CN1747753B - 用于形成角膜上皮的细胞片、及其制造方法和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题是提供对前眼部组织附着性良好的用于形成角膜上皮的细胞片。针对于此，在特定的条件下，在用0～80℃的温度范围内水合力变化的温度响应性聚合物覆盖基材表面而成的细胞培养支持体上培养用于形成角膜上皮的细胞，根据需要使培养细胞多层化，之后，(1)使培养液温度在上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，(2)将所培养的用于形成角膜上皮的细胞紧密贴合在载体上，(3)将其连同载体一起剥离，由此制造了用于形成角膜上皮的细胞片，从而解决了上述课题。

Description

用于形成角膜上皮的细胞片、及其制造方法和使用方法
技术领域
本发明涉及在生物学、医学等领域中，用于形成角膜上皮的细胞片、其制造方法和使用它们的治疗方法。
背景技术
随着医疗技术的显著发展，近年来，用他人的器官替换难以治疗的器官的器官移植得到了普遍化。成为移植对象的器官十分多样，包括皮肤、角膜、肾脏、肝脏、心脏等，并且术后的疗程也变得格外良好，因此已被确立为医疗的一种技术。作为一个例子举出角膜移植，约40年前在日本也设立了角膜银行并开始了移植工作。但是，由于角膜捐献者人数很少，相对于仅国内每年需要角膜移植的患者就有约2万人来说，实际上能够进行移植治疗的患者只有其1/10，约2000人左右。现在的情况是尽管角膜移植的技术已被大致确立，但由于角膜捐献不足的问题，所以需要寻找下一种医疗技术。
基于这样的背景，从过去开始，将人工替代物和培养细胞使之组织化而成的移植物直接移植的技术受到关注。其代表性的例子可以举出人工皮肤和培养皮肤。但是，使用合成高分子的人工皮肤具有产生排斥反应等的可能性，作为移植用皮肤不能令人满意。另一方面，由于培养皮肤是将患者本人的部分正常皮肤培养到所希望的大小，因此使用它不需担心排斥反应等，可以说是最自然的掩蔽剂。
一直以来，这样的细胞培养是在玻璃表面上或在经过种种处理的合成高分子的表面上进行的。例如，进行了如Y射线照射、硅酮涂布等表面处理的各种聚苯乙烯材质容器等作为细胞培养用容器得到普及。使用这样的细胞培养用容器培养、增殖的细胞，通过用胰岛素之类的蛋白分解酶或化学药品进行处理而被从容器表面剥离、回收。
但是，实施如上所述的化学药品处理来回收增殖的细胞时，处理工程繁杂，混入杂质的可能性大，并且增殖的细胞经过化学处理而转化或受到损伤、细胞原有的机能受到损害，具有如上等缺点。为了克服上述缺点，至今提出了若干技术方案。
日本专利特公平2-23191号公报中记载了制造可以移植角蛋白组织的膜的方法，其特征为，在角蛋白组织的膜可以在容器表面上形成的条件下，在培养容器中培养源自人新生儿的角化表皮细胞，使用酶来剥离角蛋白组织的膜。具体而言，公开了这样的技术：将3T3细胞作为饲养层使其增殖、多层化，使用作为蛋白质分解酶的分散剂回收细胞片。但是，该公报中所记载的方法
具有如下缺点：
(1)分散剂源自菌，所回收的细胞片必须充分地洗净。
(2)所培养的每种细胞其分散剂处理条件都不同，而且对该处理必须熟练。
(3)通过分散剂处理来培养的表皮细胞在病理学上被活化。
(4)由于分散剂处理，胞外基质被分解。
(5)因此移植了该细胞片的患处易受感染。
除上述的现有技术的缺点之外，作为本发明对象的角膜上皮细胞、角膜内皮细胞、以及结膜上皮细胞等前眼部相关细胞，还具有如下缺点：前眼部相关细胞由于细胞和细胞间的结合不如皮肤细胞强，因此即使使用上述分散剂，培养后也无法作为整个细胞片进行剥离、回收。
为了解决上述问题，最近提出，在除去了海绵层和上皮层的羊膜上培养角膜上皮细胞或结膜上皮细胞、并使之组织化，并连同该羊膜一起作为移植用细胞片的技术(日本专利特开2001-161353号)。由于羊膜具有充分的膜强度，并且不具有抗原性，因此作为移植用细胞片的支持体相当合适，但是羊膜这种东西原先并不在眼睛内，为了更精密地构筑眼内组织，还是希望制造仅用眼内的细胞就具有充分强度的细胞片，该细胞片与角膜实质组织直接接触。
另外，在日本专利特愿2001-226141号中，在细胞培养支持体上培养前眼部相关细胞，该细胞培养支持体是将相对于水的上限或下限临界溶解温度为0～80℃的温度响应性聚合物覆盖在基材表面上而成的，根据需要按照常规方法将培养细胞层多层化，通过只改变支持体的温度来剥离所培养的细胞片，制造具有充分强度的细胞片成为可能。另外，在该细胞片上还保持有基底膜类蛋白质，与上述用分散剂处理的细胞片相比，对组织的成活性也得到明显改善。但是，考虑到实际减轻患者的负担，希望能够进一步改善该成活性。
另外，最近在医疗现场也有多种方法被提案。例如，WO98/31316中提出，为了治疗近视进行PRK法、LASIK法时，利用培养的角膜上皮细胞片的技术。但是，这里的培养角膜上皮细胞片是由上述分散剂剥离的细胞片，存在这样的问题，即，培养角膜上皮细胞片对激光削薄的角膜组织的附着性差，无法取得显著的治疗效果。
另外，2001年5月10目的每日新闻纪事中，对角膜疾病的患者提出代替角膜粘贴培养口腔粘膜，促使患者角膜再生的技术。但是，这里的培养口腔粘膜是由上述分散剂剥离的粘膜，存在这样的问题，即，培养口腔粘膜对患者的角膜组织的附着性差，无法取得显著的治疗效果。
本发明以解决上述现有技术的问题为目标。即，本发明的目的在于提供对前眼部组织的附着性良好的用于形成角膜上皮的细胞片。另外，本发明的目的在于提供其制造方法以及使用方法。
发明内容
本发明人们为了解决上述课题，从各种角度加以探讨，进行了研究开发。其结果发现，在用温度响应性聚合物覆盖基材表面的特定条件的细胞培养支持体上，在特定条件下培养用于形成角膜上皮的细胞，之后，使培养液温度在上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，将所培养的用于形成角膜上皮的细胞片附着在特定的载体上，通过一边抑制细胞片的收缩，一边将其连同载体一起进行剥离，可以得到对活体组织附着性非常优良的用于形成角膜上皮的细胞片。本发明基于上述认识得以完成。
即本发明提供了对前眼部组织的附着性良好的、紧密贴合在载体上的用于形成角膜上皮的细胞片。
另外，本发明提供了对活体组织的附着性非常良好的用于形成角膜上皮的细胞片的制造方法，其特征为，在用0～80℃的温度范围内水合力变化的温度响应性聚合物覆盖基材表面而成的细胞培养支持体上培养用于形成角膜上皮的细胞，根据需要按照常规方法使培养细胞层多层化，之后，
(1)使培养液温度在上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，
(2)将所培养的用于形成角膜上皮的细胞紧密贴合在载体上，
(3)将其连同载体一起剥离。
本发明还提供用于治疗损伤和/或创伤达到深部的组织的、对活体组织的附着性非常良好的用于形成角膜上皮的细胞片。
本发明还进一步提供治疗方法，其特征为，对损伤和/或创伤达到深部的组织，移植对活体组织的附着性非常良好的用于形成角膜上皮的细胞片。
本发明进一步提供不仅是医疗领域，作为用于评价化学物质、毒物或药品的安全性的细胞有用的用于形成角膜上皮的细胞片。
具体实施方式
如上所述，本发明提供紧密贴合在载体上的用于形成角膜上皮的细胞片。在本发明中，称为“用于形成角膜上皮的细胞片”时，包含了由角膜上皮细胞形成的再生角膜上皮细胞片，或由角膜上皮细胞以外的细胞形成的角膜上皮代替细胞片。
作为本发明的用于形成角膜上皮的细胞片使用再生角膜上皮细胞片时，适合使用的细胞可以列举角膜上皮细胞及其干细胞，但其种类不受任何制约。
另外，作为本发明的用于形成角膜上皮的细胞片使用角膜上皮代替细胞片时，适合使用的细胞可以列举例如存在于颊膜、牙龈上的口腔粘膜细胞、毛根细胞、结膜上皮细胞中的任意一种或两种以上的混合物，或者它们与角膜上皮细胞的混合物，但其种类不受任何制约。制造这些的细胞片等时，不必在角膜上皮代替细胞的培养中添加特别的添加物，例如将口腔粘膜细胞作为角膜上皮代替细胞使用时，可以使用口腔粘膜细胞的标准的细胞培养方法进行培养，制造细胞培养片等。
本发明的前后内容中，用于形成角膜上皮的细胞片，可以是单层细胞片的状态、也可一是多层化细胞片的状态。因此，称作“再生角膜上皮细胞片”时，包括再生角膜上皮细胞的单层细胞片或多层化细胞片；称作“角膜上皮代替细胞片”时，包括角膜上皮代替细胞的单层细胞片或多层化细胞片。即，用于形成角膜上皮的细胞片可以是再生角膜上皮细胞或角膜上皮代替细胞的单层细胞片或者多层化细胞片的任意一种。
本发明中，所谓再生角膜上皮细胞片是指，上述各种细胞在培养支持体上培养成单层状，之后，从支持体剥离的细胞片；其多层化细胞片是指，该再生角膜上皮细胞片以单独状态或以与其它细胞形成的细胞片组合的状态多层化而形成的细胞片。
另外，本发明中，所谓角膜上皮代替细胞片是指，上述各种细胞在培养支持体上培养成单层状，之后，从支持体剥离的细胞片；其多层化细胞片是指，该角膜上皮代替细胞片以单独状态或以与其它细胞形成的细胞片组合的状态多层化而形成的细胞片。
本发明的用于形成角膜上皮的细胞片在培养时不会受到以分散剂、胰岛素等为代表的蛋白质分解酶引起的损伤。因此，从基材上剥离的用于形成角膜上皮的细胞片，保持着细胞-细胞间的桥粒结构，结构的缺陷少，强度高。另外，本发明的细胞片在培养时形成的细胞-基材间的基底膜类蛋白质也不会受到酶的破坏。因此，移植时能够与活体组织良好地粘结，可以实施效率优良的治疗。像这样具有对活体组织的附着性非常高的性质，在本发明中称为“高附着性”。
对以上事实进行具体说明，使用胰岛素等常用的蛋白质分解酶的情况下，细胞-细胞间的桥粒结构以及细胞、基材间的基底膜类蛋白质等几乎无法保持，因而，细胞成为各自分开的状态被剥离。其中，关于作为蛋白质分解酶的分散剂，已知对细胞-细胞间的桥粒结构可以以保持10～60％的状态剥离，但是对细胞-基材间的基底膜类蛋白质等破坏掉大部分，所以得到的细胞片强度弱。与之相对，本发明的细胞片，桥粒结构、基底膜类蛋白质残留了80％或80％以上，可以得到前述的种种效果。从而，上述的“高附着性”在结构上是指，桥粒结构和/或基底膜类蛋白质残留了80％或80％以上的状态。
本发明的用于形成角膜上皮的细胞片在作为活体组织的前眼部组织能极其良好地成活；即具有“高附着性”。我们发现，作为实现该性质的要因，必须抑制从支持体表面剥离的再生角膜上皮细胞片或其多层化细胞片的收缩。此时，用于形成角膜上皮的细胞片的收缩率在细胞片内的任意方向的长度上都希望达到20％或20％以下，优选是10％或10％以下，更优选是5％或5％以下。在细胞片的任意方向的长度上达到20％或20％以上时，剥离的细胞变松弛，该状态下附着在活体组织，也无法紧密贴合在组织上，无法达到本发明所提供的“高成活性”。
抑制用于形成角膜上皮的细胞片的收缩的方法，只要是不让细胞片收缩，就不受任何方法上的制约，例如可以举出，从支持体剥离用于形成角膜上皮的细胞片时，在该细胞片上紧密贴合切掉了中心部分的环状载体等，将该载体与细胞片一起剥离的方法等。
紧密贴合用于形成角膜上皮的细胞片时使用的载体，是为了保持本发明的细胞片不收缩的结构物，可以使用例如聚合物膜或由聚合物膜成型的结构物、金属性夹具等。例如，使用聚合物作为载体材料时，其具体的材料可以列举聚二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯、聚乙烯、纤维素及其衍生物、纸类、几丁质(chitin)、壳聚糖(chitosan)、胶原质、乌拉坦(urethane)等。
本发明中所谓紧密贴合的情况是指，在细胞片与载体的边界面上，细胞片在载体上不会错离也不会移动，以使细胞片不收缩的状态，可以由物理性的结合而紧密贴合，也可以通过两者之间存在的液体(例如培养液、其他等渗液)紧密贴合。
载体的形状不受特别的限制，例如，移植所得到的用于形成角膜上皮的细胞片时，使用在载体的一部分上切掉与移植部位同等大小或者比移植部位大的部分的载体，则细胞片仅固定在被切掉的周围的部分，仅将位于切掉部分的细胞片接触到移植部位就可以，是比较合适的。
另外，本发明的细胞片，可以在支持体表面上接种用于形成角膜上皮的细胞后，经过培养而得到，但是最好是细胞在支持体表面上达到铺满(充满的状态)后21天以内，优选15天以内，更优选10天以内。若细胞达到铺满(充满的状态)后21天以上，则所剥离的用于形成角膜上皮的细胞片的最下层的细胞活性降低，因此附着性也降低，无法达到本发明的特征——“高成活性”。
本发明的用于形成角膜上皮的细胞片，除可用于治疗例如角膜糜烂、角膜溃疡等前眼部组织的部分或全部损伤或缺损的患处等之外，还可用于治疗不具有角膜上皮细胞的双眼性的难治性角结膜疾病。本发明的前眼部组织只要是前眼部则不被特别限定，通常，可以列举角膜上皮组织、鲍曼氏(Bowman′s)组织、角膜实质组织等。在这里所谓难治性角结膜疾病包含例如皮肤粘膜眼症候群(Stevens-Johnson症候群)、眼部类天胞疮、烫伤、碱腐蚀、酸腐蚀之类的疾病。
本发明的用于形成角膜上皮的细胞片，如上所示，是对活体组织——前眼部组织能极其良好地附着的细胞片，是从现有技术完全无法得到的产品。
并且，本发明还提供了由以下的制造方法制造上述本发明的用于形成角膜上皮的细胞片的方法。即，提供了用于形成角膜上皮的细胞片的制造方法，其特征为，在用0～80℃的温度范围内水合力变化的温度响应性聚合物覆盖基材表面而成的细胞培养支持体上培养用于形成角膜上皮的细胞，根据需要按照常规方法使培养细胞层多层化，之后，
(1)使培养液温度在上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，
(2)将所培养的用于形成角膜上皮的细胞紧密贴合在载体上，
(3)将其连同载体一起剥离。
用这种方法得到的用于形成角膜上皮的细胞片具有对活体组织有“高附着性”的特征。
细胞培养支持体上用于覆盖基材的温度响应性聚合物，其特征为水合力在0～80℃温度范围内变化，优选在20℃～50℃温度范围内变化。这样的温度响应性聚合物的一种情况，可以举出在水溶液中具有上限临界溶解温度或下限临界溶解温度0～80℃，优选在20℃～50℃的聚合物。若超过80℃，细胞就有死亡的可能性，因此不优选。另外，若低于0℃，通常细胞增殖速度极度降低，或细胞会死亡，因此也不优选。
本发明中，从细胞培养支持体上剥离用于形成角膜上皮的细胞片时，优选低温处理。本发明中低温处理优选的温度条件为0℃～30℃，优选的处理时间为2分钟～1小时，但并不限定于这些温度及时间。作为优选条件的一个例子，低温处理可以使用在20℃培养30分钟这样的条件。
本发明中使用的温度响应性聚合物可以是均聚物或共聚物的任一类。这样的聚合物可以列举例如日本专利特开平2-211865号公报中记载的聚合物。具体而言，例如，由以下的单体单独聚合或者共聚得到。可使用的单体，例如可以列举(甲基)丙烯酰胺化合物、N-(或者N，N-二)烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物、或者乙烯醚衍生物，对于共聚物，可以使用其中任意两种或两种以上。另外，也可以使用与上述单体以外的单体类的共聚，聚合物之间的接枝或共聚，或者聚合物、共聚物的混合物。另外，也可以在不损害聚合物原有性质的范围内进行交联。
被实施覆盖的基材，从常用于细胞培养的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、有机玻璃等化合物开始，到通常能够赋予形态的物质，例如上述之外的聚合物、陶瓷类等全都可以使用。
温度响应性聚合物向支持体上覆盖的方法不受特别的限制，例如，可以按照日本专利特开平2-211865号公报中记载的方法进行。即，可以对基材和上述单体或聚合物，利用电子束照射(EB)、Y射线照射、紫外线照射、等离子处理、电晕处理、有机聚合反应的任意种，或者利用涂布、混炼等物理吸附等进行所述覆盖。
温度响应性聚合物的覆盖量最好是0.4～4.5μg/cm2的范围，优选0.7～3.5μg/cm2，更优选0.9～3.0μg/cm2。覆盖量少于0.2μg/cm2时，即使给与刺激，该聚合物上的细胞也难以剥离，操作效率非常差，不优选。反之，覆盖量在4.5μg/cm2以上时，细胞难以附着在该区域，难以充分附着细胞。
本发明中对支持体的形态没有特别的限制，例如可以列举皿、multiplate微孔板、烧瓶、细胞培养小室(Cell Insert)等。其中，特别对于细胞培养小室，例如可以将多层化角膜上皮细胞时所必需的3T3饲养细胞与角膜上皮细胞分开进行培养，因而较好。此时，角膜上皮细胞可以在细胞培养小室的一侧，也可以在安装有细胞培养小室的圆盘一侧，至少必须在培养角膜上皮细胞的表面上覆盖有温度响应性聚合物。
本发明中，细胞的培养在如上所述制造的细胞培养支持体上进行。覆盖在基材表面上的前述聚合物具有上限临界溶解温度时，培养基的温度在该温度以下，另外，覆盖在基材表面上的前述聚合物具有下限临界溶解温度时，培养基的温度在该温度以上，除此之外，培养基的温度不受特别的限制。但是，在导致培养细胞无法增殖的低温区域、或导致培养细胞死亡的高温区域中的培养显然是不合适的。温度以外的培养条件只要按照常规方法就可以，不受特别的限制。例如，对于使用的培养基，可以是添加有公知的胎牛血清(FCS)等的血清的培养基，另外也可以是不添加这类血清的无血清培养基。
本发明的方法中，从支持体材料剥离回收所培养的细胞时，使培养的用于形成角膜上皮的细胞紧密贴合在载体上，通过将附着有细胞的支持体材料的温度调节成支持体基材的覆盖聚合物的上限临界溶解温度以上或者下限临界溶解温度以下，可以连同载体一起剥离。另外，细胞片的剥离可以在培养细胞的培养液中进行，也可以在其它等渗液中进行，可以对应目的进行选择。
本发明中，将细胞片接触到患处之后，将细胞片从载体剥离就可以。该剥离方法不受任何限制，例如，可以是濡湿载体，使载体与细胞片的紧密贴合性减弱的剥离方法；或者也可以是用手术刀、剪刀、激光、等离子波等工具切断的方法。例如使用上述紧密贴合在部分切掉的载体上的细胞片的情况下，若使用激光等沿着患处的边界线切断，则可避免细胞片附着到患处之外不需要的部分上，是比较合适的。
本发明的用于形成角膜上皮的细胞片与活体组织间的固定方法不受特别的限定，可以缝合细胞片和活体组织，或者由于本发明的用于形成角膜上皮的细胞片迅速地在活体组织上成活，附着于患处的细胞片不与活体缝合也可以。特别对于后者，为了保护移植的细胞片，也可以同时使用隐形眼镜。
作为本发明的一种方式的多层化细胞片的制造方法不受特别的限定，例如，可以列举通常所知的3T3细胞作为饲养层进行增殖、多层化的方法，或者利用上述紧密贴合在载体上的用于形成角膜上皮的细胞片制造的方法等。具体而言，可以例示下述方法：
(1)将与载体紧密贴合的细胞片附着在细胞培养支持体上，之后加入培养基，使载体脱离细胞片，然后重复将其它与载体紧密贴合的细胞片附着的操作，使细胞片多层化。
(2)将与载体紧密贴合的细胞片反转，以载体一侧固定于细胞培养支持体上，在细胞片一侧附着其它的细胞片，之后加入培养基使载体脱离细胞片，然后重复将其它细胞片附着的操作，使细胞片多层化。
(3)将与载体紧密贴合的细胞片彼此之间以细胞片一侧紧密贴合的方法。
(4)将与载体紧密贴合的细胞片接触到患处，使细胞片附着于活体组织上之后，剥离载体，再重叠其它的细胞片的方法。
本发明中的多层化细胞片，不一定是仅由用于形成角膜上皮的细胞片形成。例如，也可以将用于形成角膜上皮的细胞片的一种形态的角膜上皮细胞片与进行同样的操作制造的角膜内皮细胞片和/或结膜上皮细胞片进行重叠。在使细胞片更加接近活体内的前眼部组织的方面，这样的技术极为有效。
为达到将高回收率地剥离、回收用于形成角膜上皮的细胞片的目的，可以单独使用或者同时使用下述方法：或者轻敲或者晃动细胞培养支持体的方法，或用移液器搅拌培养基的方法等。另外，根据需要也可以用等渗液等冲洗培养细胞进行剥离回收。
本发明所示的用于形成角膜上皮的细胞片的用途不受任何限制，例如如上所述，除对角膜糜烂、角膜溃疡等前眼部组织的部分或全部损伤或缺损的患处等之外，还对不具有角膜上皮细胞的双眼性的难治性角结膜疾病等的治疗有效。或者，本发明所示的用于形成角膜上皮的细胞片对屈光矫正有效，所述屈光矫正有：用受激准分子激光器照射中央部分，削去角膜表面，减少角膜的屈光度，从而矫正近视的准分子激光屈光性角膜切削术(PRK)；用微型角膜刀以160μm的厚度切断角膜实质层，制造角膜瓣，然后揭下该角膜瓣，用受激准分子激光器削去角膜实质层，平整表面，最后将角膜瓣放回本来的位置的准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)；用酒精滴眼使角膜表面软化，不使用微型角膜刀而切除角膜上皮50μm厚，制造角膜上皮瓣，用受激准分子激光器削去角膜实质层，平整表面，最后将角膜上皮瓣放回本来的位置的准分子激光角膜上皮磨镶术(LASEK)等。
根据上述方法得到的用于形成角膜上皮的细胞片，与以往的方法得到的产品相比，在剥离时的非侵袭性方面，极为优良，强烈期待其在移植用角膜等的临床应用。特别是，本发明的用于形成角膜上皮的细胞片与以往的移植细胞片不同，具有与活体组织的高成活性，能极为迅速地在活体组织上成活。我们认为，这是可以提高患处的治疗效率、进一步可以减轻患者负担的极其有效的技术。另外，本发明的方法中所使用的细胞培养支持体可以重复使用。
实施例
以下基于本发明的实施例进行进一步详细说明，但这些实施例对本发明没有任何限定。
实施例1
在市售的6孔细胞培养板(ベクトン·デイツキンソン·ラブウエア(Becton Dickinson Labware)公司制、フアルコン(FALCON)3090)上，涂布0.08ml30％N-异丙基丙烯酰胺单体的异丙醇溶液。以0.25MGy强度照射电子束，将聚N-异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)固定在培养皿表面上。照射后，用离子交换水洗净培养皿，除去残余的单体和未与培养皿结合的PIPAAm，在净化台内干燥，用环氧乙烷气体灭菌，得到细胞培养支持体材料。测量基材表面的温度响应性聚合物的量，发现以1.3μg/cm2覆盖。
在得到的细胞培养支持体材料上，根据常规方法培养正常兔角膜上皮细胞(使用培养基：コル礻パツク(クラボウ(株)制)、37℃、5％CO2下)。其结果，角膜上皮细胞在细胞培养支持体材料上正常地附着、增殖。
培养7日后，所培养的细胞成为铺满状态，在进一步培养7日的细胞上覆盖载体，所述载体由切出1.5cm直径圆形的直径2.1cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，轻轻地吸去培养基，连同细胞培养支持体材料一起在20℃培养30分钟后将其冷却进行低温处理，将细胞培养支持体材料上的细胞连同覆盖在其上的载体一起进行剥离。得到的细胞片收缩率在5％以下，其作为整张细胞片具有充分的强度。
按照常规方法将本实施例得到的角膜上皮细胞片移植给患角膜上皮组织部分缺损的角膜糜烂病的实验兔。将角膜上皮细胞片在创伤部位附着15分钟，之后用手术刀切除重叠在患处以外部分的细胞片。此时，并未进行细胞片与活体侧的缝合。3周后，观察患处，角膜上皮细胞片在眼球上良好地成活。
实施例2
本实施例中，除使用35％N-异丙基丙烯酰胺单体的异丙醇溶液之外，使用与实施例1同样的方法，将聚N-异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)固定在培养皿表面上。测量用这种方法形成的基材表面的温度响应性聚合物的量，发现以1.5μg/cm2覆盖。
本实施例中，也与实施例1一样，角膜上皮细胞在细胞培养支持体材料上正常地附着、增殖，培养7日后所培养的细胞成为铺满状态。在进一步培养7日的细胞上覆盖载体，所述载体由切出1.5cm直径圆形的直径2.1cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，轻轻地吸去培养基，连同细胞培养支持体材料一起在20℃培养30分钟后将其冷却进行低温处理，将细胞培养支持体材料上的细胞连同覆盖在其上的载体一起进行剥离。得到的细胞片是收缩率在5％以下的细胞片，其作为整张细胞片具有充分的强度。
按照常规方法将本实施例得到的角膜上皮细胞片移植给患角膜上皮组织部分缺损的角膜糜烂病的实验兔。将角膜上皮细胞片在创伤部位附着15分钟，之后用手术刀切除重叠在患处以外部分的细胞片。此时，并未进行细胞片与活体侧的缝合，移植后，在患处装上隐形眼镜。3周后，观察患处，角膜上皮细胞片在眼球上良好地成活。
实施例3
在实施例1的细胞培养支持体上，除将培养基改成含有丝裂霉素C的常用的保绿培养基(green′smedia)(DMEM+AB(用于制造饲养层)、用于源自人新生儿的角化表皮细胞)之外，用同样的方法培养正常兔角膜上皮细胞。其结果，细胞培养支持体材料上的角膜上皮细胞正常地附着、增殖。
培养6日后成为铺满状态，进一步培养6天使其多层化。然后，覆盖载体，所述载体由切出1.5cm直径圆形的直径2.1cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，轻轻地吸去培养基，连同细胞培养支持体材料一起在20℃培养30分钟后将其冷却进行低温处理，将细胞培养支持体材料上的细胞连同覆盖在其上的载体一起进行剥离。被剥离的多层化细胞片是收缩率在5％以下的细胞片，其作为整张细胞片具有充分的强度。
按照常规方法将本实施例得到的角膜上皮细胞片移植给患角膜上皮组织部分缺损的角膜糜烂病的实验兔。将角膜上皮细胞片在创伤部位附着15分钟，之后，用激光切除重叠在患处以外的部分的细胞片。此时，并未进行细胞片与活体侧的缝合。3周后，观察患处，角膜上皮细胞片在眼球上良好地成活。
比较例1
由实施例1制作角膜上皮细胞片，除不使用载体剥离细胞片，使其收缩之外，与实施例1同样地制造角膜上皮细胞片。此时的收缩率为42％。
与实施例1同样，按照常规方法将得到的角膜上皮细胞片移植给缺损角膜上皮组织部分的实验兔。将角膜上皮细胞片向创伤部位附着15分钟，之后，用手术刀切除重叠在患处以外的部位的的细胞片。此时，并未进行细胞片与活体侧的缝合。移植一天后观察患处，角膜上皮细胞片在眼球上的成活性差，快要从患处脱落。
比较例2
由实施例3制造角膜上皮细胞多层化细胞片，除达到铺满后的28天之后从细胞培养支持体剥离之外，与实施例3同样地制造角膜上皮细胞片。得到的细胞片收缩率在5％以下，其作为整张膜具有充分的强度。
然后，与实施例3同样，按照常规方法将得到的角膜上皮细胞片移植给缺损角膜上皮组织部分的实验兔。将角膜上皮细胞片在创伤部位附着15分钟，之后，用手术刀切除重叠在患处以外的部分的细胞片。此时，并未进行细胞片与活体侧的缝合。移植一天后观察患处，角膜上皮细胞片在眼球上的成活性恶劣，快要从患处脱落。
实施例4
在市售的φ3.5cm细胞培养用培养皿(ベクトン·デイツキンソン·ラブウエア(Becton Dickinson Labware)公司制、ファルコン(FALCON)3001)上，涂布0.1ml30％N-异丙基丙烯酰胺单体的异丙醇溶液。照射0.25MGy强度的电子束，将聚N-异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)固定在培养皿表面上。照射后，用离子交换水洗净培养皿，除去残余的单体和未与培养皿结合的PIPAAm，在净化台内干燥，用环氧乙烷气体灭菌，得到细胞培养支持体材料。测量基材表面上的温度响应性聚合物的量，发现以1.4μg/cm2覆盖。
另一方面，在深度麻醉下，从常规方法制造的具有角结膜上皮症的实验白色家兔采取口腔粘膜组织，在上述得到的细胞培养支持体材料上，将该上皮细胞按照常规方法与3T3细胞(使用培养基：コル礻パツク(クラボウ(株)制)、37℃、5％CO2下)一起进行培养。其结果，在细胞培养支持体材料上的任一上皮细胞都正常地附着、增殖。
培养6日后，所培养的细胞成为铺满状态，在进一步培养7目的细胞上覆盖载体，该载体由切出1.8cm直径圆形的直径2.3cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，轻轻地吸去培养基，连同细胞培养支持体材料一起在20℃培养30分钟后将其冷却进行低温处理，将细胞培养支持体材料上的细胞连同覆盖在其上的载体一起进行剥离。得到的细胞片收缩率在5％以下，其作为整张细胞片具有充分的强度。
按照常规方法将本实施例得到的口腔粘膜细胞片移植给患角膜上皮组织部分缺损的角结膜上皮症的实验白色家兔。将口腔粘膜细胞片在创伤部位附着15分钟，之后，用手术刀切除重叠在患处以外的部位的细胞片。此时，并未进行细胞片与活体侧的缝合。3周后，观察患处，角膜上皮细胞片在眼球上良好地成活。
实施例5
本实施例中，除使用35％N-异丙基丙烯酰胺单体的异丙醇溶液之外，使用与实施例4同样的方法，在培养皿表面上固定聚N-异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)。测量用这种方法形成的基材表面的温度响应性聚合物的量，发现以1.5μg/cm2覆盖。
本实施例中，也与实施例4同样，口腔粘膜上皮细胞在细胞培养支持体材料上正常地附着、增殖。培养6日后，所培养的细胞成为铺满状态。在进一步培养7目的细胞上覆盖载体，该载体由切出1.8cm直径圆形的直径2.3cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，轻轻地吸去培养基，连同细胞培养支持体材料一起在20℃培养30分钟后使其冷却进行低温处理，将细胞培养支持体材料上的细胞连同覆盖在其上的载体一起进行剥离。得到的细胞片收缩率在5％以下，其作为整张细胞片具有充分的强度。
按照常规方法将本实施例得到的口腔粘膜细胞片移植给患角膜上皮组织部分缺损的角结膜上皮症的实验白色家兔。将口腔粘膜细胞片在创伤部位附着15分钟，之后，用手术刀切除重叠在患处以外的部分的细胞片。此时，并未进行细胞片与活体侧的缝合，移植后，在患处装上隐形眼镜。3周后，观察患处，口腔粘膜细胞片在眼球上良好地成活。
实施例6
在实施例4的细胞培养支持体材料上，除了在深度麻醉下用常规方法从白色家兔皮肤的毛根组织采取上皮类干细胞作为细胞，并与3T3细胞一起培养之外，按照与实施例4同样的方法实施。其结果，细胞培养支持体材料上的毛根细胞正常地附着、增殖。培养2周后，覆盖载体，该载体由切出1.5cm直径圆形的直径2.1cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，轻轻地吸去培养基，连同细胞培养支持体材料一起在20℃培养30分钟后使其冷却，从而将细胞培养支持体材料上的细胞片连同覆盖在其上的载体一起进行剥离。被剥离的多层化细胞片收缩率在5％以下，其作为整张细胞片具有充分的强度。
按照常规方法将本实施例得到的细胞片移植给患角膜上皮组织部分缺损的角结膜上皮症的实验白色家兔。将毛根细胞片在创伤部位附着15分钟，之后，用激光切除重叠在患处以外的部分的细胞片。此时，并未进行细胞片与活体侧的缝合。3周后，观察患处，细胞片在眼球上良好地成活。
实施例7
在实施例4的细胞培养支持体材料上，除了在深度麻醉下用常规方法从白色家兔皮肤的结膜组织采取结膜上皮干细胞作为细胞，并与3T3细胞一起培养之外，按照与实施例4同样的方法实施。其结果，在细胞培养支持体材料上的结膜上皮细胞正常地附着、增殖。培养2周后，覆盖载体，该载体由切出1.5cm直径圆形的直径2.1cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，轻轻地吸去培养基，连同细胞培养支持体材料一起在20℃培养30分钟后冷却，将细胞培养支持体材料上的细胞连同覆盖在其上的载体一起剥离。被剥离的多层化细胞片收缩率在3％以下，其作为整张细胞片具有充分的强度。
按照常规方法将本实施例得到的细胞片移植给患角膜上皮组织部分缺损的角结膜上皮症的实验白色家兔。将结膜上皮细胞片在创伤部位附着15分钟，之后，用激光切除重叠在患处以外的部分的细胞片。此时，并未进行细胞片与活体侧的缝合。3周后，观察患处，结膜细胞多层化细胞片在眼球上良好地成活，同时也看不到来自结膜的血管侵入。
比较例3
按照实施例4制造口腔粘膜细胞片，除不使用载体而剥离细胞片，使其收缩之外，与实施例4同样地制造口腔粘膜细胞片。此时的收缩率为38％。
与实施例4同样，按照常规方法将得到的口腔粘膜细胞片移植给缺损角膜上皮组织部分的兔子。将角膜上皮细胞片在创伤部位附着15分钟，之后，用手术刀切除重叠在患处以外的部分的细胞片。此时，并未进行细胞片与活体侧的缝合。移植一天后观察患处，角膜上皮细胞片在眼球伤得成活性恶劣，快要从患处脱落。
根据以上结果可知，使用本技术，可能制作对前眼部组织的附着性良好的角膜上皮代替细胞片。这一事实可使治疗简便化、效率化，从而减轻患者的负担，并且由于这些细胞片能充分覆盖患处，并紧密地附着，因此还能显著减轻患者本人的痛苦，可以认为是一种极其有效的技术。
实施例8
按照与实施例3所示的方法完全相同的方法制造紧密贴合在载体上的角膜上皮细胞多层化细胞片。探讨该细胞片在作为近视治疗法而出名的准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK法)中能否成为角膜上皮瓣的替代品。
具体而言，首先对兔角膜用微型角膜刀以160μm的厚度切断角膜实质层，制造角膜瓣，然后除去该角膜瓣，再用受激准分子激光器削去角膜实质层，平整表面，最后在本来应放回角膜瓣的部位附着实施例3中得到的紧密贴合在载体上的角膜上皮细胞多层化细胞片。用激光将角膜上皮细胞多层化细胞片切成与患处同样的大小，完成移植。未进行缝合。3周后观察患处，角膜上皮细胞多层化细胞片在眼球上良好地成活，认为本发明的角膜上皮细胞多层化细胞片对LASIK法也有效。
实施例9
按照与实施例3所示的方法完全相同的方法制造紧密贴合在载体上的角膜上皮细胞多层化细胞片。探讨该细胞片在作为近视治疗法而出名的准分子激光角膜上皮磨镶术(LASEK法)中能否成为角膜上皮瓣的替代品。
具体而言，首先对兔角膜用酒精滴眼使角膜表面软化，不使用微型角膜刀而切除角膜上皮50μm厚制造角膜上皮瓣，然后除去该角膜上皮瓣，再用受激准分子激光器削去角膜实质层，平整表面，最后在本来应放回角膜上皮瓣的部位附着实施例3中得到的紧密贴合在载体上的角膜上皮细胞多层化细胞片。用激光将角膜上皮细胞多层化细胞片切断成与患处同样大小，完成移植。未进行缝合。3周后观察患处，角膜上皮细胞多层化细胞片在眼球上良好地成活，认为本发明的角膜上皮细胞多层化细胞片对LASEK法也有效。
根据以上结果可知，使用本技术，能够制作对前眼部组织附着性良好的再生角膜上皮细胞片、其多层化细胞片。这一事实就治疗的简便化、效率化，从而减轻患者的负担这一点而言，可以认为是一种极其有效的技术。
产业上的利用可能性
本发明得到的用于形成角膜上皮的细胞片对活体组织的成活性极高，即具有“高附着性”，强烈地期待其在例如角膜移植、角膜疾病治疗、近视治疗等的临床应用。因而，本发明是在细胞工学、医用工学等的医学、生物学等领域极为有用的发明。

Claims (23)

1.用于形成角膜上皮的细胞片，其紧密贴合在切除了中心部分的环状的载体上，其如下制得：在用0～80℃的温度范围内对于水的水合力变化的温度响应性聚合物覆盖基材表面而成的细胞培养支持体上培养用于形成角膜上皮的细胞，根据需要按照常规方法使培养细胞多层化，之后，
(1)使培养液温度在上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，
(2)将所培养的用于形成角膜上皮的细胞紧密贴合于载体上，
(3)将其连同切除了中心部分的环状的载体一起剥离。
2.根据权利要求1记载的用于形成角膜上皮的细胞片，所述细胞片未经蛋白质分解酶处理而从支持体剥离，剥离后的细胞片的收缩率保持在20％以下。
3.根据权利要求1或2记载的细胞片，其残留有80％以上基底膜类蛋白质。
4.根据权利要求1或2记载的细胞片，其残留有80％以上桥粒结构。
5.根据权利要求1或2记载的用于形成角膜上皮的细胞片，其用于治疗前眼部组织的部分或全部损伤或缺损了的患处。
6.根据权利要求5记载的用于形成角膜上皮的细胞片，所述前眼部组织是角膜上皮组织、鲍曼氏膜、角膜实质组织。
7.根据权利要求1或2记载的用于形成角膜上皮的细胞片，其剥离的时期是在细胞在支持体表面铺满后起21天以内。
8.根据权利要求1或2记载的用于形成角膜上皮的细胞片，所述细胞片是再生角膜上皮细胞片或其多层化细胞片。
9.根据权利要求8记载的用于形成角膜上皮的细胞片，所述多层化细胞片是将角膜上皮细胞进行多层化培养得到的。
10.根据权利要求1或2记载的用于形成角膜上皮的细胞片，所述细胞片是角膜上皮代替细胞片或其多层化细胞片。
11.根据权利要求10记载的用于形成角膜上皮的细胞片，所述角膜上皮代替细胞片由口腔粘膜细胞、毛根细胞、结膜上皮细胞中的任意一种或两种以上的混合物，或者由它们与角膜上皮细胞的混合物组成。
12.根据权利要求10记载的用于形成角膜上皮的细胞片，所述多层化细胞片是将口腔粘膜细胞、毛根细胞、结膜上皮细胞中的任意一种或两种以上的混合物，或者将它们与角膜上皮细胞的混合物多层化培养得到。
13.根据权利要求11记载的用于形成角膜上皮的细胞片，所述口腔粘膜细胞来自颊膜。
14.根据权利要求12记载的用于形成角膜上皮的细胞片，所述口腔粘膜细胞来自颊膜。
15.根据权利要求1或2记载的用于形成角膜上皮的细胞片，其特征是，治疗不是将用于形成角膜上皮的细胞片缝合在患处，而是将用于形成角膜上皮的细胞片覆盖于患处。
16.根据权利要求1或2记载的用于形成角膜上皮的细胞片，在覆盖于患处上时，按照患处的大小、形状被切断。
17.根据权利要求1或2记载的用于形成角膜上皮的细胞片，其中，所述细胞培养支持体是利用膜的细胞培养小室。
18.根据权利要求1或2记载的用于形成角膜上皮的细胞片，其中，所述温度响应性聚合物是聚(N-异丙基丙烯酰胺)。
19.根据权利要求1～18任一项记载的用于形成角膜上皮的细胞片的制造方法，其特征是，在用0～80℃的温度范围内对于水的水合力变化的温度响应性聚合物覆盖基材表面而成的细胞培养支持体上培养用于形成角膜上皮的细胞，根据需要按照常规方法使培养细胞多层化，之后，
(1)使培养液温度在上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，
(2)将所培养的用于形成角膜上皮的细胞紧密贴合于载体上，
(3)将其连同切除了中心部分的环状的载体一起剥离。
20.根据权利要求19记载的用于形成角膜上皮的细胞片的制造方法，所述用于形成角膜上皮的细胞片是再生角膜上皮细胞片、角膜上皮代替细胞片、或是它们中任意一个的多层化细胞片。
21.根据权利要求19或20记载的用于形成角膜上皮的细胞片的制造方法，其特征是，所述细胞培养支持体是利用膜的细胞培养小室。
22.根据权利要求19或20记载的用于形成角膜上皮的细胞片的制造方法，所述温度响应性聚合物是聚(N-异丙基丙烯酰胺)。
23.根据权利要求19或20记载的用于形成角膜上皮的细胞片的制造方法，所述剥离是未经蛋白质分解酶处理的。
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