CN100436577C - 前眼部相关细胞片、三维结构体、及它们的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供前眼部相关细胞片或三维结构体，其结构缺陷少，以保持细胞与细胞间的桥粒结构、以及细胞与基材间的基底膜类蛋白质的状态被回收。在用相对于水的上限或下限临界溶解温度为0～80℃的温度响应性聚合物覆盖基材表面而成的细胞培养支持体上培养细胞，根据需要使培养细胞层多层化，之后，(1)使培养液温度在上限临界溶解温度以上或在下限临界溶解温度以下，根据需要；(2)将所培养的前眼部相关细胞片或三维结构体紧密贴合在高分子膜上；(3)将其连同高分子膜一起剥离，由此制造前眼部相关细胞片或三维结构体。

Description

前眼部相关细胞片、三维结构体、及它们的制造方法

技术领域

本发明涉及在生物学、医学等领域中的前眼部相关细胞片、三维结构体、及它们的制造方法和使用它们的治疗方法。

背景技术

随着医疗技术的显著发展，近年来，用他人的器官替换难以治疗的器官的器官移植得到了普遍化。成为移植对象的器官十分多样，包括皮肤、角膜、肾脏、肝脏、心脏等，并且术后的疗程也变得格外良好，因此已被确立为医疗的一种技术。作为一个例子举出角膜移植，约40年前在日本也设立了角膜银行并开始了移植工作。但是，由于捐献者人数很少，相对仅国内每年需要角膜移植的患者就有约2万人来说，实际上能够进行移植治疗的患者只有其1/10，约2000人左右。现在的情况是尽管角膜移植的技术已被大致确立，但由于角膜捐献不足的问题，所以需要寻找下一种医疗技术。

基于这样的背景，从过去开始，将人工替代物和培养细胞使之组织化而成的移植物直接移植的技术受到关注。其代表性的例子可以举出人工皮肤和培养皮肤。在这里，使用合成高分子的人工皮肤具有产生排斥反应等的可能性，不宜作为移植用皮肤。另一方面，由于培养皮肤是将患者本人的部分正常皮肤培养到所希望的大小，因此使用它不需担心排斥反应等，可以说是最自然的掩蔽剂。

一直以来，这样的细胞培养是在玻璃表面上或在经过种种处理的合成高分子的表面上进行的。例如，经过如γ射线照射、硅涂布等表面处理的各种聚苯乙烯材质的容器等作为细胞培养用容器得到普及。使用这样的细胞培养用容器培养、增殖的细胞，通过用胰岛素之类的蛋白分解酶或化学药品进行处理，而从容器表面被剥离、回收。

但是，实施如上所述的化学药品处理来回收增殖的细胞时，处理工程繁杂，混入杂质的可能性大，并且增殖的细胞经过化学处理而转化或受到损伤，细胞原有的机能受到损害，具有如上等缺点。为了克服上述缺点，至今有若干技术被提案。

日本专利特公平2-23191号公报中记载了可以移植角蛋白组织的膜的制造方法，其特征为，在角蛋白组织的膜可以在容器表面上形成的条件下，在培养容器中培养源自人新生儿的角化表皮细胞，使用酶来剥离角蛋白组织的膜。具体而言，公开了这样的技术：将3T3细胞作为饲养层使其增殖、多层化，使用作为蛋白质分解酶的分散剂来回收细胞片。但是，该公报中所记载的方法具有如下缺点：

(1)分散剂源自菌，所回收的细胞片必须充分地洗净。

(2)所培养的每种细胞其分散剂处理条件都不同，必须对该处理熟练。

(3)通过分散剂处理来培养的表皮细胞在病理学上被活化。

(4)通过分散剂处理，胞外基质被分解。

(5)因此移植了该细胞片的患处易受感染。

然而，作为本发明对象的角膜上皮细胞、角膜内皮细胞、以及结膜上皮细胞等的前眼部相关细胞，其细胞/细胞间的结合不如皮肤细胞强，即使使用上述分散剂，培养后也无法作为整张细胞片进行剥离、回收。

为了解决该课题，最近提出，在除去了海绵层和上皮层的羊膜上培养角膜上皮细胞或结膜上皮细胞、并使之组织化，连同该羊膜一起作为移植用细胞片的技术(日本专利特开2001-161353号)。由于羊膜具有充分的膜强度，并且不具有抗原性，因此作为移植用细胞片的支持体比较合适，但是羊膜这种东西原先并不在眼内，为了更精密地构筑眼内组织，还是希望制造仅用眼内的细胞就具有充分强度的细胞片。

本发明以解决上述现有技术中的问题为目标来进行。即，本发明的目的在于提供可以以保持细胞与细胞间的桥粒结构、以及细胞与基材间的基底膜类蛋白质的状态进行回收的结构缺陷少的前眼部相关细胞片或三维结构体。另外，本发明的目的在于提供一种不必使用分散剂等酶来进行处理，而可以通过改变环境温度，将所培养、增殖的细胞容易地并且以作为整张细胞片具有充分强度的状态从支持体表面剥离、回收的方法。

发明内容

本发明人们为了解决上述课题，从各种角度加以探讨，进行了研究开发。其结果发现，在用温度响应性聚合物覆盖基材表面的细胞培养支持体上培养前眼部相关细胞，并根据需要使培养细胞层多层化，之后，使培养液温度在上限临界溶解温度以上或在下限临界溶解温度以下，将所培养的前眼部相关细胞片或三维结构体紧密贴合于高分子膜上，将其连同高分子膜一起剥离，由此可以得到结构缺陷少的前眼部相关细胞片或三维结构体。本发明基于上述认识得以完成。

即，本发明提供可以以保持细胞与细胞间的桥粒结构、以及细胞与基材间的基底膜类蛋白质的状态回收的结构缺陷少的前眼部相关细胞片或三维结构体。

另外，本发明提供前眼部相关细胞片或三维结构体的制造方法，其特征为，在用相对于水的上限或下限临界溶解温度为0～80℃的温度响应性聚合物覆盖基材表面而成的细胞培养支持体上培养细胞，根据需要按照常规方法使培养细胞层多层化，之后，

(1)使培养液温度在上限临界溶解温度以上或在下限临界溶解温度以下，

(2)将所培养的前眼部相关细胞片或三维结构体紧密贴合于高分子膜上，

(3)将其连同高分子膜一起剥离。

并且，本发明提供三维结构体的制造方法，其特征为，将用上述制造法得到的紧密贴合于高分子膜上的前眼部相关细胞片或三维结构体再次附着在细胞培养支持体、用温度响应性聚合物覆盖表面而成的细胞培养支持体、高分子膜、或其它细胞片等上，之后将紧贴着的高分子膜剥掉，通过重复上述操作来进行多层化。

并且，本发明提供用于治疗缺伤和/或创伤达到深部的组织的上述前眼部相关细胞片或三维结构体。

另外，本发明提供一种治疗方法，其特征为，对缺损和/或创伤达到深部的组织，移植上述前眼部相关细胞片或三维结构体。

本发明还提供不仅在医疗领域，作为用于评价化学物质、毒物或药品的安全性的细胞而有用的前眼部相关细胞片或三维结构体。

具体实施方式

作为在本发明的前眼部相关细胞片或三维结构体的制造中适合使用的细胞可以列举角膜上皮细胞、角膜内皮细胞、结膜上皮细胞等、及上皮干细胞，其种类不受任何限制。本发明中，所谓前眼部相关细胞片是表示：如上所述在活体中形成前眼部的各种细胞在培养支持体上以单层状被培养，之后从支持体剥离的细胞片；所谓其三维结构体是表示：其各种表皮培养细胞片单独或以组合的状态被多层化而成的细胞片。

本发明的前眼部相关细胞片或三维结构体在培养时不受以分散剂、胰岛素等为代表的蛋白质分解酶的损伤。因此，从基材剥离的前眼部相关细胞片或三维结构体，保持细胞与细胞间的桥粒结构，结构缺陷很少，并且强度高。由此，例如将所得到的前眼部相关细胞片或三维结构体以移植等为目标而使用的情况下，由于本发明的前眼部相关细胞片或三维结构体具有充分的强度，所以患处与外部完全隔离。另外，本发明的细胞片，在培养时所形成的细胞与基材间的基底膜类蛋白质也不会受到酶的破坏。因此，移植时能良好地与患处组织粘结，能够实施效率良好的治疗。对以上事实进行具体说明，在使用胰岛素等常用的蛋白质分解酶时，细胞与细胞间的桥粒结构、以及细胞与基材间的基底膜类蛋白质几乎无法保持，因而，细胞成为各自分开的状态被剥离。其中，关于作为蛋白质分解酶的分散剂，已知以这样的状态被剥离，即，对细胞与基材间的基底膜类蛋白质等破坏掉大部分、而对桥粒结构保持10～60％，所得到的细胞片强度很弱。相对于此，本发明的细胞片，是桥粒结构、基底膜类蛋白质皆残留80％或80％以上状态的细胞片，可以得到前述的种种效果。

如上所示，本发明的前眼部相关细胞片或三维结构体细胞兼具细胞与细胞间的桥粒结构和细胞与基材间的基底膜类蛋白质两者，而且是高强度的细胞片，利用先有技术是完全无法得到的细胞片。

在细胞培养支持体中，用于覆盖基材的温度响应性聚合物，其在水溶液中的上限临界溶解温度或下限临界溶解温度在0～80℃，更优选在20℃～50℃。上限临界溶解温度或下限临界溶解温度若超过80℃，细胞就有死亡的可能性，因此不优选。另外，上限临界溶解温度或下限临界溶解温度若低于0℃，通常细胞的增殖速度极度降低，或细胞会死亡，因此也不优选。

本发明中使用的温度响应性聚合物可以是均聚物或共聚物的任一类。这样的聚合物可以列举例如日本专利特开平2-211865号公报中记载的聚合物。具体而言，例如，由以下的单体单独聚合或者共聚得到。所使用的单体，可以列举例如(甲基)丙烯酰胺化合物、N-(或者N，N-二)烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物、或者乙烯醚衍生物，对于共聚物，可以使用其中任意两种或两种以上。另外，也可以使用与上述单体以外的单体类的共聚，聚合物之间的接枝或共聚，或者聚合物、共聚物的混合物。另外，也可以在不损害聚合物原有性质的范围内进行交联。

作为被实施覆盖的基材，从通常用于培养细胞的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、有机玻璃等化合物开始，到通常能够赋予形态的物质，例如上述之外的高分子化合物、陶瓷类等全都可以使用。

温度响应性聚合物向支持体的覆盖方法不受特别的限制，例如，可以按照日本专利特开平2-211865号公报中记载的方法进行。即，可以对基材和上述单体或高分子，利用电子束照射(EB)、γ射线照射、紫外线照射、等离子处理、电晕处理、有机聚合反应的任意种，或者利用涂布、混炼等物理吸附等进行所述覆盖。

本发明中所示的支持体材料，其特征为，表面有两个区域：覆盖有温度响应性高分子的A区域，以及由

(1)覆盖有与细胞亲和性低的高分子的区域，

(2)覆盖有与A区域不同量的温度响应性高分子的区域，

(3)覆盖有对与A区域不同的温度响应的高分子的区域，

中的任意一个，或者(1)～(3)的任意2个或3个的组合构成的B区域这两个区域。

其制造方法，只要是最终具有上述结构就不受任何限制，例如，可以列举单独或同时使用以下方法的方法：①在基材表面全部上首先制作B区域，然后遮住最终要成为B区域的部分后追加A区域的方法，或者相反先制成A再追加B的方法；②预先覆盖A、B两层，用超声波或扫描型仪器削去某一层的方法；③将覆盖物质平版印刷的方法等。

覆盖区域的形态没有任何限制，从上部观察，可以举出例如①由线和空白构成的图案、②水滴状的图案、③格子状的图案、其它特殊形状的图案、或者混合有上述形状的状态的图案，而不受任何限制，不过考虑到眼内各组织的状态，优选②中的圆形图案。

覆盖区域的大小没有任何限制，不过考虑到眼内各组织的大小、以及所培养的前眼部相关细胞片或三维结构体在剥离时的收缩，以圆形图案使用其圆内的细胞的时候，该圆的直径在5cm或5cm以下，优选在3cm或3cm以下，更优选在2cm或2cm以下。使用圆的外侧的时候，该圆的直径在1mm或1mm以下，优选在3mm或3mm以下，更优选在5mm或5mm以下。

温度响应性高分子的覆盖量最好是0.3～6.0μg/cm²的范围，优选0.5～3.5μg/cm²，更优选0.8～3.0μg/cm²。覆盖量少于0.2μg/cm²时，即使给与刺激，该高分子上的细胞也难以剥离，操作效率变得非常差，不优选。相反，覆盖量在6.0μg/cm²以上时，细胞难以附着在该区域，难以充分附着细胞。

本发明中的与细胞亲和性低的高分子，只要是不使细胞附着的高分子就不受任何限制，例如，可以列举聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素等亲水性高分子，或者硅酮高分子、氟高分子等的强疏水性高分子等。

本发明中，细胞的培养是在如上所述地制造的细胞培养支持体(例如，细胞培养皿)上进行的。覆盖在基材表面上的前述聚合物具有上限临界溶解温度时，培养基的温度在该温度以下，而覆盖在基材表面上的前述聚合物具有下限临界溶解温度时，培养基的温度在该温度以上，除此之外，培养基的温度不受特别的限制。但是，在导致培养细胞无法增殖的低温区域、或导致培养细胞死亡的高温区域中的培养显然是不合适的。温度以外的培养条件只要按照常规方法就可以，不受特别的限制。例如，对于使用的培养基，可以是添加有公知的胎牛血清(FCS)等血清的培养基，另外也可以是不添加这类血清的无血清培养基。

本发明的方法中，按照前述方法，根据前眼部相关细胞片或三维结构体的使用目的来设定培养时间就可以。所培养的细胞从支持体材料剥离回收时，将所培养的前眼部相关细胞片或三维结构体紧密贴合在高分子膜上，通过将附着有细胞的支持体材料的温度调节到支持体基材的覆盖聚合物的上限临界溶解温度以上或者下限临界溶解温度以下，可以连同高分子膜一起进行剥离。另外，细胞片的剥离可以在培养细胞的培养液中进行，也可以在其它等渗液中进行，可以适应目的进行选择。紧密贴合前眼部相关细胞片或三维结构体时所使用的高分子膜，可以列举例如聚二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯、聚乙烯、纤维素及其衍生物、几丁质(chitin)、壳聚糖(chitosan)、胶原蛋白、乌拉坦(urethane)等。

本发明中的三维结构体的制造方法不受特别的限定，例如，可以列举通常所知的3T3细胞作为饲养层进行增殖、多层化的方法，或者利用上述紧贴在高分子膜上的表皮培养细胞片制造的方法等。具体而言，可以例示如下方法：

(1)将与高分子膜紧密贴合的细胞片附着在细胞培养支持体上，之后加入培养基，将高分子膜剥离细胞片，然后附着其它与高分子膜紧密贴合的细胞片，通过重复这些操作，使细胞片多层化的方法。

(2)将与高分子膜紧密贴合的细胞片翻转，以高分子膜一侧固定于细胞培养支持体上，在细胞片一侧附着其它的细胞片，之后加入培养基，将高分子膜剥离细胞片，然后附着其它细胞片，重复上述操作，使细胞片多层化。

(3)将与高分子膜紧密贴合的细胞片彼此之间以细胞片一侧紧密贴合的方法。

(4)将与高分子膜紧密贴合的细胞片接触到活体的患处，使细胞片附着于活体组织上之后，剥掉高分子膜，再重叠其它的细胞片的方法。

本发明中的三维结构体，不一定是仅由角膜上皮细胞形成。例如，也可以在由角膜上皮细胞形成的细胞片或三维结构体上，叠加进行同样的操作制造的角膜内皮细胞片和/或结膜上皮细胞片。在使三维结构体更加接近活体内的前眼部组织的方面，这种技术极为有效。

为了达到高收获率地剥离、回收前眼部相关细胞片或三维结构体的目的，可以单独使用或者同时使用下述方法：或者轻敲或者晃动细胞培养支持体的方法，或用移液器搅拌培养基的方法等。另外，根据需要也可以用等渗液等冲洗培养细胞进行剥离回收。

根据上述方法得到的前眼部相关细胞片或三维结构体，与以往的方法得到的产品相比，不论在剥离性方面，还是在非侵袭性方面，都极为优良，强烈期待其在移植用角膜等的临床应用。特别是，本发明的前眼部相关细胞的三维结构体与以往的移植细胞片不同，由于保持了基底膜类蛋白质，所以即使在移植时较深地切削患处组织，也能成活。可以认为，这是可以提高患处的治疗效率、进一步可以减轻患者负担的极其有效的技术。另外，本发明的方法中所使用的细胞培养支持体可以重复使用。

实施例

以下基于本发明的实施例进行进一步详细说明，但这些实施例对本发明没有任何限定。

实施例1、2

在市售的聚苯乙烯制细胞培养皿(ベクトン·デイツキンソン·ラブウエア(Becton Dickinson Labware)公司制、フアルコン(FALCON)3001佩氏培养皿(Petri dish)(直径3.5cm))上，涂布0.10ml 40％(实施例1)、50％(实施例2)  N-异丙基丙烯酰胺单体的异丙醇溶液。在该涂布面上盖上带有一个2cm直径的孔的直径3.5cm的金属制掩模后，保持原状地照射0.25MGy强度的电子束，将聚N-异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)在培养皿表面上固定成圆形(岛状部分。掩模下的部分没有受到电子束成为什么都没有覆盖的海部分。)。然后剥下该金属制掩模，涂布0.10ml 20％丙烯酰胺单体的异丙醇溶液。然后，这次仅在该圆形部分放上直径2cm的圆形金属制掩模，保持原状地照射0.25MGy强度的电子束，在圆形PIPAAm层的外侧固定化聚丙烯酰胺。照射后取下金属制掩模，用离子交换水洗净培养皿，除去残余的单体和未与培养皿结合的PIPAAm，在净化台内干燥，用环氧乙烷气体灭菌，得到细胞培养支持体材料。在这里，岛部分的PIPAAm的覆盖量，根据在不使用掩模以外与上面完全相同的条件下制造的细胞培养支持体材料求得。其结果发现在该条件下，温度响应性高分子在基材表面分别覆盖1.6μg/cm²(实施例1)、2.2μg/cm²(实施例2)。在得到的细胞培养支持体材料上，通过常规方法培养正常兔角膜上皮细胞(使用培养基：コル礻パツク(クラボウ(株)制)、37℃、5％CO₂下)。其结果，角膜上皮细胞在两种细胞培养支持体材料上都仅在中心部的圆形部分正常地附着、增殖。培养14日后，在所培养的细胞的上面覆盖直径2cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜，轻轻地吸去培养基，通过连同细胞培养支持体材料一起在20℃培养30分钟后冷却，两种细胞培养支持体材料上的细胞皆连同覆盖在其上的膜一起剥离。所覆盖的膜都可以很容易地从两种细胞片剥下来。并且，剥离下来的细胞片保持细胞与细胞间的桥粒结构、以及细胞与基材间的基底膜类蛋白质，且作为整张细胞片具有充分的强度。

另外，上述各实施例中，“低温处理”是在20℃下培养30分钟的条件下进行，本发明中的“低温处理”不限于这一温度和时间。本发明中的“低温处理”优选的温度条件在0℃～30℃，优选的处理时间为2分钟～1小时。

实施例3

在实施例1的细胞培养支持体上，除将培养基换成含有丝裂霉素C的常用的保绿培养基(green′s media)(DMEM+AB(用于制造饲养层)、用于源自人新生儿的角化表皮细胞)之外，用同样的方法培养正常兔角膜上皮细胞。其结果，培养支持体材料上的角膜上皮细胞仅在中心部的圆形部分正常地附着、增殖，并且多层化。培养16天后，连同细胞培养支持体材料一起在20℃培养30分钟并冷却，从而剥离多层化角膜上皮细胞。所剥离的多层化角膜上皮细胞(三维结构体)是圆形的，保持了细胞与细胞间的桥粒结构、以及细胞与基材间的基底膜类蛋白质，作为整张细胞片具有充分的强度。

比较例1、2

除了将制造实施例1的细胞培养支持体时的单体溶液浓度分别变成5％(比较例1)、60％(比较例2)以外，与实施例1同样地制造细胞培养支持体材料。得到的细胞培养支持体上的覆盖量分别为0.1μg/cm²(比较例1)、6.2μg/cm²(比较例2)。之后，按照与实施例1同样的操作，尝试培养、剥离正常兔角膜上皮细胞。其结果，比较例1的支持体上的细胞即使进行低温处理也难以剥离，相反，在比较例2的支持体上难以附着细胞，难以使细胞充分增殖，两者的细胞培养支持体作为培养基材全都不能令人满意。

实施例4

按照常规方法从兔角膜回收角膜内皮细胞。在实施例1的接合了聚异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)的培养皿上以2×10⁶cells/cm²的细胞密度进行接种，按照常规方法进行培养(使用培养基：含10％胎牛血清的DMEM、37℃、5％CO₂下)。其结果，该角膜内皮细胞也仅在中心部的圆形部分正常地附着、增殖。10天后，在确认角膜内皮细胞成为铺满状态之后，与实施例1同样地在所培养的细胞上覆盖直径2cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜，轻轻地吸去培养基，连同细胞培养支持体材料一起在20℃培养30分钟并冷却，从而将细胞与覆盖在其上的膜一起剥离。所覆盖的膜可以很容易地从细胞片剥下来。并且，剥离下来的细胞片保持细胞与细胞间的桥粒结构、以及细胞与基材间的基底膜类蛋白质，作为整张细胞片具有充分的强度。

实施例5

在实施例2的细胞培养支持体材料的制造方法中，首先，将直径2cm的圆形金属制掩模放置于培养皿的中心，在周围固定PIPAAm，然后覆盖开有直径2cm的圆形孔的金属制掩模，从而制造在中心部固定了聚丙烯酰胺的细胞培养支持体材料(与实施例1的内侧高分子层和外侧高分子层刚好相反)。孔外侧的PIPAAm的覆盖量为2.1μg/cm²。然后，按照常规方法从兔眼回收结膜上皮细胞。在前面的接合了高分子的培养皿上以2×10⁵cells/cm²的细胞密度进行接种，按照常规方法进行培养(使用培养基：含10％胎牛血清的MEM、37℃、5％CO₂下)。其结果，被接种的结膜上皮细胞仅在中心部分的周围正常地附着、增殖。10天后，在确认结膜上皮细胞成为铺满状态之后，与实施例1同样地在所培养的细胞上覆盖聚二氟乙烯(PVDF)膜，轻轻地吸去培养基，连同细胞培养支持体材料一起在20℃培养30分钟并冷却，从而将细胞和覆盖在其上的膜一起剥离。所覆盖的膜可以很容易地从细胞片剥下来。并且，剥离下来的结膜上皮细胞片保持了细胞与细胞间的桥粒结构、以及细胞与基材间的基底膜类蛋白质，作为整张细胞片具有充分的强度。

实施例6

对不经冷却而轻轻地除去培养基的实施例2的培养皿上的角膜上皮细胞片，立即重叠实施例1中剥离下来的角膜上皮细胞片。之后，轻轻地加入实施例3中使用的培养基，剥去紧密贴合的高分子膜。以该状态培养2天，从而得到角膜上皮细胞的多层化细胞片(三维结构体)。所得到的角膜上皮细胞的多层化细胞片通过与实施例3同样地实施低温处理，从支持体表面剥离。被剥离的角膜上皮细胞的多层化细胞片(三维结构体)，作为整张细胞片具有充分的强度。

实施例7

对不经冷却而轻轻地除去培养基的实施例4的培养皿上的角膜内皮细胞片，立即重叠实施例3中剥离下来的角膜上皮细胞的多层化细胞片。之后，轻轻地加入实施例3中使用的培养基，剥去紧密贴合的高分子膜。以该状态培养2天，得到具有角膜内皮细胞层的角膜上皮细胞的多层化细胞片(三维结构体)。得到的角膜上皮细胞的多层化细胞片通过与实施例3同样地实施低温处理，从支持体表面剥离。剥离下来的三维结构体保持了细胞与细胞间的桥粒结构、以及细胞与基材间的基底膜类蛋白质，作为整张细胞片具有充分的强度。

实施例8

对不经冷却而轻轻地除去培养基的实施例4的培养皿上的角膜内皮细胞片，首先加入含有5％IV型胶原蛋白的培养基(除含有胶原蛋白以外，与实施例4的培养基同样的培养基)，按照原样静置20分钟。之后，再次不经冷却而轻轻地除去培养基。对残留在培养皿上的角膜内皮细胞片，立即重叠实施例3中剥离的角膜上皮细胞的多层化细胞片。之后，轻轻地加入实施例3中使用的培养基，剥去紧密贴合的高分子膜。以该状态培养2天，得到具有角膜内皮细胞层的角膜上皮细胞的多层化细胞片(三维结构体)。得到的角膜上皮细胞的多层化细胞片通过与实施例3同样地实施低温处理，从支持体表面剥离。剥离下来的三维结构体作为整张细胞片具有充分的强度。

实施例9

对不经冷却而轻轻地除去培养基的实施例5的培养皿上的开有孔的结膜上皮细胞片，立即放置实施例7中剥离的具有角膜内皮细胞层的角膜上皮细胞的多层化细胞片(三维结构体)，并使其部分重叠。之后，轻轻地加入实施例3中使用的培养基，剥去紧密贴合的高分子膜。以该状态培养2天，得到附着有结膜上皮细胞片、且具有角膜内皮细胞层的角膜上皮细胞多层化细胞片(三维结构体)。得到的三维结构体通过与实施例3同样地实施低温处理，从支持体表面剥离。剥离下来的三维结构体作为整张细胞片具有充分的强度。

实施例10

按照常规方法，将实施例3中得到的角膜上皮细胞的多层化细胞片(三维结构体)移植给角膜上皮细胞部分缺损的兔子。此时，直接将角膜上皮细胞的多层化细胞片缝合在创伤部位。大约3周后拆线，结果发现角膜上皮细胞的多层化细胞片在眼球上良好地成活。

根据以上结果，使用本技术可以仅用原先位于眼内的细胞来制成具有充分强度的细胞片。这一事实就治疗的效率化、由此减轻患者的负担，并且构筑更精密的组织方面来说，可以认为是一种极其有效的技术。

产业上的利用可能性

本发明的前眼部相关细胞片或三维结构体，不会像用分散剂处理的情况那样分解上皮粘附素(E-cadherin)、层粘连蛋白5(laminin5)，并且结构缺陷极少，强烈地期待其在皮肤移植等的临床应用。因而，本发明是在细胞工学、医用工学等的医学、生物学等领域极为有用的发明。

Claims (14)

1.前眼部相关细胞片或三维结构体，该前眼部相关细胞片或三维结构体结构缺陷少，保持了细胞与细胞间的桥粒结构、以及细胞与基材间的基底膜类蛋白质，以作为整张细胞片具有充分强度的状态被回收，所述前眼部相关细胞片仅由角膜上皮细胞、角膜内皮细胞、结膜上皮细胞和上皮干细胞中的任意一种或多种前眼部相关细胞构成，所述三维结构体是将角膜上皮细胞进行多层化培养而成的。

2.前眼部相关细胞片或三维结构体，该前眼部相关细胞片或三维结构体结构缺陷少，保持了细胞与细胞间的桥粒结构、以及细胞与基材间的基底膜类蛋白质，以作为整张细胞片具有充分强度的状态被回收，所述前眼部相关细胞片仅由前眼部相关细胞构成，所述前眼部相关细胞是角膜上皮细胞、角膜内皮细胞、结膜上皮细胞和上皮干细胞中的任意一种或多种；所述三维结构体是至少由角膜上皮细胞片或其多层化物与角膜内皮细胞组合而成的。

3.根据权利要求2记载的前眼部相关细胞片或三维结构体，所述三维结构体是在权利要求2的三维结构体上进一步组合结膜上皮细胞而成的。

4.权利要求1～3的任意一项记载的前眼部相关细胞片或三维结构体的制造方法，其特征为，在用相对于水的上限或下限临界溶解温度为0～80℃的温度响应性高分子覆盖基材表面而成的细胞培养支持体上培养细胞，根据需要按照常规方法使培养细胞层多层化，之后，

(1)使培养液温度在上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，进一步根据需要，

(2)将所培养的前眼部相关细胞片或其多层化细胞片紧密贴合于高分子膜上，

(3)将其连同高分子膜一起剥离。

5.根据权利要求4记载的前眼部相关细胞片或三维结构体的制造方法，其特征为，使用表面具有两个区域的细胞培养支持体，该两个区域是：覆盖有温度响应性高分子的A区域，以及由

(1)覆盖有与细胞亲和性低的高分子的区域，

(2)覆盖有与A区域不同量的温度响应性高分子的区域，

(3)覆盖有对与A区域不同的温度响应的高分子的区域，中的任意一个，或者(1)～(3)中的任意2个或3个的组合构成的B区域。

6.根据权利要求4或5记载的三维结构体的制造方法，其包括：将权利要求4或5中得到的前眼部相关细胞片或三维结构体，再次附着到细胞培养支持体、用温度响应性聚合物覆盖表面的细胞培养支持体、或高分子膜上进行叠加，或者将权利要求4或5中得到的前眼部相关细胞片或三维结构体的一部分或全部附着到其它细胞片上进行叠加。

7.根据权利要求4或5记载的前眼部相关细胞片或三维结构体的制造方法，所述剥离是未经蛋白质分解酶处理的。

8.根据权利要求6记载的前眼部相关细胞片或三维结构体的制造方法，所述剥离是未经蛋白质分解酶处理的。

9.根据权利要求4或5记载的前眼部相关细胞片或三维结构体的制造方法，所述温度响应性高分子是聚(N-异丙基丙烯酰胺)。

10.根据权利要求6记载的前眼部相关细胞片或三维结构体的制造方法，所述温度响应性高分子是聚(N-异丙基丙烯酰胺)。

11.根据权利要求4或5记载的前眼部相关细胞片或三维结构体的制造方法，所述高分子膜是经亲水化处理的聚二氟乙烯。

12.根据权利要求6记载的前眼部相关细胞片或三维结构体的制造方法，所述高分子膜是经亲水化处理的聚二氟乙烯。

13.根据权利要求6记载的三维结构体的制造方法，所述其它细胞片由角膜上皮细胞片及其多层化细胞片、角膜内皮细胞片、以及结膜上皮细胞片，以及根据权利要求4或5记载的制造方法制造的三维结构体中的一种或两种或两种以上构成。

14.权利要求1～3的任意一项记载的前眼部相关细胞片或三维结构体在制备治疗前眼部组织的一部分或全部损伤或缺损的患处的前眼部相关细胞片或三维结构体中的应用。