JP6714080B2

JP6714080B2 - 微小粒子を内包する三次元薄膜構造体およびその製造方法

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Publication number: JP6714080B2
Application number: JP2018519572A
Authority: JP
Inventors: 哲彦手島; 祐子上野; 智佐々木; 信吾塚田; 中島　寛; 寛中島; 東一郎後藤
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date: 2016-05-24
Filing date: 2017-05-24
Publication date: 2020-06-24
Anticipated expiration: 2037-05-24
Also published as: WO2017204235A1; CN109153961A; EP3447120B1; EP3447120A4; US20190136172A1; JPWO2017204235A1; EP3447120A1; CN109153961B; US20230416665A1

Description

本発明は、高分子薄膜構造体の内部に微粒子を内包した三次元薄膜構造体およびその製造方法に関する。特に、本発明は、接着性細胞を内包化させることにより、接着性細胞の単離培養と輸送操作を可能にした筒状構造体およびその製造方法に関する。
本願は、２０１６年５月２４日に、日本に出願された特願２０１６−１０３３６２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

生体組織由来の細胞を単一細胞レベルで操作する技術は、細胞生物学の基礎的な研究だけでなく、再生医療や創薬スクリーニングなどの幅広い分野で必要とされている。生体内の組織を構成する上皮細胞や神経細胞、肝細胞などの接着性細胞を操作する技術は、セルソータによる細胞の選別・解析だけでなく、生体外において細胞をアセンブルして擬似的な三次元生体組織を構築することにも役立てられている。疑似的な三次元生体組織の構築により、目的の生体組織の動態解析や薬物に対する感受性試験、さらには臓器の再構成や細胞移植のための担体の調製が可能となる。

従来、血球細胞などの浮遊性（非接着性）細胞は、それらが持つ浮遊性という特徴から、マイクロピペットやマイクロ流体デバイスなどの操作技術により、一つ一つ個別の細胞を比較的容易に選別・回収することが可能であった。一方、接着性細胞は、細胞同士または培養基板に接着しなければ生育できないという性質から、一度トリプシンなどの酵素で化学的に細胞を遊離させるか、または物理的に細胞と基板との接着を破壊して遊離させてから操作することが通常行われる。しかし、これらの化学的または物理的な遊離操作により、細胞膜表面マーカの喪失や骨格系の崩壊、および細胞死が誘導されてしまうため、細胞本来の活性を観察し、解析することが困難であった。そのため、細胞の接着状態を維持したまま操作を行うことができる、細胞へのダメージがより少ない操作方法の確立が必要不可欠であった。

近年、微細加工技術を用いて接着性細胞が接着できる微小な動的な基板を製作し、その表面上で細胞を培養して操作する技術が注目されている（非特許文献１）。自己組織的な力を用いて筒状構造体を製作し、その内部に細胞を接着させることにより、細胞の持つ接着性を維持した状態で操作することが可能となった。また、組織のような三次元環境下で細胞の振る舞いを観察することが可能となった（非特許文献２）。上記のような筒状構造体は、フォトリソグラフィ技術などの微細加工プロセスを用いて製作される。そのため、基板の材料や、基板を遊離させる際に用いられる犠牲層の材料には、一般的に、結晶成長や蒸着により形成された金属やシリコン化合物などの無機物質の薄膜が用いられている。このような無機物質の薄膜では、薄膜内に複数種類の元素からなる薄膜層が互いに密着した構造を取っている。そのため、厚み方向の格子定数の勾配により平面膜内に応力分布が発生し、薄膜が屈曲して三次元形状を形成する。

B. Radha, M. Arif, R. Datta, T. K. Kundu, G. U. Kulkarni, Nano Research 2010, 3, 738. W. Xi, C. K. Schmidt, S. Sanchez, D. H. Gracias, R. E. Carazo-Salas, S. P. Jackson, O. G. Schmidt, Nano Letters, 2014, 14, 4197.

しかしながら、金属薄膜は一般的に生体適合性が低いため、細胞を長期間接触させることは困難であり、細胞の接着基板としては好適ではない。また、加工プロセスやリフトオフプロセスにおいて細胞毒性の高いエッチング溶液を用いるため、三次元構造の製作後、基板をよく洗浄する必要があり、洗浄後にその内部に細胞を導入している。そのため、基板を単離した状態で操作することが困難である。加えて、筒状構造体内部への細胞の導入は、筒状構造体内部への細胞の偶発的な侵入に依存しているため、細胞の内包化の成功率が低いという問題があった。

上記事情に鑑み、本発明は、細胞等の微小粒子の導入効率が高く、かつその内部空間で細胞等を長期間培養することが可能な、三次元薄膜構造体を提供することを目的としている。

本発明は、以下の態様を含む。
（１）複数層の高分子膜からなる三次元構造体であって、前記三次元構造体の内部空間に、微小粒子が内包されており、前記複数層の高分子膜の各層が、互いに異なる機械的強度を有する、三次元構造体。
（２）前記複数層の高分子膜の各層が、互いに異なる膨潤率を有する高分子材料で構成されている、（１）に記載の三次元構造体。
（３）前記複数層の高分子膜の各層のうち、前記三次元構造体の外部に接する層が、最も大きい膨潤率を有する高分子材料で構成されている、（１）又は（２）に記載の三次元構造体。
（４）前記複数層の高分子膜の各層が、生体適合性の高い高分子材料で構成されている、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の三次元構造体。
（５）前記微小粒子が細胞である、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の三次元構造体。
（６）前記高分子膜の表面に、さらに、細胞外マトリクスで構成される層を有する、（１）〜（５）のいずれか一項に記載の三次元構造体。
（７）前記高分子膜の厚さが１５〜４００ｎｍである、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の三次元構造体。
（８）前記細胞が、接着性細胞であり、前記高分子膜に接着している、（５）〜（７）のいずれか一項に記載の三次元構造体。
（９）前記三次元構造体が生体組織様構造を有しており、前記細胞が生体組織様構造の細胞塊を形成している、（５）〜（８）のいずれか一項に記載の三次元構造体。
（１０）（５）〜（９）のいずれか一項に記載の三次元構造体と、前記三次元構造体の外部に存在する細胞と、を含み、前記三次元構造体に内包される細胞が、前記三次元構造体の外部へと伸展する構造を形成しており、前記三次元構造体に内包される細胞と前記三次元構造体の外部に存在する細胞との間で、細胞間相互作用が発生し得る、生体組織様構造体。
（１１）微小粒子が内包された三次元構造体を製造する方法であって、複数層の高分子膜を形成する工程（ａ）と、前記複数層の高分子膜の表面上に、微小粒子を浮遊させる工程（ｂ）と、前記複数層の高分子膜に、厚み方向の応力分布を発生させて、前記複数層の高分子膜に自己組織的に三次元構造を形成させる工程（ｃ）と、を含む、三次元構造体の製造方法。
（１２）基板上に犠牲層を形成する工程を、さらに含み、前記工程（ａ）が、前記犠牲層上に、互いに異なる膨潤率を有する高分子材料を積層して、複数層の高分子膜を形成する工程であり、前記工程（ｂ）が、前記複数層の高分子膜に、前記微小粒子を含む懸濁液を添加する工程であり、前記工程（ｃ）が、前記犠牲層を分解して、前記高分子膜を前記基板から遊離させる工程である、（１１）に記載の三次元構造体の製造方法。
（１３）前記微小粒子が細胞である、（１１）又は（１２）に記載の三次元構造体の製造方法。
（１４）さらに、前記高分子膜の表面に、細胞外マトリクスで構成される層を形成する工程を含む、（１１）〜（１３）のいずれか一項に記載の三次元構造体の製造方法。
（１５）前記高分子膜の厚さが１５〜４００ｎｍである、（１１）〜（１４）のいずれか一項に記載の三次元構造体の製造方法。
（１６）基板と、前記基板上に積層された犠牲層と、前記犠牲層上に積層された複数層の高分子膜とを含み、前記複数層の高分子膜の各層が、前記犠牲層を分解して前記高分子膜を前記基板から遊離させた際に、前記高分子膜に厚み方向の応力分布が発生し得る高分子材料で構成されている、積層体。
（１７）前記複数層の高分子膜の各層が、互いに異なる膨潤率を有する高分子材料で構成されている、（１６）に記載の積層体。
（１８）前記高分子膜上に積層された細胞外マトリクスで構成される層を、さらに含む、（１６）又は（１７）に記載の積層体。
（１９）前記高分子膜の厚さが１５〜４００ｎｍである、（１６）〜（１８）のいずれか一項に記載の積層体。

本発明により、細胞等の微小粒子の導入効率が高く、かつその内部空間で細胞等を長期間培養することが可能な、三次元薄膜構造体およびその製造方法が提供される。

本発明の一態様である三次元構造体の斜視図。本発明の一態様である三次元構造体の断面図。膨潤率の異なる二層の高分子薄膜の積層構造による屈曲の概念図。二層構造の薄膜を用いた三次元形状への自己組立てと、細胞の内包化の一態様を示す概念図。微小粒子を内包した三次元薄膜構造体形成のプロセス図の一例。微小粒子を内包した三次元薄膜構造体形成のプロセス図の一例。微小粒子を内包した三次元薄膜構造体形成のプロセス図の一例。微小粒子を内包した三次元薄膜構造体形成のプロセス図の一例。微小粒子を内包した三次元薄膜構造体形成のプロセス図の一例。微小粒子を内包した三次元薄膜構造体形成のプロセス図の一例。微小粒子を内包した三次元薄膜構造体形成のプロセス図の一例。微小粒子を内包した三次元薄膜構造体形成のプロセス図の一例。微小粒子を内包した三次元薄膜構造体形成のプロセス図の一例。微小粒子を内包した三次元薄膜構造体形成のプロセス図の一例。薄膜層の電子顕微鏡像を示す。リソグラフィ技術を用いて形成した薄膜パターンの電子顕微鏡（ＳＥＭ）像である。薄膜層の電子顕微鏡像を示す。リソグラフィ技術を用いて形成した薄膜パターンの電子顕微鏡（ＳＥＭ）像である。薄膜層の電子顕微鏡像を示す。薄膜層を集束イオンビームにより切断加工した後の断面のＳＥＭ像である。薄膜層のエネルギー分散型Ｘ線分析の結果を示す。薄膜層の各層および基板１３のエネルギー分散型Ｘ線分析の結果である。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液添加後の長方形型薄膜の筒状構造への自己組立てを示す。筒状構造への自己組立ての様子を示す位相差顕微鏡像である。薄膜上に細胞がない場合である。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液添加後の長方形型薄膜の筒状構造への自己組立てを示す。筒状構造への自己組立ての様子を示す位相差顕微鏡像である。薄膜上に細胞がある場合である。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液添加後の長方形型薄膜の筒状構造への自己組立てを示す。筒状構造の曲率半径と、パリレン層の厚みとの相関関係を示す。細胞を内包した筒状構造体の顕微鏡像を示す。チャイニーズハムスター由来卵巣（ＣＨＯ）細胞を内包した筒状構造体の位相差顕微鏡像である。細胞を内包した筒状構造体の顕微鏡像を示す。ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞を内包した筒状構造体の位相差顕微鏡像である。細胞を内包した筒状構造体の顕微鏡像を示す。ＣＨＯ細胞を内包した筒状構造体の共焦点顕微鏡像である。細胞を内包した筒状構造体の顕微鏡像を示す。長軸方向の長さが１ｃｍ以上の生体組織様構造体を作製した例である。初代神経細胞を内包した筒状構造体の作製例を示す。初代神経細胞を内包した筒状構造体の培養初期の位相差顕微鏡像である。初代神経細胞を内包した筒状構造体の作製例を示す。初代神経細胞を内包した筒状構造体を長期培養した後の位相差顕微鏡像である。初代神経細胞を内包した筒状構造体の作製例を示す。基板上に移動させた筒状構造体の位相差顕微鏡像である。初代神経細胞を内包した筒状構造体の作製例を示す。基板上に移動させた筒状構造体のＳＥＭ像である。初代神経細胞を内包した筒状構造体の作製例を示す。塩化カリウムを添加して細胞刺激を行った際の筒状構造体の内部と外部の細胞の蛍光強度の変化を観察した共焦点顕微鏡像である。初代心筋細胞を内包した筒状構造体の作製例を示す。初代心筋細胞を内包した筒状構造体を培養して作製されたファイバ状構造体の位相差顕微鏡像である。初代心筋細胞を内包した筒状構造体の作製例を示す。上図は、初代心筋細胞を内包した筒状構造体の位相差顕微鏡像（上）と、初代心筋細胞の拍動時における静止時に対する変化量を示す画像（下）である。画像は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）が提供する画像処理プログラムＩｍａｇｅＪを用いて作成した。下図は、上図で検出された変化量（強度）の経時的変化を示すグラフである。初代心筋細胞を内包した筒状構造体の作製例を示す。上図は、塩化カリウムを添加して細胞刺激を行った際の筒状構造体の内部と外部の細胞の蛍光強度の変化を観察した共焦点顕微鏡像である。下図は、上図で検出された蛍光強度の経時的変化を示すグラフである。様々な二次元形状の薄膜を用いて作製した三次元構造体の作製例をである。放射状の花型模様の形状を有する薄膜から、球体状の把持用グリッパ構造を有する三次元構造体を形成したを作製した例である。様々な二次元形状の薄膜を用いて作製した三次元構造体の作製例である。十字形状を有する薄膜から、十字形状の一方向のみが屈曲してＴ字構造を有する三次元構造体を作製した例である。様々な二次元形状の薄膜を用いて作製した三次元構造体の作製例である。長方形型の薄膜に十字形状の薄膜を繋ぎ合せることによって、ヒト型を模したような屈曲しない関節部位を介した三次元ヒト型構造を有する三次元構造体を作製した例である。様々な二次元形状の薄膜を用いて作製した三次元構造体の作製例である。内部に細孔を形成した薄膜から三次元構造体を作製した例である。様々な二次元形状の薄膜を用いて作製した三次元構造体の作製例である。内部に細孔を形成したヒト型の薄膜から三次元構造体を作製した例である。様々な二次元形状の薄膜を用いて作製した三次元構造体の作製例である。波状形状を有する薄膜から、螺旋構造を有する三次元構造体を作製した例である。様々な二次元形状の薄膜を用いて作製した三次元構造体の作製例である。格子形状を有する薄膜から、網目状ネット構造を有する三次元構造体を作製した例である。筒状構造体の曲率半径ρ、パリレン層の厚みｔ_ｐ、シルクフィブロインゲル層の厚みｔ_ｓ、薄膜の横幅ｗ、および薄膜の長軸方向の長さｌを説明する図である。筒状構造体の曲率半径ρと、パリレン層の厚みｔ_ｐとの相関関係を示す。筒状構造体の曲率半径ρと、パリレン層の厚みｔ_ｐとの相関関係を示す。黒四角はシルクフィブロインゲル層の厚みｔ_ｓを１００ｎｍとした場合を示し、黒丸はシルクフィブロインゲル層の厚みｔ_ｓを２１０ｎｍとした場合を示す。筒状構造体の曲率半径ρと、薄膜の横幅ｗとの相関関係を示す。筒状構造体の曲率半径ρと、薄膜の長軸方向の長さｌとの相関関係を示す。

＜三次元構造体＞
本発明の三次元構造体は、複数層の高分子膜からなる三次元構造体の内部空間に、微小粒子を内包してなる、三次元構造体である。また、一態様において、本発明の三次元構造体は、複数層の高分子膜からなる三次元構造体であって、前記三次元構造体の内部空間に、微小粒子が内包されており、前記複数層の高分子膜の各層が、互いに異なる機械的強度を有する、三次元構造体である。以下に、本発明の好ましい一態様を示す図面を挙げ、本発明の三次元構造体について説明する。

図１は、本発明の一態様である三次元構造体の斜視図であり、図２は、本発明の一態様である三次元構造体の断面図である。図中、１００は三次元構造体、１は薄膜、１０は第１の薄膜層、１１は第２の薄膜層、２０は細胞等の微小粒子、２１は接着タンパク質をそれぞれ示す。

図１および図２に示すように、三次元構造体１００は、薄膜１により形成される三次元構造体の内部空間に、微小粒子２０が内包された構造となっている。本実施態様においては、三次元構造体１００は、筒状構造体であるが、本発明の三次元構造体は筒状構造体に限定されない。例えば、生体組織用構造など様々な三次元構造とすることができる。

図１および図２に示すように、本実施態様においては、薄膜１は第１の薄膜層１０と第２の薄膜層１１とから構成される。本発明において、薄膜１は、２層からなるものに限定されず、３層以上の薄膜層からなるものであってもよい。薄膜１を構成する薄膜層の数は、特に限定されないが、５層以内であることが好ましく、３層以内であることがより好ましく、２層であることがさらに好ましい。

薄膜１を構成する薄膜層１０と薄膜層１１は、生体適合性の高い高分子材料により構成される。薄膜層１０と薄膜層１１を構成する高分子材料は、生体適合性の高いものであれば、特に限定されず、合成高分子と生体高分子のいずれも用いることができる。合成高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、（３，４−エチレンジオキシチオフェン）／ポリ（４−スチレンスルホン酸）（ＰＥＤＯＴ−ＰＳＳ）、ポリピロール系高分子、ポリアニリン系高分子、ポリパラキシレン（パリレン）などを挙げることができる。生体高分子としては、例えば、多糖類；ゼラチン、シルクフィブロインなどのタンパク質；キトサン、コラーゲンなどの細胞外マトリクスなどを挙げることができる。

また、薄膜層１０と薄膜層１１には、透明性の高い高分子材料を用いてもよい。薄膜層１０と薄膜層１１とに透明性の高い高分子材料を用いれば、顕微鏡での観察時に光路を遮断することがないため、正立型・倒立型を問わずあらゆる種類の顕微鏡において構造体内部の観察が可能となる。また、超解像度顕微鏡を使用すれば、より微細な細胞の挙動や細胞中のタンパク質の活性を蛍光で観察することも可能となる。微小粒子２０が接着性細胞である場合には、薄膜層１１には、細胞接着性の高分子材料を用いることが好ましい。

薄膜層１０と薄膜層１１とは、互いに異なる機械的強度を有している。機械的強度としては、例えば、弾性率が挙げられる。そのために、薄膜層１０と薄膜層１１は、互いに膨潤率が異なる高分子材料を用いて形成することが好ましい。例えば、三次元構造体１００が筒状構造体である場合には、薄膜層１０に膨潤率の大きいものを用い、薄膜層１１には膨潤率の小さいものを用いることが好ましい。そのような薄膜層の組み合わせとしては、例えば、薄膜層１０をシルクフィブロインゲルで構成し、薄膜層１１をパリレンで構成したもの等が挙げられる。本発明は、これに限定されず、逆に、薄膜層１０に膨潤率の小さいものを用い、薄膜層１１に膨潤率の大きいものを用いてもよい。また、薄膜１を３層以上の薄膜層により構成する場合も、各薄膜層は、互いに膨潤率の異なる高分子材料で構成することが好ましい。

複数の薄膜層により形成される薄膜１の厚さは、特に限定されないが、三次元構造体の内部空間への酸素や物質の透過性が妨げられない程度の厚さとすることが好ましい。例えば、薄膜１の厚さは、好ましくは１５〜４００ｎｍ、より好ましくは２０〜３００ｎｍ、さらに好ましくは２０〜２００ｎｍとすることができる。この場合、直径が１０μｍスケールの細胞を好適に内包することができ、また薄膜１の屈曲を妨げることがない。薄膜１の厚さを上記のようにするために、例えば、薄膜層１０の厚さを、好ましくは１０〜３５０ｎｍ、より好ましくは１５〜２５０ｎｍ、さらに好ましくは５０〜２００ｎｍとすることができ、薄膜層１１の厚さを好ましくは５〜２００ｎｍ、より好ましくは１０〜１５０ｎｍ、さらに好ましくは２０〜１００ｎｍとすることができる。

また、薄膜１の表面は、任意の二次元平面パターンを形成したものであってもよい。例えば、リソグラフィ技術を用いて、パターニングすることで任意の二次元形状を形成することができる。パターンの大きさは、５０μｍ以上であることが好ましい。例えば、内包させる細胞種や細胞数に応じて、薄膜１の表面に、任意の二次元形状のパターンを形成してもよい。また、三次元構造体１００に微小粒子２０として細胞を内包させる場合、細胞の種類に応じて、三次元構造体１００の内部空間形状が生体組織様構造となるように、薄膜１の表面にパターンを形成してもよい。例えば、上皮細胞から構成される中空状の血管組織やファイバ状の神経組織などの生体組織を模した内部空間形状となるように、薄膜１の表面にパターンを形成することができる。

三次元構造体１００に内包される微小粒子２０は、特に限定されず、１μｍ以下のサイズの微小粒子であればよい。微小粒子２０の例としては、動植物細胞、細菌、寄生虫体、マイクロビーズ、マイクロバブル、球形脂質二重膜（リポソーム）、ナノパーティクルなどが挙げられる。動植物細胞のうち、好ましいものとしては、例えば、接着性細胞などが挙げられる。接着性細胞の例としては、神経細胞、心筋細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。

図２に示す実施態様では、微小粒子２０が、修飾タンパク質層２１により薄膜１に接着されている。このように、微小粒子２０を薄膜層１１の表面に接着させる場合には、微小粒子２０との親和性の高い材料により、薄膜層１１の表面を修飾してもよい。例えば、微小粒子２０が接着性細胞である場合には、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンなどの細胞外マトリクスを用いて、薄膜層１１の表面修飾を行うことができる。薄膜層１１にこのような表面修飾を施すことにより、より長期的に細胞接着性を維持することができる。薄膜層１１の表面修飾に用いる細胞外マトリクス等は、特に限定されず、接着性細胞の種類に応じて、適宜適切な細胞外マトリクス等を選択することができる。例えば、株化培養細胞であれば、フィブロネクチン等を好適に用いることができ、神経細胞であれば、ラミニン等を好適に用いることができる。

三次元構造体１００に内包させる微小粒子２０の量は特に限定されず、用途に応じて適宜適切な量を内包させることができる。微小粒子２０が細胞である場合、三次元構造体１００に内包された細胞は、三次元構造体１００の内部空間形状に従って増殖する。そのため、三次元構造体１００の内部空間形状を生体組織様構造とすることにより、内包された細胞が増殖して生体組織様構造を形成する。本発明の三次元構造体では、三次元構造体を構成する薄膜が生体適合性の高い高分子材料により形成されているため、長期間の細胞培養を行うことができる。

また、微小粒子２０として細胞を内包させた三次元構造体１００を、あらかじめ細胞を培養しておいた培養基板上に移動させて培養を行うと、三次元構造体１００の内部から三次元構造体１００の外部へと細胞突起、軸索、細胞体等が伸展する。これらの細胞突起、軸索、細胞体等の構造を介して、三次元構造体１００に内包された細胞と三次元構造体外部に存在する細胞との間で、細胞間相互作用が発生し得る。

本発明の三次元構造体は、（ｉ）構成する薄膜が生体適合性の高い高分子材料で構成されている点、（ｉｉ）薄膜上で細胞を培養することができるため、培養細胞を自己組織化的に三次元薄膜構造体に内包させることができる点、および（ｉｉｉ）細胞を内包させた場合に、内包させた細胞が生体組織として機能し得る点において、従来の薄膜三次元構造体とは異なる。

このように、本発明の三次元構造体は、細胞を内包させた場合に、内包細胞を生体組織として機能させることができ、内包細胞に生体組織様構造を形成させることができる。三次元構造体内部の細胞は、三次元構造体外部の細胞との相互作用も可能である。そのため、細胞を内包させた三次元構造体は、生体組織様構造体として、癲癇や脊髄損傷のような神経組織の修復のための移植組織（グラフト）、心筋梗塞などにより損傷した心筋組織の修復のための移植組織（グラフト）等に応用することができる。また、薬物応答を試験する疑似的な生体組織として、薬剤スクリーニング等に応用することができる。また、屈曲するヒンジ構造を有する三次元構造体を設計することにより、目的とする細胞の捕捉、目的とする細胞の組織表面への吸着、目的とする細胞を把持するためのアクチュエータ機能などを実現する三次元構造体を得ることも可能である。さらに、本発明の三次元構造体は、生体内埋め込みデバイスのための素子としても応用できる。

＜三次元構造体の製造方法＞
本発明の三次元構造体は、高分子材料により構成されている。高分子材料は、その剛性の低さから、薄膜の形成は可能なものの、形成した薄膜の加工や強度分布を形成することは難しい。そのため、高分子薄膜を用いて三次元形状を製作する技術に関する報告例は未だ少ない。

そこで、本発明においては、リソグラフ技術等を用いて複数層からなる高分子薄膜を形成し、高分子薄膜内部に厚さ方向の応力分布を発生させる構造を作ることで、高分子薄膜が自己組織的に三次元形状に組み立てられる現象を利用した。すなわち、本発明の一態様は、微小粒子が内包された三次元構造体を製造する方法であって、複数層の高分子膜を形成する工程と、前記複数層の高分子膜の表面上に、微小粒子を浮遊させる工程と、前記複数層の高分子膜に、厚み方向の応力分布を発生させて、前記複数層の高分子膜に自己組織的に三次元構造を形成させる工程と、を含む、三次元構造体の製造方法である。以下に、本発明の好ましい一態様を示す図面を挙げ、本発明の三次元構造体の製造方法について説明する。

図３は、膨潤率の異なる二層の高分子薄膜の積層構造による屈曲の概念図である。図中の符号は、図１および図２と同じである。まず、図３により、各層の膨潤率が異なる複数層の高分子薄膜による自己組織的な三次元形状の組立について説明する。

図３に例示する構造体においては、薄膜層１０と薄膜層１１とは、互いに異なる膨潤率を有する高分子材料により形成されている。薄膜層１０の膨潤率は薄膜層１１の膨潤率よりも大きい。そのため、薄膜層１０と薄膜層１１とからなる薄膜１を水溶液に浸漬すると、各層は水を吸収して膨潤するが、膨潤による体積の変化量は、薄膜層１１よりも薄膜層１０の方が大きくなる。この体積の変化量の差を駆動力として、薄膜１は、薄膜層１１が内部層、薄膜層１０が外部層となるように屈曲し、三次元構造体を形成する。

次に、図４および図５Ａ〜５Ｊを用いて、本発明の三次元構造体の製造方法の一態様を説明する。図４は、二層構造の薄膜を用いた三次元形状への自己組立てと、微小粒子の内包化の一態様を示す概念図である。また、図５Ａ〜５Ｊは、微小粒子を内包した三次元構造体形成のプロセス図の一例である。図中、１２は犠牲層、１３は基板、３０はフォトレジスト膜をそれぞれ示す。その他の符号は、図１および図２と同じである。

図４および図５Ａ〜５Ｊに示す実施態様では、薄膜１を基板１３から遊離させて三次元構造を形成させるために、薄膜１と基板１３との間に形成した犠牲層１２を利用する。そのため、まず、図５Ａに示すように、基板１３上に犠牲層１２を形成する。犠牲層１２を形成する方法は、特に限定されず、スピンコーティング、化学気相成長（ＣＶＤ）、インクジェットプリンティング、蒸着法、エレクトロスプレイ法などが利用可能である。

基板１３の材質は、特に限定されないが、表面の平坦性が高い材質のものを用いることが好ましい。また、基板１３上で、細胞を内包する三次元構造体１００の蛍光顕微鏡による観察を行う場合には、蛍光顕微鏡による細胞の蛍光強度を妨げない材質のものを用いることが好ましい。また、分光光度計と赤外分光計での波長の吸収帯が、薄膜層１０に重複しないことが好ましい。そのような材料としては、例えば、シリコン、ソーダガラス、石英、酸化マグネシウム、サファイアなどが挙げられる。なお、図５Ａ〜５Ｊの例では、基板１３としてガラス基板を用いている。

基板１３の厚みは、特に限定されず、例えば、５０〜２００μｍとすることができる。また、基板１３の表面は、細胞の非特異的吸着の抑制を目的として、ＰＥＧや２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）ポリマ等で修飾してもよい。

犠牲層１２の材質は、特に限定されないが、ゲル−ゾル転移可能な物理ゲルを用いることが好ましい。また、ゲル−ゾル転移のために使用される溶液や光等の刺激が、細胞毒性を示さないものであることが好ましい。そのようなゲルとしては、例えば、光や熱、ｐＨの変化により分解されるゲル等が挙げられる。具体例としては、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）やアゾベンゼン修飾ポリマゲルなどを挙げることができる。また、キレート剤や酵素の作用により分解するゲル等も用いることができる。そのようなゲルとしては、例えば、アルギン酸カルシウムゲル等が挙げられる。なお、図５Ａ〜５Ｊの例では、犠牲層１２としてアルギン酸カルシウムゲルを用いている。犠牲層１２の厚みは、特に限定されず、例えば、２０〜２００ｎｍとすることができる。

次に、図５Ｂに示すように、犠牲層１２上に、薄膜層１０を形成する。薄膜層１０の形成方法は、特に限定されず、スピンコーティング、ＣＶＤ、インクジェットプリンティング、蒸着法、エレクトロスプレイ法などが利用可能である。薄膜層１０の材質および厚みは、上記のとおりとすればよい。薄膜層１０の材質としては、例えば、溶液中に浸漬された際に膨潤し体積変化が誘導される高分子材料が好ましい。なお、図５Ａ〜５Ｊの例では、薄膜層１０としてシルクフィブロインゲルを用いている。

次に、図５Ｃに示すように、薄膜層１０上に、薄膜層１１を形成する。薄膜層１１の形成方法は、特に限定されず、ＣＶＤ、スピンコーティング、インクジェットプリンティング、蒸着法、エレクトロスプレイ法などが利用可能である。薄膜層１１の材質および厚みは、上記のとおりとすればよい。薄膜層１１の材質としては、例えば、溶液中に浸漬された際に、薄膜層１０と比較して、大きな体積変化が誘導されない高分子材料が好ましい。または、薄膜層１０とは逆の体積変化が誘導される高分子材料が好ましい。なお、図５Ａ〜５Ｊの例では、薄膜層１１としてパリレンを用いている。

上記のように、薄膜層１０と薄膜層１１とに、膨潤率の異なる高分子材料を使用することにより、溶液中に浸漬された際に、薄膜層１０と薄膜層１１とで膨潤による体積変化に差が生じ、厚み方向に応力分布が発生する。この応力分布が駆動力となり、後の工程で犠牲層１２を分解して基板１３から遊離させた際に、薄膜１は自己組織的に三次元形状を形成する。

次に、図５Ｄ〜５Ｆに示すように、必要に応じて、薄膜１上にパターン形成を行う。パターン形成方法としては、例えば、フォトリソグラフィ法、電子ビームリソグラフィ法、ドライエッチング法等の微細加工技術を適用することができる。図５Ｄの例では、薄膜層１１上にフォトレジスト膜３０を形成し、任意の形状のフォトマスクを通して紫外線を照射し、物理マスクをパターニングしている。その後は、図５Ｅに示すように、エッチングを行い、図５Ｆに示すようにフォトマスクを除去すればよい。なお、前記エッチングは、基板１３に届くまで行ってもよく、犠牲層１２に届くまで行ってもよい。薄膜１上のパターン形成は任意であるが、薄膜１上に二次元平面パターンを設計することにより、自己組織的に組み立てられる三次元形状を自在に変化させることができる。例えば、組み立て後の三次元構造体の内部空間が生体組織様構造となるようにパターン形成することにより、三次元構造体に細胞を内包させた場合に、生体組織様構造に沿って細胞を増殖させることが可能となる。例えば、上皮細胞から構成される中空状の血管組織、神経性細胞から構成されるファイバ状の神経組織、心筋細胞から構成される心臓形状の心筋組織など、実際の生体組織の形状に応じた設計が可能となる。

次に、図５Ｇに示すように、必要に応じて、微小粒子２０との親和性の高い材料により、薄膜層１１の表面を修飾してもよい。図５Ｇの例では、薄膜層１１の表面上に修飾タンパク質層２１を形成している。修飾に用いる材料等は、上記のとおりとすればよい。なお、図５Ｇの例では、フィブロネクチン又はラミニンにより修飾を行っている。

次に、図５Ｈに示すように、微小粒子２０の懸濁液を薄膜層１１上に添加し、薄膜層１１上に微小粒子２０を浮遊させる。このとき、懸濁液中の微小粒子２０の濃度を調整することにより、組み立て後の三次元構造体に内包される微小粒子２０の数を制御することができる。

次に、図５Ｉに示すように、犠牲層１２を分解する。犠牲層１２の分解は、犠牲層１２の材質に応じて、適切な方法を採用すればよい。例えば、犠牲層１２が、光や熱、ｐＨの変化により分解されるゲルであれば、光や熱、ｐＨを変化させることにより、犠牲層１２を分解することができる。また、犠牲層１２が、キレート剤や酵素の作用により分解するゲルであれば、キレート剤や酵素を作用させることにより、犠牲層１２を分解することができる。なお、犠牲層１２がアルギン酸カルシウムゲルである図５Ｉの例では、クエン酸ナトリウムやＥＤＴＡなどのキレート剤、アルギン酸カルシウムゲルを特異的に分解するアルギナーゼと呼ばれる酵素などを添加することにより、犠牲層１２を分解することができる。

上記のように犠牲層１２を分解することにより、図５Ｊに示すように、薄膜１が基板１３から遊離し、任意の形状の三次元構造をとる。その際に、薄膜１上に存在していた微小粒子２０は、三次元構造体の内部空間に内包される。

細胞毒性を有さない刺激により犠牲層１２の分解を行うことにより、微小粒子２０として細胞を使用する場合であっても、犠牲層１２の分解操作の直前に、薄膜１上に細胞を添加することが可能となる。このとき、薄膜１上の細胞懸濁液の細胞濃度を変化させることにより、三次元構造体に内包される細胞数を制御することができる。また、三次元構造体の組立と同時に細胞が三次元構造体に内包されるため、多くの細胞を一括して三次元構造体に内包させることができる。そのため、三次元構造体内への偶発的な細胞の侵入に依存していた従来の方法と比較して、三次元構造体内への細胞の導入効率を格段に向上させることができる。

以上、この発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。

以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。

［実施例１］三次元構造体に自己組立て可能な薄膜の作製
三次元構造体に自己組立て可能な薄膜の作製を、図５Ａ〜５Ｆに示すプロセスに従って行った。本実施例では、基板１３にガラス基板を用い、犠牲層１２にはアルギン酸カルシウムゲルを用いた。まず、ガラス基板である基板１３上で、アルギン酸ナトリウム溶液をスピンコーティングした。その後、スピンコーティングした基板１３を１００ｍＭの塩化カルシウム溶液中に浸漬することにより、アルギン酸カルシウムの物理ゲルからなる犠牲層１２を形成した（図５Ａ）。アルギン酸カルシウムゲルの厚みは、アルギン酸ナトリウム溶液の濃度とスピンコーティングの速度を変化させることで制御可能であり、本実施例では、２ｗｔ％のアルギン酸ナトリウム溶液を３０００ｒｐｍでスピンコーティングすることで、４０ｎｍのゲル層を形成した。

次に、犠牲層１２上に薄膜層１０を形成した。薄膜層１０を構成するゲルとして、シルクフィブロインゲルを用いた。シルクフィブロインは、水に溶解し、フィルタを用いて２００ｎｍよりも大きな分子を除去したものを使用した。上記のように調製したシルクフィブロイン溶液を、犠牲層１２の表面上にスピンコーティングし、その後メタノール溶液に浸漬することにより、シルクフィブロインゲルからなる薄膜層１０を形成した（図５Ｂ）。シルクフィブロインゲルの厚みは、シルクフィブロイン溶液の濃度とスピンコーティングの速度を変化させることで制御可能であり、本実施例では、４０ｍｇ／ｍＬのシルクフィブロイン溶液を１０００ｒｐｍでスピンコーティングすることで、約２００ｎｍのゲル層を形成した。

次に、薄膜層１０上に薄膜層１１を形成した。薄膜層１０の表面上に、パラキシレンのダイマをＣＶＤにより成長していくことで、パリレン薄膜からなる薄膜層１１を形成した（図５Ｃ）。薄膜層１１の厚みは、パラキシレンダイマの投入重量により制御可能であり、本実施例では、５０ｍｇのパラキシレンダイマをＣＶＤにより薄膜層１０上で成長させることで、約５０ｎｍのパリレン層を形成した。

次に、薄膜層１１上にポジ型フォトレジスト（Ｓ１８１３）をスピンコーティングし、フォトマスクを通して紫外光を照射することにより、薄膜層１１上に物理マスクをパターニングした（図５Ｄ）。その後、アッシャ内で酸素プラズマによりエッチングを行った（図５Ｅ）。エッチングは、基板１３に届くまで行った。最後に、アセトンによりフォトマスクを除去してパリレン層である薄膜層１１を露出させた（図５Ｆ）。

図６Ａおよび図６Ｂに、上記のとおりに形成した薄膜パターンの電子顕微鏡（ＳＥＭ）像を示す。図６Ｂは、図６Ａの点線で囲んだ領域の拡大像である。図６Ａおよび図６ＢのＳＥＭ像から、薄膜層１０、薄膜層１１および犠牲層１２の各層が、平面状に積層されていることが確認された。また、エッチング操作により各層が切削されているが、基板１３上に、微小な粒子が存在していることが確認された。これは、エッチング操作でも除去できなかったアルギン酸カルシウムゲルが残存したものと考えられる。

集束イオンビーム（ＦＩＢ）により、薄膜層を切断加工した後の断面のＳＥＭ像を、図６Ｃに示す。また、前記断面において、エネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＸ）を用いて、各薄膜層、基板１３および基板１３上の微小粒子について、これらを構成する特異的な元素の局在の確認と同定を行った（図６Ｄ）。その結果、薄膜層１１にはパリレン特有の塩素（Ｃｌ）が、犠牲層１２にはアルギン酸カルシウムゲル特有のカルシウム（Ｃａ）が、基板１３にはケイ素（Ｓｉ）がそれぞれ確認された。また、薄膜層１１およびエッチング後の基板１３には、ＳＥＭ観察のためにスパッタリングした金（Ａｕ）の存在が確認され、エッチング後の基板１３上の微小粒子には、アルギン酸カルシウムゲル特有のカルシウム（Ｃａ）の存在が観察された。

［実施例２］薄膜による三次元構造体の自己組立て
細胞を内包する三次元構造体の自己組立てを、図５Ｇ〜５Ｊに示すプロセスに従って行った。実施例１で作製した薄膜１と犠牲層１２が接着した基板１３を、タンパク質溶液に浸漬し、薄膜層１１のパリレン膜表面にタンパク質修飾を行った（図５Ｇ）。タンパク質修飾の種類は、内包させる細胞の種類に応じて、適宜選択する。本実施例では、株化培養細胞の接着を誘導するために、１ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液を用いて薄膜層１１の修飾を行った。１ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液を、株化培養細胞を播種する際に同時に培養液中に添加し、最終濃度が１μｇ／ｍＬとなるように調製した。また、初代神経細胞の接着を誘導するために、１ｍｇ／ｍＬのラミニン溶液を用いて薄膜層１１の修飾を行った。１ｍｇ／ｍＬのラミニン溶液を、初代神経細胞を播種する際に同時に培養液中に添加し、最終濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。上記のように調製した細胞培養液を薄膜１上に播種し、薄膜層１１表面上に細胞を浮遊させた（図５Ｈ）。なお、薄膜１の自己組立てを行う前に、播種する細胞数を変化させることで、内包させる細胞数を制御することが可能である。

次に、キレート剤を添加して、犠牲層１２のアルギン酸カルシウムゲル層を溶解した（図５Ｉ）。キレート剤は、細胞毒性を有さないものである必要があるが、本実施例では、キレート剤としてＥＤＴＡ溶液を用いた。０．０５ｍｏｌ／ｍＬのＥＤＴＡ溶液を最終濃度が０．００１ｍｏｌ／Ｌとなるように添加して、犠牲層１２を溶解し、薄膜１を基板１３から遊離させた。

ＥＤＴＡ溶液の添加により犠牲層１２を溶解すると、薄膜１が基板１３から遊離して、筒状構造へと自己組立てが起こった（図５Ｊ）。図７Ａおよび図７Ｂは、薄膜１の自己組立ての様子を示す位相差顕微鏡像である。細胞がない場合（図７Ａ）および細胞がある場合（図７Ｂ）で観察を行ったが、いずれの場合も、ＥＤＴＡ溶液の添加後、薄膜１が徐々に基板１３から剥離され、次第に中心部へと反応が進むことが観察された。この時、反応は等方的に進行するため、長軸方向よりも短軸方向への反応の方がより早く完了し、短軸方向への薄膜の屈曲が誘導されることが観察された。これにより、長軸方向の長さを維持した状態の筒状構造が得られた。

ＥＤＴＡ溶液を添加してから筒状構造体が完成するまでの時間は、添加するＥＤＴＡ溶液の最終濃度と基板を浸漬している溶液の種類により制御が可能である。本実施例では、縦２００μｍ、横４００μｍ、厚さ４０ｎｍのアルギン酸カルシウムゲルからなる犠牲層１２を、２００μＬの純水中に浸漬し、０．５ＭのＥＤＴＡ溶液を添加することで、約２０秒以内に犠牲層１２を除去することができた（図７Ａ）。また、薄膜１の屈曲に伴い、薄膜１上を浮遊する細胞は筒状構造体の内部空間に取り込まれた（図７Ｂ）。筒状構造体に内包された細胞は、その後の溶液交換作業や構造体のハンドリングなどの操作を行っても、筒状構造体の内部空間における位置を変化させないことが確認された。

薄膜１の屈曲現象は薄膜１の厚み方向の応力分布に起因しているため、薄膜１を構成する薄膜層１０と薄膜層１１の体積を変化させることにより、薄膜１の屈曲の際の曲率を制御可能である。図７Ｃは、薄膜１の曲率半径と、パリレン層からなる薄膜層１１の厚みとの相関関係を示したものである。薄膜層１１のパリレン層の厚みが増加することによって、一定の応力下において構造体の断面二次モーメントが増加し、より屈曲しにくくなることが観察された。

上記のようにして作製された筒状構造体は、基板１３から完全に遊離した状態となる。これにより、ピペット操作による回収や移動などのハンドリングが可能になる。さらに、ガラスキャピラリを用いて複数の筒状構造体を近接化することも可能となる。そのため、細胞を内包させた筒状構造体をグラフトとして用い、目的の生体組織などへの輸送や移植に応用可能である。

［実施例３］筒状構造体に内包された接着性細胞の培養
本実施例では、筒状構造体に内包させる細胞として、株化培養細胞であるチャイニーズハムスター由来卵巣（ＣＨＯ）細胞とヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞を用いた。両細胞ともに、培養液としてウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）を１０％含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて培養した。３７℃の温度を保ち、二酸化炭素濃度を５％に保持した湿潤環境下で、両細胞の培養を行った。

筒状構造体の作製と細胞の内包化は、実施例１および実施例２のとおりに行った。筒状構造体への内包から一週間経過後に、細胞の生死判定を行い、ＣＨＯ細胞とＨＥＫ細胞のいずれも、筒状構造体内での生存を確認した。また、増殖を無限に繰り返す株化培養細胞であるＣＨＯ細胞とＨＥＫ細胞では、細胞の増殖とともに筒状構造体の空間内部が細胞で満たされ、細胞塊を形成することが観察された。また、細胞の種類によって、形成される細胞塊の構造は異なっていた。ＣＨＯ細胞では、細胞は薄膜層１１の表面のみに接着し、中空構造の生体組織様構造を示した（図８Ａ）。一方、細胞同士の接着が強いＨＥＫ細胞では、薄膜層１１表面への接着よりも細胞同士での接着が強く、筒状構造体の構造を維持しながらも、細胞が凝集した細胞塊（スフェロイド）が形成された（図８Ｂ）。ＨＥＫ細胞において形成された細胞塊は、培養と共に体積を増加し、筒状構造の外部へと増殖が進行し、基板１３へと伸展していくことが観察された（図８Ｂ矢印）。また、図８Ｃに、ＣＨＯ細胞を内包した筒状構造の共焦点顕微鏡像を示す。本画像において、細胞はＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭにより蛍光ラベル化されており、細胞質全体が染色されている。本画像により、細胞体が薄膜壁面と接着し、壁面に局在していることが観察された。

また、本実施例の筒状構造体は、長軸方向をより長くすることで、より長い生体組織様構造体も作製可能である。図８Ｄに示した筒状構造体は、１ｃｍ以上の大きな生体組織様構造体を作製した例である。近年、細胞塊を作製して再生医療に応用しようという研究が多くなされているが、細胞の凝集体が２００μｍ以上になると、酸素や栄養分の透過性が悪くなり、凝集体内部より細胞死が誘導されることが報告されている。本発明の三次元構造体では、薄膜１の厚さを制御できるため、酸素や栄養分の透過性を適正に維持することができる。また、生体組織様構造体の構造を無秩序に肥大化させず、直径の制御が可能であるため、三次元構造体内部での細胞の長期培養が可能になった。

本実施例において、細胞体は、培養期間中、筒状構造体の内部に内包されており、その状態を維持したまま操作することができた。また、細胞を内包する薄膜１は、ＤＭＥＭ培地中で３７℃の温度で培養を続けても、三次元形状が崩壊することはなかった。ガラスキャピラリを用いることにより、三次元構造を変化させることなく、三次元構造体に内包された細胞塊をｘ−ｙ平面に移動させることができ、また、三次元構造体に細胞を内包させたまま、異なる細胞群が存在する場所への移植も可能であった。さらに、筒状構造体に内包させたまま細胞塊を短軸方向に回したり、ｚ軸での角度制御（傾斜）を行ったりすることも可能であり、細胞の多角度観察にも応用可能であることが確認された。

［実施例４］筒状構造体に内包された初代神経細胞の培養
本実施例では、ラット脳組織より単離した初代神経細胞である海馬細胞と大脳皮質細胞を用いた。図９Ａに示すように、単一の筒状構造体に多数の細胞を内包すると、培養とともに細胞同士の会合が開始され、細胞塊が形成された。初代神経細胞の場合、長期培養に伴い細胞同士の接着が誘導されるが、それと同時に筒状構造体の内部表面への接着も維持され、その状態が維持されたまま、筒状構造体の内部空間のみでの神経突起または軸索の伸長が観察された（図９Ｂ）。海馬細胞と大脳皮質細胞のいずれの細胞においても、一ヶ月以上の培養期間中、筒状構造体の内部で安定的な細胞体の形態と軸索の伸展状態が維持されること、および筒状構造体内部で細胞死が誘導されないことを確認した。

初代大脳皮質細胞および海馬細胞は、細胞の増殖速度が遅いため、筒状構造体から細胞がはみ出すことはなく、株化培養細胞に比べて一か月以上のより長期の培養が可能であった。また、初代神経細胞は、神経情報伝達のために神経軸索を伸長するため、細胞が細胞塊を筒状構造体の内部で形成した後、筒状構造体外部へと神経軸索を伸長することも確認された。本実施例においては、三次元構造体は筒状であり、その二つの端点のみが培養液空間に開放されているため、その端点から筒状構造体外部へと神経軸索が伸長した。このことは、初代神経細胞を内包した本実施例の三次元構造体により、神経組織様の微小構造の組立てが可能となるだけではなく、長軸方向の一方向的に細胞の電気的信号を伝達する電気配線素子としての応用も可能であることを示している。

本実施例の神経組織様細胞塊は、筒状構造体をハンドリングすることで、組織を崩壊させずに移動させることが可能であった。筒状構造体を移動させた基板表面上に、筒状構造体から軸索が伸長していくことが、位相差顕微鏡画像（図９Ｃ）と凍結乾燥試料のＳＥＭ画像（図９Ｄ）から確認された。さらに、あらかじめ異なる種類の細胞を培養していた培養基板上に本実施例の筒状構造体を移動することにより、上記と同様に、筒状構造体から基板表面上に軸索が伸長していき、基板上にあらかじめ存在していた細胞体と結合して細胞間相互作用が発生することが確認された。

初代神経細胞では、細胞膜の内側と外側とでイオン濃度に差があり、静止状態で膜内が負に分極している。細胞は生体膜電位の変化に応じてイオン透過孔の開閉を調節する機能を有するため、塩化カリウム（ＫＣｌ）溶液を用いて細胞の脱分極を誘導することで、強制的に電位依存性カルシウムイオンチャネルを活性化させ、カルシウムイオンを細胞内に流入させることができる。そこで、初代神経細胞を筒状構造体に内包して培養した後、ＫＣｌ溶液を添加して脱分極を誘導した。その結果、筒状構造体の外部に存在する神経細胞だけでなく、筒状構造体に内包された細胞も、細胞の刺激が可能であることが実証された。さらに、カルシウム蛍光プローブであるＦｌｕｏ−４でカルシウムをラベル化し、細胞外液中のカルシウムイオンの細胞内への透過を共焦点顕微鏡により観察した。ＫＣｌ溶液を添加して細胞刺激を行ったところ、図９Ｅに示すように、筒状構造体の外部の細胞だけでなく、筒状構造体に内包された細胞でも蛍光強度の変化が観察された。また、筒状構造体に内包された細胞と外部の細胞との接合点および軸索上においても、蛍光強度の変化が観察された。さらに、これらの蛍光強度の変化が同期していることを共焦点顕微鏡により確認した。また、ＫＣｌ溶液による刺激後も、筒状構造体に内包された細胞の発火が同期して誘導されていることが観察され、筒状構造体内部に形成された微小神経様組織内での細胞間の持続的な接着と、細胞相互間での電気的信号のやりとりが確認された。

［実施例５］筒状構造体に内包された初代心筋細胞の培養
本実施例では、ラットの心臓組織より単離した初代心筋細胞を用いた。図１０Ａに示すように、単一の筒状構造体に心筋細胞を内包すると、初代神経細胞と同様に培養とともに細胞同士の会合が開始され、細胞塊が形成された。細胞塊は繊維状に一方向に形成され、その方向は筒状構造体と同一の方向を有していた。初代心筋細胞の場合、長期培養に伴い細胞同士の接着が誘導されるが、それと同時に筒状構造の内部表面への接着も維持され、その状態が維持されたまま、筒状構造体の内部空間のみでの細胞塊形成が観察された。

心筋細胞では、一ヶ月以上の培養期間中、筒状構造体の内部で安定的な細胞塊の形態が維持されること、および筒状構造体内部で細胞死が誘導されないことを確認した。図１０Ｂに示すように、内包化された初代心筋細胞では、細胞塊が拍動を開始し、その拍動が、筒状構造体内部のどの場所の細胞においても同期することを確認した。これにより微小な心臓組織の再構築に成功したことが確認された。

心筋細胞は、初代神経細胞と同様に、細胞膜の内側と外側とでイオン濃度に差があり、静止状態で膜内が負に分極している。細胞は生体膜電位の変化に応じてイオン透過孔の開閉を調節する機能を有する。心筋組織の拍動は、電気的なシグナルを細胞が受け取る際に、カルシウムイオンを細胞内に流入させることが知られている。そこで、カルシウム蛍光プローブであるＦｌｕｏ−４でカルシウムをラベル化し、心筋細胞外液中のカルシウムイオンの心筋細胞内への透過を蛍光顕微鏡により観察した。図１０Ｃに示すように、拍動と同期する形で、蛍光強度の変化も筒状構造体内部のどの場所の細胞においても同期することが観察された。また、蛍光強度の変化も、筒状構造体内部においてのみ同期することが観察された。

［実施例６］様々な形状の三次元構造体の作製
長方形型の薄膜が筒状構造体に自己組立てされることに限らず、薄膜の二次元形状を任意に決定することで、様々な三次元構造を作製できることを確認した。図１１Ａ〜１１Ｇに、様々な二次元形状の薄膜から自己組立された三次元構造体を示す。放射状の花型模様の形状を有する薄膜は、球体状の把持用グリッパ構造を有する三次元構造体を形成した（図１１Ａ）。十字形状を有する薄膜は、十字形状の一方向のみが屈曲してＴ字構造を有する三次元構造体を形成した（図１１Ｂ）。さらに、長方形型の薄膜に十字形状の薄膜を繋ぎ合せることによって、ヒト型を模したような屈曲しない関節部位を介した三次元ヒト型構造が形成された（図１１Ｃ）。また、薄膜の内部に細孔を形成しても、細孔が形成されていない薄膜と同様の三次元構造をとることが観察された（図１１Ｄ、１１Ｅ）。したがって、薄膜に細孔を形成することにより、外部からの物質の供給を誘導するような三次元構造体も作製できる。さらに、波状形状を有する薄膜は、螺旋構造を有する三次元構造体を形成した（図１１Ｆ）。また、格子形状を有する薄膜は、網目状ネット構造を有する三次元構造体を形成した（図１１Ｇ）。これらの結果から、薄膜の形状を制御することにより、様々な構造を有する三次元構造体を製造できることが示された。

［実施例７］筒状構造体の曲率半径の制御
実施例２において、薄膜１は、薄膜層１０と薄膜層１１との間の機械的強度の差から生じる面内方向の座屈による歪み分布を利用して、自己組織的に三次元形状に組立てられることを確認した。さらに、自己組立てが完了した後の、定常状態での筒状構造体の曲率半径は、２つの薄膜層間の厚みの比率と機械的強度の比率にのみ依存することを見出した。図１２Ａ〜１２Ｅは、薄膜１の曲率半径ρと、パリレンからなる薄膜層１１の厚みｔ_ｐ（図１２Ｂ、１２Ｃ）、薄膜１の横幅ｗ（図１２Ｄ）、および薄膜１の長軸方向の長さｌ（図１２Ｅ）との相関関係を示したものである。薄膜１を構成する２つの薄膜層のうち、薄膜層１１の厚みｔ_ｐのみを増加させると、それに伴い薄膜１の曲率半径ρも増加した（図１２Ｂ）。また、薄膜層１０の厚みｔ_ｓを減少させると、それに伴い薄膜１の曲率半径ρが増加する傾向が観察された（図１２Ｃ）。さらに、薄膜１の厚みを一定にした場合、長方形型の薄膜１では、薄膜１の曲率半径ρは、短軸方向の長さ（幅ｗ）にほぼ線形に比例する（図１２Ｄ）のに対して、長軸方向の長さｌにはほとんど影響を受けない（図１２Ｅ）ことが観察された。薄膜層１０としてのシルクフィブロインゲル層と薄膜層１１としてのパリレン層からなる薄膜１では、シルクフィブロインゲル層が１〜１００ＭＰａの弾性率を、パリレン層が１〜１０ＧＰａの弾性率を有しているため、２つの層の弾性率の比率（シルクフィブロインゲル層の弾性率／パリレン層の弾性率）として、０．０００１〜０．１までの値を取ることができる。ただし、２つの薄膜層間で弾性率に差異が生じれば、弾性率の比率は特に限定されない。弾性率の測定方法は、薄膜層１０に用いる高分子材料と薄膜層１１に用いる高分子材料とで同じ測定方法を用いれば、特に限定されない。例えば、弾性率の測定方法としては、Ｊｉａｎｇら（Jiang C et al., Adv. Funct. Mater. 2007, 17, 2229-2237）やＨｕら（Hu X et al., Biomacromolecules. 2011 May 9;12(5):1686-96）に記載の方法等を挙げることができる。

本実施例の筒状構造体は可動性を有するため、キャピラリにより位置制御を行うことで、既存の細胞外電位を計測する微小電極アレイ（ＭＥＡ）基板の上に配置し、任意の細胞の任意の時間における高効率な細胞外電位の計測に応用可能である。

本発明によれば、生体適合性の高いソフトマテリアルで形成した薄膜三次元構造に細胞を内包化させるため、生体適合性の高い生体デバイスや人工組織の作製が可能になる。本発明は、再生医療技術や薬剤スクリーニングをはじめとする、生体組織様構造体を使用する分野全般で利用可能である。また、本発明は、生体埋め込みデバイス素子や細胞外電位計測素子にも応用可能である。

１薄膜
１０第１の薄膜層
１１第２の薄膜層
１２犠牲層
１３基板
２０微小粒子
２１修飾タンパク質層
３０フォトレジスト膜

Claims

複数層の高分子膜からなる三次元構造体であって、
前記三次元構造体の内部空間に、微小粒子が内包されており、
前記複数層の高分子膜の各層が、互いに異なる機械的強度を有し、
前記複数層の高分子膜が、シルクフィブロインゲルで構成される層とポリパラキシレンで構成される層とからなり、前記複数層の高分子膜の各層のうち、前記三次元構造体の外部に接する層が、前記シルクフィブロインゲルで構成される層である、
三次元構造体。
前記高分子膜の表面に、さらに、細胞外マトリクスで構成される層を有する、請求項１に記載の三次元構造体。
前記高分子膜の厚さが１５〜４００ｎｍである、請求項１又は２に記載の三次元構造体。
前記微小粒子が細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元構造体。
前記細胞が、接着性細胞であり、前記高分子膜に接着している、請求項４に記載の三次元構造体。
前記三次元構造体が生体組織様構造を有しており、前記細胞が生体組織様構造の細胞塊を形成している、請求項４又は５に記載の三次元構造体。
請求項４〜６のいずれか一項に記載の三次元構造体と、前記三次元構造体の外部に存在する細胞と、を含み、
前記三次元構造体に内包される細胞が、前記三次元構造体の外部へと伸展する構造を形成しており、前記三次元構造体に内包される細胞と前記三次元構造体の外部に存在する細胞との間で、細胞間相互作用が発生し得る、生体組織様構造体。
微小粒子が内包された三次元構造体を製造する方法であって、
複数層の高分子膜を形成する工程（ａ）と、
前記複数層の高分子膜の表面上に、微小粒子を浮遊させる工程（ｂ）と、
前記複数層の高分子膜に、厚み方向の応力分布を発生させて、前記複数層の高分子膜に自己組織的に三次元構造を形成させる工程（ｃ）と、
を含み、
前記複数層の高分子膜が、シルクフィブロインゲルで構成される層とポリパラキシレンで構成される層とからなり、前記複数層の高分子膜の各層のうち、前記三次元構造体の外部に接する層が、前記シルクフィブロインゲルで構成される層である、
三次元構造体の製造方法。
基板上に犠牲層を形成する工程を、さらに含み、
前記工程（ａ）が、前記犠牲層上に、シルクフィブロインゲルで構成される層とポリパラキシレンで構成される層とを積層して、複数層の高分子膜を形成する工程であり、
前記工程（ｂ）が、前記複数層の高分子膜に、前記微小粒子を含む懸濁液を添加する工程であり、
前記工程（ｃ）が、前記犠牲層を分解して、前記高分子膜を前記基板から遊離させる工程である、
請求項８に記載の三次元構造体の製造方法。
前記微小粒子が細胞である、請求項８又は９に記載の三次元構造体の製造方法。
さらに、前記高分子膜の表面に、細胞外マトリクスで構成される層を形成する工程を含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の三次元構造体の製造方法。
前記高分子膜の厚さが１５〜４００ｎｍである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の三次元構造体の製造方法。
基板と、前記基板上に積層された犠牲層と、前記犠牲層上に積層された複数層の高分子膜とを含み、
前記複数層の高分子膜の各層が、前記犠牲層を分解して前記高分子膜を前記基板から遊離させた際に、前記高分子膜に厚み方向の応力分布が発生し得る高分子材料で構成されており、
前記複数層の高分子膜が、前記犠牲層上に形成されたシルクフィブロインゲルで構成される層と前記シルクフィブロインゲルで構成される層上に形成されたポリパラキシレンで構成される層とからなる、
積層体。
前記高分子膜上に積層された細胞外マトリクスで構成される層を、さらに含む、請求項１３に記載の積層体。
前記高分子膜の厚さが１５〜４００ｎｍである、請求項１３又は１４に記載の積層体。