CN112723304A

CN112723304A - 微珠芯片及其制备方法

Info

Publication number: CN112723304A
Application number: CN202011465019.5A
Authority: CN
Inventors: 李智; 刘超钧; 许心意
Original assignee: Suzhou Lasso Biochip Technology Co ltd
Current assignee: Suzhou Lasso Biochip Technology Co ltd
Priority date: 2020-12-14
Filing date: 2020-12-14
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2040-12-14
Also published as: CN112723304B

Abstract

本发明涉及生物芯片技术领域，具体是一种微珠芯片及其垂直沉降制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：A、疏水处理单晶硅板，B、光刻胶蚀刻，C、垂直沉降法装载二氧化硅微球。采用本发明的垂直沉降法使微珠的入孔率达到98％～99.4％，同时在保证压入率的情况下，尽可能的减少浪费的微珠，提高微珠的利用率，且能将所有没有压入小孔中的微珠100％清除，同时不影响已经固定好的微珠，入孔后稳定性好。

Description

微珠芯片及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物芯片技术领域，具体地说，是一种微珠芯片及其垂直沉降制备方法。

背景技术

相比测序技术而言，高密度生物芯片拥有成本低、检测位点量大、格式统一、分析快等优势。利用生物芯片技术，英国、美国均已建立了大规模人群的基因库。新冠肺炎疫情背景下，欧洲、美国启动了对新冠患者的群体基因组检测，并采用了生物芯片技术，研究基因和新冠易感性之间的关系。通过自主研发生物芯片，基因检测成本将大幅下降，可用于广泛的中国人群体基因组检测。

密封的生物芯片中，微结构加工属于常见的技术，在微结构加工中微球随机进入预先加工好的微结构中，并不易人工的控制，因此微球的进入效率是有上限的。微球进入微结构的效率符合泊松分布。因此，常规的微球进入方法存在多种缺点，例如微球进入效率不高，微球不能准确进入微结构的内部等。

中国专利文献CN111269799A公开了一种油封式生物化学芯片制备方法，将生物化学芯片的内表面或者其功能区域进行整体的疏水修饰，然后通入亲水性的微球，通过化学或者物理方式将微球连接在生物化学芯片的预先加工好的微坑内。油封式的生物化学芯片不需要对于芯片的内表面进行区分性的化学修饰，通过亲水性的微球代替了原来的区分化学修饰的技术，简化了芯片的生产步骤，提高了成品率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微珠芯片及其垂直沉降制备方法，利用毛细吸引力促使微球固定在预先加工好的小孔内，已解决现有技术中微珠入孔率低、利用率低的技术问题。

本发明的第一方面，提供一种微珠芯片的垂直沉降制备方法，包括以下步骤：

A、疏水处理单晶硅板：在单晶硅板上镀一层致密的氮化硅(SiN)层或镁合金层，厚度约为0.1um～10um；

B、蚀刻：利用光刻胶将掩膜板上的图案转移到步骤A疏水处理的单晶硅板表面后，利用等离子蚀刻技术再一次将光刻胶表面的图案转移到氮化硅层，使得图案下的单晶硅板直接暴露到空气中，再利用化学方法将硅板表面多余的光刻胶洗净；

C、装载二氧化硅微球：

固体二氧化硅微球注入超纯水中，经过超声分散配制成浓度0.1mg/mL～20mg/mL(优选5mg/mL)的单分散的二氧化硅胶体溶液；

将单晶硅板，垂直插入盛有二氧化硅胶体溶液的容器当中，使得单晶硅板整个没入在二氧化硅胶体溶液中；加热至50℃～88.3℃；并等待液面下降至芯片表面没有蚀刻小孔的高度；将硅板取出，漂洗，干燥。

进一步的，所述的步骤A中，氮化硅层或镁合金层的厚度优选为1um～5um(保持平面平滑)；更优选为1um。在单晶硅板上镀氮化硅层或镁合金层的原因是降低硅板表面的亲水性，效果是使亲水的带寡核苷酸链的二氧化硅微球不易附着在硅板表面未有刻蚀的部分。

进一步的，所述的步骤B中，将蚀刻完毕的硅板用大量的去离子水荡洗三次后，再用分析纯的乙醇洗净清洗表面三次，用氮气(99.99％纯)风干后备用。

进一步的，所述的步骤C中，将单晶硅板垂直插入盛有二氧化硅胶体溶液的容器当中，使毛细压力的作用方向垂直于平面表面，能够使微球受到垂直于小孔的力，提高微球入孔率。当装置内溶剂蒸发时，液体表面慢慢从硅板降落，二氧化硅微球在毛细压力的作用下，在硅板表面自组装为六角形周期排列结构，但由于非小孔部分表面附有氮化硅疏水层，故微球不易附着在氮化硅层表面，而落于小孔上方的微球在毛细压力的作用下会被压入孔中。重复该操作2-3次可以大大提高微珠的入孔率。

进一步的，所述的步骤C中，加热至50℃～88.3℃，常温常压下在此温度范围内超纯水不产生气泡，且能够加快溶剂的挥发速度，从而加速微球自组装的速度。更优选65℃。

进一步的，所述的步骤C中，超声分散功率80W，时间2h。

进一步的，所述的步骤C中，单晶硅板需裁剪成标准载玻片大小75mm*25mm*1.00mm。

进一步的，所述的步骤C中，将所述的二氧化硅胶体溶液放置在磁力搅拌容器中，保持溶液流速2rpm～20rpm使得溶液中的二氧化硅微球保持均匀分布在溶液中，不会沉底；将该装置放置于用于防震动的气垫上，避免房间内的震动传导到该装置。

进一步的，所述的步骤C中，将单晶硅板整个没入在二氧化硅胶体溶液中后，在该装置外用一大烧杯罩住用于防止气流影响和隔绝灰尘。

进一步的，所述的步骤C中，将取出的硅板，用大量去离子水漂洗后再用分析纯的乙醇漂洗，并用氮气干燥。

进一步的，重复步骤C数次(3次)。

进一步的，所述的步骤C中，固体二氧化硅微球为共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球，其制备方法包括以下步骤a-c：

a.二氧化硅微球表面修饰氨基

将二氧化硅微球配制成10mg/mL～200mg/mL的二甲苯悬浮液；加入硅烷化试剂，硅烷化试剂在混合液中的体积浓度为10％以下，充分反应，使二氧化硅微球表面修饰上氨基；

b.激活二氧化硅微球

将步骤A获得的表面修饰上氨基的二氧化硅微球悬浮在乙腈中，微球的质量浓度为10mg/mL～200mg/mL；加入二异丙基乙胺和三聚氰氯，摇晃反应；用乙腈清洗去除多余反应物，再让二氧化硅微球悬浮在硼酸钠缓冲液中，调pH值至7.5～8.5；

c.二氧化硅微球共价连接寡核苷酸链

将100nmol待连接的寡核苷酸链干粉用2M的氯化钠溶液溶解，与步骤B获得的二氧化硅微球硼酸钠悬浮液混合，其中二氧化硅微球含量为10～100mg，震荡反应5～8小时后进行1000～3000rpm离心处理，保留上清液；清洗、干燥。

进一步的，所述的步骤a中，二氧化硅微球粒径为500nm～5um(优选3um)。微球的CV<5.0％。

进一步的，所述的步骤a中，二氧化硅微球配制成100mg/mL的二甲苯悬浮液。当微球浓度低于10mg/mL时，反应体积较大，寡核苷酸链的浓度相应较低，偶联效率大幅降低，若要达到相同或相似的效果，需要加入过量的寡核苷酸链，造成浪费；当微球浓度大于200mg/mL时，微球悬浮液接近胶状，较难进行混匀等操作。

进一步的，所述的步骤a中，硅烷化试剂选自3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷。本发明采用硅烷化试剂使二氧化硅微球硅烷化后表面带上氨基，再通过三聚氰氯作为连接物偶联上寡核苷酸链，通过氨基连接比巯基更稳定。

进一步的，所述的步骤a中，硅烷化试剂在混合液中的浓度为0.1％～2.5％。

进一步的，所述的步骤b中，微球的质量浓度为100mg/mL。

进一步的，所述的步骤b中，混合液中二异丙基乙胺浓度为0.3M，三聚氰氯浓度为0.1M。步骤b中选择二异丙基乙胺和三聚氰氯活化氨基的原因：二异丙基乙胺为催化剂，三聚氰氯为实际连接物，选择其原因为三聚氰氯上的Cl活性高，易与寡核苷酸链发生缩合，反应产物也较稳定。

进一步的，所述的步骤b中，硼酸钠缓冲液浓度为0.05M～2M。微球悬浮液选择硼酸钠缓冲液是为了保证pH值，使反应在弱碱性环境发生，以利于寡核苷酸链与微球的连接反应，同时保护寡核苷酸链碱基内部的氨基不受影响。发明人尝试过氯化钠溶液，中性环境，连接效果较差；尝试过Tris缓冲液，弱碱性环境，连接效果差，荧光强度很弱，分析原因为Tris中有活性强的氨基，与寡核苷酸链竞争，抢占了可连接的位置。

进一步的，所述的步骤c中，寡核苷酸链的长度为10mer～200mer，末端修饰氨基。低于10mer的太短不稳定，高于200mer的合成上有难度，同时太长会有更多二级结构，也不利于偶联。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球制备方法包括以下步骤：

a.二氧化硅微球表面修饰氨基

原材料为表面带硅羟基的实心二氧化硅微球，粒径3um，将其配制成100mg/mL的二甲苯悬浮液。加入能使其表面氨基化的硅烷化试剂(3-氨丙基三甲氧基硅烷)，硅烷化试剂在在混合液中的浓度为1.0％。将混合液在室温下摇晃1小时，充分反应完成后，微球表面会带上氨基。

b.激活二氧化硅微球

将表面带氨基的微球悬浮在乙腈中，微球的质量浓度为100mg/mL。加入二异丙基乙胺和三聚氰氯，混合液中二异丙基乙胺浓度为0.3M，三聚氰氯浓度为0.1M，将混合液在室温下摇晃1小时，三聚氰氯与微球表面的氨基发生缩合反应，使微珠表面基团活性大大增强。用乙腈清洗3～5次去除多余反应物和产物后，再用2M的硼酸钠缓冲液冲洗3～5次，最后让微球悬浮在硼酸钠缓冲液中，加入适量盐酸将悬浮液的pH值调整至7.5～8.5。

c.二氧化硅微球共价连接寡核苷酸链

将100nmol待连接的寡核苷酸链干粉用2M的氯化钠溶液溶解，将其与适量硼酸钠微球悬浮液混合，其中微球含量为50mg，将混合液在室温下震荡5～8小时，使寡核苷酸链与微球充分接触，并与微球表面的活性基团发生反应。连接反应完成后，将混合液进行1000～3000rpm离心处理，保留上清液。微球用超纯水清洗3～5次，去除多余的反应物和产物，烘干成干粉形式，储存待用。

将与寡核苷酸链偶联后的微球，与目标物杂交(目标物与寡核苷酸链互补，末端带FAM荧光基团)，从而计算出参与连接反应的寡核苷酸链的量，以及微球与寡核苷酸链的连接效率。经过多次实验验证，连接效率可达到1000～10000个寡核苷酸链/平方微米。

更进一步的，所述的微珠芯片的垂直沉降制备方法包括以下步骤：

A、疏水处理单晶硅板：首先在单晶硅板上镀一层致密的氮化硅(SiN)层，厚度约为1um。

B、蚀刻：利用光刻胶将掩膜板上的图案转移到镀有氮化硅的单晶硅板表面后，利用等离子蚀刻技术再一次将光刻胶表面的图案转移到氮化硅层，使得图案下的单晶硅板直接暴露到空气中，后利用化学方法将硅板表面多余的光刻胶洗净。将蚀刻完毕的硅板用大量的去离子水荡洗三次后，再用分析纯的乙醇洗净清洗表面三次，用氮气(99.99％纯)风干后备用。

C、装载二氧化硅微球：将一定量单分散的已经与寡核苷酸耦连的固体二氧化硅微球注入分析纯的超纯水中，经过超声分散(2h，80W)配制成一定浓度的单分散的二氧化硅胶体溶液(0.1mg/mL～20mg/mL)。将上述溶液放置在一磁力搅拌容器中，保持一定溶液流速(2rpm～20rpm)使得溶液中的二氧化硅微球保持均匀分布在溶液中，不会沉底。将该装置放置于用于防震动的气垫上，避免房间内的震动传导到该装置。

将单晶硅板裁剪成标准载玻片大小(75mm*25mm*1.00mm)，并将裁减好的硅板垂直插入盛有二氧化硅胶体溶液的容器当中，使得硅板整个没入在二氧化硅胶体溶液中。在该装置外用一大烧杯罩住用于防止气流影响和隔绝灰尘。同时，将该装置内的溶液加热至一定温度(50℃～88.3℃)并等待液面下降至芯片表面没有蚀刻小孔的高度。将硅板取出，用大量去离子水漂洗后再用分析纯的乙醇漂洗，并用氮气干燥。

当装置内溶剂蒸发时，液体表面慢慢从硅板降落，二氧化硅微球在毛细压力的作用下，在硅板表面自组装为六角形周期排列结构，但由于非小孔部分表面附有氮化硅疏水层，故微球不易附着在氮化硅层表面，而落于小孔上方的微球在毛细压力的作用下会被压入孔中。重复上述操作2～3次可以使微珠的入孔率达到98％～99.4％。

本发明的第二方面，提供一种如上所述的制备方法制备得到的微珠芯片。

本发明的第三方面，提供一种如上所述的微珠芯片在制备生物芯片中的应用。

本发明优点在于：

1、采用本发明的垂直沉降法使微球的入孔率达到98％～99.4％。

2、操作流程中的微球溶液可以反复使用，微球溶液在反复使用多次后，通过观察硅板表面微球的入孔率可以算出溶液中已经被消耗微球的质量，通过添加新的固体微球，可以使得溶液的浓度可以恢复到初始浓度，从而提高微珠的利用率。

3、由于硅板表面的疏水性，依附于硅板非刻蚀部分的微球数量较少，且通过在分析纯乙醇中轻轻漂洗可以去除100％没有压入小孔中的微球，同时不影响已经固定好的微珠，入孔后稳定性好。

附图说明

图1是本发明实施例2制备得到的产品的显微图片；

图2是本发明实施例3制备得到的产品的显微图片；

图3是本发明实施例4制备得到的产品的显微图片；

图4是本发明对比例1制备得到的产品的显微图片；

图5是本发明对比例2制备得到的产品的显微图片；

图6是本发明对比例3制备得到的产品的显微图片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球的制备方法

包括以下步骤：

a.二氧化硅微球表面修饰氨基

b.激活二氧化硅微球

c.二氧化硅微球共价连接寡核苷酸链

将100nmol待连接的寡核苷酸链干粉用2M的氯化钠溶液溶解(寡核苷酸链的长度为15mer，末端修饰氨基)，将其与适量硼酸钠微球悬浮液混合，其中微球含量为50mg，将混合液在室温下震荡5～8小时，使寡核苷酸链与微球充分接触，并与微球表面的活性基团发生反应。连接反应完成后，将混合液进行1000～3000rpm离心处理，保留上清液。微球用超纯水清洗3～5次，去除多余的反应物和产物，烘干成干粉形式，储存待用。

将与寡核苷酸链偶联后的微球，与目标物杂交(目标物与寡核苷酸链互补，末端带FAM荧光基团)，在比相应寡核苷酸链的解链温度低20℃的条件下培育30分钟，检测其荧光强度。检测时微球浓度为2mg/mL，所使用的激发/发射滤光片为488nm/520nm。本发明中提到的所有荧光强度均在上述条件下测得。荧光强度与浓度的换算使用标准曲线(由配制的标准物测荧光值得到)：C＝8.797e-7*I-0.0055。其中C为荧光基团的浓度，单位nmol/mL，I为荧光强度。则由荧光强度可以得到荧光基团浓度，又已知微球的量，从而可以计算得到单位表面积上荧光基团的个数。从而计算出参与连接反应的寡核苷酸链的量，以及微球与寡核苷酸链的连接效率。经过多次实验验证，连接效率可达到约9500～10500个寡核苷酸链/平方微米(微球粒径3um，多次测量荧光强度为40048、42619、39890)。

实施例2：微珠芯片的垂直沉降制备方法

包括以下步骤：

C、装载二氧化硅微球：将单分散的已经与寡核苷酸耦连的固体二氧化硅微球注入分析纯的超纯水中，经过超声分散(2h，80W)配制成浓度0.1mg/mL的单分散的二氧化硅胶体溶液。将上述溶液放置在一磁力搅拌容器中，保持一定溶液流速2rpm使得溶液中的二氧化硅微球保持均匀分布在溶液中，不会沉底。将该装置放置于用于防震动的气垫上，避免房间内的震动传导到该装置。

将单晶硅板裁剪成标准载玻片大小(75mm*25mm*1.00mm)，并将裁减好的硅板垂直插入盛有二氧化硅胶体溶液的容器当中，使得硅板整个没入在二氧化硅胶体溶液中。在该装置外用一大烧杯罩住用于防止气流影响和隔绝灰尘。同时，将该装置内的溶液加热至50℃并等待液面下降至指定高度H(指定高度H指：从H往下的芯片表面没有蚀刻小孔)。将硅板取出，用大量去离子水漂洗后再用分析纯的乙醇漂洗，并用氮气干燥。重复上述操作3次可以使微珠的入孔率达到98％，利用率99％，产品显微图见图1。

实施例3：微珠芯片的垂直沉降制备方法

包括以下步骤：

C、装载二氧化硅微球：将单分散的已经与寡核苷酸耦连的固体二氧化硅微球注入分析纯的超纯水中，经过超声分散(2h，80W)配制成浓度20mg/mL的单分散的二氧化硅胶体溶液。将上述溶液放置在一磁力搅拌容器中，保持一定溶液流速20rpm使得溶液中的二氧化硅微球保持均匀分布在溶液中，不会沉底。将该装置放置于用于防震动的气垫上，避免房间内的震动传导到该装置。

将单晶硅板裁剪成标准载玻片大小(75mm*25mm*1.00mm)，并将裁减好的硅板垂直插入盛有二氧化硅胶体溶液的容器当中，使得硅板整个没入在二氧化硅胶体溶液中。在该装置外用一大烧杯罩住用于防止气流影响和隔绝灰尘。同时，将该装置内的溶液加热至一定温度88.3℃并等待液面下降至指定高度H(指定高度H指：从H往下的芯片表面没有蚀刻小孔)。将硅板取出，用大量去离子水漂洗后再用分析纯的乙醇漂洗，并用氮气干燥。重复上述操作2-3次可以使微珠的入孔率达到98.9％，利用率99％，产品显微图见图2。

实施例4：微珠芯片的垂直沉降制备方法

包括以下步骤：

C、装载二氧化硅微球：将单分散的已经与寡核苷酸耦连的固体二氧化硅微球注入分析纯的超纯水中，经过超声分散(2h，80W)配制成浓度10mg/mL的单分散的二氧化硅胶体溶液。将上述溶液放置在一磁力搅拌容器中，保持一定溶液流速10rpm使得溶液中的二氧化硅微球保持均匀分布在溶液中，不会沉底。将该装置放置于用于防震动的气垫上，避免房间内的震动传导到该装置。

将单晶硅板裁剪成标准载玻片大小(75mm*25mm*1.00mm)，并将裁减好的硅板垂直插入盛有二氧化硅胶体溶液的容器当中，使得硅板整个没入在二氧化硅胶体溶液中。在该装置外用一大烧杯罩住用于防止气流影响和隔绝灰尘。同时，将该装置内的溶液加热至一定温度70℃并等待液面下降至指定高度H(指定高度H指：从H往下的芯片表面没有蚀刻小孔)。将硅板取出，用大量去离子水漂洗后再用分析纯的乙醇漂洗，并用氮气干燥。重复上述操作2-3次可以使微珠的入孔率达到99.3％，利用率99％，产品显微图见图3。

对比例1：

对比例1步骤C中固体二氧化硅微球溶液浓度为0.05mg/mL，其余步骤参数同实施例4。结果微球入孔率为92％，利用率为99％，产品显微图见图4。

对比例2：

对比例2步骤C中微球溶液流速为40rpm，其余步骤参数同实施例4。结果微球入孔率为60％，利用率为99％，产品显微图见图5。

对比例3：

对比例3步骤C中将微球溶液加热到95℃以上，其余步骤参数同实施例4。结果微球入孔率为10％，利用率为50％，产品显微图见图6。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.一种微珠芯片的垂直沉降制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、疏水处理单晶硅板：在单晶硅板上镀一层致密的氮化硅层或镁合金层，厚度0.1um-10um；

C、装载二氧化硅微球：

固体二氧化硅微球注入超纯水中，经过超声分散配制成浓度0.1mg/mL～20mg/mL的单分散的二氧化硅胶体溶液；

将单晶硅板，垂直插入盛有二氧化硅胶体溶液的容器当中，使得单晶硅板整个没入在二氧化硅胶体溶液中；加热至50℃-88.3℃；并等待液面下降至芯片表面没有蚀刻小孔的高度；将硅板取出，漂洗，干燥。

2.根据权利要求1所述的微珠芯片的垂直沉降制备方法，其特征在于，所述的步骤C中，固体二氧化硅微球为共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球，其制备方法包括以下步骤：

a.二氧化硅微球表面修饰氨基

b.激活二氧化硅微球

c.二氧化硅微球共价连接寡核苷酸链

3.根据权利要求2所述的微珠芯片的垂直沉降制备方法，其特征在于，所述的步骤a中，二氧化硅微球粒径为500nm～5um。

4.根据权利要求2所述的微珠芯片的垂直沉降制备方法，其特征在于，所述的步骤a中，硅烷化试剂选自3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷。

5.根据权利要求2所述的微珠芯片的垂直沉降制备方法，其特征在于，所述的步骤a中，硅烷化试剂在混合液中的浓度为0.1％～2.5％。

6.根据权利要求2所述的微珠芯片的垂直沉降制备方法，其特征在于，所述的步骤b中，混合液中二异丙基乙胺浓度为0.3M，三聚氰氯浓度为0.1M。

7.根据权利要求2所述的微珠芯片的垂直沉降制备方法，其特征在于，所述的步骤b中，硼酸钠缓冲液浓度为0.05M～2M。

8.根据权利要求2所述的微珠芯片的垂直沉降制备方法，其特征在于，所述的步骤c中，寡核苷酸链的长度为10mer～200mer，末端修饰氨基。

9.根据权利要求1所述的微珠芯片的垂直沉降制备方法，其特征在于，所述的步骤A中，氮化硅层或镁合金层，厚度为1um～5um。

10.根据权利要求1所述的微珠芯片的垂直沉降制备方法，其特征在于，所述的步骤B中，将蚀刻完毕的硅板用大量的去离子水荡洗三次后，再用分析纯的乙醇洗净清洗表面三次，用氮气风干后备用。

11.根据权利要求1所述的微珠芯片的垂直沉降制备方法，其特征在于，所述的步骤C中，超声分散功率80W，时间2h。

12.根据权利要求1所述的微珠芯片的垂直沉降制备方法，其特征在于，所述的步骤C中，单晶硅板需裁剪成标准载玻片大小75mm*25mm*1.00mm。

13.根据权利要求1所述的微珠芯片的垂直沉降制备方法，其特征在于，所述的步骤C中，将所述的二氧化硅胶体溶液放置在磁力搅拌容器中，保持溶液流速2rpm～20rpm使得溶液中的二氧化硅微球保持均匀分布在溶液中，不会沉底；将该装置放置于用于防震动的气垫上，避免房间内的震动传导到该装置。

14.根据权利要求1所述的微珠芯片的垂直沉降制备方法，其特征在于，所述的步骤C中，将单晶硅板整个没入在二氧化硅胶体溶液中后，在该装置外用一大烧杯罩住用于防止气流影响和隔绝灰尘。

15.根据权利要求1所述的微珠芯片的垂直沉降制备方法，其特征在于，所述的步骤C中，将取出的硅板，用大量去离子水漂洗后再用分析纯的乙醇漂洗，并用氮气干燥。

16.根据权利要求1所述的微珠芯片的垂直沉降制备方法，其特征在于，重复步骤C数次。

17.一种如权利要求1-16任一所述的制备方法制备得到的微珠芯片。

18.一种如权利要求17所述的微珠芯片在制备生物芯片中的应用。