CN107904155B - 一种用于液体分散的微流控芯片及其应用、使用方法 - Google Patents

一种用于液体分散的微流控芯片及其应用、使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于液体分散的微流控芯片及其应用、使用方法。该芯片为A层、B层和C层依次连接形成的三层复合式结构；A层含有进样通道、进样通道入口、进样通道出口和液滴捕获微室阵列，进样通道入口和进样通道出口分别设置于进样通道的两端，液滴捕获微室阵列与进样通道连接；C层含有灌流通道或微孔，灌流通道或微孔与A层中的液滴捕获微室阵列相对应；B层为多孔薄膜层。该芯片具有操作简便、可控性好、而且具有良好的生物兼容性，适合在高通量分析中进行应用。

Description

一种用于液体分散的微流控芯片及其应用、使用方法
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，特别涉及一种用于液体分散的微流控芯片及其应用，还涉及用于液体分散的微流控芯片的使用方法。
背景技术
与以试管为载体的传统生物分析相比较，微流控芯片分析具有多方面优势：(1)反应体积小，可以显著节省试剂消耗；(2)设计灵活；(3)便于实现高通量分析；(4)可以将复杂体系分散为众多只包含单一研究对象的简单体系，使背景单纯便于定量和定性分析，因而可以获知检测对象的异质性。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于液体分散的微流控芯片。
本发明的另一目的在于提供所述用于液体分散的微流控芯片的应用。
本发明的再一目的在于提供所述用于液体分散的微流控芯片的使用方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种用于液体分散的微流控芯片，为A层、B层和C层依次连接形成的三层复合式结构；A层含有进样通道、进样通道入口、进样通道出口和液滴捕获微室阵列，进样通道入口和进样通道出口分别设置于进样通道的两端，液滴捕获微室阵列与进样通道连接；C层含有灌流通道或微孔，其位置与A层中的液滴捕获微室阵列相对应；B层为多孔薄膜层。
所述的A层为底层时，进样通道入口和进样通道出口分别贯穿B层，开口于C层。
所述的进样通道为一条以上。
所述的进样通道入口和所述的进样通道出口依据所述的进样通道的条数而定。
优选的，所述的C层为底层时，含有灌流通道、灌流通道入口和灌流通道出口，灌流通道入口和灌流通道出口分别设置于灌流通道的两端，灌流通道入口和灌流通道出口分别贯穿B层，开口于A层；灌流通道与A层中的液滴捕获微室阵列相对应。
所述的用于液体分散的微流控芯片的面积优选为10～100平方厘米。
所述的用于液体分散的微流控芯片的材质优选为无色透明材料，从而易于观察。
所述的A层的材质优选为硅胶、塑料或玻璃。
所述的多孔薄膜层的材质优选为塑料。
所述的多孔薄膜层的厚度优选为10μm。
所述的多孔薄膜层中的多孔薄膜优选为具有如下特点的多孔薄膜：微孔孔径为100～200nm、开口率为15～20％。
所述的C层的材质优选为硅胶、塑料或玻璃。
所述的塑料多孔薄膜的材质优选为聚碳酸酯。
所述的用于液体分散的微流控芯片具有如下特点：A层中进样通道引入液体，而C层中的通道或微孔中为空气条件下，液体接触到多孔薄膜后由于流动阻力的增加，而被捕获于微室中。当A层中进样通道中的液体排空，同层阵列微室中捕获的液体彼此隔绝，实现了液体的分散；完成液体分散后，可以对分散体系进一步操作。如向C层中的通道或微孔中引入水相溶液，B层的多孔薄膜两侧液体中小颗粒物质可以发生交换；如向C层中的通道或微孔中引入油相溶液后，则可以封闭微室中的液体。
所述的用于液体分散的微流控芯片在高通量分析中的应用。
所述的用于液体分散的微流控芯片的使用方法，步骤如图1A-1D所示，具体如下：
(1)将液体注入A层中的进样通道后，液体顺序充盈同层的微室阵列；
(2)排除A层中进样通道内多余液体后，液体被扣留在液滴捕获微室，液体捕获微室之间彼此隔绝；
(3)在A层中完成液体分散后，可以进一步向C层含有对应液滴捕获微室阵列的通道或微孔中引入溶液。当引入水相溶液后，B层的多孔薄膜两侧液体中小颗粒物质可以发生交换；当向C层中的通道或微孔中引入油相溶液后，则可以封闭微室中的液体。
本发明的发明机理为，在多孔薄膜一侧为液体，一侧为气体的条件下，液体接触薄膜时接触面积显著增加，其后果是表面效应放大，界面力显著增加。因此，多孔薄膜处液体的流动阻力显著增加，因而实现了基于流动阻力调控的液体捕获和分流。
由于多孔薄膜的间隔，在完成液体分散后可以对分散体系进一步操作。当在多孔薄膜另一侧引入水相液体的条件下，薄膜两侧水相溶液中的小颗粒物质可以介由薄膜发生交换；当在多孔薄膜另一侧引入油相液体的条件下，油相液体可以封闭水相液体。
本发明相对于现有技术具有如下优点及效果：
(1)本发明提供的用于液体分散的微流控芯片操作简单，无需使用复杂的流体控制装置；
(2)本发明提供的用于液体分散的微流控芯片可以实现液体定位、定量捕获；
(3)在完成液体分散后可以对分散体系进一步操作，适合于不同类型应用。
综上所述，本发明提供的样品分散芯片其分析方法具有操作简便、可控性好、而且具有良好的生物兼容性。
附图说明
图1A是用于液体分散的微流控芯片操作时样品引入进样通道的示意图。
图1B是用于液体分散的微流控芯片操作时样品充盈微室的示意图。
图1C是用于液体分散的微流控芯片操作时排除进样通道内多余液体的示意图。
图1D是用于液体分散的微流控芯片操作时底层通道引入液体的示意图。
图2是实施例1提供的用于液体分散的微流控芯片。
图3是实施例2提供的用于液体分散的微流控芯片。
图4是实施例3提供的用于液体分散的微流控芯片。
图5A-5H是实施例4利用实施例1的用于液体分散的微流控芯片进行高通量乳腺癌抗肿瘤药物测试的操作过程图。其中，图5A对应步骤(1)～(4)、图5B对应步骤(5)、图5C对应步骤(6)、图5D对应步骤(7)、图5E对应步骤(8)、图5F对应步骤(9)、图5G对应步骤(10)、图5H对应步骤(11)。
图6A-6E是实施例5利用实施例2的用于液体分散的微流控芯片进行乳腺癌单细胞成瘤实验的操作过程图。其中，图6A对应步骤(1)～(3)、图6B对应步骤(4)、图6C对应步骤(5)、图6D对应步骤(6)、图6E对应步骤(7)。
图7A-7E是实施例6利用实施例3的用于液体分散的微流控芯片进行单细胞水平耐药大肠杆菌筛选的操作过程图。其中，图7A对应步骤(1)～(3)、图7B对应步骤(4)、图7C对应步骤(5)、图7D对应步骤(6)、图7E对应步骤(7)。
其中，1-微孔、2-进样通道入口、3-进样通道出口、4-多孔薄膜层、5-液滴捕获微室、6-灌流通道、7-灌流通道入口、8-灌流通道出口。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种用于液体分散的微流控芯片，如图2所示：为三层复合式结构，包括若干个微孔1、若干个进样通道入口2、若干个进样通道出口3、多孔薄膜层4、若干个液滴捕获微室5和若干条进样通道；微孔1设置在顶层上，多孔薄膜层4为中间层，液滴捕获微室5和与液滴捕获微室5连接的进样通道设置在底层；进样通道两端分别设置进样通道入口2和进样通道出口3，进样通道入口2和进样通道出口3分别贯穿于中间层，开口在顶层。微孔1正对着液滴捕获微室5。
具体地，本实施例所提供的微流控芯片的尺寸为10cm(长)×10cm(宽)。顶层和底层的材质为硅胶材质，中间层的材质为多孔聚碳酸酯薄膜。多孔聚碳酸酯薄膜的厚度为10微米，具有孔径为200nm的微孔，开口率(porisity)为15％。底层中的进样通道为8条，每条进样通道的两侧分别设置3个液滴捕获微室5，每个液滴捕获微室5的直径为2mm，即底层共有48个液滴捕获微室5。顶层设置有48个微孔1，微孔1的直径为3mm，48个微孔1正对着底层的48个液滴捕获微室5。
实施例2
一种用于液体分散的微流控芯片，如图3所示：为三层复合式结构，包括进样通道入口2、进样通道出口3、多孔薄膜层4、若干个液滴捕获微室5、灌流通道6、灌流通道入口7、灌流通道出口8和进样通道；灌流通道6、灌流通道入口7和灌流通道出口8设置在顶层，灌流通道入口7和灌流通道出口8分别设置在灌流通道6的两端；多孔薄膜层4为中间层；液滴捕获微室5和与液滴捕获微室5连接的进样通道设置在底层；进样通道两端分别设置进样通道入口2和进样通道出口3，进样通道入口2和进样通道出口3分别贯穿于中间层，开口在顶层。灌流通道6正对着液滴捕获微室5。
具体地，本实施例所提供的微流控芯片的尺寸为5cm(长)×10cm(宽)。顶层和底层的材质为玻璃材质，中间层的材质为多孔聚碳酸酯薄膜。多孔聚碳酸酯薄膜的厚度为10微米，具有孔径为100nm的微孔，开口率(porisity)为20％。底层的液滴捕获微室5分别设置在进样通道两侧，共有480个，形成阵列，每个液滴捕获微室5的直径为200微米。顶层的灌流通道6覆盖底层的液滴捕获微室5阵列。
实施例3
一种用于液体分散的微流控芯片，如图4所示：为三层复合式结构，包括进样通道入口2、进样通道出口3、多孔薄膜层4、若干个液滴捕获微室5、灌流通道6、灌流通道入口7、灌流通道出口8和进样通道；灌流通道6、灌流通道入口7和灌流通道出口8设置在底层，灌流通道入口7和灌流通道出口8分别设置在灌流通道6的两端，灌流通道入口7和灌流通道出口8分别贯穿于中间层，开口在顶层；多孔薄膜层4为中间层；液滴捕获微室5和与液滴捕获微室5连接的进样通道设置在顶层，进样通道两端分别设置进样通道入口2和进样通道出口3；灌流通道6正对着液滴捕获微室5。
具体地，本实施例所提供的微流控芯片的尺寸为2.5cm(长)×4cm(宽)。顶层和底层的材质为聚碳酸酯材质，中间层的材质为多孔聚碳酸酯薄膜。多孔聚碳酸酯薄膜的厚度为10微米，具有孔径为200nm的微孔，开口率(porisity)为15％。顶层的液滴捕获微室5分别设置在进样通道两侧，共有960个，形成阵列，每个液滴捕获微室5的直径为100微米。底层的灌流通道6覆盖顶层的液滴捕获微室5阵列。
实施例4
使用实施例1提供的用于液体分散的微流控芯片进行乳腺癌抗肿瘤药物测试，芯片局部的操作过程如图5A-5H所示：
(1)将芯片安装在芯片承载平台上；芯片的进样通道入口2借助毛细管与微量注射泵连接；微量注射泵吸取10μL乳腺癌细胞悬液(密度为105个/mL，悬浮于2％(w/v)海藻酸钠-PBS溶液，PBS溶液的pH值＝7.2、浓度为0.1M，乳腺癌细胞为标准细胞株，如MCF-7细胞株)；
(2)微量注射泵控制将乳腺癌细胞悬液注入芯片进样通道，顺序充满一系列液滴捕获微室5；
(3)多余样品从进样通道出口3排除；
(4)重复步骤(1)～(3)步操作，依次将8个乳腺癌细胞样品分散于8组液滴捕获微室；
(5)芯片顶层的每个微孔1加入5μL DMEM培养液；
(6)37℃下培养48小时；
(7)吸除每个微孔1中的培养基，加入含有抗肿瘤药物的DMEM培养基5μL；测试药物有12种，包括：顺铂、卡铂、阿霉素、氟尿嘧啶、丝裂霉素、甲氨蝶呤、长春新碱、紫杉醇、多柔比星、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼；每种药物设置4个浓度，12种药物，分配在一组48个微孔中；
(8)37℃下培养24小时；
(9)吸除每个微孔1中的培养基，加入钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)混合溶液(其中Calcein-AM浓度分别为2μmol·L-1，PI浓度为4μmol·L-1)1μL，37℃孵育10分钟；
(10)吸除每个微孔1中的溶液，每个微孔1重新加入10μL PBS溶液；
(11)倒置荧光显微镜下呈像检测每个微室中的细胞存活率，从而筛选得到有效作用乳腺癌细胞的药物以及合适的浓度。
实施例5
使用实施例2提供的用于液体分散的微流控芯片进行乳腺癌单细胞成瘤实验，具体操作过程(图6A-6E)所示：
(1)将芯片安装在芯片承载平台上；芯片的进样通道入口2借助毛细管与微量注射泵连接；微量注射泵吸取2微升乳腺癌细胞悬液(密度为2×103个/mL，悬浮于DMEM培养液)；
(2)微量注射泵控制将乳腺癌细胞悬液注入芯片的进样通道，顺序充满一系列液滴捕获微室5；
(3)多余样品从进样通道出口3排除；
(4)向芯片顶层的灌流通道6持续灌注DMEM培养液，37℃下培养72小时；
(5)芯片顶层的灌流通道6充满钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)混合溶液，终浓度分别为2μmol/L和4μmol/L，37℃孵育10分钟；
(6)排除芯片顶层灌流通道6中的钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)混合溶液，再充满PBS溶液；
(7)倒置荧光显微镜下呈像检测每个微室中的细胞成瘤情况。成瘤细胞比例＝成瘤细胞数/总细胞数×100％。
实施例6
使用实施例3提供的用于液体分散的微流控芯片进行单细胞水平耐氨苄西林大肠杆菌筛选，具体操作过程(图7A-7E)所示：
(1)将芯片安装在芯片承载平台上；芯片的进样通道入口2借助毛细管与微量注射泵连接；微量注射泵吸取2微升细菌悬液(密度为103/mL，悬浮于含有氨苄西林的肉汤培养液)；
(2)微量注射泵控制将细菌悬液注入芯片进样通道，顺序充满一系列液滴捕获微室；
(3)将多余样品从进样通道出口3排除；
(4)芯片底层的灌流通道6充满矿物油，37℃下培养24小时；
(5)排除芯片底层灌流通道6中的矿物油，充满含有SYTO9/PI荧光染料的溶液，保持10min；
(6)排除SYTO9/PI荧光染料溶液，充满PBS溶液；
(7)倒置荧光显微镜下呈像检测每个微室中的细菌存活状态，活细菌显绿色荧光，提示耐氨苄西林；死细菌显红色荧光，提示对氨苄西林敏感。耐氨苄西林细菌比例＝绿色荧光细菌数/(绿色荧光细菌数+红色荧光细菌数)×100％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于液体分散的微流控芯片，其特征在于：为A层、B层和C层依次连接形成的三层复合式结构；A层含有进样通道、进样通道入口、进样通道出口和液滴捕获微室阵列，进样通道入口和进样通道出口分别设置于进样通道的两端，液滴捕获微室阵列与进样通道连接；C层含有灌流通道或微孔，灌流通道或微孔与A层中的液滴捕获微室阵列相对应；B层为多孔薄膜层；所述的A层的材质为硅胶、塑料或玻璃；所述的多孔薄膜层的材质为塑料；所述的C层的材质为硅胶、塑料或玻璃；
在多孔薄膜一侧为液体，一侧为气体的条件下，液体接触多孔薄膜时接触面积显著增加，表面效应放大，界面力显著增加；因此，多孔薄膜处液体的流动阻力显著增加，实现了基于流动阻力调控的液体捕获和分流；
由于多孔薄膜的间隔，在完成液体分散后对分散体系进一步操作；当在多孔薄膜另一侧引入水相液体的条件下，多孔薄膜两侧水相溶液中的小颗粒物质介由多孔薄膜发生交换；当在多孔薄膜另一侧引入油相液体的条件下，油相液体封闭水相液体。
2.根据权利要求1所述的用于液体分散的微流控芯片，其特征在于：所述的A层为底层时，进样通道入口和进样通道出口分别贯穿B层，开口于C层。
3.根据权利要求1所述的用于液体分散的微流控芯片，其特征在于：所述的进样通道为一条以上。
4.根据权利要求1所述的用于液体分散的微流控芯片，其特征在于：所述的C层为底层时，含有灌流通道、灌流通道入口和灌流通道出口，灌流通道入口和灌流通道出口分别设置于灌流通道的两端，灌流通道入口和灌流通道出口分别贯穿B层，开口于A层；灌流通道与A层中的液滴捕获微室阵列相对应。
5.根据权利要求1所述的用于液体分散的微流控芯片，其特征在于：所述的用于液体分散的微流控芯片的面积为10～100平方厘米。
6.根据权利要求1所述的用于液体分散的微流控芯片，其特征在于：所述的用于液体分散的微流控芯片的材质为无色透明材料。
7.根据权利要求1所述的用于液体分散的微流控芯片，其特征在于：
所述的多孔薄膜层的厚度为10μm；
所述的多孔薄膜层中的多孔薄膜为具有如下特点的多孔薄膜：微孔孔径为100～200nm、开口率为15～20％；
所述的塑料多孔薄膜的材质为聚碳酸酯。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的用于液体分散的微流控芯片的应用，其特征在于：用于高通量分析。
9.根据权利要求1～7中任一项所述的用于液体分散的微流控芯片的使用方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将液体注入A层中的进样通道后，液体充盈液滴捕获微室阵列；
(2)排除进样通道内多余液体后，液体被扣留在液滴捕获微室，液滴捕获微室之间彼此隔绝；
(3)向C层含有对应液滴捕获微室阵列的通道中引入溶液；引入水相后，B层的多孔薄膜两侧液体发生交换；引入油相溶液后，油相溶液封闭液滴捕获微室。
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