CN108165475B - 一种高通量单细胞捕获和排列芯片及方法 - Google Patents

一种高通量单细胞捕获和排列芯片及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高通量单细胞捕获和排列芯片及方法，属于材料与组织工程领域，涉及高通量单细胞的捕获和排列，包括：蛋白渗透作用进行基底表面微图案的制作，膜孔限制作用来高通量捕获和排列单细胞，细胞在复杂微图案上的排布与铺展。本发明可以实现85％以上的单细胞捕获率，实现细胞在规定蛋白图案上的整齐排列和铺展。发明克服了大细胞群体研究时细胞异质性带来的影响，并且方法简单、单细胞捕获率高、拥有适宜的后续培养环境，决定其可应用于单细胞水平上的细胞连接、细胞间相互作用及细胞信号转导等的研究，在细胞工程与组织工程研究中都有着十分重要的作用。

Description

一种高通量单细胞捕获和排列芯片及方法
技术领域
本发明涉及一种高通量单细胞捕获和排列芯片制备方法及捕获和排列方法，属于材料与组织工程领域，涉及膜孔法和微图案法结合进行单细胞的捕获和排列的研究，可解决大细胞群体间细胞异质性带来的影响，后续单细胞分析在基因组学，转录组学，蛋白质组学和代谢组学等领域都有着举足轻重的作用。
背景技术
传统研究中经常把细胞样品看成是稳定和均一的，忽略了细胞间异质性带来的影响。实验表明细胞样品的平均反应不能准确的反应细胞个体的准确状态。所以单细胞的研究至关重要。而单细胞的捕获又是细胞研究的前提，在探测单细胞的生物传感器进行毒理学检测、多功能干细胞的正常分化、肿瘤干细胞的耐药性研究和构建精准的工程化组织等方面单细胞的捕获研究都起着重要作用。
现有的单细胞捕获研究主要集中在利用微流控技术、微接触印刷技术、微孔法及其改进方法进行单细胞捕获，但是现有方法固有的限制总会使其有或多或少的缺陷。比如微流控技术有样品反应快且节约样品，占用较少体积，高通量等的优点。但是缺点也十分明显，比如，单细胞捕获率较低以及无法实现多细胞排列，系统较为复杂且操作有一定难度等。比如Ye的研究中利用毛细微塑法进行单细胞的捕获，捕获率只有43.4％。在之后改进的方法中使捕获更加精确且可形成细胞间的连接但系统较为复杂。微孔法的优点是可以实现高通量的细胞捕获且方法简单，如Soo利用电活性微孔阵列达到95％的单细胞捕获，但是微孔捕获的单细胞由于微孔尺寸的限制，细胞缺乏在同一平面的生长空间，使得细胞在后续培养中只能以细胞为单位在小孔中生长。为了克服孔径较小微孔对细胞形状的束缚，Joong等研究尝试用不同形状的较大尺寸微孔进行单细胞捕获和培养，用来提供足够的空间供细胞的黏附和生长，但是单细胞捕获率降低到62％。微接触印刷技术由于可能实现精确地平面表面图案化所以适用于细胞后续的培养和细胞相互作用的研究，但细胞捕获率仅为36％左右。
微接触印刷技术形成的微图案对细胞后续培养的优势主要表现在由于蛋白的转印在基底上形成亲水和疏水区域，粘附细胞的同时控制细胞的形状和位置，规定细胞的伸展及骨架排布，在干细胞的相关研究中微图案的形状会影响细胞的分化方向，除此之外微图案化也会帮助细胞形成类似于在体的细胞排列。
薄膜孔过滤法因而它的过滤机理主要是筛除作用，吸附效应很小，大多都是用来过滤菌体等研究。
与发明相关的参考文献：
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总之，现有方法具有捕获率低或者无法满足研究细胞相互作用的缺点。
发明内容
本发明技术解决方案：克服现有技术的不足，提供一种高通量单细胞捕获和排列芯片及方法，利用微图案作用及薄膜的滤过作用，在相容性好的PDMS基地上实现了大规模阵列的单细胞捕获，捕获率高，且方法简单价格低廉，可广泛应用于生物医学研究。
本发明技术解决方案：一种高通量单细胞捕获和排列的芯片，包括：
下层为基底，所述基底包括爬片和以一定厚度均匀置于所述爬片上的聚合物材料PDMS；
上层为包含细胞捕获孔和铺展孔的多孔膜，所述多孔膜紧贴在所述基底上，所述细胞捕获孔和所述铺展孔按照特定图案分布在所述多孔膜上且贯通所述多孔膜上下两侧，所述细胞捕获孔的孔径大于悬浮的待捕获细胞的直径且小于所述直径的两倍，所述铺展孔以一定距离的孔间距分布在所述细胞捕获孔周围；
上层多孔膜贴附在下层基底上，滴上细胞外基质粘附蛋白，所述粘附蛋白通过多孔膜的膜孔渗透并粘附在所述基底上，形成粘附蛋白微图案。
所述爬片为生物玻片，玻璃爬片边长8-24mm，厚度0.17mm。
所述聚合物材料为PDMS(聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,简称PDMS)。
所述一定厚度为15μm-1mm。
所述待捕获细胞为不同类型的人体或动物细胞，可根据不同细胞的大小对多孔膜的孔径大小和距离进行调整。所述膜孔可以为方形和圆形，所述细胞捕获孔的边长或孔径大于悬浮的待捕获细胞的直径且小于所述直径的两倍；所述铺展孔可以是方形或圆形，铺展孔边长或直径为3-5μm，距离根据所捕获细胞要求确定。
所述待捕获细胞为多种细胞，所述多种细胞可以包括来自人、哺乳动物或单细胞原生动物的任何贴壁细胞。
所述多孔膜材料为聚对二甲苯(parylene)，多孔膜整体大小根据实验需要，在25mm2-400mm2之间。
还包括根据所述待捕获细胞的大小、形状和分布来设计满足不同需要的所述细胞捕获孔和所述铺展孔在所述多孔膜上分布的所述特定图案。
所述粘附蛋白为介导细胞连接的细胞外基质蛋白：纤维粘连蛋白、层粘连蛋白或胶原蛋白。
本发明的一种高通量单细胞捕获和排列的芯片的制备方法，包括：
(1)用匀胶机将PDMS均匀铺展于爬片上作为基底；
(2)用包含细胞捕获孔和铺展孔的多孔膜，所述多孔膜紧贴在所述基底上，所述细胞捕获孔和所述铺展孔按照特定图案分布在所述多孔膜上且贯通所述多孔膜上下两侧；
(3)在所述多孔膜上滴加包含粘附蛋白的试剂，粘附蛋白经所述细胞捕获孔和所述铺展孔通过所述多孔膜渗透至所述基底上，并在所述基底上形成待捕获细胞铺展的特定图案，清洗所述基底及所述多孔膜。
本发明的一种高通量单细胞捕获和排列的芯片的细胞捕获方法，包括：
(1)对待捕获细胞进行悬浮处理；
(2)将细胞以2×105个/cm2浓度悬浮于芯片上，静置，待细胞落入；
(3)捕获孔后，将多孔膜掀起，继续培养待细胞在铺展图案上铺展，既完成细胞的捕获和铺展。
本发明与现有技术相比的优点在于：
(1)本发明利用微图案作用及薄膜的滤过作用，在相容性好的PDMS基地上实现了大规模阵列的单细胞捕获，捕获率高，且方法简单价格低廉，可广泛应用于生物医学研究。
(2)本发明采用上层多孔膜捕获细胞，细胞粘附后将膜掀起，细胞可在下层PDMS上按照细胞外基质蛋白微图案进行铺展和排列，由于本发明的这个技术特征，可以实现高通量捕获细胞的同时将细胞按照一定的形状、大小和位置排列的目的。
(3)本发明在细胞捕获后将多孔膜掀起，留下的细胞在二维PDMS基质上生长，由于本发明的这个技术特征，可以实现在精确控制细胞几何形状和位置后对细胞连接、通讯等进行研究。
(4)本发明的多孔膜孔径大小，孔径位置的设计都可以随不同细胞大小和不同排列位置要求而改变，由于本发明的这个技术特征，可针对不同细胞不同组织设计蛋白微图案的形状和排列，来研究各种细胞的连接及信号传导等。
附图说明
图1为多孔膜俯视图，附图标记说明：1-捕获孔、2-铺展孔。
图2为本发明流程图。附图标记说明：3-PDMS薄膜、4-生物玻片、5-Parylene C多孔膜、6-纤维粘连蛋白、7-悬浮细胞、8-捕获并铺展的细胞。
图3为本发明方法捕获的单细胞(左)、两个细胞(中)和三个细胞(右)。
图4为本发明方法(上排)与文献9(下排)和文献10(中排)所述方法比较的电镜照片(左列)、纤维粘连蛋白荧光照片(中列)和细胞核荧光照片(右列)。
图5为本发明方法与文献9和文献10所述方法单细胞捕获率的比较统计分析。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。
实施列1：对成肌细胞C2C12的捕获和铺展
(1)根据成肌细胞C2C12悬浮状态直径约14μm设计正方形多孔膜捕获孔1(图1)边长25μm，正方形捕获孔2(图1)边长3μm。
(2)基底制作：PDMS(Sylgard 184)前聚物与交联剂以质量配比为10:1混匀后，用匀胶机4000转/分钟在生物玻片上均匀甩一层15μm厚的PDMS薄膜3(图2)，65℃4小时固化。爬片为生物玻片4(图2)，玻璃爬片直径可为8-24mm，厚度0.17mm，本发明实施例选用直径24mm爬片。
(3)多孔膜制作：多孔膜5(图2)含有细胞捕获孔1和铺展孔2(图1)，捕获细胞可以为不同类型的人体或动物细胞，可根据不同细胞的大小对多孔膜的孔径大小和距离进行调整，细胞捕获孔的孔径大小为悬浮状态细胞的直径的1-2倍。铺展孔直径为3-5μm，距离根据所捕获细胞要求确定。实施例中以成肌细胞C2C12为对象，C2C12细胞悬浮状态直径约14μm，设计捕获孔边长25μm，铺展孔边长3μm，细胞之间距离60μm。多孔膜整体大小根据实验需要，在25mm2-400mm2之间。本实施例所用多孔膜面积为100mm2。多孔膜材料为聚对二甲苯(parylene)，通过淀积光刻作用制作多孔膜。
(4)微图案的制作：用紫外清洗机对基底和多孔膜进行亲水和灭菌处理15分钟，在基底和多孔膜之间滴加无菌水200μL，将多孔膜借助水的导向作用铺展在亲水处理过的PDMS基底上，利用洗耳球将其吹干贴紧。
(5)粘附蛋白图案形成：实验中所用粘附蛋白可以为介导细胞连接的细胞外基质蛋白：纤维粘连蛋白、层粘连蛋白或胶原蛋白，本实施例用纤维粘连蛋白6(图2)。配置无菌25μg/mL的纤维粘连蛋白溶液200μL滴于膜上，静止1h，使蛋白充分渗透。吸走多余纤维粘连蛋白，PBS洗三次。
(6)细胞捕获：将生长状态良好的C2C12细胞经胰酶消化悬浮后，接种2×105个于膜上，静止4h，显微镜观察细胞7(图2)在捕获孔粘附后，小心揭下多孔膜。添加细胞培养基，继续培养细胞。
(7)细胞铺展：在上述培养细胞24h后可发现细胞骨架按照设计铺展孔铺展完全8(图2)，可以进行后续的实验。
(8)细胞捕获和铺展结果，本发明实施例单细胞捕获率为86.2±4.5％(图3中的左图)，两个细胞铺展率为53.4±7.6％(图3中的中间图)，三个细胞铺展率为54.5±1.2％(图3中的右图)。结果表明本发明方法可以实现85％以上单细胞捕获率。
实施例2：对成肌细胞单细胞捕获与现有技术比较。
(1)根据成肌细胞C2C12悬浮状态直径约14μm设计正方形多孔膜捕获孔1(图1)边长25μm，正方形捕获孔2(图1)边长3μm。
(2)基底制作：PDMS(Sylgard 184)前聚物与交联剂以质量配比为10:1混匀后，用匀胶机4000转/分钟在生物玻片上均匀甩一层15μm厚的PDMS薄膜3(图2)，65℃4小时固化。所述爬片为生物玻片4(图2)，玻璃爬片直径可为8-24mm，厚度0.17mm，本实施例选用直径24mm爬片。
(3)多孔膜制作：多孔膜5(图2)含有细胞捕获孔1和铺展孔2(图1)，捕获细胞可以为不同类型的人体或动物细胞，可根据不同细胞的大小对多孔膜的孔径大小和距离进行调整，细胞捕获孔的孔径大小为悬浮状态细胞的直径的1-2倍。铺展孔直径为3-5μm，距离根据所捕获细胞要求确定。实施例中以成肌细胞C2C12为对象，C2C12细胞悬浮状态直径约14μm，设计捕获孔边长25μm，铺展孔边长3μm，细胞之间距离60μm。多孔膜整体大小根据实验需要，在25mm2-400mm2之间。本实施例所用多孔膜面积为100mm2。多孔膜材料为聚对二甲苯(parylene)，通过淀积光刻作用制作多孔膜。
(4)微图案的制作：用紫外清洗机对基底和多孔膜进行亲水和灭菌处理15分钟，在基底和多孔膜之间滴加无菌水200μL，将多孔膜借助水的导向作用铺展在亲水处理过的PDMS基底上，利用洗耳球将其吹干贴紧。
(5)粘附蛋白图案形成：实验中所用粘附蛋白可以为介导细胞连接的细胞外基质蛋白：纤维粘连蛋白、层粘连蛋白或胶原蛋白，本实施例用纤维粘连蛋白6(图2)。配置无菌25μg/mL的纤维粘连蛋白溶液200μL滴于膜上，静止1h，使蛋白充分渗透。吸走多余纤维粘连蛋白，PBS洗三次。
(6)细胞捕获：将生长状态良好的C2C12细胞经胰酶消化悬浮后，接种2×105个于膜上，静止4h，显微镜观察细胞7(图2)在捕获孔粘附后，小心揭下多孔膜。添加细胞培养基，继续培养细胞。
(7)细胞铺展：在上述培养细胞24h后可发现细胞骨架按照设计铺展孔铺展完全8(图2)，进行细胞捕获率的计算。
(8)将生长状态良好的C2C12细胞经胰酶消化悬浮后，接种2×105个于100mm2参考文献9中的组合型微图案上以及传统的简单微图案上(文献10)。培养细胞24h后分别对成肌细胞进行细胞捕获率计算。电镜对多孔膜微图案(图4上排)、组合型微图案(图4下排)和简单微图案(图4中排)结果如图4所示，对于单细胞捕获率分别为：86.2±4.5％，37±5.9％和34±6.7％，如图5。结果表明，本发明比较已有同类方法单细胞捕获率显著增加。
总之，本发明可以实现85％以上的单细胞捕获率，实现细胞在规定蛋白图案上的整齐排列和铺展。发明克服了大细胞群体研究时细胞异质性带来的影响，并且方法简单、单细胞捕获率高、拥有适宜的后续培养环境，决定其可应用于单细胞水平上的细胞连接、细胞间相互作用及细胞信号转导等的研究，在细胞工程与组织工程研究中都有着十分重要的作用。
提供以上实施例仅是为了描述本发明的目的，而并非要限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求限定。不脱离本发明的精神和原理而做出的各种等同替换和修改，均应涵盖在本发明的范围之内。

Claims (9)

1.一种高通量单细胞捕获和排列芯片，其特征在于，包括：
下层为基底，所述基底包括爬片和以一定厚度均匀置于所述爬片上的聚合物材料；所述一定厚度为15μm-1mm；
上层为包含细胞捕获孔和铺展孔的多孔膜，所述多孔膜紧贴在所述基底上，所述细胞捕获孔和所述铺展孔按照特定图案分布在所述多孔膜上且贯通所述多孔膜上下两侧，所述细胞捕获孔的孔径大于悬浮的待捕获细胞的直径且小于所述直径的两倍，所述铺展孔以一定距离的孔间距分布在所述细胞捕获孔周围；所述铺展孔边长或直径为3-5μm，一定距离根据所捕获细胞要求确定；上层多孔膜贴附在下层基底上，滴上细胞外基质粘附蛋白，所述粘附蛋白通过多孔膜的膜孔渗透并粘附在所述基底上，形成粘附蛋白微图案。
2.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述爬片为生物玻片，玻璃爬片边长8-24mm，厚度0.17mm。
3.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述聚合物材料为PDMS。
4.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述待捕获细胞为不同类型的人体或动物细胞，可根据不同细胞的大小对多孔膜的孔径大小和距离进行调整，所述膜孔可以为正方形和圆形，所述细胞捕获孔的边长或孔径大于悬浮的待捕获细胞的直径且小于所述直径的两倍；所述铺展孔是方形或圆形。
5.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于：所述多孔膜的材料为聚对二甲苯(parylene)，多孔膜整体大小范围为25mm2-400mm2。
6.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于：还包括根据所述待捕获细胞的大小、形状和分布来设计满足不同需要的所述细胞捕获孔和所述铺展孔在所述多孔膜上分布的所述特定图案。
7.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述粘附蛋白为介导细胞连接的细胞外基质蛋白：纤维粘连蛋白、层粘连蛋白或胶原蛋白。
8.一种如权利要求1-7任意之一所述高通量单细胞捕获和排列芯片的制备方法，其特征在于，包括：
(1)用匀胶机将PDMS均匀铺展于爬片上作为基底；
(2)用包含细胞捕获孔和铺展孔的多孔膜，所述多孔膜紧贴在所述基底上，所述细胞捕获孔和所述铺展孔按照特定图案分布在所述多孔膜上且贯通所述多孔膜上下两侧；
(3)在所述多孔膜上滴加包含粘附蛋白的试剂，粘附蛋白经所述细胞捕获孔和所述铺展孔通过所述多孔膜渗透至所述基底上，并在所述基底上形成待捕获细胞铺展的特定图案，清洗所述基底及所述多孔膜。
9.一种高通量单细胞捕获和排列芯片的细胞捕获方法，其特征在于，包括：
(1)对待捕获细胞进行悬浮处理；
(2)将细胞以2×105个/cm2浓度悬浮于权利要求1-8任意之一所述芯片上，静置；
(3)待细胞落入捕获孔后，将多孔膜掀起，继续培养待细胞在铺展图案上铺展，既完成细胞的捕获和铺展。
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