CN112717842B - 共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物芯片技术领域，具体是一种共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球及其制备方法。本发明测试了不同激活微球的方法、不同寡核苷酸链、不同供应商微球产品、不同微球浓度、及溶剂下的耦连实验，测算并找到耦连效率最高的实验方法及操作细节，经过多次实验验证，连接效率可达到1000～10000个寡核苷酸链/平方微米，大大节省了制作成本，为后续生物芯片的制作提供了稳定且保存时间长的共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球产品。

Description

共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物芯片技术领域，具体地说，是共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球及其制备方法。
背景技术
相比测序技术而言，高密度生物芯片拥有成本低、检测位点量大、格式统一、分析快等优势。利用生物芯片技术，英国、美国均已建立了大规模人群的基因库。新冠肺炎疫情背景下，欧洲、美国启动了对新冠患者的群体基因组检测，并采用了生物芯片技术，研究基因和新冠易感性之间的关系。通过自主研发生物芯片，基因检测成本将大幅下降，可用于广泛的中国人群体基因组检测。
高密度生物芯片首先需要以二氧化硅微珠作为寡核苷酸探针的固定载体，中国专利文献CN110029150A公开了一种用于检测微小RNA的小分子金属螯合剂标记寡核苷酸探针的制备方法，采用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化偶联羧基氨基的方法，将核酸与二氧化硅微球进行偶联；采用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化偶联羧基氨基的方法，将金属螯合剂与核酸进行偶联；利用氯金酸溶液及柠檬酸钠溶液制备金纳米颗粒，分别配置氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液，在常温下将其混合进行反应制备底物金纳米颗粒；基于序列特异性杂交的微小RNA可视化及定量方法。提供固定分离探针与目标形成夹心结构传感器。并利用上述传感器建立了一种全新的检测miRNA的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种寡核苷酸耦连效率高、成品稳定、保存时间长的共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球的制备方法。
本发明的第一方面，提供一种共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球的制备方法，包括以下步骤：
A.二氧化硅微球表面修饰氨基
将二氧化硅微球配制成10mg/mL～200mg/mL的二甲苯悬浮液；加入硅烷化试剂，硅烷化试剂在混合液中的体积浓度为10％以下，充分反应，使二氧化硅微球表面修饰上氨基；
B.激活二氧化硅微球
将步骤A获得的表面修饰上氨基的二氧化硅微球悬浮在乙腈中，微球的质量浓度为10mg/mL～200mg/mL；加入二异丙基乙胺和三聚氰氯，摇晃反应；用乙腈清洗去除多余反应物，再让二氧化硅微球悬浮在硼酸钠缓冲液中，调pH值至7.5～8.5；
C.二氧化硅微球共价连接寡核苷酸链
将100nmol待连接的寡核苷酸链干粉用2M的氯化钠溶液溶解，与步骤B获得的二氧化硅微球硼酸钠悬浮液混合，其中二氧化硅微球含量为10～100mg，震荡反应5-8小时后进行1000～3000rpm离心处理，保留上清液；清洗、干燥。
进一步的，所述的步骤A中，二氧化硅微球粒径为500nm～5um(优选3um)。微球的CV<5.0％。
进一步的，所述的步骤A中，二氧化硅微球配制成100mg/mL的二甲苯悬浮液。当微球浓度低于10mg/mL时，反应体积较大，寡核苷酸链的浓度相应较低，偶联效率大幅降低，若要达到相同或相似的效果，需要加入过量的寡核苷酸链，造成浪费；当微球浓度大于200mg/mL时，微球悬浮液接近胶状，较难进行混匀等操作。
进一步的，所述的步骤A中，硅烷化试剂选自3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷。本发明采用硅烷化试剂使二氧化硅微球硅烷化后表面带上氨基，再通过三聚氰氯作为连接物偶联上寡核苷酸链，通过氨基连接比巯基更稳定。
进一步的，所述的步骤A中，硅烷化试剂在混合液中的浓度为0.1％～2.5％。
进一步的，所述的步骤B中，微球的质量浓度为100mg/mL。
进一步的，所述的步骤B中，混合液中二异丙基乙胺浓度为0.3M，三聚氰氯浓度为0.1M。步骤B中选择二异丙基乙胺和三聚氰氯活化氨基的原因：二异丙基乙胺为催化剂，三聚氰氯为实际连接物，选择其原因为三聚氰氯上的Cl活性高，易与寡核苷酸链发生缩合，反应产物也较稳定。
进一步的，所述的步骤B中，硼酸钠缓冲液浓度为0.05M～2M。微球悬浮液选择硼酸钠缓冲液是为了保证pH值，使反应在弱碱性环境发生，以利于寡核苷酸链与微球的连接反应，同时保护寡核苷酸链碱基内部的氨基不受影响。发明人尝试过氯化钠溶液，中性环境，连接效果较差；尝试过Tris缓冲液，弱碱性环境，连接效果差，荧光强度很弱，分析原因为Tris中有活性强的氨基，与寡核苷酸链竞争，抢占了可连接的位置。
进一步的，所述的步骤C中，寡核苷酸链的长度为10mer～200mer，末端修饰氨基。低于10mer的太短不稳定，高于200mer的合成上有难度，同时太长会有更多二级结构，也不利于偶联。
更进一步优选的，所述的制备方法包括以下步骤：
A.二氧化硅微球表面修饰氨基
原材料为表面带硅羟基的实心二氧化硅微球，粒径3um，将其配制成100mg/mL的二甲苯悬浮液。加入能使其表面氨基化的硅烷化试剂(3-氨丙基三甲氧基硅烷)，硅烷化试剂在在混合液中的浓度为1.0％。将混合液在室温下摇晃1小时，充分反应完成后，微球表面会带上氨基。
B.激活二氧化硅微球
将表面带氨基的微球悬浮在乙腈中，微球的质量浓度为100mg/mL。加入二异丙基乙胺和三聚氰氯，混合液中二异丙基乙胺浓度为0.3M，三聚氰氯浓度为0.1M，将混合液在室温下摇晃1小时，三聚氰氯与微球表面的氨基发生缩合反应，使微珠表面基团活性大大增强。用乙腈清洗3～5次去除多余反应物和产物后，再用2M的硼酸钠缓冲液冲洗3～5次，最后让微球悬浮在硼酸钠缓冲液中，加入适量盐酸将悬浮液的pH值调整至7.5～8.5。
C.二氧化硅微球共价连接寡核苷酸链
将100nmol待连接的寡核苷酸链干粉用2M的氯化钠溶液溶解，将其与适量硼酸钠微球悬浮液混合，其中微球含量为50mg，将混合液在室温下震荡5～8小时，使寡核苷酸链与微球充分接触，并与微球表面的活性基团发生反应。连接反应完成后，将混合液进行1000～3000rpm离心处理，保留上清液。微球用超纯水清洗3～5次，去除多余的反应物和产物，烘干成干粉形式，储存待用。
将与寡核苷酸链偶联后的微球，与目标物杂交(目标物与寡核苷酸链互补，末端带FAM荧光基团)，从而计算出参与连接反应的寡核苷酸链的量，以及微球与寡核苷酸链的连接效率。经过多次实验验证，连接效率可达到1000～10000个寡核苷酸链/平方微米。
以上步骤和参数共同作用大大提高了连接效率，其中最重要的是硅烷化试剂的浓度和三聚氰氯的浓度，其分别保证了微球表面氨基的密度和连接基团的密度，以用于最终与寡核苷酸链连接。硼酸钠溶液的浓度是为了保证pH值，使反应在弱碱性环境发生，以利于寡核苷酸链与微球的连接反应，同时保护寡核苷酸链碱基内部的氨基不受影响。寡核苷酸链的长度限制主要是从合成可行性上考虑的，低于10mer的太短不稳定，高于200mer的合成上有难度，同时太长会有更多二级结构，也不利于偶联。
本发明的第二方面，提供一种如上所述的制备方法制备得到的共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球。
本发明的第三方面，提供一种如上所述的共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球在制备生物芯片中的应用。
本发明优点在于：
本发明测试了不同激活微球的方法、不同长度寡核苷酸链、不同供应商微球产品、不同微球浓度、及溶剂下的耦连实验，测算并找到耦连效率最高的实验方法及操作细节，经过多次实验验证，连接效率可达到1000～10000个寡核苷酸链/平方微米，大大节省了制作成本，为后续生物芯片的制作提供了稳定且保存时间长的共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球产品。
附图说明
图1.硅烷化试剂浓度对于微球表面氨基密度的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：
本发明的共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球的制备方法，包括以下步骤：
A.二氧化硅微球表面修饰氨基
原材料为表面带硅羟基的实心二氧化硅微球，粒径3um，将其配制成100mg/mL的二甲苯悬浮液。加入能使其表面氨基化的硅烷化试剂(3-氨丙基三甲氧基硅烷)，硅烷化试剂在在混合液中的浓度为1.0％。将混合液在室温下摇晃1小时，充分反应完成后，微球表面会带上氨基。
B.激活二氧化硅微球
将表面带氨基的微球悬浮在乙腈中，微球的质量浓度为100mg/mL。加入二异丙基乙胺和三聚氰氯，混合液中二异丙基乙胺浓度为0.3M，三聚氰氯浓度为0.1M，将混合液在室温下摇晃1小时，三聚氰氯与微球表面的氨基发生缩合反应，使微珠表面基团活性大大增强。用乙腈清洗3～5次去除多余反应物和产物后，再用2M的硼酸钠缓冲液冲洗3～5次，最后让微球悬浮在硼酸钠缓冲液中，加入适量盐酸将悬浮液的pH值调整至7.5～8.5。
C.二氧化硅微球共价连接寡核苷酸链
将100nmol待连接的寡核苷酸链干粉用2M的氯化钠溶液溶解(寡核苷酸链的长度为15mer，末端修饰氨基)，将其与适量硼酸钠微球悬浮液混合，其中微球含量为50mg，将混合液在室温下震荡5～8小时，使寡核苷酸链与微球充分接触，并与微球表面的活性基团发生反应。连接反应完成后，将混合液进行1000～3000rpm离心处理，保留上清液。微球用超纯水清洗3～5次，去除多余的反应物和产物，烘干成干粉形式，储存待用。
将与寡核苷酸链偶联后的微球，与目标物杂交(目标物与寡核苷酸链互补，末端带FAM荧光基团)，在比相应寡核苷酸链的解链温度低20℃的条件下培育30分钟，检测其荧光强度。检测时微球浓度为2mg/mL，所使用的激发/发射滤光片为488nm/520nm。本发明中提到的所有荧光强度均在上述条件下测得。荧光强度与浓度的换算使用标准曲线(由配制的标准物测荧光值得到)：C＝8.797e-7*I-0.0055。其中C为荧光基团的浓度，单位nmol/mL，I为荧光强度。则由荧光强度可以得到荧光基团浓度，又已知微球的量，从而可以计算得到单位表面积上荧光基团的个数。从而计算出参与连接反应的寡核苷酸链的量，以及微球与寡核苷酸链的连接效率。经过多次实验验证，连接效率可达到约9500～10500个寡核苷酸链/平方微米(微球粒径3um，多次测量荧光强度为40048、42619、39890)。
实施例2：
本发明的共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球的制备方法，包括以下步骤：
A.二氧化硅微球表面修饰氨基
原材料为表面带硅羟基的实心二氧化硅微球，粒径500nm，将其配制成10mg/mL的二甲苯悬浮液。加入能使其表面氨基化的硅烷化试剂(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，硅烷化试剂在在混合液中的浓度为2.5％。将混合液在室温下摇晃1小时，充分反应完成后，微球表面会带上氨基。
B.激活二氧化硅微球
将表面带氨基的微球悬浮在乙腈中，微球的质量浓度为10mg/mL。加入二异丙基乙胺和三聚氰氯，混合液中二异丙基乙胺浓度为0.3M，三聚氰氯浓度为0.1M，将混合液在室温下摇晃1小时，三聚氰氯与微球表面的氨基发生缩合反应，使微珠表面基团活性大大增强。用乙腈清洗3～5次去除多余反应物和产物后，再用0.05M的硼酸钠缓冲液冲洗3～5次，最后让微球悬浮在硼酸钠缓冲液中，加入适量盐酸将悬浮液的pH值调整至7.5～8.5。
C.二氧化硅微球共价连接寡核苷酸链
将100nmol待连接的寡核苷酸链干粉用2M的氯化钠溶液溶解(寡核苷酸链的长度为25mer，末端修饰氨基)，将其与适量硼酸钠微球悬浮液混合，其中微球含量为10mg，将混合液在室温下震荡5～8小时，使寡核苷酸链与微球充分接触，并与微球表面的活性基团发生反应。连接反应完成后，将混合液进行1000～3000rpm离心处理，保留上清液。微球用超纯水清洗3～5次，去除多余的反应物和产物，烘干成干粉形式，储存待用。
将与寡核苷酸链偶联后的微球，与目标物杂交(目标物与寡核苷酸链互补，末端带FAM荧光基团)，在比相应寡核苷酸链的解链温度低20℃的条件下培育30分钟，检测其荧光强度。检测时微球浓度为2mg/mL，所使用的激发/发射滤光片为488nm/520nm。本发明中提到的所有荧光强度均在上述条件下测得。荧光强度与浓度的换算使用标准曲线(由配制的标准物测荧光值得到)：C＝8.797e-7*I-0.0055。其中C为荧光基团的浓度，单位nmol/mL，I为荧光强度。则由荧光强度可以得到荧光基团浓度，又已知微球的量，从而可以计算得到单位表面积上荧光基团的个数。从而计算出参与连接反应的寡核苷酸链的量，以及微球与寡核苷酸链的连接效率。经过多次实验验证，连接效率可达到3700～4000个寡核苷酸链/平方微米。(微球粒径500nm，多次测量荧光强度83798、76548、88933)
实施例3：
本发明的共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球的制备方法，包括以下步骤：
A.二氧化硅微球表面修饰氨基
原材料为表面带硅羟基的实心二氧化硅微球，粒径1um，将其配制成200mg/mL的二甲苯悬浮液。加入能使其表面氨基化的硅烷化试剂(3-氨丙基三甲氧基硅烷)，硅烷化试剂在在混合液中的浓度为0.1％。将混合液在室温下摇晃1小时，充分反应完成后，微球表面会带上氨基。
B.激活二氧化硅微球
将表面带氨基的微球悬浮在乙腈中，微球的质量浓度为200mg/mL。加入二异丙基乙胺和三聚氰氯，混合液中二异丙基乙胺浓度为0.3M，三聚氰氯浓度为0.1M，将混合液在室温下摇晃1小时，三聚氰氯与微球表面的氨基发生缩合反应，使微珠表面基团活性大大增强。用乙腈清洗3～5次去除多余反应物和产物后，再用1M的硼酸钠缓冲液冲洗3～5次，最后让微球悬浮在硼酸钠缓冲液中，加入适量盐酸将悬浮液的pH值调整至7.5～8.5。
C.二氧化硅微球共价连接寡核苷酸链
将100nmol待连接的寡核苷酸链干粉用2M的氯化钠溶液溶解(寡核苷酸链的长度为15mer，末端修饰氨基)，将其与适量硼酸钠微球悬浮液混合，其中微球含量为100mg，将混合液在室温下震荡5～8小时，使寡核苷酸链与微球充分接触，并与微球表面的活性基团发生反应。连接反应完成后，将混合液进行1000～3000rpm离心处理，保留上清液。微球用超纯水清洗3～5次，去除多余的反应物和产物，烘干成干粉形式，储存待用。
将与寡核苷酸链偶联后的微球，与目标物杂交(目标物与寡核苷酸链互补，末端带FAM荧光基团)，在比相应寡核苷酸链的解链温度低20℃的条件下培育30分钟，检测其荧光强度。检测时微球浓度为2mg/mL，所使用的激发/发射滤光片为488nm/520nm。本发明中提到的所有荧光强度均在上述条件下测得。荧光强度与浓度的换算使用标准曲线(由配制的标准物测荧光值得到)：C＝8.797e-7*I-0.0055。其中C为荧光基团的浓度，单位nmol/mL，I为荧光强度。则由荧光强度可以得到荧光基团浓度，又已知微球的量，从而可以计算得到单位表面积上荧光基团的个数。从而计算出参与连接反应的寡核苷酸链的量，以及微球与寡核苷酸链的连接效率。经过多次实验验证，连接效率可达到约2300个寡核苷酸链/平方微米。(微球粒径1um，多次测量荧光强度为29421、29021、30037)
实施例4：
Hilliard等公开了一种二氧化硅微球偶联寡核苷酸链的方法(Hilliard,Lisa&Zhao,Xiaojun&Tan,Weihong.(2002).Immobilization of Oligonucleotides ontoSilica Nanoparticles for DNA Hybridization Studies.Analytica Chimica Acta-ANAL CHIM ACTA.470.51-56.10.1016/S0003-2670(02)00538-X.)，与本发明相比：
该文献中是使二氧化硅微球硅烷化后表面带上巯基(文中所用硅烷化试剂为3-巯丙基三甲氧基硅烷)，再通过巯基-二巯基交换反应偶联上寡核苷酸链。而本发明使二氧化硅微球硅烷化后表面带上氨基，再通过三聚氰氯作为连接物偶联上寡核苷酸链。虽然都是硅烷化微球，但两者反应路径不同。
该文献中，偶联效果以能检出的目标物(与微球上的寡核苷酸链互补)浓度来衡量，最低能检出5nM。而本发明能检出1nM的目标物。
该文献中，偶联反应需要进行18小时。而本发明只需进行5～8小时就可达到更好的连接效果。
该文献中，偶联后的微球在干粉状态下，4℃环境中稳定保存时间为1周。而本发明中偶联后的微球在干粉状态下，4℃环境中，12周内与带荧光的目标物杂交后亮度无显著变化，也就是说至少能稳定保存12周。(测试数据如下表1，目前仅测试到12周)
表1
时间 刚完成偶联 1周后 2周后 4周后 8周后 12周后
荧光强度 29239 28323 29401 29150 28177 28060
实施例5：对比试验
本实施例考察微球的质量浓度对于偶联寡核苷酸链的二氧化硅微球荧光强度的影响，见表2，表中各组加入微球的量和寡核苷酸链的量固定，分别为100mg和100nmol，但微球的质量浓度不同。偶联条件相同，时间均为8小时。寡核苷酸链长度为50mer，其他制备方法和参数同实施例1。结果显示，当微球浓度低于10mg/mL时，反应体积较大，寡核苷酸链的浓度相应较低，偶联效率大幅降低，若要达到相同或相似的效果，需要加入过量的寡核苷酸链，造成浪费；当微球浓度大于200mg/mL时，微球悬浮液接近胶状，较难进行混匀等操作，因此也不选择此浓度。
表2
微球浓度 5mg/mL 10mg/mL 50mg/mL 100mg/mL 200mg/mL
荧光强度 4688 25032 27756 29239 28250
实施例6：对比试验
本发明采用硅烷化试剂使二氧化硅微球硅烷化后表面带上氨基，再通过三聚氰氯作为连接物偶联上寡核苷酸链，通过氨基连接比巯基更稳定。本实施例考察硅烷化试剂(3-氨丙基三甲氧基硅烷)浓度对于微球表面氨基密度的影响，仅改变硅烷化试剂在混合液中的浓度，其他参数和制备方法同实施例1步骤A，对比试验结果如图1和表3。检测手段为X射线光电子能谱分析，所列结果为N/Si的原子比例，代表了微球表面氨基密度。可以看到当浓度在0.1％～2.5％之间时，氨基密度随浓度增大而增大，根据不同应用需求可选择不同浓度；当浓度高于2.5％之后无明显增多氨基的效果。
表3
硅烷化试剂浓度 N/Si原子比例
0.0001％ 0
0.001％ 0
0.01％ 0
0.1％ 0.0102
0.5％ 0.0156
1％ 0.0501
1.5％ 0.1121
2％ 0.1508
2.5％ 0.2181
3％ 0.2112
3.5％ 0.2094
4％ 0.2082
4.5％ 0.1957
5％ 0.1997
实施例7：对比试验
本发明步骤B中二氧化硅微球悬浮液选择硼酸钠缓冲液是为了保证pH值，使反应在弱碱性环境发生，以利于寡核苷酸链与微球的连接反应，同时保护寡核苷酸链碱基内部的氨基不受影响。发明人尝试过氯化钠溶液，中性环境，连接效果较差；尝试过Tris缓冲液，弱碱性环境，连接效果差，荧光强度很弱，分析原因为Tris中有活性强的氨基，与寡核苷酸链竞争，抢占了可连接的位置。对比试验见表4，本实施例考察不同缓冲液种类对于偶联寡核苷酸链的二氧化硅微球荧光强度的影响，各组微球反应浓度均为100mg/mL，寡核苷酸链长度为50mer，其他参数和制备方法同实施例1。
表4
微球悬浮液选择 2M氯化钠溶液 Tris缓冲液 2M硼酸钠缓冲液
荧光强度 5785 893 29239
实施例8：对比试验
本实施例考察不同寡核苷酸链在最适反应条件下与微球偶联，再与目标物杂交后的荧光强度对比。其他参数和制备方法同实施例1。见表5，结果显示本发明中的连接方法受寡核苷酸链的长度和序列限制小，适用范围较广。
表5
Figure BDA0002814016290000101
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (8)

1.一种共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.二氧化硅微球表面修饰氨基
将二氧化硅微球配制成10mg/mL～200mg/mL的二甲苯悬浮液；加入硅烷化试剂，硅烷化试剂在混合液中的体积浓度为10％以下，充分反应，使二氧化硅微球表面修饰上氨基；所述的二氧化硅微球粒径为500nm～5um；
B.激活二氧化硅微球
将步骤A获得的表面修饰上氨基的二氧化硅微球悬浮在乙腈中，微球的质量浓度为10mg/mL～200mg/mL；加入二异丙基乙胺和三聚氰氯，摇晃反应，加入的二异丙基乙胺浓度为0.3M，三聚氰氯浓度为0.1M；用乙腈清洗去除多余反应物，再让二氧化硅微球悬浮在硼酸钠缓冲液中，调pH值至7.5～8.5；
C.二氧化硅微球共价连接寡核苷酸链
将100nmol待连接的寡核苷酸链干粉用2M的氯化钠溶液溶解，与步骤B获得的二氧化硅微球硼酸钠悬浮液混合，其中二氧化硅微球含量为10～100mg，震荡反应5-8小时后进行1000～3000rpm离心处理，保留上清液；清洗、干燥。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤A中，硅烷化试剂选自3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤A中，硅烷化试剂在混合液中的浓度为0.1％～2.5％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤B中，微球的质量浓度为100mg/mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤B中，硼酸钠缓冲液浓度为0.05M～2M。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤C中，寡核苷酸链的长度为10mer～200mer，末端修饰氨基。
7.一种如权利要求1-6任一所述的制备方法制备得到的共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球。
8.一种如权利要求7所述的共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球在制备生物芯片中的应用。
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