此类结构上的细胞，而黑点是底部表面上微孔中的珠。图18B显示了此类装置的俯视图，显示了顶盖上的细胞捕获结构将捕获的细胞与珠共定位于底部表面上的微孔中。
图19A-19B显示了图18的装置，其中油已经通过通道加载以置换水相液滴并实现珠/细胞对的包囊。图19A显示了加载到微通道(灰色阴影区域)中的油围绕微孔/细胞阱位置但不填充它们，使细胞、珠和液滴介质包囊或分隔在具有油环绕的单一水性微室内。图19B显示了加载有油的装置的俯视图，其中油围绕微孔/阱，将细胞和珠一起包囊在水性微室中。
图20A-D显示了捕获在细胞阱结构上的球体的捕获和油包囊。图20A是10um荧光微球(白色圆圈)的荧光图像，用作细胞的代替以允许显现，捕获在如图18中的装置上。图20B显示位于细胞捕获结构上的荧光颗粒的叠加白光和荧光图像。图20C显示了流入通道中的油，导致形成分离的水性液滴，其模拟阱结构的形状，从而包囊球体。在细胞阱结构处装置的顶部和底部表面之间的间隙高度低于周围空间中的间隙高度，并且在缓慢的流动速率条件下油不能从这些间隙中置换水。图20D显示了在冲洗油通过通道之后被油包围的分离的含水室。将球体包囊在水性液滴内。
发明详述
本文中的实施方案提供了用于分离单细胞以用于表征分析物的装置、系统和方法。在一些实施方案中，装置是利用微流体技术(例如电润湿)的液滴致动器装置。本发明的装置、系统和方法可以提供用于处理生物样品(例如，细胞悬浮液)以分析分析物的自动化液体处理。分析物的实例包括核酸(例如，基因组DNA甲基化DNA、线粒体DNA、DNA/RNA杂合体、RNA信使RNA(mRNA)、病毒RNA，微RNA)、蛋白质、细胞器等。
在各个实施方案中，液滴致动器包括微孔阵列，其中多个单细胞是分离的(即，每微孔的单细胞)。可以裂解细胞并且可以处理来自每个单细胞的分析物。在一个实施方案中，将分析物捕捉在一个或多个捕捉珠上。捕捉珠可以例如是凝胶珠、或多孔珠、或中空珠(例如壳)，并且可以是或可以不是磁响应的。捕捉珠可以包括对于捕捉珠独特的条形码，或者捕捉珠可以不包括条形码。捕捉珠可以以另一种方式编码，例如颜色编码。
在一个实施方案中，微孔阵列与液滴致动器分开形成并整合到液滴致动器的底部基底中。阵列可以整合到液滴致动器的液滴操作间隙中。在另一个实施方案中，直接在基底，诸如液滴致动器的底部基底上制作阵列。在一个实施方案中，可以选择微孔的大小和捕捉珠的大小，使得阵列中的每个微孔容纳单个捕捉珠。
在一个实施方案中，多个细胞阱与液滴致动器分开形成并整合到液滴致动器的顶部基底中。多个细胞阱可以整合到液滴致动器的液滴操作间隙中。在另一个实施方案中，直接在基底，诸如液滴致动器的顶部基底上制作多个细胞阱。在一个实施方案中，可以选择细胞阱的大小，使得多个中的每个阱容纳单细胞。
在各个实施方案中，捕捉珠包括固定化在珠表面上的多个捕捉元件。在一个实施方案中，捕捉元件是固定化在珠表面上的捕捉寡核苷酸，用于捕捉来自单细胞的核酸。捕捉寡核苷酸可以例如包括核酸捕捉序列、独特的分子标识符(unique molecularidentifier，UMI)序列和独特的珠特异性条形码序列。在一个实例中，核酸捕捉序列是用于从单细胞捕捉总RNA的多聚T序列。在另一个实例中，核酸捕捉序列是多个转录物特异性捕捉序列，其靶向一组感兴趣的基因。独特的条形码序列允许每个细胞的核酸(例如转录物组)与初始细胞相关联。因此，对于任何给定的单细胞，可以鉴定基因和转录物并将其分配到相同的细胞，因为序列共享相同的独特条形码。在一些实施方案中，捕捉寡核苷酸还包括用于从珠释放捕捉的核酸的可切割序列。
本发明的液滴致动器可以配置成执行样品至分析方案中的一个或多个步骤。在一个实施方案中，液滴致动器可以配置成进行一个或多个用于分析核酸的过程步骤。核酸的分析可以例如包括PCR分析和/或测序分析。在一个实例中，液滴致动器可以配置为进行样品至测序就绪(sequencing-ready)文库的方案中的一个或多个步骤。液滴致动器可以配置为液滴致动器上的单独微孔中的多个单细胞以及单独微孔中的单珠的分离，并且在独特的条形码珠上捕捉来自每个单细胞的核酸。然后从液滴致动器中回收来自液滴致动器上的每个微孔的条形码编码的珠，并在台上处理以产生测序就绪文库。
在另一个实例中，液滴致动器可以配置用于在液滴致动器上的单独微孔中多个单细胞以及单独微孔中的单珠的分离，在独特的条形码编码珠上捕捉来自每个单细胞的核酸，并在液滴致动器上处理捕获的核酸，以产生测序就文库。
在另一个实例中，液滴致动器可以配置用于在液滴致动器上的单独细胞阱中多个单细胞以及单独微孔中的单珠的分离，其中每个细胞阱位于单独微孔近侧，在独特的条形码编码珠上捕捉来自每个单细胞的核酸，并在液滴致动器上处理捕获的核酸以产生测序就绪文库。
在液滴致动器上整合的微孔装置
液滴致动器通常包括一个或多个基底，所述基底配置成形成用于进行液滴操作的表面或间隙。一个或多个基底建立用于进行液滴操作的液滴操作表面或间隙，并且还可以包括布置成进行液滴操作的电极。液滴操作基底或基底之间的间隙可以用填充剂流体涂覆或填充，该填充剂流体与形成液滴的液体不混溶。
图1A显示了液滴致动器100的实例的透视图，所述液滴致动器100包括微孔的排列(例如微孔阵列)以分离感兴趣的细胞(例如单细胞)，用于表征分析物。液滴致动器100包括由液滴操作间隙分开的底部基底110和顶部基底112。底部基底110例如是印刷电路板(PCB)。顶部基底112例如是塑料或玻璃基底。液滴致动器100包括在顶部和底部基底112，110中的一个或两个中形成的区室113。区室113的形状和尺寸为接受微孔装置115。例如，微孔装置115与底部基底110分开形成。然后，微孔装置115与液滴致动器100的底部基底110配合。这样，相对于液滴致动器100的液滴操作间隙提供微孔装置115。任选地，可以将微孔装置115插入顶部基底112中的区室中，或者与顶部和底部基底112，110之一形成整体。
在一个实例中，微孔装置115的大小为约10.2mm x 9.5mm。微孔装置115包括例如微孔阵列(未显示)。
图1B显示了图1A的液滴致动器100的俯视图，并显示了用于分配和/或收集反应流体的流体储器的排列。液滴致动器100包括多个流体储器120(例如，4个流体储器120a至120d)，其可以例如分配为废物流体收集和/或流体分配储器。在该实例中，流体储器120a可以用作样品分配储器，用于分配一种或多种样品液滴，其包括一定量的感兴趣的单细胞；流体储器120b可以用作试剂分配储器，用于分配一个或多个试剂液滴，其包括一定量的捕捉珠(例如，条形码编码的磁响应性捕捉珠)；流体储器120c可以用作试剂分配储器，用于分配一个或多个细胞裂解缓冲液液滴；并且流体储器120d可以用作废物流体收集储器，用于接收用过的反应液滴。在各个实施方案中，可以提供其他储器和试剂，例如用于在细胞裂解和分析物结合后从微孔中回收捕获珠的缓冲液，按照下面参考图5G描述的步骤。参考图2更详细地描述液滴致动器100和微孔装置115。
图2显示了图1的微孔装置115和液滴致动器100的一部分的侧视图。底部基底110通过液滴操作间隙215与顶部基底112分开。在液滴操作表面上的液滴操作间隙215中进行液滴操作。微孔装置1115以微孔装置115的表面形成液滴操作表面的一部分的方式与区室113偶联并保持在区室113内。底部基底110包括液滴操作电极220(例如，电润湿电极)的排列。在液滴操作表面上的液滴操作电极220上进行液滴操作。整合在底部基底110中的微孔装置115包括基底225。在一个实例中，基底225是硅基底。在基底225的面向液滴操作间隙215的表面上布置疏水层230。疏水层230形成液滴操作间隙215的一侧，用于与微孔装置115对齐的液滴操作间隙215的区域。在一个实例中，疏水层230由CYTOP形成。多个微孔235(例如，微孔阵列)在基底225和疏水层230中形成并且通向基底225和疏水层230。微孔235通向微孔装置115的液滴操作表面。参考图3A至3D更详细描述微孔装置115的制作。
可以使用液滴操作沿着液滴操作电极220将样品液滴(未显示)转运到微孔装置115。在一个实例中，样品液滴可以包含要处理的多个感兴趣的细胞(例如，单细胞)，用于构建用于测序的核酸文库，如参考图5A至5G更详细地描述的。
图3A至3D显示了制作图1和2的微孔装置115的过程300的实例。可通过调节微孔235的大小和间距来容易地调节微孔装置115中的微孔235的密度。在该实例中，仅显示了微孔装置115的一部分。
在第一步骤中并且现在参考图3A，提供了基底225。在一个实例中，基底225是大小约10.2mm x 9.5mm的硅晶片。然后，在基底225的表面上形成疏水层230(例如，CYTOP、FOTS或其他氟化单层或聚合物)。
在下一步骤中并且现在参考图3B，使用标准光刻过程，在疏水层230的顶部提供光致抗蚀剂层310。然后，将环状空隙315阵列图案化到光致抗蚀剂层310中。这样做，在疏水层230的顶部形成遮蔽屏(shadow mask)，使疏水层230的环状区域暴露。使用遮蔽屏来限定微孔235的位置并且蚀刻微孔235。
每个环状空隙315的直径可以是例如约3μm至约60μm。在一个实例中，每个环状空隙315的直径为约40μm，并且环状空隙315的间距为约80μm。在该实例中，基底225上的环状空隙315的密度为约150个环/mm2。因此，可以在约10.2mm x 9.5mm的区域中提供约15,000个环状空隙315。环状空隙315的大小基于微珠的大小来选择，所述微珠用于基于珠的方案中以捕捉靶定分析物(例如，核酸)。
在下一步骤中并且现在参考图3C，使用蚀刻过程从疏水层230和基底225的部分除去材料，所述部分通过光致抗蚀剂层310中的环状空隙315暴露，从而形成微孔235。在一个实例中，蚀刻过程是反应性离子蚀刻(RIE)过程。在环状空隙315处，可以将微孔235蚀刻到例如约30μm至约50μm的深度。在一个实例中，将微孔235蚀刻到约30μm的深度。选择微孔225的深度，使得仅一个微珠和一个单细胞可以适合任何一个微孔225。
在下一步骤中并且现在参考图3D，除去光致抗蚀剂层310以暴露留在微孔225外部的疏水层230的部分。例如，使用丙酮剥离方案除去光致抗蚀剂层310。微孔装置115可以描述为具有“半疏水”表面，即微孔225的表面是亲水的，而微孔225之间的间隙区域涂有疏水层230。
图4显示了微孔装置，例如微孔装置115的一部分的截面400。在该实例中，微孔的直径为约40μm，间距为约80μm。
液滴致动器上的单细胞分离和分析物捕捉
图5A至5G显示了图2的液滴致动器100的侧视图，并显示了使用微孔装置(例如，微孔装置115)来分离单细胞以表征分析物的过程500。图5A至5H的方法是方案的实例，其中在微孔中分离单细胞，裂解并且将靶定的分析物捕获到珠上用于后续处理。在一个实例中，捕捉珠是具有磁响应性的条形码编码珠，并且靶定的分析物是RNA。过程500可以包括但不限于以下步骤。
在一个步骤中并且现在参考图5A，经由液滴操作将样品液滴510转运到微孔装置115。样品液滴510包括一定量的单细胞515。
在另一步骤中并且现在参考图5B，将样品液滴510在微孔装置115处温育一段时间(例如，约30至约60秒)，其足以使单细胞515沉降(通过重力)到微孔235中。微孔235中细胞的捕捉率是样品液滴510中单细胞515的初始浓度和样品液滴510位于微孔装置115处的时间量的函数。
在另一步骤中并且现在参考图5C，使用液滴操作将样品液滴510转运离开微孔装置115。当将样品液滴510转运离开微孔装置115时，将微孔235中捕获的残留的样品流体和单细胞515保留在微孔装置115处。由于在微孔235之间的间隙区域中存在疏水层230，残留的样品液体和细胞定位在微孔235中并且间隙区域基本上没有样品残留物。
在另一步骤中并且现在参考图5D，使用液滴操作将包括一定量的磁响应性捕捉珠525的试剂液滴520转运到微孔装置115。在每个磁响应性捕捉珠525上固定化多个捕捉元件(例如，核酸捕捉探针(未显示))，其包括捕捉序列和独特的条形码序列(未显示)。在一个实例中，捕捉序列是用于捕获总mRNA的多聚T序列。在另一个实例中，捕捉序列是靶向一组感兴趣基因的多个转录物特异性捕捉序列。例如，磁响应性捕捉珠525通过重力在微孔235中沉积。在另一个实例中，磁体(未显示)可以定位在微孔装置115下方，使得磁体的磁力将磁响应性捕捉珠525吸引到微孔235中。在试剂液滴520中的磁响应性捕捉珠525的浓度足够高，使得微孔装置115中的每个微孔235包含磁响应性捕捉珠525。磁响应性捕捉珠525的大小使得仅一个珠将适合微孔235。
在另一个步骤中并且现在参考图5E，使用液滴操作将试剂液滴520转运离开微孔装置115。由于将包含任何多余的磁响应性捕捉珠525的试剂液滴520转运离开微孔装置115，将微孔235中的残留试剂流体和磁响应性捕捉珠525保留在微孔装置115处。
在另一步骤中并且现在参考图5F，使用液滴操作将细胞裂解试剂液滴530转运到微孔装置115。然后，使用液滴操作将细胞裂解试剂液滴530转运离开微孔装置115。每个微孔235现在包括一定量的细胞裂解试剂和磁响应性捕捉珠525。一些微孔235可以包括一个单细胞515。其他微孔235可以包括超过一个(例如两个)单细胞515。在温育期(例如约10分钟至约15分钟)中，在微孔235中裂解单细胞515，并且在磁响应性捕捉珠525上捕获释放的分析物(例如，RNA)。
在另一步骤中并且现在参考图5G，使用液滴操作将捕捉液滴535转运到微孔装置115。将磁体540定位在顶部基底112上方并与微孔装置115对齐，使得微孔装置115在其磁场内。使用磁体540的磁场将磁性响应捕获珠525与其上捕获的分析物(例如，RNA(未显示))从微孔235中拉出并进入捕捉液滴535中。
在另一步骤中并且现在参考图5H，移动磁体540离开微孔装置115和顶部基底112。当移动磁体540离开微孔装置115时，将其上具有捕获的分析物(例如，RNA)的磁响应性捕捉珠525悬浮在捕捉液滴535中。然后，使用液滴操作将其中具有磁响应性捕捉珠525的捕捉液滴535转运离开微孔装置115，用于后续处理步骤(例如，将RNA逆转录成cDNA、PCR扩增、文库制备和测序)。
在一个实例中，从液滴致动器100除去其中具有磁响应性捕捉珠525的捕捉液滴535，并且离开液滴致动器进行后续的处理步骤(例如，样品清洁、将RNA逆转录成cDNA、PCR扩增、文库制备(例如，Nextera方案)、和测序)。
在另一个实例中，在液滴致动器上进行后续处理步骤(例如，样品清洁、将RNA逆转录成cDNA、PCR扩增和文库制备)以产生测序就绪文库。从液滴致动器中取出测序就绪文库，用于后续测序。
图6A是液滴致动器的微孔装置600的一部分的俯视图，其显示了微孔中的细胞和捕获珠的共包囊。在该实例中，微孔装置600中的微孔的直径为约30μm(250个微孔/mm2)。捕捉珠是直径约20μm的磁响应性珠。细胞以红色显示，并且捕捉珠以绿色显示。细胞和捕捉珠位于微孔装置600的微孔中。在此实例中，其中捕捉珠的大小小于微孔的大小，超过约95％的微孔含有珠。因为微孔装置600的表面是疏水的，所以在微孔之间的表面上观察不到细胞和/或珠的残留物。
图6B是另一个液滴致动器的微孔装置650的一部分的俯视图，其显示了微孔中的细胞和捕获珠的共包囊。在该实例中，微孔装置650中的微孔的直径为约40μm(150个微孔/mm2)，并且捕获珠的直径为约40μm。细胞以红色显示，并且捕捉珠以绿色显示。细胞和捕捉珠位于微孔装置600的微孔中。在此实例中，其中捕捉珠的大小与微孔的大小大致相同，大量的微孔不含捕捉珠。
细胞捕捉效率
为了评估细胞捕获到液滴致动器的微孔装置上的效率，使用两种不同的液滴致动器。第一液滴致动器包括微孔装置，其大小为9.2mm x 2mm并且包括约3,000个微孔，所述微孔直径为约40μm，间距为约80μm。第二种液滴致动器包括大小为9.2mm x 10.5mm的微孔装置，并且包括约15,000个微孔，所述微孔直径为约40μm，间距为约80μm。将每个液滴致动器放置在显微镜的台上以允许显现和计数细胞。使用具有不同细胞浓度的三种样品溶液(即，50个细胞/μL、100个细胞/μL和250个细胞/μL)。将样品溶液加载到液滴致动器上，并使用液滴操作将样品液滴转运到液滴致动器的微孔装置。在足以使单细胞(通过重力)沉降到微孔装置的微孔中的一段时间(例如，约60秒)之后，使用液滴操作将样品液滴转运离开微孔装置。当将样品液滴转运离开微孔装置时，将残留的样品流体和单细胞保留在微孔装置的微孔中。将微孔中捕获的细胞显现并计数。下表1显示了细胞捕获数据。数据显示对于相同的细胞浓度(50个细胞/μL或100个细胞/μL)，包含单细胞的微孔的百分比(“单细胞/微孔”)对于9.2mm x 2mm微孔装置(即，对于50个细胞/μL为约2.2％，对于100个细胞/μL为约3.6％)和9.2mm x 10.5mm微孔装置(即对于50个细胞/μL为约2％和对于100细胞/μL为约4％)大致相同。数据还显示，随着样品液滴中细胞浓度增加，细胞捕获率增加，但多个细胞(例如，每孔两个细胞)的孔数也增加。每微孔的多个细胞(例如两个细胞)可以定义为细胞间的污染或“串扰”。可以通过选择微孔阵列区域的大小、样品液滴中的细胞浓度和/或样品液滴在微孔装置上温育的持续时间来调节单细胞捕获的效率。
从捕获的单细胞RNA构建文库
图7A显示了从使用非磁性响应性条形码编码珠捕获单细胞RNA的基于液滴致动器的方法中回收的RNA制备的cDNA的图700和图705。图700显示了来自含有100个单细胞等值的cDNA的携带cDNA的珠的第一分数(MW11-1)的cDNA大小分布。图705显示来自含有100个单细胞等值的cDNA的携带cDNA的珠的第二分数(MW11-2)的cDNA大小分布。在该实例中，将含有约50个细胞/μL的细胞样品液滴加载到液滴致动器上并使用液滴操作转运到液滴致动器上的微孔装置。在足以使样品液滴中的细胞沉降(通过重力)到微孔装置的微孔中的一段时间之后，使用液滴操作将样品液滴转运离开微孔装置。使用液滴操作将包括一定量的非磁性条形码编码珠的试剂液滴转运到微孔装置。在足以使条形码编码珠(通过重力)沉降到微孔装置的微孔中的一段时间之后，使用液滴操作将试剂液滴转运离开微孔装置。使用液滴操作将裂解试剂液滴(例如，1％LDS裂解缓冲液滴)转运到微孔装置。在细胞裂解温育期(例如，约15分钟)后，使用液滴操作将裂解试剂液滴转运离开微孔装置。除去裂解试剂液滴后，打开液滴致动器筒，并且将杂交缓冲液溶液(例如6x SSC)移液到微孔装置上。然后，通过从液滴致动器的微孔装置移液除去其上结合有RNA的非磁性条形码编码珠，用于随后使用台上逆转录方案加工成cDNA。数据显示将来自裂解细胞的RNA捕获在条形码编码珠上，并且在台上反应中容易地逆转录成cDNA。
图7B显示了分别从图7A的图700和图705的cDNA在台上制备的文库插入物的片段大小分布的图715和图720。数据显示两种不同文库制备反应之间的一致的文库产率和插入物大小。
串扰的量化
每个微孔的多个细胞(例如，两个细胞)可以定义为细胞间污染或“串扰”。为了量化液滴致动器上的单细胞分离和核酸捕捉期间的串扰，使用人与小鼠细胞的1比1混合物。简言之，将混合细胞样品(50个细胞/μL)加载到液滴致动器上并运送到液滴致动器上的微孔装置。在足以使单细胞沉降(通过重力)到微孔中的一段时间之后，使用液滴操作将混合的样品液滴转运离开微孔装置。裂解细胞，并在独特的条形码编码珠上捕捉每个微孔中释放的RNA。从液滴致动器中回收其上具有RNA的条形码编码珠，并处理捕获的RNA用于构建cDNA文库。对cDNA文库进行测序，并且测定与每种独特条形码相关的转录物。因为人和小鼠细胞各自含有独特的转录物，所以使用转录物和条形码序列信息鉴定与每个微孔相关的细胞类型。
图8A显示了每个独特条形码的人转录物和小鼠转录物的读段计数的图800。图上的每个点代表独特的条形码，其代表单个孔。若在微孔中分离单细胞，则与特定条形码相关的转录物来自人细胞或来自小鼠细胞。在串扰的情况下，例如每个微孔一个小鼠细胞和一个人细胞，来自小鼠和人两者的转录物将与特定条形码相关联。在x轴上绘制对于与特定条形码相关的人转录物的读段计数。在y轴上绘制与特定条形码相关的小鼠转录物的读段计数。带圆圈的区域表示来自与特定条形码相关的人和小鼠细胞两者的读段，并指示串扰(即，从相同微孔分离的人和小鼠转录物两者)。在此实例中，158个独特的条形码与小鼠转录物相关联，137个独特的条形码与人转录物相关联，并且5个独特的条形码与人和小鼠转录物的混合物相关联。串扰百分比为约3％，并且纯度为约97％。
图8B显示了第二种混合物种实验中每种独特条形码的人和小鼠转录物的读数计数的图805。除了使用较少的细胞外，基本上如上参考图8A所述进行实验。在该实例中，54个独特的条形码与小鼠转录物相关联，18个独特的条形码与人转录物相关联，并且0个独特的条形码与人和小鼠转录物的混合相关联。串扰百分比为约0％，并且纯度为约97％。纯度，例如97％，意味着平均地小鼠相关条形码含有97％的小鼠转录物和3％的人转录物；类似地，人相关条形码含有97％的人转录物和3％的小鼠转录物。
细胞大小和捕捉偏差
为了评估细胞大小对细胞捕获到液滴致动器的微孔装置上的效率的影响，使用两个物种的细胞，即人Hek细胞和小鼠3T3细胞。将每种细胞的等分试样用不同的标记物染色并以1:1的比率混合。将细胞组合成一个约120μl的液滴并转移到微孔基底上，然后离开微孔基底。在理想情况下，由于初始比率，将细胞以1:1的比率捕获在微孔中(例如，在微孔中捕获300个细胞，它们中的一半是小鼠的，另一半是人的)。但是，由于细胞的大小，存在偏差。在类似的实验中，在微孔中捕获的两种不同大小的珠显示类似的偏差，即，较大的颗粒比较小的颗粒以更高的比率捕获。
配置用于细胞悬浮液输入到测序文库输出的液滴致动器
图9显示了适用于进行多路复用单细胞文库构建方案的液滴致动器的底部基底900的实例的俯视图。底部基底900可以例如是PCB。底部基底900包括电极排列910，其配置用于多个单细胞的多路复用处理，以构建一个或多个单细胞文库。在液滴操作表面上的电极排列910上进行液滴操作。在该实例中，电极排列910配置用于在专用反应区域中并行处理多达4种不同样品，用于构建4种不同的单细胞测序文库。
电极排列910包括4个样品输入区915(例如，样品输入区915a到915d)，用于输入和分配样品溶液(例如，单细胞悬浮液)。电极排列910还包括4个微孔阵列920(例如，微孔阵列920a到920d)，其配置用于分离多个单细胞、细胞裂解和在捕捉珠(例如，条形码编码捕捉珠)上捕捉核酸(例如RNA)。电极排列910还包括4个反应区925(例如反应区925a到925d)，用于进行构建单细胞文库的处理步骤。处理步骤包括例如将RNA逆转录为cDNA、外切核酸酶I消化、PCR扩增和Nextera文库制备。电极排列910还包括4个文库输出区930(例如，文库输出区930a到930d)，用于收集和检索文库输出。
将每个样品输入区915、微孔阵列920、反应区925和文库输出区930通过液滴操作电极935(例如电润湿电极)的排列(诸如路径或阵列)互连。例如，将样品输入区915a、微孔阵列920a、反应区925a和文库输出区930a通过液滴操作电极935的排列互连。每个样品输入区915的排列、微孔阵列920、反应区925、文库输出区930和液滴操作电极935在底部基底900上提供专用区域，用于处理4个不同样品。
在液滴致动器上制作微孔阵列
可以在液滴致动器的底部基底上直接制作微孔阵列。在一个实例中，在液滴致动器的底部基底的限定区域上形成微孔阵列。
图10A至10C显示了在液滴致动器的底部基底上制作微孔阵列的过程1000的实例。现在参考图10A，提供底部基底1010。在该实例中，底部基底1010是PCB。PCB材料可以是例如具有RIE的聚酰亚胺。顶部基底1010的顶部是聚酰亚胺层1015。在一个实例中，聚酰亚胺层1015的厚度为约30μm。聚酰亚胺层1015顶部是疏水层1020。在一个实例中，聚酰亚胺层1015是Kapton层，而疏水层1020是CYTOP层。
在第一步中并且现在参考图10B，使用掩模1025(例如光致抗蚀剂掩模)来限定环状空隙1030的阵列。在另一个实例中，掩模1025是金属掩模。在一个实例中，环状空隙1030的直径为约50μm，间距为约80μm。环状空隙1030的密度约为150个环/mm2。在另一个实例中，环状空隙1030的大小范围为直径约30μm至约50μm，间距范围为约60μm至约100μm。环状空隙1030的密度范围为约100个环/mm2至约1000个环/mm2。
在下一步骤中并且现在参考图10C，使用蚀刻过程从疏水层1020和聚酰亚胺层1015的部分除去材料，其通过掩模1025暴露，从而形成微孔1035。在一个实例中，蚀刻过程是反应离子蚀刻(RIE)过程。在该实例中，将微孔1035蚀刻到例如约2.5μm的深度。
在下一步骤中并且现在参考图10D，除去掩模1025。
在另一个实例中，将掩模1025(例如，光致抗蚀剂掩模)替换为另一种合适的材料(例如，金属掩模)，并且使用备选的制作过程来形成微孔的阵列，其中将聚酰亚胺层1015和底部基底1010蚀刻至总深度约30μm至约50μm。
在另一个实例中，将聚酰亚胺层1015替换为可光成像材料，如可从DuPont(Wilmington，DE)获得的 PC 1000。 PC 1000层的厚度为约50μm。然后，使用光刻过程来限定和形成微孔阵列，所述微孔的直径为约50μm，间距为约100μm，深度为约30μm至约50μm。然后，在可光成像层的剩余表面的表面上形成CYTOP层(例如，疏水层1020)。
在又一个实施方案中，通过压印聚合物膜层(例如，聚酰亚胺层1015)来形成微孔1035。在一个实例中，聚合物膜是Kapton。在另一个实例中，聚合物膜是环烯烃。在一个实例中，压印过程是卷对卷过程(roll-to-roll process)，其用于在聚合物基底中创建微孔结构。
在又一个实施方案中，使用传统的热压花(hot embossing)过程在聚合物膜层(例如，聚酰亚胺层1015)中形成微孔1035，以在聚合物基底中创建微孔结构。
在又一个实施方案中，在布置在聚合物膜层(例如，聚酰亚胺层1015)顶上的树脂层中形成微孔1035。在该实例中，然后可以使用压印或压花过程来创建微孔结构(例如，微孔1035)。随后使用例如热处理或光处理来固化树脂层，以在聚合物膜的顶上创建刚性微孔结构。随后，将膜层压到含有电极的数字微流体PCB上，并将疏水层(例如CYTOP)沉积到聚合物层上。还可以在形成微孔的过程中使用其他过程，例如使用热引发的图案转移和/或UV引发的图案转移的卷到板(roll-to-panel)过程。
细胞捕获结构的掺入
在一些实施方案中，本文所述的装置包括具有一个或多个基底的液滴致动器，所述基底配置为形成用于进行液滴操作的表面或间隙。一个或多个基底建立用于进行液滴操作的液滴操作表面或间隙，并且还可以包括排列成进行液滴操作的电极。在本文所述的一些实施方案中，微孔装置包括具有多个微孔的第一基底，所述微孔通向微孔装置的液滴操作表面。在一些实施方案中，装置还包括含有多个细胞阱的第二基底，所述细胞阱通向微孔装置的液滴操作表面。在一些实施方案中，细胞阱位于与第一基底极其接近的第二基底上，并且通向第一基底上的微孔。在一些实施方案中，顶部基底上的细胞阱各自位于装置的底部基底上的微孔上方。
细胞阱包括例如Di Carlo,等人,“Dynamic single cell culture array,”LabChip 2006,6,1445-1449中描述的那些结构，并且可以具有任何合适的形状，如杯形、U形或桥形、或其组合。细胞阱的维度(宽度、长度、深度)可以随感兴趣的靶细胞的大小而容易优化。细胞阱可以用任何合适的材料，诸如聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作，并模制到第二基底上，其可以是玻璃或其他合适的材料。在一些实施方案中，将细胞阱排列成不对称偏移的行。用于捕获阵列装置的模具可以使用负光致抗蚀剂或本领域已知的其他合适方法制作。
图18A-18B显示了在顶部基底中具有细胞阱结构的数字微流体装置，其允许在含有珠的底部基底中的微孔上方物理捕获感兴趣的细胞。图18A提供了装置的侧视图，其中珠和细胞共定位。空心矩形是固定到顶部基底1710的细胞捕获结构，浅灰色点是捕获在此类结构上的细胞，而黑点是底部基底110上的微孔中的捕捉珠525。这两个基底通向液滴操作间隙215。底部基底110包括液滴操作电极220(例如，电润湿电极)的排列。图18B显示了此类装置的俯视图，显示了顶部基底上的细胞捕获结构用来将捕获的细胞与底部基底上的微孔中的珠共定位。
样品-孔“加帽”或用不混溶相包囊
本发明提供分隔微孔阵列中的单独反应的微通道装置和方法。微通道装置包括在微通道的底面中形成的微孔阵列，使得微通道沿着单个边缘或面与每个微孔相交。每个微孔是反应区室，其可以用水性反应混合物填充，然后用不混溶相(例如油)“加帽”，使得每个微孔(和其中的内容物)彼此隔开。在一个实施方案中，反应混合物包括一定量的单细胞，用于在单独的反应区室中包囊。
图11A至11E显示了微通道装置的透视图，并显示了用不混溶相加帽微孔阵列以形成分离的反应区室的过程1100。过程1100可以包括但不限于以下步骤。
在一个步骤中并且现在参考图11A，微通道装置1110包括微通道1115。在微通道1115的底部表面中形成微孔1120的线或阵列。在一个实例中，微孔1120是环状孔。在另一个实例中，微孔1120的形状为矩形。
在其他步骤中并且现在参见图11B和11C，将反应混合物1125流入微通道1115，填充微通道1115和微孔1120。在一个实例中，反应混合物1125包括一定量的单细胞(未显示)以在单独的微孔1120中包囊以用于后续处理步骤。在一个实例中，将单细胞包囊在单独的微孔1120中，用于在单细胞基因组学方案中进行处理。将反应混合物1125留在微通道装置1110中达一段时间，该时间段足以使单细胞(未显示)沉降(通过重力)到微孔1120中。微孔1120中的细胞(未显示)的捕获率是反应混合物中单细胞的初始浓度和反应混合物1125保留在微通道装置1110中的时间量的函数。
在其他步骤中并且现在参考图11D和11E，将不混溶相1130加载到微通道1115中。在一个实例中，不混溶相1130是油。当将不混溶相1130加载到微通道1115中时，将反应混合物1125从微通道1115置换并且将反应混合物1125保留在微孔1120中。这样做，用不混溶相1130将微孔1120“加帽”，使得每个微孔1120现在与所有其他微孔1120隔离，并且随后的反应(例如，逆转录或PCR扩增)在隔离的区室中进行。可以回收每个微孔1120中的反应产物，例如，通过在第二水相溶液中流动并收集第二水相溶液(未显示)进行。
图12A和12B是例如图11A至11E的微通道装置1110的一部分的俯视图，并且分别显示了完全加载的微通道和相关的微孔和在油注射之后的“加帽”的微孔。
图13是微通道装置1300的一部分的俯视图，该微通道装置1300包括矩形形状的微孔。在该实例中，微孔用水溶液填充并用不混溶相(例如油)加帽。
图14是高度平行的微通道阵列1400的一部分的俯视图。
在备选的实施方案中，本公开提供了结合细胞阱阵列使用微孔阵列分隔单独反应的微通道装置和方法。微通道装置包括在微通道的底面中形成的微孔阵列，使得微通道沿着单一边缘或面与每个微孔相交。微通道装置包括在微通道的顶板中形成的细胞阱结构阵列，使得微通道沿着第二边缘或面与每个细胞阱相交。每个微孔/细胞阱位置是反应区室，其可以用水性反应混合物填充，然后用不混溶相(例如油)包囊，使得每个微孔/细胞阱单元(和其中的内容物)彼此隔离。一旦细胞和珠分别在细胞阱和微孔中共定位，使用例如水性介质，可以将不混溶的流体引入系统以置换水性介质。在微孔/细胞阱单元的位置处顶部和底部基底之间的间隙减小防止了水性介质在该位置处的置换。如图19A-19B所示，已经将细胞加载到顶部基底1710上的细胞阱中，并且将珠525加载到底部基底110上的微孔中。通过微通道215加载油以置换水相液滴并实现珠/细胞对的包囊。图19A显示了加载到微通道(灰色阴影区域)中的油围绕微孔/细胞阱位置但不填充它们，使细胞、珠和水性介质被包囊或分隔在具有油环绕的单一水性微室中。图19B显示了加载有油的装置的俯视图，其中油围绕微孔/阱，将细胞和珠一起包囊在水性微室中。
在示例性实施方案中，图20A-D显示了捕获在细胞阱结构上的球体的捕获和油包囊。图20A是10um荧光微球(白色圆圈)的荧光图像，用作细胞的代替以允许显现，捕获在如图18中的装置上。图20B显示位于细胞捕获结构上的荧光颗粒的叠加白光和荧光图像。图20C显示了流入通道中的油，导致形成分离的液滴，其模拟阱结构的形状，从而包囊球体。在细胞阱结构处装置的顶部和底部表面之间的间隙高度低于周围空间中的间隙高度，并且在缓慢的流动速率条件下油不能从这些间隙中置换水。图20D显示了在冲洗油通过通道之后被油包围的分离的水性室。将球体包囊在水性液滴内。
“正”孔
图15A、15B、15C和15D显示了“正”孔结构1500的实例。上述大多数孔设计包括凹入基底中的几何形状。利用凹陷孔，可以捕获/分离/分隔水性流体，包括表面能量差(235对230)或没有表面能量差(1400)。在这些情况下，捕获的流体的体积处于或低于基底表面。然而，在表面能量的足够差异的情况下，即使在可忽略的凹陷或不存在凹陷(即“正”孔)的情况下也可以实现类似的效果，其中捕获的流体的体积将处于或高于基底表面。
正孔结构1500包括亲水层1510，如玻璃、氧化硅和/或亲水处理的聚合物层。疏水层1512，如CYTOP、聚对二甲苯(parylene)和/或FOTS层位于亲水层1510的顶上。在疏水层1512中形成空隙，从而形成“正”孔1514(即，可忽略的凹陷深度但是差异的表面能量)，其中一部分亲水层1510是暴露的。当较大的水性液滴或团(bolus)1513通过“正”孔1514时，水性液滴或团1513的部分将以“正”孔1514内的较小的分离体积1530保持捕获。
现在参考图16A、16B和16C，为了促进例如在“正”孔1514内捕获细胞1520和/或珠1522，“正”孔1514的表面可以涂覆有化学物质，其对细胞1520和/或珠1522具有亲和力。另外，一对亲水捕获特征1516可以形成在亲水层1510的顶上和“正”孔1514内。即，某些亲水捕获特征1516可以用于在使细胞1520和/或珠1522流过“正”孔结构1500时物理捕获它们。例如，在加载液滴1513包含多个细胞1520和/或珠1522的情况下，当它流过“正”孔1514时，亲和化学物质可以结合细胞1520和/或珠1522，将它们保持在“正”孔1514中，或者具有适当的形状(本文显示为锥度小于要捕捉的细胞1520和/或珠1522的大小)的亲水性捕获特征1516可以将一个或多个细胞1520和/或珠1522捕获在“正”孔1514内。
系统
图17显示了微流体系统1700的实例的功能框图，所述微流体系统1700包括液滴致动器1705，其是流控筒的一个实例。在液滴致动器(诸如液滴致动器1705)中数字微流体技术对离散液滴进行液滴操作，通过电控制其表面张力(电润湿)进行。液滴可以夹在液滴致动器1705的两个基底，由液滴操作间隙分开的底部基底和顶部基底之间。底部基底可以包括电可寻址电极的排列。顶部基底可以包括参考电极平面，该参考电极平面例如从导电墨水或氧化铟锡(ITO)制成。底部基底和顶部基底可以涂覆有疏水材料。在液滴操作间隙中进行液滴操作。液滴周围的空间(即，底部和顶部基底之间的间隙)可以填充有不混溶的惰性流体，如硅油，以防止液滴蒸发并促进它们在装置内的转运。可以通过改变电压激活的模式来实现其他液滴操作；实例包括液滴的合并、分裂、混合和分配。
液滴致动器1705可以设计成配合到微流体系统1700的仪器板(instrument deck)(未显示)上。仪器板可以容纳液滴致动器1705并容纳其他液滴致动器特征，诸如但不限于一个或多个磁铁和一个或多个加热装置。例如，仪器板可以容纳一个或多个磁体1710，其可以是永磁体。任选地，仪器板可以容纳一个或多个电磁铁1715。磁铁1710和/或电磁铁1715相对于液滴致动器1705定位，用于固定化磁响应性珠。任选地，磁体1710和/或电磁体1715的位置可以由电动机1720控制。另外，仪器板可以容纳一个或多个加热装置1725，用于控制例如液滴致动器1705的某些反应和/或洗涤区域内的温度。在一个实例中，加热装置1725可以是加热棒，其相对于液滴致动器1705定位，以提供其热控制。
微流体系统1700的控制器1730电偶联到本文阐述的装置的各种硬件组件，诸如液滴致动器1705、电磁铁1715、电动机1720和加热装置1725，以及检测器1735、阻抗感测系统1740、以及任何其他输入和/或输出设备(未显示)。控制器1730控制微流体系统1700的整体操作。控制器1730可以是例如通用计算机、专用计算机、个人计算机或其他可编程数据处理装置。控制器1730用来提供处理能力，诸如存储、解释和/或执行软件指令，以及控制系统的整体操作。控制器1730可以配置和编程为控制这些设备的数据和/或功率方面。例如，在一个方面，关于液滴致动器1705，控制器1730通过激活/停用电极来控制液滴操作。
控制器1730配置为执行程序指令以实现本文描述的过程。控制器1730指示液滴致动器将样品液滴转运到微孔装置。样品液滴包括进入微孔的感兴趣的细胞。控制器1730进一步管理系统以将捕捉珠引入微孔，其中捕捉元件固定化在捕捉珠上并指引液滴致动器将细胞裂解试剂液滴转运到微孔装置。裂解试剂液滴的一部分进入微孔，并且在温育期期间，使感兴趣的细胞释放分析物，其由捕捉珠上的捕捉元件捕获。控制器1730指引液滴致动器将样品液滴转运离开微孔装置，同时在微孔中留下捕获的至少一部分感兴趣的细胞。控制器1730指引系统的组件从微孔除去具有其上捕获的分析物的捕捉珠。例如，控制器1730指引磁体1710和/或电磁铁1715(位于微孔附近)形成磁场，该磁场将捕捉珠从微孔中拉出。任选地，控制器1730管理磁体1710和电磁体1715以利用磁场将捕捉珠移动到微孔以及离开微孔。
在一些实施方案中，系统控制器进一步配置成在温育期期间和/或之前执行程序指令以指引液滴致动器将与细胞裂解试剂液滴不混溶的流体转运到微孔装置，其中不混溶的流体不进入微孔和细胞阱，从而用细胞裂解试剂包囊具有单细胞的单珠。
在一个实例中，检测器1735可以是相对于液滴致动器1705定位的成像系统。在一个实例中，成像系统可以包括一个或多个发光二极管(LED)(即，照明源)和数字图像捕获设备，例如电荷耦合器件(CCD)相机。可以使用适合于使用中的特定试剂或标记物的装置进行检测。例如，可以使用诸如荧光检测器、吸光度检测器、发光检测器等的光学检测器来检测适当的光学标记物。针对基于阵列的检测而设计的系统是特别有用的。例如，与本文阐述的方法一起使用的光学系统可以构造成包括如以下中描述的各种部件和组件：Banerjee等人,美国专利号8,241,573,题目为“Systems and Devices for Sequence by SynthesisAnalysis,”2012年8月14日公告；Feng等人,美国专利号7,329,860,题目为“ConfocalImaging Methods and Apparatus,”2008年2月12日公告；Feng等人,美国专利号8,039,817,题目为“Compensator for Multiple Surface Imaging,”2011年10月18日公告；Feng等人,美国专利公开号20090272914,题目为“Compensator for Multiple SurfaceImaging,”2009年11月5日公布；和Reed等人,美国专利公开号20120270305,题目为“Systems,Methods,and Apparatuses to Image a Sample for Biological or ChemicalAnalysis,”2012年10月25日公布，其全部公开通过引用并入本文。此类检测系统特别可用于核酸测序实施方案。
阻抗感测系统1740可以是用于检测液滴致动器1705的特定电极处的阻抗的任何电路。在一个实例中，阻抗感测系统1740可以是阻抗谱仪。阻抗感测系统1740可以用于监测任何电极的电容性负载，诸如任何液滴操作电极，其上具有或不具有液滴。关于合适的电容检测技术的实例，参见Sturmer等人,国际专利公开号WO/2008/101194,题目为“Capacitance Detection in a Droplet Actuator,”2009年10月30日公布；和Kale等人,国际专利公开号WO/2002/080822,题目为“System and Method for DispensingLiquids,”2004年2月26日公布，其全部公开内容通过引用并入本文。
液滴致动器1705可以包括破坏装置1745。破坏装置1745可以包括促进液滴致动器中的材料(例如组织、细胞和孢子)破坏(裂解)的任何装置。例如，破坏装置1745可以是超声处理机构、加热机构、机械剪切机构、珠击打机构、整合到液滴致动器1705中的物理特征、电场产生机构、热循环机构、以及任何其组合。破坏装置1745可以由控制器1730控制。
在一些实施方案中，本公开涵盖用于捕捉感兴趣的细胞的数字流控系统，所述系统包含：(a)包含液滴操作间隙的液滴致动器，所述液滴致动器包含所述液滴操作间隙附近排列的液滴操作电极；(b)微孔装置，其包含：(1)第一基底，所述微孔装置包含所述第一基底中形成的微孔，所述微孔通向所述微孔装置的液滴操作表面，所述微孔装置与所述液滴致动器偶联并且定位为使得所述微孔面向所述液滴操作间隙；和(2)第二基底，所述微孔装置包含所述第二基底上形成的细胞阱，所述细胞阱通向所述微孔装置的所述液滴操作表面；(c)控制器，其配置为执行程序指令以：(1)指引所述液滴致动器将样品液滴转运到微孔装置，所述样品液滴包含进入所述细胞阱的感兴趣的细胞；(2)将捕捉珠引入所述微孔，其中在所述捕捉珠上固定化捕捉元件；并且(3)指引所述液滴致动器将细胞裂解试剂液滴转运到所述微孔装置，其中所述裂解试剂液滴的部分进入所述细胞阱和微孔，并且在温育期期间引起所述感兴趣的细胞释放分析物，所述分析物由所述捕捉珠上的所述捕捉元件捕捉。
在系统的一些实施方案中，第一基底包括布置在其上的疏水层，该疏水层形成液滴操作表面。在一些实施方案中，微孔的大小和间距的尺寸为仅接收单个捕获珠。
应当理解，本公开的各个方面可以体现为方法、系统、计算机可读介质和/或计算机程序产品。本公开的各方面可以采取硬件实施方案，软件实施方案(包括固件、常驻软件、微代码等)的形式，或者组合软件和硬件方面的实施方案，这些实施方案在本文中通常可以都称为“电路”、“模块”或“系统”。此外，本公开的方法可以采用计算机可用存储介质上的计算机程序产品的形式，该计算机可用存储介质具有包含在介质中体现的计算机可用程序代码。
任何合适的计算机可用介质可以用于本公开的软件方面。计算机可用或计算机可读介质可以是例如但不限于电子、磁、光、电磁、红外或半导体系统、装置、装置或传播介质。计算机可读介质可以包括瞬时的实施方案。计算机可读介质的更具体实例(非详尽列表)将包括以下中的一些或全部：具有一条或多条线的电连接、便携式计算机磁盘、硬盘、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦可编程只读存储器(EPROM或闪存)、光纤、便携式光盘只读存储器(CD-ROM)、光存储设备、传输介质诸如支持互联网或内联网的那些、或磁存储设备。注意，计算机可用或计算机可读介质甚至可以是纸张或打印程序的其他合适的介质，因为程序可以通过例如光学扫描纸张或其他介质以电子方式捕获，然后编译，解释或在其它情况下以合适的方式处理(若必要的话)，然后存储在计算机存储器中。在本文件的上下文中，计算机可用或计算机可读介质可以是可以包含、存储、通信、传播或传输程序以供指令执行系统、装置或设备使用或与之结合使用的任何介质。
用于进行本文中阐述的方法和装置的操作的程序代码可以用面向对象的编程语言编写，例如Java、Smalltalk、C++等。然而，用于执行本文阐述的方法和装置的操作的程序代码也可以用传统的过程编程语言编写，诸如“C”编程语言或类似的编程语言。程序代码可以由处理器、专用整合电路(ASIC)或执行程序代码的其他组件执行。程序代码可以简称为存储在存储器(例如上面讨论的计算机可读介质)中的软件应用。程序代码可以使处理器(或任何处理器控制的装置)产生图形用户界面(“GUI”)。可以在显示装置上可视地产生图形用户界面，但是图形用户界面也可以具有可听特征。然而，程序代码可以在任何处理器控制的装置中操作，例如计算机、服务器、个人数字助理、电话、电视或利用处理器和/或数字信号处理器的任何处理器控制的装置。
程序代码可以本地和/或远程执行。例如，程序代码可以完全或部分地存储在处理器控制的装置的本地存储器中。然而，程序代码也可以至少部分地远程存储、访问和下载到处理器控制的装置。例如，用户的计算机可以完全执行程序代码或仅部分地执行程序代码。程序代码可以是独立的软件包，其至少部分地在用户的计算机上和/或部分地在远程计算机上或完全在远程计算机或服务器上执行。在后一种情况下，远程计算机可以通过通信网络连接到用户的计算机。
无论网络环境如何，都可以应用本文中阐述的方法和装置。通信网络可以是在射频域和/或互联网协议(IP)域中操作的有线网络。然而，通信网络还可以包括分布式计算网络，例如因特网(有时也称为“万维网”)、内联网、局域网(LAN)和/或广域网(WAN)。通信网络可以包括同轴电缆、铜线、光纤线和/或混合同轴线。通信网络甚至可以包括利用电磁频谱的任何部分和任何信令传导标准(诸如IEEE 802标准族、GSM/CDMA/TDMA或任何蜂窝标准和/或ISM频带)的无线部分。通信网络甚至可以包括电源线部分，其中信号通过电线通信。本文阐述的方法和装置可以应用于任何无线/有线通信网络，而不管物理组件、物理配置或通信标准。
参考各种方法和方法步骤描述了本公开的某些方面。应该理解，每个方法步骤可以由程序代码和/或机器指令实现。程序代码和/或机器指令可以创建用于实现方法中指定的功能/动作的装置。
程序代码还可以存储在计算机可读存储器中，该计算机可读存储器可以指示处理器、计算机或其他可编程数据处理装置以特定方式运行，使得存储在计算机可读存储器中的程序代码产生或者转换包括实现方法步骤的各个方面的指令装置的制品。
程序代码还可以加载到计算机或其他可编程数据处理装置上，以使得执行一系列操作步骤以产生处理器/计算机实现的过程，使得程序代码提供用于实现在本公开的方法中指定的各种功能/动作的步骤。
结论
实施方案的前述详细描述参考了附图，附图显示了本公开的具体实施方案。具有不同结构和操作的其他实施方案不脱离本公开的范围。术语“本发明”等是参考本说明书中阐述的申请人的发明的许多可选方面或实施方案的某些具体实例而使用的，并且其使用和不存在都不旨在限制申请人的发明的范围或权利要求书的范围。仅为了方便读者，本说明书分为几个部分。标题不应解释为限制本发明的范围。定义旨在作为本发明说明书的一部分。应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以改变本发明的各种细节。此外，前面的描述仅用于说明的目的，而不是为了限制的目的。

Claims (33)

1.用于在数字微流体系统中捕捉感兴趣的细胞的方法，所述方法包括：
(a)利用液滴致动器将样品液滴转运到微孔装置，所述微孔装置包含具有多个微孔的基底，所述多个微孔通向所述微孔装置的液滴操作表面，所述样品液滴包含进入所述微孔的感兴趣的细胞；
(b)将捕捉珠引入所述微孔，其中在所述捕捉珠上固定化捕捉元件；并且
(c)利用所述液滴致动器将细胞裂解试剂液滴转运到所述微孔装置，其中所述细胞裂解试剂液滴的部分进入所述微孔，并且在温育期期间引起所述感兴趣的细胞释放分析物，所述分析物由所述捕捉珠上的所述捕捉元件捕捉。
2.权利要求1的方法，其进一步包括利用所述液滴致动器在留下所述微孔中捕捉的所述感兴趣的细胞的至少一部分的情况下将所述样品液滴转运离开所述微孔装置。
3.权利要求1的方法，其进一步包括允许所述感兴趣的细胞的至少一部分沉降到所述微孔中。
4.权利要求1的方法，其中所述微孔装置的所述液滴操作表面包含微孔间的间隙区域，其是疏水的，使得基本上没有所述感兴趣的细胞或捕捉珠的残留物保留在所述微孔装置的所述液滴操作表面上。
5.权利要求1的方法，其进一步包括从所述微孔除去其上捕捉有所述分析物的捕捉珠。
6.权利要求5的方法，其中所述除去操作包括将磁体置于所述微孔附近以形成从所述微孔拉出所述捕捉珠的磁场。
7.权利要求1的方法，其进一步包括利用磁场移动所述捕捉珠到微孔以及离开所述微孔。
8.权利要求1的方法，其中每个所述捕捉珠包含多个所述捕捉元件。
9.权利要求8的方法，其中所述多个捕捉元件包含捕捉序列和独特的条形码序列。
10.权利要求9的方法，其中所述捕捉序列是下列之一：i)用于捕捉总mRNA的多聚T序列，或ii)靶向一组感兴趣基因的多个转录物特异性捕捉序列。
11.权利要求1的方法，其中筛分(sized)所述捕捉珠，使得仅所述捕捉珠之一适合所述微孔之一。
12.权利要求1的方法，其中所述捕捉珠通过重力在所述微孔中沉积。
13.权利要求1的方法，其中所述捕捉珠是磁性的，并且利用磁吸引在所述微孔中沉积。
14.用于捕捉感兴趣的细胞的数字流控系统，所述系统包含：
(a)包含液滴操作间隙的液滴致动器，所述液滴致动器包含接近所述液滴操作间隙排列的液滴操作电极；
(b)包含基底的微孔装置，所述微孔装置包含所述基底中形成的微孔，所述微孔通向所述微孔装置的液滴操作表面，所述微孔装置与所述液滴致动器偶联并且定位为使得所述微孔面向所述液滴操作间隙；和
(c)控制器，其配置为执行程序指令以：
(1)指引所述液滴致动器将样品液滴转运到微孔装置，所述样品液滴包含进入所述微孔的感兴趣的细胞；
(2)将捕捉珠引入所述微孔，其中在所述捕捉珠上固定化捕捉元件；并且
(3)指引所述液滴致动器将细胞裂解试剂液滴转运到所述微孔装置，其中所述裂解试剂液滴的部分进入所述微孔，并且在温育期期间引起所述感兴趣的细胞释放分析物，所述分析物由所述捕捉珠上的所述捕捉元件捕捉。
15.权利要求14的系统，其中所述基底包含其上布置的疏水层，所述疏水层形成所述液滴操作表面。
16.权利要求14的系统，其中所述液滴操作间隙配置为保留填充剂流体，其包含含有所述感兴趣的细胞的所述样品液滴。
17.权利要求14的系统，其中所述微孔具有一定的大小和间距，其尺寸为仅接受来自所述样品液滴中的所述感兴趣的细胞的单细胞并且仅接受单个所述捕捉珠。
18.权利要求14的系统，其中所述微孔具有30μm-50μm的深度。
19.权利要求14的系统，其中所述微孔具有3μm-60μm的直径。
20.权利要求14的系统，其中所述微孔彼此以不大于80μm的间隔分开。
21.权利要求14的系统，其中所述控制器进一步配置为执行程序指令以在所述温育期期间和/或之前，指引所述液滴致动器将与所述细胞裂解试剂液滴不混溶的流体转运到所述微孔装置，其中所述不混溶的流体不进入所述微孔和细胞阱，从而用细胞裂解试剂包囊具有单细胞的单珠。
22.用于在数字微流体系统中捕捉感兴趣的细胞的方法，所述方法包括：
(a)利用液滴致动器将样品液滴转运到微孔装置，所述微孔装置包含具有多个微孔和多个细胞阱的第一基底，所述多个微孔通向所述微孔装置的液滴操作表面，所述多个细胞阱通向所述微孔装置的所述液滴操作表面，所述样品液滴包含进入所述细胞阱的感兴趣的细胞；
(b)将捕捉珠引入所述微孔，其中在所述捕捉珠上固定化捕捉元件；并且
(c)利用所述液滴致动器将细胞裂解试剂液滴转运到所述微孔装置，其中所述细胞裂解试剂液滴的部分进入所述微孔和细胞阱，并且在温育期期间引起所述感兴趣的细胞释放分析物，所述分析物由所述捕捉珠上的所述捕捉元件捕捉。
23.权利要求22的方法，其中筛分所述捕捉珠，使得仅所述捕捉珠之一适合所述微孔之一。
24.权利要求22或23的方法，其中筛分所述细胞阱，使得仅所述感兴趣的细胞之一适合所述细胞阱之一。
25.权利要求22-24中任一项的方法，其还包括：
(d)在所述温育期期间和/或之前，利用所述液滴致动器将与所述细胞裂解试剂液滴不混溶的流体转运到所述微孔装置，其中所述不混溶的流体不进入所述微孔和细胞阱，从而用细胞裂解试剂包囊具有单细胞的单个微珠。
26.权利要求22的方法，其还包括从所述微孔除去其上捕捉有所述分析物的所述捕捉珠。
27.权利要求26的方法，其中所述除去操作包括将磁体置于所述微孔附近以形成从所述微孔拉出所述捕捉珠的磁场。
28.权利要求22的方法，其还包括利用磁场移动所述捕捉珠到微孔以及离开所述微孔。
29.权利要求22的方法，其中每个所述捕捉珠包含多个所述捕捉元件。
30.权利要求29的方法，其中所述多个捕捉元件包含捕捉序列和独特的条形码序列，其中所述捕捉序列任选是下列之一：i)用于捕捉总mRNA的多聚T序列，或ii)靶向一组感兴趣的基因的多个转录物特异性捕捉序列。
31.用于捕捉感兴趣的细胞的数字流控系统，所述系统包含：
(a)包含液滴操作间隙的液滴致动器，所述液滴致动器包含所述液滴操作间隙附近排列的液滴操作电极；
(b)微孔装置，其包含：
(1)第一基底，所述微孔装置包含所述第一基底中形成的微孔，所述微孔通向所述微孔装置的液滴操作表面，所述微孔装置与所述液滴致动器偶联并且定位为使得所述微孔面向所述液滴操作间隙；和
(2)第二基底，所述微孔装置包含所述第二基底上形成的细胞阱，所述细胞阱通向所述微孔装置的所述液滴操作表面；
(c)控制器，其配置为执行程序指令以：
(1)指引所述液滴致动器将样品液滴转运到微孔装置，所述样品液滴包含进入所述细胞阱的感兴趣的细胞；
(2)将捕捉珠引入所述微孔，其中在所述捕捉珠上固定化捕捉元件；并且
(3)指引所述液滴致动器将细胞裂解试剂液滴转运到所述微孔装置，其中所述裂解试剂液滴的部分进入所述细胞阱和微孔，并且在温育期期间引起所述感兴趣的细胞释放分析物，所述分析物由所述捕捉珠上的所述捕捉元件捕捉。
32.权利要求31的系统，其中所述第一基底包含其上布置的疏水层，所述疏水层形成所述液滴操作表面。
33.权利要求31的系统，其中所述微孔具有一定的大小和间距，其尺寸为仅接受单个所述捕捉珠。
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