CN112871227B - 基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片及方法，解决现有液滴回收方法存在芯片制作复杂的问题。该芯片包括键合在一起的下载体和上载体；下载体的上表面设置有至少一个进样口、微流道结构和一个出样口，微流道结构包括入口流道、微腔室阵列和出口流道；微腔室阵列包括多个平行设置的微流道以及设置在微流道两侧的多个微腔室；微腔室包括腔室以及连接腔室和微流道的喉部；进样口通过入口流道与每个微流道连通；每个微流道通过出口流道与出样口连通；上载体的下表面镀有金属材质层，上载体上设置有与出样口相对的通孔，用作蓄油池。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和仪器科学领域，涉及液滴微流控技术，具体涉及一种基于光热效应产生气泡进行微量液滴操控的液滴微流控芯片及使用该液滴微流控芯片制备微量液滴阵列并选择性导出目标微量液滴的方法。
背景技术
液滴微流控技术极大地减少了反应体积和分析时间，从而导致了高通量筛选和测序的变革性进展。通过将液滴排列成静态阵列，可以监视在这些微腔室内长时间发生的动态事件，从而有助于识别稀有事件和细胞类型。在许多情况下，非常需要回收少量包含独特分析物或细胞的液滴，以进行进一步分析。
现有几种液滴回收方法是从微孔阵列中选择性回收液滴。回收方法高度依赖于动态监控或液滴孵育的捕获方法。在所谓的“豆荚式”设备中，液滴被引导通过并被物理捕获在波纹状通道中，如果不在每个液滴中使用某种类型的条形码或标签，则无法进行选择性回收。如果表型很少，则从条形码中进行事后选择是无效的。对于具有通过密度差捕获液滴的微孔阵列设备，只需将设备翻转即可释放液滴。但是，此方法是非特定的，并且无法进行选择性释放。目前，选择性回收液滴的最有效方法是基于使用气动阀的机械驱动。机械驱动可以以相当大的精度和精确度捕获和释放二维和三维阵列中的液滴。但是，该方法的适用性可能受到以下事实的限制：阀的数量必须至少与微孔的数量匹配。这将需要相当复杂的设备制造过程，并且还需要复杂的设备来控制压力，并将压力传递至必要的一组阀以实现选择性释放。由于这些限制，基于这种方法的捕获和选择性释放能力被限制在几百个，而包括稀有细胞表型在内的许多高通量应用则需要监测至少几千个液滴。
现有通过微流控设备中，集成光敏聚合物层使光从静态微孔阵列中选择性的释放液滴。该光敏层放置在捕获大量液滴的微孔阵列和带有或不带有可用于回收的顶部流动通道的PDMS平板之间。通过使用聚焦光局部加热来诱导气泡以选择性地向下推动释放液滴。然而上述方法在芯片制作时需要复杂的制作步骤，限制了工业化大规模的生产。
发明内容
为了解决现有液滴回收方法存在芯片制作复杂，或者需气阀控制，难以形成高通量液滴阵列，以及难以选择性释放目标液滴的技术问题，本发明提供了一种基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片及方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片，其特殊之处在于：包括键合在一起的下载体和上载体；
所述下载体的上表面设置有至少一个进样口、微流道结构和一个出样口，
所述微流道结构包括入口流道、微腔室阵列和出口流道；
所述微腔室阵列包括多个平行设置的微流道以及设置在微流道两侧的多个微腔室；
所述微腔室包括腔室以及连接腔室和微流道的喉部；
所述进样口通过入口流道与每个微流道连通；
所述每个微流道通过出口流道与出样口连通；
所述上载体的下表面镀有金属材质层，上载体上设置有与出样口相对的通孔，用作蓄油池。
进一步地，所述微流道两侧的微腔室沿微流道中心线方向错位设置。
进一步地，所述金属材质层的材质为ITO或金或银或铝，厚度为10纳米～10微米。
进一步地，所述金属材质层的厚度为50纳米～150纳米。
进一步地，所述腔室为圆形结构或矩形结构或葫芦型结构；
所述通孔的直径为3mm～10mm。
进一步地，所述上载体的材质为玻璃或石英或氟化钙或聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯；
所述下载体的材质为玻璃或石英或聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯。
进一步地，所述上载体的材质为玻璃；所述下载体的材质为聚二甲基硅氧烷。
进一步地，所述下载体为PDMS高聚物，PDMS高聚物为PDMS单体与固化剂的混合物，厚度为1mm～10mm。
同时，本发明还提供了使用上述基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片制备微量液滴阵列并选择性导出液滴的方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
1)液滴阵列生成
1.1)利用流体驱动装置将水相液体通过微流控芯片的进样口进入微流道，使得水相液体完全充满微腔室，停止水相液体进入；
1.2)利用流体驱动装置将油相液体通过微流控芯片的进样口进入微流道，微腔室中的水相液体不会被油相液体挤出，形成水相液滴阵列；
2)液滴的选择性取出
通过显微镜成像观察到水相液滴目标后，通过激光的光热效应，在微腔室内产生气泡将水相液滴挤出腔室；
3)液滴的导出
在流动的油相液体带动下，挤出微腔室的目标水相液滴会流动到出样口，使用移液枪枪头将目标水相液滴吸入到枪头中。
进一步地，步骤1.1)中，所述流体驱动装置为注射泵或重力驱动装置；
步骤2)中，所述激光波长为1064nm，激光能量为100毫瓦-2000毫瓦。
与现有技术相比，本发明的优点是：
1、本发明基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片制作简单，其上设有微腔室阵列，具有高通量的特点。
2、本发明通过使用聚焦光局部加热来诱导产生气泡，将水相液滴挤出腔室，使用流动的油相液将目标水相液滴挤出出样口，并通过枪头吸入目标液滴，可实现目标单液滴的选择性释放、且微量液滴的操控方式简便。
附图说明
图1是本发明基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片结构示意图；
图2是本发明基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片中下载体结构示意图；
图3是本发明基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片中上载体结构示意图；
图4是本发明基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片中一个微流道结构示意图，其中图a、b、c、d分别为4种腔室结构形式；
图5是本发明方法中液滴浓缩后芯片截面示意图；
图6是本发明方法中液滴取出原理示意图；
图7是本发明方法中激光位点的区域示意图；
其中，附图标记如下：
1-下载体，11-进样口，12-出样口，13-入口流道，14-微腔室阵列，141-微流道，142-微腔室，1421-腔室，1422-喉部，15-出口流道；
2-上载体，21-金属材质层，22-通孔；
31-水相液体，32-油相液体，33-气泡，34-激光，35-激光点位置。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明的内容作进一步详细描述。
如图1至图3所示，一种基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片由上层带有微流道结构的下载体1和下层镀有一层金属材质层21的上载体2键合形成。
如图2所示，下载体1的上表面设置有一个进样口11、所述微流道结构和一个出样口12，微流道结构包括入口流道13、微腔室阵列14和出口流道15；微腔室阵列14包括多个平行设置的微流道141以及设置在每个微流道141两侧的多个微腔室142；每个微流道141两侧的微腔室142沿微流道141中心线方向错位设置，微腔室142包括腔室1421以及连接腔室1421和微流道141的喉部1422；进样口11通过入口流道13与每个微流道141连通；每个微流道141通过出口流道15与出样口12连通；进样口11进行液体的注入，出样口12进行液滴的导出，微腔室阵列14进行液滴的捕获。下载体1材质为玻璃、石英、PDMS(聚二甲基硅氧烷)或PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)，优选地为PDMS。
如图3所示，上载体2的下表面镀有金属材质层21，上载体2上设置有与出样口12相对的通孔22，通孔22的直径为3mm～10mm，用作蓄油池。金属材质层21的材质为ITO、金、银、铝等导电金属材质，优选地为ITO(氧化铟锡)；金属材质层21的厚度为10纳米～10微米，优选为50纳米～150纳米；金属材质层21的载体(即上载体2)材质为玻璃、石英、氟化钙、PDMS(聚二甲基硅氧烷)或PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)，优选地为玻璃。
当激光束聚焦于浸没在液体中的强激光吸收金属材料(例如，金银或者氧化铟锡ITO)时。部分激光能量会被金属吸收并转化为热量，使在金属表面附近的液体温度加热到沸点之后，在金属-液体界面处会产生气泡。基于该光热效应产生气泡原理，本发明提供了一种基于光热效应产生气泡进行微量液滴操控的装置，包括基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片、激光器、显微镜、电脑和流体驱动装置；
流体驱动装置：作为驱动流体进入微流道结构的驱动力来源；流体驱动装置包括注射泵或重力驱动装置；
激光器：用于产生激光；激光器产生的激光波长为1064nm，激光的能量为100毫瓦-2000毫瓦，优选为800毫瓦，此激光能量为激光到达物镜前的能量；
基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片：用于在激光激发和流体驱动装置作用下产生液滴；
显微镜：用于载放基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片和显微成像，其中耦合了电动三维移动平台以及激光激发的光路；
电脑：用于图像呈现观察。
基于上述微量液滴操控的装置，本发明提供了一种基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片制备微量液滴阵列并选择性导出液滴的方法，包括以下步骤：
1)液滴阵列生成
1.1)利用流体驱动装置将水相液体31通过微流控芯片的进样口11进入微流道141，使得水相液体31完全充满微腔室142，停止水相液体31进入；
1.2)利用流体驱动装置将油相液体32通过微流控芯片的进样口11进入微流道141，微腔室142中的水相液体31不会被油相液体32挤出，这样就会形成水相液滴阵列；
2)液滴的选择性取出
通过显微镜成像观察到水相液滴目标后，通过激光产生的光热效应，在微腔室142内产生气泡33将水相液滴挤出腔室1421；
3)液滴的导出
在流动的油相液体32带动下，挤出微腔室142的目标水相液滴会流动到出样口12，使用移液枪枪头将目标水相液滴吸入到枪头中。
实施例一
本实施例提供了一种基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片的制备方法，制备的微流控芯片结构如图1所示，芯片为一体化结构，该制备方法包括以下步骤：
1)制备下载体1和上载体2
下载体1的制备包括：
a)用CAD设计如图1所示微流控芯片的微流道结构，包括入口流道13、微腔室阵列14和出口流道15并进行菲林掩膜打印；
b)将清洗过的硅片滴上SU-8光刻胶进行甩胶，厚度约为40um；后将其覆盖掩膜，在曝光机下进行曝光，并用显影液将未固化部分清洗干净，得到硅片模板。
c)将PDMS单体与固化剂按一定比例混匀，得到PDMS高聚物。将PDMS高聚物倒在硅片模板上，厚约1-10mm，烘干后得到带有微流道结构的PDMS芯片。
d)将带有微流道结构的PDMS芯片上用打孔器打出进样口11和出样口12；
上载体2的制备包括：在载体模板下层键合的是镀有一层ITO的玻璃，玻璃上有一个直径为3-10mm的通孔22作为蓄油池，通孔22和出样口12对应；
2)上下两层打等离子体键合，置于70℃过夜使芯片恢复疏水性，将上载体2扣合在下载体1上，且上载体2上的通孔22与出样口12相对设置，形成基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片。
本实施例中微流道结构可以根据需求调整，图4中示出了4种芯片的微腔室142结构，腔室1421为圆形结构或矩形结构或葫芦型结构，在其它实施例中，腔室1421可根据实际需要进行合理设计和变形。
本实施例二
本实施例提供了一种单细胞液滴的选择性取出，包括以下步骤：
一、实验准备
将过夜培养的细胞取一毫升到离心管里，转速为3000转每分钟离心5分钟，弃上清，加培养基重悬后，梯度稀释100倍，最终浓度约为107个细胞每毫升，吸入注射器中。细胞可为酵母细胞、大肠杆菌细胞或Hela细胞等生物细胞中的一种或多种。
打开显微镜仪器，打开1064激光。
所采用的微流控芯片结构的微腔室142结构如图4中a所示。
二、实验中
2.1液滴阵列的生成
将芯片放入真空泵中抽真空十分钟，使得液体可以完全填充满微阵列。取出后芯片后倒置放入显微镜载物台上，使用注射器流速为2ul/m的流速将细胞通过进样口11泵入微流道141，使液体完全充满微流道141，停止进样，使用含有3％EM90的矿物油，以流速为2ul/m的速度进油形成液滴。
2.2液滴浓缩
生成液滴阵列后，使用含有3％EM90的矿物油，以流速为20ul/m的速度进油二十分钟使得液滴浓缩，使得油相浸润包裹水相如图5所示。调整流速为1ul/m进行进样。
2.3蓄油池清洁
为了防止污染，在进行液滴取出之前，使用无水乙醇将蓄油池冲洗干净后。
2.4液滴选择性取出
使用高倍镜下观察到目标液滴后，调整激光聚焦位置，激光点位置35如图7所示，打开1064激光，如图6所示，激光34产生的气泡33将液滴挤出微腔室阵列14时，关闭激光。
2.5液滴的导出
在油相流动的带动下，挤出腔室1421的液滴会流动到微流道141出口，移动视野到蓄油池，切换到低倍镜，观察到液滴流出后，使用10ul的枪头将液滴导出，取出的液滴可以使用移液器注入到离心管中，进行下游的分析。
实施例三
本实施例提供了一种单细胞液滴的培养和培养后的选择性取出，包括以下步骤：
一、实验准备
将过夜培养的细胞取一毫升到离心管里，转速为3000转每分钟离心5分钟，弃上清，加培养基重悬后，梯度稀释100倍，最终浓度约为107个细胞每毫升，吸入注射器中。
所采用的微流控芯片结构的微腔室142结构如图4中a所示。
二、实验中
2.1)液滴阵列的生成
将芯片放入真空泵中抽真空十分钟，使得液体可以完全填充满微阵列。取出后芯片后倒置放入显微镜载物台上，使用注射器流速为2ul/m的流速将细胞通过进样口11泵入微流道141，使液体完全充满微流道141，停止进样，使用含有3％EM90的矿物油，以流速为2ul/m的速度进油形成液滴。
2.2)液滴培养
将芯片的进样口11和出样口12使用胶带密封后，将芯片放置在细胞适宜的温度和湿度环境下进行培养。培养的时间根据菌株的繁殖时间来确定。
2.3)液滴浓缩
取出芯片后，将芯片倒置放置在显微镜上，使用含有3％EM90的矿物油，以流速为20ul/m的速度进油二十分钟使得液滴浓缩，使得油相浸润包裹水相如图5所示。调整流速为1ul/m进行进样。
2.4)蓄油池清洁
为了防止污染，在进行液滴取出之前，使用无水乙醇将蓄油池冲洗干净后。
2.5)液滴选择性取出
使用高倍镜下观察到细胞生长的液滴后，调整激光聚焦位置，激光点的位置如图7所示，打开1064激光，激光产生的气泡33将液滴挤出微腔室阵列14时，关闭激光。
2.6)液滴的导出
在油相流动的带动下，挤出腔室1421的液滴会流动到微流道141出口，移动视野到蓄油池，切换到低倍镜，观察到液滴流出后，使用10ul的枪头将液滴导出，取出的液滴可以使用移液器注入到离心管中，进行下游的分析。
以上仅是对本发明的优选实施方式进行了描述，并不将本发明的技术方案限制于此，本领域技术人员在本发明主要技术构思的基础上所作的任何公知变形都属于本发明所要保护的技术范畴。
Claims (9)
1.一种制备微量液滴阵列并选择性导出目标微量液滴的方法，使用基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片，其特征在于：
所述基于光热效应进行微量液滴操控的微流控芯片包括键合在一起的下载体(1)和上载体(2)；
所述下载体(1)的上表面设置有至少一个进样口(11)、微流道结构和一个出样口(12)，
所述微流道结构包括入口流道(13)、微腔室阵列(14)和出口流道(15)；
所述微腔室阵列(14)包括多个平行设置的微流道(141)以及设置在微流道(141)两侧的多个微腔室(142)；
所述微腔室(142)包括腔室(1421)以及连接腔室(1421)和微流道(141)的喉部(1422)；
所述进样口(11)通过入口流道(13)与每个微流道(141)连通；
所述每个微流道(141)通过出口流道(15)与出样口(12)连通；
所述上载体(2)的下表面镀有金属材质层(21)，上载体(2)上设置有与出样口(12)相对的通孔(22)，用作蓄油池；
包括以下步骤：
1)液滴阵列生成
1.1)利用流体驱动装置将水相液体(31)通过微流控芯片的进样口(11)进入微流道(141)，使得水相液体(31)完全充满微腔室(142)，停止水相液体(31)进入；
1.2)利用流体驱动装置将油相液体(32)通过微流控芯片的进样口(11)进入微流道(141)，微腔室(142)中的水相液体(31)不会被油相液体(32)挤出，形成水相液滴阵列；
2)液滴的选择性取出
通过显微镜成像观察到水相液滴目标后，通过激光(34)的光热效应，在微腔室(142)内产生气泡(33)将水相液滴挤出腔室(1421)；
3)液滴的导出
在流动的油相液体(32)带动下，挤出微腔室(142)的目标水相液滴会流动到出样口(12)，使用移液枪枪头将目标水相液滴吸入到枪头中。
2.根据权利要求1所述一种制备微量液滴阵列并选择性导出目标微量液滴的方法，其特征在于：步骤1.1)中，所述流体驱动装置为注射泵或重力驱动装置；
步骤2)中，所述激光波长为1064nm，激光能量为100毫瓦-2000毫瓦。
3.根据权利要求1或2所述一种制备微量液滴阵列并选择性导出目标微量液滴的方法，其特征在于：所述微流道(141)两侧的微腔室(142)沿微流道(141)中心线方向错位设置。
4.根据权利要求3所述一种制备微量液滴阵列并选择性导出目标微量液滴的方法，其特征在于：所述金属材质层(21)的材质为ITO或金或银或铝，厚度为10纳米～10微米。
5.根据权利要求4所述一种制备微量液滴阵列并选择性导出目标微量液滴的方法，其特征在于：所述金属材质层(21)的厚度为50纳米～150纳米。
6.根据权利要求5所述一种制备微量液滴阵列并选择性导出目标微量液滴的方法，其特征在于：所述腔室(1421)为圆形结构或矩形结构或葫芦型结构；
所述通孔(22)的直径为3mm～10mm。
7.根据权利要求6所述一种制备微量液滴阵列并选择性导出目标微量液滴的方法，其特征在于：所述上载体(2)的材质为玻璃或石英或氟化钙或聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯；
所述下载体(1)的材质为玻璃或石英或聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯。
8.根据权利要求7所述一种制备微量液滴阵列并选择性导出目标微量液滴的方法，其特征在于：所述上载体(2)的材质为玻璃；
所述下载体(1)的材质为聚二甲基硅氧烷。
9.根据权利要求8所述一种制备微量液滴阵列并选择性导出目标微量液滴的方法，其特征在于：所述下载体(1)为PDMS高聚物，PDMS高聚物为PDMS单体与固化剂的混合物，厚度为1mm～10mm。
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