CN116287171A

CN116287171A - 一种基因芯片及其制备方法

Info

Publication number: CN116287171A
Application number: CN202310550898.9A
Authority: CN
Inventors: 张迪鸣; 张云山
Original assignee: Zhejiang Lab
Current assignee: Zhejiang Lab
Priority date: 2023-05-16
Filing date: 2023-05-16
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2043-05-16
Also published as: CN116287171B

Abstract

本申请提供一种基因芯片及其制备方法，涉及生物芯片技术领域。基因芯片的制备方法包括采用光刻法在基板的第一表面形成凹槽阵列区；将混合有微珠的溶液均匀地滴加于凹槽阵列区，并对基板进行封装；将封装后的基板置于超声波装置中，在超声波的条件下进行组装，使微珠进入凹槽阵列区内的凹槽中，制备得到基因芯片。本申请提供的基因芯片的制备方法，微珠在超声波的作用下发生连续震动，不仅可以更均匀地嵌入至基板的各个凹槽内，提高了微珠的入孔率；还能避免微珠多层重叠于基板上，提高了后续的清洗效果。

Description

一种基因芯片及其制备方法

技术领域

本申请涉及生物芯片技术领域，具体而言，涉及一种基因芯片及其制备方法。

背景技术

生物芯片(biochip)技术是80年代发展起来的一门新兴技术，通常生物芯片是以硅片、玻璃或者高分子材料等作为基底材料，并集成有DNA、RNA、多肽、蛋白质等至少一种生物活性物质，然后利用荧光探针或同位素探针与生物活性物质进行杂交，再采用先进的成像设备获取图像信息，从而获取微观数据信息。生物芯片主要有基因芯片（DNA芯片）、蛋白质芯片和组织芯片三大类。其中，基因芯片（DNA芯片）现已经成为一种有效的基础及临床医学研究办法，可以支持一次性检测几万种基因表达水平或者几百万个DNA遗传标记，为科研和临床工作者提供了强大的技术平台。基因芯片是通过检测基底材料与带有荧光标记的DNA探针分子杂交后的信号强弱来获取DNA样品分子的数量和序列信息。

现有的基因芯片的制备方法通常是以硅基板作为基板，在硅基板的表面刻蚀出数十万、数百万甚至上亿的小孔。然后将表面共价偶联有DNA探针的微珠按一定比例混合均匀，随机组装在硅基板上，硅基板上的每个小孔用来容纳一个微珠，最终形成高密度基因芯片。而微珠在硅基板上的组装是基因芯片制备的关键步骤。微珠组装的好坏不仅直接影响到基因芯片的装载密度，更关系到后续检测性能的好坏。因此如何更均匀、稳固、无损地完成微珠的组装，并且适合大规模生产是基因芯片生产制造过程的重难点问题。

发明内容

本申请提供一种基因芯片及其制备方法。该基因芯片的制备方法可以使微珠更均匀地嵌入至基板的各个凹槽内，提高了微珠的入孔率。

具体地，本申请是通过如下技术方案实现的：

本申请一方面提供了一种基因芯片的制备方法，包括：

采用光刻法在基板的第一表面形成凹槽阵列区；

将混合有微珠的溶液均匀地滴加于所述凹槽阵列区，并对所述基板进行封装；将封装后的基板置于超声波装置中，在超声波的条件下进行组装，使微珠进入所述凹槽阵列区内的凹槽中，以制备得到基因芯片。

可选地，所述超声波的功率为80W~120 W，所述组装的时间为10 min ~30 min。

可选地，所述混合有微珠的溶液是通过超声波分散后得到单分散的微珠溶液。

可选地，所述单分散的微珠溶液的浓度为1 mg /mL~5 mg/mL。

可选地，所述单分散的微珠溶液中微珠的粒径为3μm ~5.5 μm，微珠的CV值≤4.0%。

可选地，在所述超声波的条件下进行组装，使微珠进入所述凹槽阵列区内的凹槽中之后，还包括

将组装有微珠的基板置于离心机中，在离心力的作用下进行微珠沉降。

可选地，所述离心机的转速为2000 rpm ~4000 rpm，所述沉降的时间为5 min ~10min。

可选地，在将所述混合有微珠的溶液均匀地滴加于所述凹槽阵列区之前，还包括：

将形成有所述凹槽阵列区的基板嵌入设置于组装模具的安装槽内，使所述基板的第一表面朝向所述安装槽的槽口设置，并在所述凹槽阵列区与所述槽口之间形成容纳空间。

可选地，对所述基板进行封装包括：

先利用载玻片覆盖于所述安装槽的槽口，使所述载玻片和所述安装槽之间没有缝隙或气泡后，再利用封口膜缠绕所述组装模具和所述载玻片，以完成封装。

可选地，将所述封装后的基板置于超声波装置中时，所述载玻片相对于所述组装模具朝向所述超声波装置的顶部设置。

可选地，所述微珠包括二氧化硅微珠和/或聚合物微珠，且所述二氧化硅微珠和/或所述聚合物微珠携带生物探针。

本申请另一方面还提供了一种基因芯片，采用如上述任一所述的基因芯片的制备方法制备得到。

本申请提供的技术方案可以达到以下有益效果：

本申请提供了一种基因芯片及其制备方法，微珠在超声波的作用下发生连续震动，不仅可以更均匀地嵌入至基板的各个凹槽内，提高了微珠的入孔率；还能避免微珠多层重叠于基板上，提高了后续的清洗效果。

附图说明

图1为本申请一示例性实施例示出的基因芯片的制备方法的一种流程图。

图2为本申请一示例性实施例示出的基因芯片的制备方法的另一种流程图。

图3为本申请一示例性实施例示出的组装模具的结构示意图。

图4本申请实验例示出的聚苯乙烯微球FAM探针显色后的荧光显微图像。

图5为本申请实施例1制备得到的基因芯片的荧光显微图像。

图6为本申请实施例2制备得到的基因芯片的荧光显微图像。

图7为本申请实施例3制备得到的基因芯片的荧光显微图像。

图8为本申请实施例4制备得到的基因芯片的荧光显微图像。

图9为本申请实施例5制备得到的基因芯片的荧光显微图像。

图10为本申请实施例6制备得到的基因芯片的荧光显微图像。

图11为本申请实施例7制备得到的基因芯片的荧光显微图像。

图12为本申请实施例8制备得到的基因芯片的荧光显微图像。

图13为本申请实施例2与对比例1-2制备得到的基因芯片的荧光显微图像对比图。

图14为本申请实施例6与对比例1、对比例3制备得到的基因芯片分别进行三次清洗后入孔率的对比结果折线图。

图15为本申请实施例6与对比例3制备得到的基因芯片的荧光显微图像对比图。

具体实施方式

为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本申请提供的基因芯片及其制备方法进行详细说明，本申请的保护范围不受以下实施例的限制。

请参阅图1，本申请提供的基因芯片的制备方法，包括如下步骤：

S1、采用光刻法在基板的第一表面形成凹槽阵列区；

S2、将混合有微珠的溶液均匀地滴加于所述凹槽阵列区，并对所述基板进行封装；将封装后的基板置于超声波装置中，在超声波的条件下进行组装，使微珠进入所述凹槽阵列区内的凹槽中，制备得到基因芯片。

在上述方案中，微珠在超声波的作用下发生连续震动，不仅可以更均匀地嵌入至基板的各个凹槽内，提高了微珠的入孔率；还能避免微珠多层重叠于基板上，提高了后续的清洗效果。

需要说明的是，凹槽阵列区可以包括多个凹槽。其中，凹槽的形状及尺寸不做具体限定，只要满足与微珠的形状相适配以及尺寸相近似即可。例如，凹槽的横截面可以为圆形、椭圆形或三角形等任意图形，但并不限于此。而凹槽的尺寸较小，可以达到微米级别。例如，当微珠的粒径为4.5μm~5.5μm时，凹槽的深度可以为2.5 um～3.5 um。由此，避免凹槽的深度过浅，容易导致微珠组装的不牢固，容易从凹槽内脱出。也避免凹槽的深度过深，进入凹槽内的微球裸露程度过小，不利于清洗或液体孵育等后续实验操作。当然，凹槽的深度也并不限于此，可以根据微珠的粒径大小，进行适应性调整。

“光刻法”是指在光照作用下，借助感光材料 (例如光刻胶)将掩膜版上的图形转移到基板上的方法。在一个实施例中，S1步骤的具体操作流程为：先将光刻胶均匀地旋涂于基板的第一表面，形成厚度均匀的薄膜。烘干光刻胶后，通过光线例如紫外光曝光，使紫外光经过掩模版后将携带有掩模版图案信息的部分光线照射在旋涂有感光材料（例如光刻胶）的基板上，这一过程称为曝光。然后再通过显影试剂将曝光后的光刻胶中与紫外光发生化学反应的部分除去或保留，以将掩模版上的图形复制到光刻胶上，这一过程称为显影。最后再利用ICP刻蚀技术将图形转移到基板上后，去除光刻胶，即在基板的第一表面形成凹槽阵列区。

需要说明的是，旋涂是指依靠基板旋转时产生的离心力及光刻胶自身的重力作用，将落入在基板上的光刻胶更全面且更均匀地涂布于基板的第一表面。通过旋涂的方式更容易获得密度较大的光刻胶薄膜，且薄膜的厚度比较均匀、一致。当然，在其它实施例中，也可以采用其他涂布方式例如刮涂等在基板的表面涂覆一层光刻胶。

掩模版，一般是指在透明材料例如玻璃或石英的表面覆盖一层具有预设图案的金属薄膜例如铬膜，实现对光线的遮挡和透过功能。ICP刻蚀技术是一种被广泛使用的刻蚀技术。例如，可以采用现有的电感耦合等离子体（ICP）刻蚀机生成的高密度等离子体，对基板的第一表面进行轰击，基板第一表面位于图形区域内的材料部分的化学键被打断后，与等离子体生成挥发性物质并从基板的第一表面脱离，以在基板的第一表面刻蚀出永久的凹槽图形。

去除光刻胶，一般是指采用现有的湿法或干法将基板表面的剩余光刻胶去除的过程。具体地，湿法就是利用有机溶剂或者对光刻胶有腐蚀作用的溶液将光刻胶溶解或腐蚀掉，从而达到去胶的目的。干法去胶是利用氧等离子体将光刻胶灰化掉，从而达到去胶的目的。上述过程均为现有已知的技术，在此不做过多赘述。

在一个实施例中，在步骤S1之前，还包括步骤S0：对基板进行预处理。预处理的过程具体可以采用清洗试剂例如丙酮对基板进行清洗之后，再进行干燥处理。通过对基板表面进行清洗，可以去除基板表面的有机杂质、颗粒等污染物，然后再进行干燥处理后，可以提高基板对光刻胶的粘附力。需要说明的是，清洗试剂除了采用丙酮，还可以采用异丙醇等其它溶剂。

在一个实施例中，在S2步骤之后、S3步骤之前，还包括清洗步骤。例如，将S2步骤组装有微珠的基板用去离子水进行清洗两次后，再进行S3步骤。由此，可以尽可能地将未嵌入凹槽内的微珠清洗掉，避免在凹槽外发生重叠，而影响后续的荧光显微图像效果。需要说明的是，上述的清洗次数并不限于此，可以为一次、三次、四次甚至更多。

在一个实施例中，在S3步骤中进行微珠沉降之后还包括清洗步骤，例如采用去离子水清洗三次后，得到基因芯片。由此，可以尽可能地将未嵌入凹槽内的微珠清洗掉，避免在凹槽外发生重叠，而影响后续的荧光显微图像效果。需要说明的是，上述的清洗次数并不限于此，可以为一次、两次、四次甚至更多。

在一个实施例中，所述超声波的功率为80W~120 W，所述组装的时间为10 min ~30min。由此，在一定频率的超声波下，可以防止由于超声波的功率不足而导致微珠的震动幅度过小，使微珠不能尽可能多的嵌入凹槽内，降低了微珠的入孔率；同时也避免因超声波的功率太大，导致微珠的震动幅度过强，使微珠进入凹槽的过程更加剧烈，与凹槽发生摩擦后会更大程度地破坏微珠的表面，而影响后续的数据分析结果的准确性。而将组装的时间设定在合适的范围内有助于节省时间且达到最佳的组装效果。

在一个实施例中，所述混合有微珠的溶液是通过超声波分散后得到的呈单分散状态的微珠溶液。由此，可以使微珠分散地更加均匀，得到微珠粒径均一且大小相一致的微珠溶液。在一个实施例中，超声波分散的功率为70W~ 90W，分散时间为10 min~30 min。由此，可以更高效地使溶液中的微珠分散更均匀。

需要说明的是，配置微珠溶液的试剂可以为超纯水，但并不限于此。

在一个实施例中，所述单分散的微珠溶液的浓度为1 mg /mL~5 mg/mL。由此，在将微珠溶液滴加在凹槽阵列区时，可以保证单位体积（每mL）的微珠溶液中含有一定量的微珠，避免浓度过高不仅使各个微珠之间在超声的作用下相互影响而降低微珠的入孔效率，还造成了微珠的浪费；也避免浓度过低而导致微珠的入孔效率低下。

在一个实施例中，所述单分散的微珠溶液中微珠的粒径为3μm ~5.5 μm，微珠的CV（即粒径变异系数）≤4.0%。由此，可以保证各个微珠之间的粒径更趋于一致。

在一个实施例中，在所述超声波的条件下进行组装，使微珠进入所述凹槽阵列区内的凹槽中之后，还包括将组装有微珠的基板置于离心机中，在离心力的作用下进行微珠沉降。

请参阅图2，本申请提供的基因芯片的制备方法，具体包括如下步骤：

S1、采用光刻法在基板的第一表面形成凹槽阵列区；

S2、将混合有微珠的溶液均匀地滴加于所述凹槽阵列区，并对所述基板进行封装；将封装后的基板置于超声波装置中，在超声波的条件下进行组装，使微珠进入所述凹槽阵列区内的凹槽中；

S3、将组装有微珠的基板置于离心机中，在离心力的作用下进行微珠沉降，制备得到基因芯片。

在上述方案中，微珠先在超声波的作用下发生连续震动，以随机碰撞的形式进入凹槽阵列区内的凹槽中，使微珠组装的更加均匀，提高微珠的入孔率。而嵌入凹槽内的微珠在离心力的作用下，可以进一步增加各个微珠的嵌入深度，这样微珠就不容易从凹槽中脱离，增加微珠的稳固性，同时使嵌入深度达到基本一致，有利于后续的光学成像。

在一个实施例中，所述离心机的转速为2000 rpm ~4000 rpm，所述沉降的时间为5min ~10 min。由此，避免离心力过小导致微珠的嵌入深度不足而容易脱离，也避免离心力过大导致微珠产生变形或碎裂，从而影响后续的数据分析结果的准确性；而将沉降时间设定在合适的范围内有助于节省时间且达到最佳的沉降效果。

在一个实施例中，在将所述混合有微珠的溶液均匀地滴加于所述凹槽阵列区之前，还包括将形成有所述凹槽阵列区的基板嵌入设置于组装模具的安装槽内，使所述基板的第一表面朝向所述安装槽的槽口设置，并在所述凹槽阵列区与所述槽口之间形成容纳空间。由此，可以将混合有微珠的溶液滴加在容纳空间内，这样安装槽的槽壁可以限制微珠溶液的流动，避免微珠溶液流失，提高了微珠溶液的利用率。

在一个实施例中，组装模具包括多个安装槽，可以同时完成多个基因芯片的组装，由此可以提高基因芯片的组装效率。例如，如图3所示，组装模具包括10个安装槽，可同时完成10个基因芯片的组装。具体地，组装模具的长度可以为75 mm，宽度可以为25 mm，厚度可以为3 mm，但并不限于此。其中，安装凹槽的形状与基因芯片中基板的形状相适配，在此不做具体限定。但安装凹槽的深度要大于基因芯片的厚度，例如，安装槽的长度可以为10 mm，宽度可以为10mm，深度可以为2mm。而基板的长度和宽度应与安装槽的长度和宽度相等，但基板的厚度应小于安装槽的深度2mm，例如可以为1mm。将基板放置于安装槽内时，基板的第一表面和槽口之间形成厚度为1mm的容纳空间，用于容纳微珠溶液。当然，安装槽的尺寸和基板的尺寸也并不限于此。

在一个实施例中，对所述基板进行封装包括：先利用载玻片覆盖于所述安装槽的槽口，使所述载玻片和所述安装槽之间没有缝隙或气泡后，再利用封口膜缠绕所述组装模具和所述载玻片，以完成封装。由此，结构简单，易于操作，且进行封装后的基板可以免受外部环境的影响。当然，封装的具体结构和具体操作也并不限于此。

例如，当安装槽的长度为10 mm，宽度为10mm，深度为2mm，且在基板的第一表面和槽口之间形成厚度为1mm的容纳空间时，该空间可容纳150 μL~200 μL的微珠溶液，以确保在盖上载玻片时，位于载玻片之下的液体中不会存留空气，而影响微珠的组装效果。

在一个实施例中，载玻片的长度和宽度与组装模具的长度和宽度对应相等。由此，只需要通过一张载玻片即可覆盖于所有的基因芯片之上。例如，当组装模具的长度为75mm，宽度为25 mm时，载玻片的长度也为75 mm，宽度也为25 mm。而载玻片的厚度可以为1mm，但并不限于此。

其中，载玻片的材质可以选取两面光滑的玻璃材质，但也并不限于此。

在一个实施例中，将所述封装后的基板置于超声波装置中时，所述载玻片相对于所述组装模具朝向所述超声波装置的顶部设置。换句话说，当封装后的基板放入到超声波装置中，应保持载玻片的一侧朝上，即尽可能地使载玻片所在平面的高度高于安装槽的槽口所在平面的高度。由此，在超声波的状态下进行微珠组装的过程中，微珠可以凭借超声波提供的能量以及自身的重力落入凹槽内，大大提升了微珠的组装效率。

需要说明的是，超声波装置可选取现有的超声波清洗机，这样一来，可以将多个组装模具中的多个基因芯片共同完成组装，适用于基因芯片的大规模生产。

在一个实施例中，所述微珠包括二氧化硅微珠和/或聚合物微珠，且所述二氧化硅微珠和/或所述聚合物微珠携带生物探针。由此，便于用先进的成像设备获取图像信息，从而获取微观数据信息。

其中，聚合物包括但不限于聚苯乙烯，生物探针包括但不限于寡核苷酸探针。

以微珠为聚苯乙烯微球共价结合寡核苷酸链为例，其微珠的制备方法如下：

聚苯乙烯微球活化步骤：先将0.1mol PH=3.5的4-吗啉乙磺酸缓冲液（MES）用碱液中和至PH=5~6后，与羧基聚苯乙烯微球配制成1 mg/mL~5 mg/mL的悬浮液；然后加入利用MES配制的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC）溶液和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）溶液，当悬浮液的体系中EDC和NHS的浓度达到10-25 mg/mL后，震荡0.5-2h。

EDC溶液用于活化聚苯乙烯微球上的羧基，而经过EDC活化后的羧基比较容易发生水解，因此需要NHS来稳定，以形成稳定的活泼酯中间体。

聚苯乙烯微球共价结合寡核苷酸链步骤：将5 nmol ~10 nmol待连接的寡核苷酸链干粉用MES缓冲液溶解后，与已活化的聚苯乙烯微球悬浮液混合后，其中聚苯乙烯微球含量为1 mg~5 mg，室温震荡反应4小时，然后利用PBST缓冲液（8 mM Na₂HPO₄，2 mM KH₂PO₄，10mM KCl，140 mM NaCl，0.05%（V/V）Tween-20，pH 7.2~7.4）离心清洗三次（5000 rpm，5 min）后，用超纯水重悬，得到聚苯乙烯微球共价结合有寡核苷酸链的微珠溶液。

由于聚苯乙烯微球的表面修饰羧基，寡核苷酸链的末端修饰氨基，通过氨基与羧基缩合反应形成的酰胺键，稳定性较好，不易断裂。

需要说明的是，寡核苷酸链的长度可以为10 mer~150 mer，但并不限于此。上述过程仅提供了聚苯乙烯微球共价结合寡核苷酸链的制备过程，由于采用二氧化硅微球或其它聚合物微珠共价结合寡核苷酸链的制备过程均属于现有已知的技术，在此不一一做详细的描述。

本申请另一方面还提供了一种基因芯片，采用上述任一所述的基因芯片的制备方法制备得到。

采用本申请提供的基因芯片的制备方法制备得到的基因芯片，在进行后续多次清洗过程后，依然能够维持较高的入孔率。具体可详见如下具体实施例：

实验例

聚苯乙烯微球活化步骤：将预先配置好的PH=6的吗啉乙磺酸缓冲液（MES），与羧基聚苯乙烯微球配制成5 mg/mL的悬浮液；然后加入利用MES配制的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC）溶液和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）溶液，当悬浮液的体系中EDC和NHS的浓度达到25 mg/mL后，震荡1h。

聚苯乙烯微球共价结合寡核苷酸链步骤：将10 nmol待连接的寡核苷酸链干粉用MES缓冲液溶解后，与已活化的聚苯乙烯微球悬浮液混合后，其中聚苯乙烯微球含量为5mg，室温震荡反应4小时，然后利用PBST缓冲液（8 mM Na₂HPO₄，2 mM KH₂PO₄，10 mM KCl，140mM NaCl，0.05%（V/V）Tween-20，pH 7.2~7.4）离心清洗三次（5000 rpm，5 min）后，用超纯水重悬，得到聚苯乙烯微球共价结合有寡核苷酸链的微珠溶液。

杂交探针测试

向0.1 mg聚苯乙烯微球共价结合有寡核苷酸链的微珠溶液中加入100 μL 1 μMPBST缓冲液（8 mM Na₂HPO₄，2 mM KH₂PO₄，10 mM KCl，140 mM NaCl，0.05%（V/V）Tween-20，pH 7.2~7.4）配制的杂交探针溶液(寡核苷酸链，且末端修饰有FAM基团)，使杂交探针溶液中已通过FAM基团修饰的寡核苷酸链与微珠溶液中的寡核苷酸链互补，重悬均匀，室温震荡孵育30 min后，再利用PBST缓冲液（8 mM Na₂HPO₄，2 mM KH₂PO₄，10 mM KCl，140 mM NaCl，0.05%（V/V）Tween-20，pH 7.2~7.4）离心清洗三次（5000 rpm，5 min）。

采用荧光显微镜FAM通道拍摄的图像信息记录如图4所示，在荧光显微镜下，可以明显的看到发出荧光的微珠，由此可以证明聚苯乙烯微球上成功偶联寡核苷酸链。

需要说明的是，下文中各实施例和对比例均以采用上述实验例制备得到的聚苯乙烯微球共价结合有寡核苷酸链的微珠溶液。在组装前将微珠溶液进行离心操作（5000 rpm，5 min）后，去除上清液后即得到聚苯乙烯共价结合寡核苷酸链的微珠。

实施例1

S1、采用光刻法在硅基板（10mm×10mm×1mm）的第一表面形成凹槽阵列区；

S2、将上述聚苯乙烯共价结合寡核苷酸链的微珠注入超纯水中，经过超声分散配制成浓度为1 mg /mL的单分散的微珠溶液；将蚀刻好的硅基板放入组装模具（75mm×25mm×3mm）中的安装槽内（10mm×10mm×2mm），将150 μL单分散的微珠溶液均匀滴加在硅基板的第一表面上，并在组装模具上覆盖载玻片，并确保位于载玻片之下的液体中不会存有空气后，用封口膜缠绕密封后，正面朝上放入超声清洗器中，采用120 W超声组装10 min，用去离子水清洗硅基板表面两次，完成微珠的组装；制备得到基因芯片。

该方法得到的基因芯片，硅基板上微球的入孔率约为94％。基因芯片的荧光显微图像如图5所示。

实施例2

与实施例1的区别在于：配置单分散的微珠溶液的浓度为2 mg /mL，超声组装的时间为15 min，其他制备方法和条件与实施例1相同。

该方法得到的基因芯片，硅基板上微球的入孔率约为96％。基因芯片的荧光显微图像如图6所示。

实施例3

与实施例2的区别在于：配置单分散的微珠溶液的浓度为5 mg /mL，超声组装的时间为30 min，其他制备方法和条件与实施例2相同。

该方法得到的基因芯片，硅基板上微球的入孔率约为95％。基因芯片的荧光显微图像如图7所示。

实施例4

与实施例2的区别在于：采用80 W超声组装10 min。其他制备方法和条件与实施例2相同。

该方法得到的基因芯片，硅基板上微球的入孔率约为92％。基因芯片的荧光显微图像如图8所示。

实施例5

与实施例1的区别在于：在S2步骤之后，还包括S3：将组装有微珠的硅基板正面朝上，放入微孔板离心机中，在离心机的转速为2000 rpm下离心5 min，用去离子水清洗硅基板表面三次，即完成微珠沉降，制备得到基因芯片。其他制备方法和条件与实施例1相同。

该方法得到的基因芯片，硅基板上微球的入孔率约为94％。基因芯片的荧光显微图像如图9所示。

实施例6

与实施例5的区别在于：配置单分散的微珠溶液的浓度为2 mg /mL，超声组装的时间为15 min，在离心机的转速为2000 rpm下离心10 min，其他制备方法和条件与实施例5相同。

该方法得到的基因芯片，硅基板上微球的入孔率约为95％。基因芯片的荧光显微图像如图10所示。

实施例7

与实施例6的区别在于：配置单分散的微珠溶液的浓度为5 mg /mL，超声组装的时间为30 min，在离心机的转速为4000 rpm下离心10 min，其他制备方法和条件与实施例6相同。

该方法得到的基因芯片，硅基板上微球的入孔率约为94％。基因芯片的荧光显微图像如图11所示。

实施例8

与实施例6的区别在于：采用80 W超声组装10 min。其他制备方法和条件与实施例6相同。

该方法得到的基因芯片，硅基板上微球的入孔率约为92％。基因芯片的荧光显微图像如图12所示。

对比例1

普通沉降装载：将上述聚苯乙烯共价结合寡核苷酸链的微珠注入超纯水中，制成10 mg/mL的微珠溶液，然后将150 μL的微珠溶液均匀滴加在硅基板的第一表面上，待溶液挥发后，用去离子水清洗硅基板表面两次，完成微珠的装载，得到基因芯片。

该方法得到的基因芯片，硅基板上微球的入孔率约为80％。

对比例2

离心装载：将上述聚苯乙烯共价结合寡核苷酸链的微珠注入超纯水中，制成10mg/mL的微珠溶液，然后将150 μL的微珠溶液均匀滴加在硅基板的第一表面上，进行封装后放入96孔板离心机中1500 rpm离心10 min，用去离子水清洗硅基板表面两次，装载完成。

对比例3

超声装载：制备方法和条件与实施例3相同，以完成微珠的超声组装。

上述实施例1-4和对比例1制作的基因芯片中微珠的入孔率数据见下表。

表1

由表1的实施例1-4与对比例1对比可以看出，经超声装载得到的基因芯片，装配完成的入孔率均达到92%以上。而对比例1采用普通沉降装载得到的基因芯片在装载完成时的入孔率仅为80%。这表明，微珠在超声波的作用下发生连续震动，以随机碰撞的形式进入凹槽阵列区内的凹槽中，可以使微珠组装的更加均匀，提高微珠的入孔率。

请参阅图13，本申请实施例2提供的经超声装载得到的基因芯片，与对比例1采用普通沉降装载得到的基因芯片相比。本申请的微珠在超声波分散的作用下分散性更好，且微珠在超声波的组装下可以发生连续震动，以随机碰撞的形式进入凹槽阵列区内的凹槽中，可以使微珠组装的更加均匀，提高了微珠的入孔率。本申请实施例2提供的经超声装载得到的基因芯片，与对比例2采用离心装载得到的基因芯片相比。本申请的微珠在超声波的作用下发生连续震动，可以降低微珠多层重叠于基板的概率，避免因离心力过大且方向单一而导致微珠大面积地多层重叠于基板上，从而增加了后续的清洗难度，降低了清洗效果。

另外，对比例2经离心装载制备的基因芯片，由于微珠大面积地多层重叠于基板上，在进行后续清洗中，堆叠于基板上的多层微珠在部分掉落时，容易对已经落入凹槽内的微球中，与聚苯乙烯微球共价结合的寡核苷酸链形成破坏，因此会降低后续获取的微观数据信息的准确性。

将上述实施例5-8和对比例1和对比例3制作的基因芯片进行三次清洗（采用超声波清洗机在功率为80 W的条件下超声清洗3 min）试验后，测试结果见下表。

表2

由表2的实施例5-8与对比例1和对比例3对比可以看出，实施例5-8经超声装载和离心沉降进行稳固后得到的基因芯片在进行多次清洗后，入孔率仍然能够达到89%以上。而对比例3仅采用超声装载得到的基因芯片在进行多次清洗后，入孔率才达到80%。这表明，在超声装载后再进行离心沉降，嵌入凹槽内的微珠在离心力的作用下进行沉降，可以进一步增加各个微珠的嵌入深度，这样微珠就不容易从凹槽中脱离，使微珠的组装更加稳固。

如图14所示，对比例1采用普通沉降装载得到的基因芯片在进行多次清洗后，入孔率从80%下降至50%，大大增加了微珠的损失率。对比例3经超声装载制备得到的基因芯片在进行多次清洗后，入孔率从95%下降至80%，微珠的损失率较小；而由本申请实施例6制备得到的基因芯片在进行多次清洗后，入孔率仅从95%下降至91%，大大降低了微珠的损失率。

由表2的实施例5-8与对比例1对比可以看出，经超声装载和离心沉降进行稳固后得到的基因芯片，装配完成的入孔率均达到92%以上。而对比例1采用普通沉降装载得到的基因芯片在装载完成时的入孔率仅为80%。这表明，微珠在超声波的作用下发生连续震动，以随机碰撞的形式进入凹槽阵列区内的凹槽中，可以使微珠组装的更加均匀，提高微珠的入孔率。

另外，请参阅图15，本申请提供的实施例6经超声装载和离心沉降进行稳固后得到的基因芯片，相比于对比例3仅采用超声装载得到的基因芯片，微珠的亮度更加均匀。这表明在超声装载后再进行离心沉降，嵌入凹槽内的微珠在离心力的作用下，可以进一步增加各个微珠的嵌入深度，使嵌入深度达到基本一致，有利于光学成像，使成像时的亮度更加均匀。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请保护的范围之内。

Claims

1.一种基因芯片的制备方法，其特征在于，包括：

采用光刻法在基板的第一表面形成凹槽阵列区；

2.根据权利要求1所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述超声波的功率为80W~120 W，所述组装的时间为10 min ~30 min。

3.根据权利要求1所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述混合有微珠的溶液是通过超声波分散后得到单分散的微珠溶液。

4.根据权利要求3所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述单分散的微珠溶液的浓度为1 mg /mL~5 mg/mL。

5.根据权利要求3所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述单分散的微珠溶液中微珠的粒径为3μm ~5.5 μm，微珠的CV值≤4.0%。

6.根据权利要求1所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，在所述超声波的条件下进行组装，使微珠进入所述凹槽阵列区内的凹槽中之后，还包括

7.根据权利要求6所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述离心机的转速为2000rpm ~4000 rpm，所述沉降的时间为5 min ~10 min。

8.根据权利要求1至7任一项所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，在将所述混合有微珠的溶液均匀地滴加于所述凹槽阵列区之前，还包括：

9.根据权利要求8所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，对所述基板进行封装包括：

10.根据权利要求9所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，将所述封装后的基板置于超声波装置中时，所述载玻片相对于所述组装模具朝向所述超声波装置的顶部设置。

11.根据权利要求1至7任一项所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述微珠包括二氧化硅微珠和/或聚合物微珠，且所述二氧化硅微珠和/或所述聚合物微珠携带生物探针。

12.一种基因芯片，其特征在于，采用权利要求1至11任一项所述的基因芯片的制备方法制备得到。