KR20050118670A

KR20050118670A - 각막 상피 형성용 세포 시트, 그들의 제조 방법 및 그들의이용 방법

Info

Publication number: KR20050118670A
Application number: KR1020057014284A
Authority: KR
Inventors: 데루오 오카노; 고지 니시다; 마사유키 야마토
Original assignee: 가부시키가이샤 셀시드; 고지 니시다
Priority date: 2003-02-06
Filing date: 2004-02-06
Publication date: 2005-12-19
Also published as: US20180126040A1; CN1747753A; EP1602383A1; WO2004069295A1; ES2538696T3; CN1747753B; EP1602383A4; KR101141985B1; EP2450065B1; US20060234377A1; EP2450065A1; US10434219B2; EP1602383B1

Abstract

본 발명은, 전안부 조직에 대한 부착성이 양호한 각막 상피 형성용 세포 시트를 제공하는 것을 과제로 한다. 이에 대하여, 0∼80℃ 의 온도 범위에서 수화력이 변화하는 온도 응답성 폴리머로 기재 표면을 피복한 세포 배양 지지체 상에서 각막 상피 형성용 세포를 특정 조건으로 배양하고, 필요에 의해 배양 세포층을 중층화시키고, 그 후

(1) 배양액 온도를 상한 임계 용해 온도 이상 또는 하한 임계 용해 온도 이하로 하고,

(2) 배양한 각막 상피 형성용 세포를 캐리어에 밀착시키고,

(3) 그대로 캐리어와 함께 특정 조건 하에서 박리함으로써 각막 상피 형성용 세포 시트를 제조함으로써, 상기 과제를 해결하기에 이르렀다.

Description

각막 상피 형성용 세포 시트, 그들의 제조 방법 및 그들의 이용 방법{CELL SHEETS FOR ECTOCORNEA FORMATION, METHOD OF PRODUCING THE SAME AND METHOD OF USING THE SAME}

본 발명은, 생물학, 의학 등의 분야에서의 각막 상피 형성용 세포 시트, 제조 방법 및 그들을 이용한 치료 방법에 관한 것이다.

의료 기술의 현저한 발전에 의해, 최근, 치료가 곤란해진 장기를 타인의 장기와 바꾸고자 하는 장기 이식이 일반화되어 있다. 대상이 되는 장기도 피부, 각막, 신장, 간장, 심장 등으로 실로 다양하고, 또한, 수술 후의 경과도 현격하게 좋아져, 의료의 한 기술로서 이미 확립되고 있다. 일 예로서 각막 이식을 들면, 약 40 년 전에 일본에도 아이 뱅크가 설립되어 이식 활동이 시작되었다. 그러나, 아직도 도너 수가 적고, 국내에서만도 각막 이식이 필요한 환자가 연간 약 2 만명 나오는 데 반해, 실제로 이식 치료를 할 수 있는 환자는 약 1/10 인 2000 명 정도밖에 없다고 한다. 각막 이식이라는 거의 확립된 기술이 있음에도 불구하고, 도너 부족이라는 문제 때문에, 추가 의료 기술이 요구되고 있는 것이 현상이다.

이러한 배경 하, 이전보다, 인공 대체물이나 세포를 배양하여 조직화시킨 것을 그대로 이식하려고 하는 기술이 주목받고 있다. 그 대표적인 예로서, 인공 피부 및 배양 피부를 들 수 있을 것이다. 그러나, 합성 고분자를 사용한 인공 피부는 거절 반응 등이 생길 가능성이 있어, 이식용 피부로서는 바람직하지 못하다. 한편, 배양 피부는 본인의 정상인 피부의 일부를 원하는 크기까지 배양한 것이어서, 이것을 사용하더라도 거절 반응 등의 우려가 없어, 가장 자연스러운 마스킹제라고 할 수 있다.

종래, 그와 같은 세포 배양은, 유리 표면 상 혹은 다양한 처리를 행한 합성 고분자의 표면 상에서 행해지고 있었다. 예를 들어, 폴리스티렌을 재료로 하는 표면 처리, 예를 들어 γ 선 조사, 실리콘 코팅 등을 행한 다양한 용기 등이 세포 배양용 용기로서 보급되어 있다. 이러한 세포 배양용 용기를 사용하여 배양ㆍ증식한 세포는, 트립신과 같은 단백 분해 효소나 화학 약품에 의해 처리함으로써 용기 표면에서 박리ㆍ회수된다.

그러나, 상기 기술한 바와 같은 화학 약품 처리를 실시하여 증식한 세포를 회수하는 경우, 처리 공정이 복잡해져, 불순물 혼입의 가능성이 많아지고, 증식한 세포가 화학적 처리에 의해 변성 혹은 손상되어 세포 본래의 기능이 손상되는 예가 있는 등의 결점이 지적되었다. 이러한 결점을 극복하기 위해서, 지금까지 몇 가지 기술이 제안되어 있다.

일본 특허공고공보 평2-23191호에는, 인간 신생아 유래 각화 표피 세포를, 케라틴 조직의 막이 용기의 표면 상에 형성되는 조건 하에서, 배양 용기 중에서 배양하고, 케라틴 조직의 막을 효소를 사용하여 박리시키는 것을 특징으로 하는 케라틴 조직이 이식가능한 막을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 구체적으로는, 3T3 세포를 피더 레이어로서 증식, 중층화시켜, 단백질 분해 효소인 디스파제를 사용하여 세포 시트를 회수하는 기술이 개시되어 있다. 그러나, 당해 공보에 기재되어 있는 방법은 다음과 같은 결점을 갖고 있었다.

(1) 디스파제는 균 유래의 것이며, 회수된 세포 시트를 충분히 세정할 필요성이 있는 것.

(2) 배양된 세포마다 디스파제 처리의 조건이 다르고, 그 처리에 숙련이 필요한 것.

(3) 디스파제 처리에 의해 배양된 표피 세포가 병리학적으로 활성화되는 것.

(4) 디스파제 처리에 의해 세포 외 매트릭스가 분해되는 것.

(5) 그 때문에 그 세포 시트가 이식된 환부는 감염되기 쉬운 것.

상기 기술한 바와 같은 종래 법의 결점에 부가하여, 본 발명이 대상으로 하는 각막 상피 세포, 각막 내피 세포, 및 결막 상피 세포 등의 전안부 관련 세포는, 피부 세포만큼 세포ㆍ세포 간의 결합이 강하지 않기 때문에, 상기 디스파제를 갖는다 해도, 배양 후, 1 장의 시트로서 박리, 회수할 수 없다는 결점을 갖고 있었다.

이러한 과제를 해결하기 위해서, 최근, 스폰지층과 상피층을 제거한 양막 (羊膜) 상에서, 각막 상피 세포나 결막 상피 세포를 배양, 조직화시키고, 그 양막마다 이식용 세포 편으로 하는 기술이 고안되었다 (일본 공개특허공보 2001-161353호). 양막은, 충분한 막강도를 가지고 있고, 또한 항원성을 가지고 있지 않아서, 이식용 세포 편의 지지체로서 제격이지만, 양막이라는 것이 원래 안 (眼) 내에 없고, 보다 정밀하게 안 내 조직을 구축해 가기 위해서는, 역시 안 내의 세포만으로 충분한 강도를 가진 시트를 제작하고, 그 시트가 각막 실질 조직과 직접 접하는 것이 요망되었다.

또한, 일본 특허출원 2001-226141호에서는, 물에 대한 상한 혹은 하한 임계 용해 온도가 0∼80℃ 인 온도 응답성 폴리머를 기재 표면에 피복한 세포 배양 지지체 상에서 전안부 관련 세포를 배양하고, 필요에 따라 통상적인 방법에 의해 배양 세포층을 중층화시키고, 지지체의 온도를 바꾸는 것만으로 배양한 세포 시트를 박리시킴으로써, 충분한 강도를 가진 세포 시트의 제작이 가능해졌다. 또한, 이 세포 시트에는 기저막형 단백질도 유지하고 있어, 상기 기술한 디스파제 처리한 것과 비교하여, 조직에 대한 생착성도 분명히 개선되어 있다. 그러나, 실제 환자의 부담 경감을 생각하면, 그 생착성에 더욱 개선이 요구되었다.

또한, 최근, 의료 현장에서도 다양한 방법이 제안되어 있다. 예를 들어, WO98/31316 에 있어서는 근시 치료를 위해 PRK 법, LASIK 법을 행할 때, 배양한 각막 상피 세포 시트를 이용하는 기술이 제안되어 있다. 그러나, 여기서의 배양 각막 상피 시트는, 상기 기술한 디스파제에 의해서 박리된 것이며, 레이저로 깎인 각막 조직에 대한 부착성이 나빠, 현저한 치료 효과도 바랄 수 없다는 문제점이 있었다.

또한, 2001 년 5 월 10 일자 마이니치 신문 기사에서, 각막 질환 환자에 대하여, 각막 대신에 배양 구강 점막을 붙여, 환자의 각막 재생을 촉진하는 기술이 제안되어 있다. 그러나, 여기서의 배양 구강 점막은, 상기 기술한 디스파제에 의해서 박리된 것이며, 환자에 대한 각막 조직에 대한 부착성이 나빠, 현저한 치료 효과도 바랄 수 없다는 문제점이 있었다.

본 발명은, 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하는 것을 의도하여 이루어진 것이다. 즉, 본 발명은, 전안부 조직에 대한 부착성이 양호한 각막 상피 형성용 세포 시트를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은, 그 제조법, 그리고 이용 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

(발명의 개요)

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서, 다양한 각도에서 검토하여, 연구 개발을 행하였다. 그 결과, 온도 응답성 폴리머로 기재 표면을 피복한 특정 조건의 세포 배양 지지체 상에서 각막 상피 형성용 세포를 특정 조건 하에서 배양하고, 그 후, 배양액 온도를 상한 임계 용해 온도 이상 또는 하한 임계 용해 온도 이하로 하고, 배양한 각막 상피 형성용 세포 시트를 특정 캐리어에 밀착시키고, 세포 시트의 수축을 억제하면서, 그대로 캐리어와 함께 박리함으로써, 생체 조직에 매우 부착성이 양호한 각막 상피 형성용 세포 시트가 얻어짐을 발견하였다. 본 발명은 이러한 식견에 기초하여 완성된 것이다.

즉, 본 발명은, 전안부 조직에 대한 부착성이 양호한, 캐리어에 밀착시킨, 각막 상피 형성용 세포 시트를 제공한다.

또한, 본 발명은, 0∼80℃ 의 온도 범위에서 수화력이 변화하는 온도 응답성 폴리머로 기재 표면을 피복한 세포 배양 지지체 상에서 각막 상피 형성용 세포를 배양하고, 필요에 따라 통상적인 방법에 의해 배양 세포층을 중층화시키고, 그 후,

(2) 배양한 각막 상피 형성용 세포를 캐리어에 밀착시키고,

(3) 그대로 캐리어와 함께 박리하는 것을 특징으로 하는, 생체 조직에 매우 부착성이 양호한 각막 상피 형성용 세포 시트의 제조 방법을 제공한다.

더불어, 본 발명은, 심부까지 결손 및/또는 창상된 조직을 치료하기 위한 생체 조직에 매우 부착성이 양호한 상기 각막 상피 형성용 세포 시트를 제공한다.

또한 더불어, 본 발명은, 심부까지 결손 및/또는 창상된 조직에 대하여, 생체 조직에 매우 부착성이 양호한 상기 각막 상피 형성용 세포 시트를 이식하는 것을 특징으로 하는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 의료 분야뿐만 아니라, 화학 물질, 독물, 혹은 의약품의 안전성 평가용 세포로서 유용한 각막 상피 형성용 세포 시트를 제공한다.

(발명의 실시 형태)

상기 기술한 바와 같이, 본 발명은 캐리어에 밀착시킨, 각막 상피 형성용 세포 시트를 제공한다. 본 발명에 있어서, 각막 상피 형성용 세포 시트라고 하는 경우, 각막 상피 세포로부터 형성되는 재생 각막 상피 세포 시트, 혹은 각막 상피 세포 이외의 세포로부터 형성되는 각막 상피 대체 세포 시트를 포함한다.

본 발명의 각막 상피 형성용 세포 시트로서 재생 각막 상피 세포 시트를 사용하는 경우, 사용되는 바람직한 세포로서 각막 상피 세포, 및 그 줄기 세포를 들 수 있지만, 그 종류는, 전혀 제약되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 각막 상피 형성용 세포 시트로서 각막 상피 대체 세포 시트를 사용하는 경우, 사용되는 바람직한 세포로서, 예를 들어, 협막 (頰膜), 잇몸에 존재하는 구강 점막 세포, 모근 세포, 결막 상피 세포 중 어느 하나 또는 2 이상의 혼합물, 혹은 이들과 각막 상피 세포와의 혼합물을 들 수 있지만, 그 종류는, 전혀 제약되는 것은 아니다. 이들 세포 시트 등을 제작할 때에, 각막 상피 대체 세포의 배양 중에 특별한 첨가물을 첨가할 필요가 없고, 예를 들어 구강 점막 세포를 각막 상피 대체 세포로서 사용하는 경우에는, 구강 점막 세포의 표준적인 세포 배양 방법을 사용하여 배양하여, 세포 배양 시트 등을 제작할 수 있다.

본 발명의 문맥에 있어서, 각막 상피 형성용 세포 시트는, 단층 시트 상태이어도 되고, 중층화 시트 상태이어도 된다. 따라서, 재생 각막 상피 세포 시트라고 하는 경우, 재생 각막 상피 세포의 단층 시트 또는 중층화 시트를 포함하고, 각막 상피 대체 세포 시트라고 하는 경우, 각막 상피 대체 세포의 단층 시트 또는 중층화 시트를 포함한다. 즉, 각막 상피 형성용 세포 시트는, 재생 각막 상피 세포 또는 각막 상피 대체 세포의, 단층 시트 또는 중층화 시트 중 어느 것이어도 된다.

본 발명에 있어서, 재생 각막 상피 세포 시트란, 상기한 각종 세포가 배양 지지체 상에서 단층상으로 배양되고, 그 후, 지지체에서 박리된 시트를 의미하고, 그 중층화 시트란, 그 재생 각막 상피 세포 시트가 단독 혹은 다른 세포로 이루어지는 시트와 조합된 상태로 중층화된 시트를 의미한다.

또한, 본 발명에 있어서, 각막 상피 대체 세포 시트란, 상기한 각종 세포가 배양 지지체 상에서 단층상으로 배양되고, 그 후, 지지체에서 박리된 시트를 의미하고, 그 중층화 시트란, 그 각막 상피 대체 세포 시트가 단독 혹은 다른 세포로 이루어지는 시트와 조합된 상태로 중층화된 시트를 의미한다.

본 발명에서의 각막 상피 형성용 세포 시트는 배양 시에 디스파제, 트립신 등으로 대표되는 단백질 분해 효소에 의한 손상을 받지 않은 것이다. 그 때문에, 기재로부터 박리된 각막 상피 형성용 세포 시트는, 세포-세포 간의 데스모솜 구조가 유지되고, 구조적 결함이 적어, 강도가 높은 것이다. 또한, 본 발명의 시트는 배양 시에 형성되는 세포-기재 간의 기저막형 단백질도 효소에 의한 파괴를 받고 있지 않다. 이로써, 이식 시에 있어서 환부의 생체 조직과 양호하게 접착할 수 있어, 효율적으로 치료를 실시할 수 있게 된다. 이러한 생체 조직에 대하여 매우 부착성이 높다는 성질을 갖는 것을, 본 발명에 있어서 「고부착성」 이라고 한다.

이상의 것을 구체적으로 설명하면, 트립신 등의 통상의 단백질 분해 효소를 사용한 경우, 세포-세포 간의 데스모솜 구조 및 세포, 기재 간의 기저막형 단백질 등은 거의 유지되지 않고, 따라서, 세포는 각각 분리된 상태가 되어 박리된다. 그 중에서, 단백질 분해 효소인 디스파제에 관해서는, 세포-세포 간의 데스모솜 구조에 관해서는 10∼60% 유지한 상태로 박리시킬 수 있는 것으로 알려져 있지만, 세포-기재 간의 기저막형 단백질 등을 거의 파괴하기 때문에, 얻어지는 세포 시트는 강도가 약한 것이다. 이에 대하여, 본 발명의 세포 시트는, 데스모솜 구조, 기저막형 단백질이 80% 이상 잔존된 상태의 것이며, 상기 기술한 바와 같은 다양한 효과를 얻을 수 있는 것이다. 따라서, 상기 기술한 「고부착성」, 구조적으로는 데스모솜 구조 및/또는 기저막형 단백질이 80% 이상 잔존된 상태의 것을 말한다.

본 발명에서의 각막 상피 형성용 세포 시트는 생체 조직인 전안부 조직에 매우 양호하게 생착되는; 즉, 「고부착성」 이다. 그 성질이 실현되기 위한 요인으로는, 지지체 표면에서 박리시킨 재생 각막 상피 세포 시트 또는 그 중층화 시트의 수축을 억제하는 것도 필요함을 발견하였다. 그 때, 각막 상피 형성용 세포 시트의 수축률은 시트 내의 어느 방향에서의 길이에서도 20% 이하인 것이 바람직하고, 바람직하게는 10% 이하, 더욱 바람직하게는 5% 이하인 것이 바람직하다. 시트 중 어느 하나의 방향의 길이에 있어서 20% 이상이 되면, 박리된 세포 시트는 늘어져, 그 상태로 생체 조직에 부착시켜도 조직에 밀착되지 않아, 본 발명에서 나타내는 바의 「고생착성」 은 바랄 수 없다.

각막 상피 형성용 세포 시트의 수축을 억제하는 방법은, 세포 시트를 수축시키지 않는 한 전혀 방법적으로 제약되는 것은 아니지만, 예를 들어, 지지체로부터 각막 상피 형성용 세포 시트를 박리시킬 때, 이들 세포 시트에 중심부를 잘라낸 링형상의 캐리어 등을 밀착시키고, 그 캐리어마다 세포 시트를 박리하는 방법 등을 들 수 있다.

각막 상피 형성용 세포 시트를 밀착시킬 때에 사용하는 캐리어는, 본 발명의 세포 시트가 수축되지 않도록 유지하기 위한 구조물이고, 예를 들어 고분자막 또는 고분자막으로부터 성형된 구조물, 금속성 지그 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 캐리어의 재질로서 고분자를 사용하는 경우, 그 구체적인 재질로는 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF), 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 셀룰로오스 및 그 유도체, 종이류, 키틴, 키토산, 콜라겐, 우레탄 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 밀착이라고 하는 경우, 세포 시트가 수축되지 않도록, 세포 시트와 캐리어와의 경계면에서, 캐리어 상에서 세포 시트가 어긋나거나 이동하지 않은 상태의 것을 말하며, 물리적으로 결합함으로써 밀착되어 있어도 되고, 양자 간에 존재하는 액체 (예를 들어 배양액, 그 밖의 등장액) 를 통해 밀착되어 있어도 된다.

캐리어의 형상은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 얻어진 각막 상피 형성용 세포 시트를 이식할 때에, 캐리어의 일부에 이식 부위와 동일한 정도 혹은 이식 부위보다 크게 잘라낸 것을 이용하면, 세포 시트는 잘라낸 것 주위의 부분에만 고정되어, 잘라낸 부분에 있는 세포 시트를 이식 부위에 대는 것만으로 충분하여, 바람직하다.

또한, 본 발명의 세포 시트는, 지지체 표면 상에 각막 상피 형성용 세포를 파종 후, 배양함으로써 얻어지지만, 지지체 표면 상에서 세포가 컨플루언트 (가득찬 상태) 에 도달하고 나서 21 일 이하, 바람직하게는 15 일 이하, 추가로 10 일 이하인 것이 바람직하다. 세포가 컨플루언트 (가득찬 상태) 에 도달하고 나서 21 일보다 많으면, 박리된 각막 상피 형성용 세포 시트의 최하층의 세포의 활성이 저하되고, 그 때문에 부착성도 저감되어, 본 발명의 특징인 「고생착성」 은 바랄 수 없게 된다.

본 발명의 각막 상피 형성용 세포 시트를, 예를 들어, 각막 미란, 각막 궤양 등의 전안부 조직의 일부 혹은 전부가 손상 또는 결손된 환부 등 이외에, 각막 상피 세포를 가지고 있지 않은 양안성 난치성 각결막 질환을 치료할 때에 사용할 수 있다. 본 발명의 전안부 조직이란, 전안부이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 일반적으로는, 각막 상피 조직, 보만 조직, 각막 실질 조직 등을 들 수 있다. 여기서 난치성 각결막 질환이라고 하는 경우, 예를 들어 Stevens-Johnson 신드롬, 안류 천포창, 열상, 알칼리 부식, 산 부식과 같은 질환이 포함된다.

본 발명에서의 각막 상피 형성용 세포 시트는, 이상에 나타내는 바와 같이, 생체 조직인 전안부 조직에 매우 양호하게 부착할 수 있는 세포 시트이고, 종래 기술에서는 전혀 얻을 수 없던 것이다.

본 발명은 또한, 이하의 제조 방법에 의해 상기 기술한 본 발명의 각막 상피 형성용 세포 시트를 제작하는 방법도 역시 제공한다. 즉, 0∼80℃ 의 온도 범위에서 수화력이 변화하는 온도 응답성 폴리머로 기재 표면을 피복한 세포 배양 지지체 상에서 각막 상피 형성용 세포를 배양하고, 필요에 따라 통상적인 방법에 의해 배양 세포층을 중층화시키고, 그 후,

(2) 배양한 각막 상피 형성용 세포를 캐리어에 밀착시키고,

(3) 그대로 캐리어와 함께 박리하는 것을 특징으로 하는, 각막 상피 형성용 세포 시트의 제조 방법을 제공한다. 이러한 방법으로 얻어진 각막 상피 형성용 세포 시트는, 생체 조직에 대하여 「고부착성」 이라는 특징을 갖는다.

세포 배양 지지체에 있어서 기재의 피복에 사용되는 온도 응답성 폴리머는, 0∼80℃, 보다 바람직하게는 20℃∼50℃ 의 온도 범위에서 수화력이 변화하는 것을 특징으로 하고 있다. 이러한 온도 응답성 폴리머의 일 태양으로서, 수용액 중에서 상한 임계 용해 온도 또는 하한 임계 용해 온도 0℃∼80℃, 보다 바람직하게는 20℃∼50℃ 를 갖는 것을 들 수 있다. 80℃ 를 초과하면 세포가 사멸할 가능성이 있으므로 바람직하지 못하다. 또한, 0℃ 보다 낮으면 일반적으로 세포 증식 속도가 극도로 저하되거나, 또는 세포가 사멸되기 때문에, 역시 바람직하지 못하다.

본 발명에 있어서는, 세포 배양 지지체 상에서 각막 상피 형성용 세포 시트를 박리할 때에, 저온 처리하는 것이 바람직하다. 본 발명에서의 저온 처리로서 바람직한 온도 조건은 0℃∼30℃ 이고, 바람직한 처리 시간은 2 분∼1 시간이지만, 이들 온도 및 시간에 한정되지 않는다. 바람직한 조건의 일 예로서, 저온 처리는 20℃ 에서 30 분 인큐베이트라는 조건을 사용할 수 있다.

본 발명에 사용하는 온도 응답성 폴리머는 호모폴리머, 코폴리머 중 어느 것이어도 된다. 이러한 폴리머로는, 예를 들어, 일본 공개특허공보 평2-211865호에 기재되어 있는 폴리머를 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 이하의 모노머의 단독 중합 또는 공중합에 의해서 얻어진다. 사용할 수 있는 모노머로는, 예를 들어, (메트)아크릴아미드 화합물, N-(혹은 N,N-디)알킬 치환 (메트)아크릴아미드 유도체, 또는 비닐에테르 유도체를 들 수 있고, 코폴리머의 경우는, 이들 중에서 임의의 2 종 이상을 사용할 수 있다. 또한, 상기 모노머 이외의 모노머류와의 공중합, 폴리머끼리의 그래프트 또는 공중합, 혹은 폴리머, 코폴리머의 혼합물을 사용해도 된다. 또한, 폴리머 원래의 성질을 손상하지 않는 범위에서 가교하는 것도 가능하다.

피복이 실시되는 기재로는, 통상 세포 배양에 사용되는 유리, 개질 유리, 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트 등의 화합물을 비롯하여, 일반적으로 형태 부여가 가능한 물질, 예를 들어, 상기 이외의 폴리머 화합물, 세라믹스류 등 모두 사용할 수 있다.

온도 응답성 폴리머의 지지체에 대한 피복 방법은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 일본 공개특허공보 평2-211865호에 기재되어 있는 방법에 따라도 된다. 즉, 이러한 피복은, 기재와 상기 모노머 또는 폴리머를, 전자선 조사 (EB), γ 선 조사, 자외선 조사, 플라즈마 처리, 코로나 처리, 유기 중합 반응 중 어느 하나에의해, 또는 도포, 혼련 등의 물리적 흡착 등에 의해 행할 수 있다.

온도 응답성 폴리머의 피복량은, 0.4∼4.5㎍/㎠ 의 범위가 좋고, 바람직하게는 0.7∼3.5㎍/㎠ 이고, 더욱 바람직하게는 0.9∼3.0㎍/㎠ 이다. 0.2㎍/㎠ 보다 적은 피복량일 때, 자극을 주더라도 당해 폴리머 상의 세포는 박리되기 어려워, 작업 효율이 현저히 나빠져 바람직하지 못하다. 반대로 4.5㎍/㎠ 이상이면, 그 영역에 세포가 부착되기 어려워, 세포를 충분히 부착시키는 것이 곤란해진다.

본 발명에서의 지지체의 형태는 특별히 제약되는 것은 아니지만, 예를 들어 디쉬, 멀티플레이트, 플라스크, 셀 인서트 등을 들 수 있다. 그 중에서, 특히 셀 인서트에 관해서는, 예를 들어 각막 상피 세포를 중층화시킬 때에 필요한 3T3 피더 세포를 각막 상피 세포와 나눠 배양할 수 있기 때문에 제격이다. 그 때, 각막 상피 세포는 셀 인서트측에 있어도 되고, 셀 인서트가 장착되는 디쉬측에 있어도 되고, 적어도 각막 상피 세포가 배양되는 표면에는 온도 응답성 폴리머가 피복되어 있을 필요성이 있다.

본 발명에 있어서, 세포의 배양은 상기 기술한 바와 같이 하여 제조된 세포 배양 지지체 상에서 행해진다. 배지 온도는, 기재 표면에 피복된 상기 폴리머가 상한 임계 용해 온도를 갖는 경우는 그 온도 이하, 또한 상기 폴리머가 하한 임계 용해 온도를 갖는 경우는 그 온도 이상이면 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 배양 세포가 증식하지 않는 저온역, 혹은 배양 세포가 사멸하는 고온역에서의 배양이 부적절한 것은 말할 필요도 없다. 온도 이외의 배양 조건은, 통상적인 방법에 따르면 되고, 특별히 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 사용하는 배지에 관해서는, 공지된 소 태아 혈청 (FCS) 등의 혈청이 첨가되어 있는 배지여도 되고, 또한, 이러한 혈청이 첨가되어 있지 않은 무혈청 배지여도 된다.

본 발명의 방법에 있어서, 배양한 세포를 지지체 재료에서 박리 회수하기 위해서는, 배양된 각막 상피 형성용 세포를 캐리어에 밀착시키고, 세포가 부착된 지지체 재료의 온도를 지지체 기재의 피복 폴리머의 상한 임계 용해 온도 이상 혹은 하한 임계 용해 온도 이하로 함으로써, 그대로 캐리어와 함께 박리할 수 있다. 또, 세포 시트를 박리되는 것은 세포를 배양했던 배양액 중에서 행하는 것도 가능하고, 기타 등장액 중에서 행하는 것도 가능하여, 목적에 따라 선택할 수 있다.

본 발명에서는, 세포 시트를 환부에 댄 후, 세포 시트를 캐리어에서 벗기면 된다. 그 벗기는 방법은, 전혀 제약되는 것은 아니지만, 예를 들어, 캐리어를 적셔 캐리어와 세포 시트의 밀착성을 약하게 하여 벗기는 방법, 또는 메스, 가위, 레이저 광, 플라즈마 파 등의 지그를 사용하여 절단하는 방법이여도 된다. 예를 들어 상기 기술한 바와 같은 일부를 잘라낸 캐리어에 밀착된 세포 시트를 사용한 경우, 레이저 광 등을 사용하여 환부의 경계선을 따라 절단하면 환부 이외의 쓸데없는 곳에 대한 세포 시트의 부착을 피할 수 있어 제격이다.

본 발명의 각막 상피 형성용 세포 시트와 생체 조직과의 고정 방법은 특별히 한정되는 것은 아니라, 세포 시트와 생체 조직을 봉합해도 되고, 혹은 본 발명의 각막 상피 형성용 세포 시트는 생체 조직과 신속하게 생착되기 때문에, 환부에 부착시킨 세포 시트는 생체측과 봉합하지 않아도 된다. 특히 후자의 경우, 이식한 세포 시트를 보호하는 의미에서 콘택트 렌즈를 병용해도 된다.

본 발명의 일 태양인 중층화 시트의 제조법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 일반적으로 알려져 있는 3T3 세포를 피더 레이어로서 증식, 중층화시키는 방법, 혹은 상기한 캐리어에 밀착된 각막 상피 형성용 세포 시트를 이용함으로써 제조하는 방법 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 다음과 같은 방법이 예시된다.

(1) 캐리어와 밀착된 세포 시트를 세포 배양 지지체에 부착시키고, 그 후 배지를 부가함으로써 캐리어를 세포 시트로부터 벗기고, 그리고 추가로 별도의 캐리어와 밀착된 세포 시트를 부착시키는 것을 되풀이함으로써 세포 시트를 중층화시키는 방법.

(2) 캐리어와 밀착된 세포 시트를 반전시켜 세포 배양 지지체 상에서 캐리어측에서 고정시키고, 세포 시트측에 별도의 세포 시트를 부착시키고, 그 후 배지를 부가함으로써 캐리어를 세포 시트로부터 벗기고, 다시 별도의 세포 시트를 부착시키는 조작을 되풀이함으로써 세포 시트를 중층화시키는 방법.

(3) 캐리어와 밀착된 세포 시트끼리를 세포 시트측에서 밀착시키는 방법.

(4) 캐리어와 밀착된 세포 시트를 생체의 환부에 대어, 세포 시트를 생체 조직에 부착시킨 후, 캐리어를 벗기고, 다시 별도의 세포 시트를 겹쳐 가는 방법.

본 발명에서의 중층화 시트는, 반드시 각막 상피 형성용 세포만으로 이루어지는 것이 아니여도 된다. 예를 들어, 각막 상피 형성용 세포 시트의 일 형태인 각막 상피 세포 시트와 동일하게 조작하여 제작한 각막 내피 세포 시트 및/또는 결막 상피 세포 시트를 중첩시키는 것도 가능하다. 생체 내의 전안부 조직에 의해 가까운 것으로 하는 데에 있어서 이러한 기술은 매우 유효하다.

각막 상피 형성용 세포 시트를 고수율로 박리, 회수할 목적으로, 세포 배양 지지체를 가볍게 두드리거나, 흔드는 방법, 또한 피펫을 사용하여 배지를 교반하는 방법 등을 단독으로, 또는 병용하여 사용해도 된다. 더불어, 필요에 따라 배양 세포는 등장액 등으로 세정하여 박리 회수해도 된다.

본 발명에 나타나는 각막 상피 형성용 세포 시트의 용도는 전혀 제약되는 것은 아니지만, 예를 들어 상기 기술한 바와 같이, 각막 미란, 각막 궤양 등의 전안부 조직의 일부 혹은 전부가 손상 또는 결손된 환부 등의 것 이외에, 각막 상피 세포를 가지고 있지 않은 양안성 난치성 각결막 질환 등의 치료에 유효하다. 혹은 본 발명에 나타나는 각막 상피 형성용 세포 시트는, 엑시머레이저를 중앙부에 조사하여 각막 표면을 깎고, 각막의 굴절력을 감소시켜 근시를 교정하는 PRK 법, 마이크로 케라톰에 의해서 160㎛ 의 두께로 각막 실질층을 절단하여 플랩을 제작한 후, 플랩을 떼내고, 엑시머레이저로 각막 실질층을 깎아, 표면을 정리하고, 최후에 플랩을 원래의 위치에 되돌리는 라식 (LASIK) 법, 알코올을 점안하여 각막 표면을 부드럽게 하고, 마이크로 케라톰을 사용하지 않고 각막 상피의 50㎛ 의 두께로 절제하여 플랩을 제작하여, 엑시머레이저로 각막 실질층을 깎아, 표면을 정리하고, 최후에 플랩을 원래의 위치에 되돌리는 라섹 (LASEK) 법 등의 굴절 교정에 유효하다.

상기 기술한 방법에 의해 얻어진 각막 상피 형성용 세포 시트는, 종래 방법에 의해 얻어진 것과 비교하여, 박리 시의 비침습성인 점에서 매우 우수하며, 이식용 각막 등의 임상 응용이 강하게 기대된다. 특히, 본 발명의 각막 상피 형성용 세포 시트는 종래의 이식 시트와는 달리, 생체 조직과의 높은 생착성을 갖기 때문에, 매우 신속하게 생체 조직에 생착된다. 이는, 환부의 치료 효율의 향상, 나아가서는 환자의 부담의 경감도 도모되어 매우 유효한 기술이라고 생각된다. 또, 본 발명의 방법에 있어서 사용되는 세포 배양 지지체는 반복 사용이 가능하다.

이하에, 본 발명을 실시예에 따라서 더욱 자세히 설명하지만, 이들은 본 발명을 전혀 한정하는 것은 아니다.

실시예 1

시판되는 6 웰용 셀 인서트 (Becton Dickinson Labware 사 제조 FALCON 3090) 상에, N-이소프로필아크릴아미드 모노머를 30% 가 되도록 이소프로필알코올에 용해시킨 것을 0.08㎖ 도포하였다. 0.25MGy 의 강도의 전자선을 조사하여, 배양 접시 표면에 N-이소프로필아크릴아미드 폴리머 (PIPAAm) 를 고정화하였다. 조사 후, 이온 교환수에 의해 배양 접시를 세정하고, 잔존 모노머 및 배양 접시에 결합하지 않은 PIPAAm 을 제거하여, 클린 벤치 내에서 건조시키고, 에틸렌옥사이드 가스로 멸균함으로써 세포 배양 지지체 재료를 얻었다. 기재 표면에서의 온도 응답성 폴리머량을 측정한 결과, 1.3㎍/㎠ 피복되어 있음을 알 수 있었다.

얻어진 세포 배양 지지체 재료 상에서, 통상적인 방법에 의해 정상 토끼 각막 상피 세포를 배양하였다 (사용 배지:콜네팍 (크라보(주) 제조), 37℃, 5% CO₂ 하). 그 결과, 각막 상피 세포는, 세포 배양 지지체 재료 상에 정상적으로 부착되어, 증식하였다.

배양 7 일 후에 배양한 세포는 컨플루언트 상태가 되고, 추가로 7 일간 배양한 세포 상에 직경 1.5㎝ 의 원형상으로 잘라낸 직경 2.1㎝ 의 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF) 막으로부터 성형한 캐리어를 덮어, 배지를 조용히 흡인하고, 세포 배양 지지체 재료마다 20℃ 에서 30 분 인큐베이트하여 냉각함으로써 저온 처리하여, 세포 배양 지지체 재료 상의 세포도 덮은 캐리어와 함께 박리시켰다. 얻어진 세포 시트는 수축률 5% 이하의 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 것이었다.

본 실시예에서 얻어진 각막 상피 세포 시트를 각막 상피 조직부가 결손된 각막 미란 질병 모델인 토끼에게 통상적인 방법에 따라서 이식하였다. 각막 상피 세포 시트를 창상부에 15 분간 부착시키고, 그 후, 메스를 사용하여 환부 이외의 곳에 겹치는 세포 시트를 절제하였다. 그 때, 세포 시트와 생체측의 봉합은 행하지 않았다. 3 주간 후, 환부를 관찰한 결과, 각막 상피 세포 시트는 안구에 양호하게 생착되어 있었다.

실시예 2

본 실시예에 있어서는, N-이소프로필아크릴아미드 모노머를 35% 가 되도록 이소프로필알코올에 용해시킨 것 이외에는, 실시예 1 과 동일한 방법을 사용하여, 배양 접시 표면에 N-이소프로필아크릴아미드 폴리머 (PIPAAm) 를 고정화하였다. 이 방법으로 형성한 기재 표면에서의 온도 응답성 폴리머량을 측정한 결과, 1.5㎍/㎠ 피복되어 있음을 알 수 있었다.

본 실시예에 있어서도, 실시예 1 과 동일하게, 각막 상피 세포는 세포 배양 지지체 재료 상에 정상적으로 부착ㆍ증식하여, 배양 7 일 후에 배양한 세포는 컨플루언트 상태가 되었다. 또한 7 일간 배양한 세포 상에 직경 1.5㎝ 의 원형상으로 잘라낸 직경 2.1㎝ 의 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF) 막으로부터 성형한 캐리어를 덮어, 배지를 조용히 흡인하고, 세포 배양 지지체 재료마다 20℃ 에서 30 분 인큐베이트하여 냉각함으로써 저온 처리하여, 세포 배양 지지체 재료 상의 세포도 덮은 캐리어와 함께 박리시켰다. 얻어진 세포 시트는 수축률 5% 이하의 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 것이었다.

본 실시예에서 얻어진 각막 상피 세포 시트를 각막 상피 조직부가 결손된 각막 미란 질병 모델인 토끼에게 통상적인 방법에 따라서 이식하였다. 각막 상피 세포 시트를 창상부에 15 분간 부착시키고, 그 후, 메스를 사용하여 환부 이외의 곳에 겹치는 세포 시트를 절제하였다. 그 때, 세포 시트와 생체측의 봉합은 행하지 않고, 이식 후, 환부에 콘택트 렌즈를 장착시켰다. 3 주간 후, 환부를 관찰한 결과, 각막 상피 세포 시트는 안구에 양호하게 생착되어 있었다.

실시예 3

실시예 1 의 세포 배양 지지체 상에서, 배지를 마이토마이신 C 를 포함하는 통상의 그린 등의 배지 (DMEM+AB (피더 레이어 제작용), 인간 신생아 유래 각화 표피 세포용) 로 변경하는 것 이외에는 동일한 방법으로 정상 토끼 각막 상피 세포를 배양시켰다. 그 결과, 배양 지지체 재료 상의 각막 상피 세포는 정상적으로 부착되어, 증식하였다.

배양 6 일 후에 컨플루언트 상태가 되고, 추가로 6 일간 배양하여 중층화시켰다. 다음으로, 직경 1.5㎝ 의 원형상으로 잘라낸 직경 2.1㎝ 의 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF) 막으로부터 성형한 캐리어를 덮어, 배지를 조용히 흡인하고, 세포 배양 지지체 재료마다 20℃ 에서 30 분 인큐베이트하여 냉각함으로써 저온 처리하여, 세포 배양 지지체 재료 상의 중층화 각막 상피 세포 시트를 덮은 캐리어와 함께 박리시켰다. 박리된 중층화 시트는 수축률 5% 이하의 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 것이었다.

본 실시예에서 얻어진 각막 상피 세포 중층화 시트를 각막 상피 조직부가 결손된 각막 미란 질병 모델인 토끼에게 통상적인 방법에 따라서 이식하였다. 각막 상피 세포 시트를 창상부에 15 분간 부착시키고, 그 후, 레이저 광을 사용하여 환부 이외의 곳에 겹치는 세포 시트를 절제하였다. 그 때, 세포 시트와 생체측의 봉합은 행하지 않았다. 3 주간 후, 환부를 관찰한 결과, 각막 상피 세포 중층화 시트는 안구에 양호하게 생착되어 있었다.

비교예 1

실시예 1 에서 각막 상피 세포 시트를 제작하고, 캐리어를 사용하지 않고 세포 시트를 박리시켜, 수축시키는 것 이외에는 실시예 1 과 동일하게 각막 상피 세포 시트를 제조하였다. 그 때의 수축률은, 42% 이었다.

실시예 1 과 동일하게 얻어진 각막 상피 세포 시트를 각막 상피 조직부를 결손시킨 토끼에게 통상적인 방법에 따라서 이식하였다. 각막 상피 세포 시트를 창상부에 15 분간 부착시키고, 그 후, 메스를 사용하여 환부 이외의 곳에 겹치는 세포 시트를 절제하였다. 그 때, 세포 시트와 생체측의 봉합은 행하지 않았다. 이식 1 일 후에 환부를 관찰한 결과, 각막 상피 세포 시트의 안구에 대한 생착성은 나빠서, 환부에서 탈락되려 하고 있었다.

비교예 2

실시예 3 에서 각막 상피 세포 중층화 시트를 제작하고, 세포 배양 지지체로부터 박리되기까지의 기간을 컨플루언트에 도달하고 나서 28 일 후로 한 것 이외에는 실시예 3 과 동일하게 각막 상피 세포 중층화 시트를 제조하였다. 얻어진 시트의 수축률은 5% 이하이고, 1 장의 막으로서 충분히 강도가 있는 것이었다.

다음으로, 실시예 3 과 동일하게 얻어진 각막 상피 세포 중층화 시트를 각막 상피 조직부를 결손시킨 토끼에게 통상적인 방법에 따라서 이식하였다. 각막 상피 세포 시트를 창상부에 15 분간 부착시키고, 그 후, 메스를 사용하여 환부 이외의 곳에 겹치는 세포 시트를 절제하였다. 그 때, 세포 시트와 생체측의 봉합은 행하지 않았다. 이식 1 일 후에 환부를 관찰한 결과, 각막 상피 세포 시트의 안구에 대한 생착성은 나빠서, 환부에서 탈락되려 하고 있었다.

실시예 4

시판되는 3.5㎝ø 세포 배양용 배양 접시 (Becton Dickinson Labware 사 제조 FALCON 3001) 상에, N-이소프로필아크릴아미드 모노머를 30% 가 되도록 이소프로필알코올에 용해시킨 것을 0.1㎖ 도포하였다. 0.25MGy 의 강도의 전자선을 조사하여, 배양 접시 표면에 N-이소프로필아크릴아미드 폴리머 (PIPAAm) 를 고정화하였다. 조사 후, 이온 교환수에 의해 배양 접시를 세정하고, 잔존 모노머 및 배양 접시에 결합하지 않은 PIPAAm 을 제거하여, 클린 벤치 내에서 건조시키고, 에틸렌옥사이드 가스로 멸균함으로써 세포 배양 지지체 재료를 얻었다. 기재 표면에서의 온도 응답성 폴리머량을 측정한 결과, 1.4㎍/㎠ 피복되어 있음을 알 수 있었다.

한편, 통상적인 방법에 의해 제작해 둔 각결막 상피증 모델인 백색 집토끼에서 깊은 마취 하에서 구강 점막 조직을 채취하고, 그 상피 세포를 얻어진 세포 배양 지지체 재료 상에서, 통상적인 방법에 따라서 3T3 세포와 함께 배양하였다 (사용 배지: 콜네팍 (크라보(주) 제조), 37℃, 5% CO₂ 하). 그 결과, 어떠한 세포 배양 지지체 재료 상의 상피 세포에서도 정상적으로 부착되어, 증식하였다.

배양 6 일 후에 배양한 세포는 컨플루언트 상태가 되고, 추가로 7 일간 배양한 세포 상에 직경 1.8㎝ 의 원형상으로 잘라낸 직경 2.3㎝ 의 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF) 막으로부터 성형한 캐리어를 덮어, 배지를 조용히 흡인하고, 세포 배양 지지체 재료마다 20℃ 에서 30 분 인큐베이트하여 냉각함으로써 저온 처리하여, 세포 배양 지지체 재료 상의 세포도 덮은 캐리어와 함께 박리시켰다. 얻어진 세포 시트는 수축률 5% 이하의 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 것이었다.

본 실시예에서 얻어진 구강 점막 세포 시트를 각막 상피 조직부가 결손된 각결막 상피증 모델인 백색 집토끼에게 통상적인 방법에 따라서 이식하였다. 구강 점막 세포 시트를 창상부에 15 분간 부착시키고, 그 후, 메스를 사용하여 환부 이외의 곳에 겹치는 세포 시트를 절제하였다. 그 때, 세포 시트와 생체측의 봉합은 행하지 않았다. 3 주간 후, 환부를 관찰한 결과, 구강 점막 세포 시트는 안구에 양호하게 생착되어 있었다.

실시예 5

본 실시예에 있어서는, N-이소프로필아크릴아미드 모노머를 35% 가 되도록 이소프로필 알코올에 용해시킨 것 이외에는, 실시예 4 와 동일한 방법을 사용하여, 배양 접시 표면에 N-이소프로필아크릴아미드 폴리머 (PIPAAm) 를 고정화하였다. 이 방법으로 형성한 기재 표면에서의 온도 응답성 폴리머량을 측정한 결과, 1.5㎍/㎠ 피복되어 있음을 알 수 있었다.

본 실시예에 있어서도, 실시예 4 와 동일하게, 구강 점막 상피 세포는 세포 배양 지지체 재료 상에 정상적으로 부착ㆍ증식하여, 배양 6 일 후에 배양한 세포는 컨플루언트 상태가 되었다. 추가로 7 일간 배양한 세포 상에 직경 1.8㎝ 의 원형상으로 잘라낸 직경 2.3㎝ 의 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF) 막으로부터 성형한 캐리어를 덮어, 배지를 조용히 흡인하고, 세포 배양 지지체 재료마다 20℃ 에서 30 분 인큐베이트하여 냉각함으로써 저온 처리하여, 세포 배양 지지체 재료 상의 세포도 덮은 캐리어와 함께 박리시켰다. 얻어진 세포 시트는 수축률 5% 이하의 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 것이었다.

본 실시예에서 얻어진 구강 점막 세포 시트를 각막 상피 조직부가 결손된 각결막 상피증 모델인 백색 집토끼에게 통상적인 방법에 따라서 이식하였다. 구강 점막 세포 시트를 창상부에 15 분간 부착시키고, 그 후, 메스를 사용하여 환부 이외의 곳에 겹치는 세포 시트를 절제하였다. 그 때, 세포 시트와 생체측의 봉합은 행하지 않고, 이식 후, 환부에 콘택트 렌즈를 장착시켰다. 3 주간 후, 환부를 관찰한 결과, 구강 점막 세포 시트는 안구에 양호하게 생착되어 있었다.

실시예 6

실시예 4 의 세포 배양 지지체 재료 상에서, 세포로서 깊은 마취 하의 백색 집토끼 피부의 모근 조직으로부터 상피계 줄기 세포를 통상적인 방법에 의해 채취하여, 3T3 세포와 함께 배양한 것 이외에는 실시예 4 와 동일한 방법으로 실시하였다. 그 결과, 배양 지지체 재료 상의 모근 세포는 정상적으로 부착되어, 증식하였다. 2 주간 배양한 후, 직경 1.5㎝ 의 원형상으로 잘라낸 직경 2.1㎝ 의 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF) 막으로부터 성형한 캐리어를 덮어, 배지를 조용히 흡인하고, 세포 배양 지지체 재료마다 20℃ 에서 30 분 인큐베이트하여 냉각함으로써, 세포 배양 지지체 재료 상의 세포 시트를 덮은 캐리어와 함께 박리시켰다. 박리된 중층화 시트는 수축률 5% 이하의 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 것이었다.

본 실시예에서 얻어진 세포 시트를 각막 상피 조직부가 결손된 각결막 상피증 모델인 백색 집토끼에게 통상적인 방법에 따라서 이식하였다. 모근 세포 시트를 창상부에 15 분간 부착시키고, 그 후, 레이저 광을 사용하여 환부 이외의 곳에 겹치는 세포 시트를 절제하였다. 그 때, 세포 시트와 생체측의 봉합은 행하지 않았다. 3 주간 후, 환부를 관찰한 결과, 세포 시트는 안구에 양호하게 생착되어 있었다.

실시예 7

실시예 4 의 세포 배양 지지체 재료 상에서, 세포로서 깊은 마취 하의 백색 집토끼 피부의 결막 조직으로부터 결막 상피 세포를 통상적인 방법에 의해 채취하여, 3T3 세포와 함께 배양한 것 이외에는 실시예 4 와 동일한 방법으로 실시하였다. 그 결과, 배양 지지체 재료 상의 결막 상피 세포는 정상적으로 부착되어, 증식하였다. 2 주간 배양한 후, 직경 1.5㎝ 의 원형상으로 잘라낸 직경 2.1㎝ 의 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF) 막으로부터 성형한 캐리어를 덮어, 배지를 조용히 흡인하고, 세포 배양 지지체 재료마다 20℃ 에서 30 분 인큐베이트하여 냉각함으로써, 세포 배양 지지체 재료 상의 세포 시트를 덮은 캐리어와 함께 박리시켰다. 박리된 중층화 시트는 수축률 3% 이하의 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 것이었다.

본 실시예에서 얻어진 세포 시트를 각막 상피 조직부가 결손된 각결막 상피증 모델인 백색 집토끼에게 통상적인 방법에 따라서 이식하였다. 결막 상피 세포 시트를 창상부에 15 분간 부착시키고, 그 후, 레이저 광을 사용하여 환부 이외의 곳에 겹치는 세포 시트를 절제하였다. 그 때, 세포 시트와 생체측의 봉합은 행하지 않았다. 3 주간 후, 환부를 관찰한 결과, 결막 세포 중층화 시트는 안구에 양호하게 생착되어 있고, 결막으로부터의 혈관 침입도 발견되지 않았다.

비교예 3

실시예 4 에서 구강 점막 세포 시트를 제작하고, 캐리어를 사용하지 않고 세포 시트를 박리시켜, 수축시키는 것 이외에는 실시예 4 와 동일하게 구강 점막 세포 시트를 제조하였다. 그 때의 수축률은, 38% 이었다.

실시예 4 와 동일하게 얻어진 구강 점막 세포 시트를 각막 상피 조직부를 결손시킨 토끼에게 통상적인 방법에 따라서 이식하였다. 각막 상피 세포 시트를 창상부에 15 분간 부착시키고, 그 후, 메스를 사용하여 환부 이외의 곳에 겹치는 세포 시트를 절제하였다. 그 때, 세포 시트와 생체측의 봉합은 행하지 않았다. 이식 1 일 후에 환부를 관찰한 결과, 구강 점막 세포 시트의 안구에 대한 생착성은 나빠서, 환부에서 탈락되려 하고 있었다.

이상의 결과로부터, 본 기술에 의하면, 전안부 조직에 대한 부착성이 양호한 각막 상피 대체 세포 시트의 작성이 가능함을 알 수 있었다. 이것은, 치료의 간편화, 효율화에 의한 환자의 부담 경감, 또한 이들 세포 시트가 환부를 충분히 덮어, 단단히 부착하는 점에서 환자 본인의 통증도 현저히 경감시키는 매우 유효한 기술이라고 생각된다.

실시예 8

실시예 3 에 나타내는 방법과 완전히 동일한 방법으로 캐리어에 밀착된 각막 상피 세포 중층화 시트를 제작하였다. 이것을 근시 치료법으로서 알려진 라식 (LASIK) 법에서의 각막 상피 플랩의 대체가 되는 것인지 여부를 검토하였다.

구체적으로는, 우선 토끼 각막에 대하여 마이크로 케라톰에 의해서 160㎛ 의 두께로 각막 실질층을 절단하여 플랩을 제작한 후, 그 플랩을 제거하고, 추가로 엑시머레이저로 각막 실질층을 깎아, 표면을 정리하고, 최후에 원래 플랩을 되돌리는 장소에 실시예 3 에서 얻어진 캐리어에 밀착된 각막 상피 세포 중층화 시트를 부착시켰다. 레이저 광으로 환부와 동일한 크기로 각막 상피 세포 중층화 시트를 절단하여, 이식을 완료하였다. 봉합은 행하지 않았다. 3 주간 후, 환부를 관찰한 결과, 각막 상피 세포 중층화 시트는 안구에 양호하게 생착되어 있고, 본 발명의 각막 상피 세포 중층화 시트는 라식법에도 유효하다고 생각하였다.

실시예 9

실시예 3 에 나타내는 방법과 완전히 동일한 방법으로 캐리어에 밀착된 각막 상피 세포 중층화 시트를 제작하였다. 이것을 근시 치료법으로서 알려진 라섹 (LASEK) 법에서의 각막 상피 플랩의 대체가 되는 것인지 여부를 검토하였다.

구체적으로는, 우선 토끼 각막에 대하여 알코올을 점안하여 각막 표면을 부드럽게 하고, 마이크로 케라톰을 사용하지 않고 각막 상피의 50㎛ 의 두께로 절제하여 플랩을 제작한 후, 그 플랩을 제거하고, 엑시머레이저로 각막 실질층을 깎아, 표면을 정리하고, 최후에 원래 플랩을 되돌리는 장소에 실시예 3 에서 얻어진 캐리어에 밀착된 각막 상피 세포 중층화 시트를 부착시켰다. 레이저 광으로 환부와 동일한 크기로 각막 상피 세포 중층화 시트를 절단하여, 이식을 완료하였다. 봉합은 행하지 않았다. 3 주간 후, 환부를 관찰한 결과, 각막 상피 세포 중층화 시트는 안구에 양호하게 생착되어 있고, 본 발명의 각막 상피 세포 중층화 시트는 라섹법에도 유효하다고 생각하였다.

이상의 결과로부터, 본 기술에 의하면, 전안부 조직에 대한 부착성이 양호한 재생 각막 상피 세포 시트, 그 중층화 시트의 작성이 가능함을 알 수 있었다. 이는, 치료의 간편화, 효율화에 의한 환자의 부담 경감이라는 점에서 매우 유효한 기술이라고 생각된다.

본 발명에서 얻어지는 각막 상피 형성용 세포 시트는 생체 조직에 대한 생착성이 매우 높고, 즉 「고부착성」 이며, 예를 들어 각막 이식, 각막 질환 치료, 근시 치료 등의 임상 응용이 강하게 기대된다. 따라서, 본 발명은 세포 공학, 의용 공학 등의 의학, 생물학 등의 분야에서의 매우 유용한 발명이다.

Claims

캐리어에 밀착시킨, 각막 상피 형성용 세포 시트.
제 1 항에 있어서, 단백질 분해 효소에 의한 처리를 실시하지 않고 지지체로부터 박리되어, 박리 후의 세포 시트의 수축률이 20% 이하로 유지되는, 각막 상피 형성용 세포 시트.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 기저막형 단백질이 80% 이상 잔존되어 있는 세포 시트.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 데스모솜 구조가 80% 이상 잔존되어 있는 세포 시트.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 전안부 조직의 일부 혹은 전부가 손상 또는 결손된 환부를 치료하기 위한, 각막 상피 형성용 세포 시트.
제 5 항에 있어서, 전안부 조직이 각막 상피 조직, 보만막, 각막 실질 조직인, 각막 상피 형성용 세포 시트.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 박리되는 시기가, 세포가 지지체 표면에서 컨플루언트가 되고 나서 21 일 이내인, 각막 상피 형성용 세포 시트.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 재생 각막 상피 세포 시트 또는 그 중층화 시트인, 각막 상피 형성용 세포 시트.
제 8 항에 있어서, 중층화 시트가 각막 상피 세포를 중층화 배양시킨 것인, 각막 상피 형성용 세포 시트.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 각막 상피 대체 세포 시트 또는 그 중층화 시트인, 각막 상피 형성용 세포 시트.
제 10 항에 있어서, 각막 상피 대체 세포 시트가, 구강 점막 세포, 모근 세포, 결막 상피 세포 중 어느 하나 혹은 2 이상의 혼합물, 혹은 이들과 각막 상피 세포와의 혼합물로 이루어지는 각막 상피 형성용 세포 시트.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 중층화 시트가 구강 점막 세포, 모근 세포, 결막 상피 세포 중 어느 하나 혹은 2 이상의 혼합물, 또는 이들과 각막 상피 세포와의 혼합물을 중층화 배양시킨 것인, 각막 상피 형성용 세포 시트.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 구강 점막 세포가 협막 유래의 것인, 각막 상피 형성용 세포 시트.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 각막 상피 형성용 세포 시트를 환부에 대하여 봉합하지 않고 피복하는 것을 특징으로 하는, 각막 상피 형성용 세포 시트.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 환부에게 피복할 때, 환부의 크기, 형상을 따라 절단되는, 각막 상피 형성용 세포 시트.
물에 대한 0∼80℃ 의 온도 범위에서 수화력이 변화하는 온도 응답성 폴리머로 기재 표면을 피복한 세포 배양 지지체 상에서 각막 상피 형성용 세포를 배양하고, 필요에 따라 통상적인 방법에 의해 배양 세포층을 중층화시키고, 그 후,

(1) 배양액 온도를 상한 임계 용해 온도 이상 또는 하한 임계 용해 온도 이하로 하고,

(2) 배양한 각막 상피 형성용 세포를 캐리어에 밀착시키고,

(3) 그대로 캐리어와 함께 박리하는 것을 특징으로 하는, 각막 상피 형성용 세포 시트의 제조 방법.
제 16 항에 있어서, 각막 상피 형성용 세포 시트가, 재생 각막 상피 세포 시트, 각막 상피 대체 세포 시트, 또는 그들 중 어느 하나의 중층화 시트인, 각막 상피 형성용 세포 시트의 제조 방법.
제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 세포 배양 지지체가 막을 이용한 셀 인서트인 것을 특징으로 하는, 각막 상피 형성용 세포 시트의 제조 방법.
제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 온도 응답성 폴리머가, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)인, 각막 상피 형성용 세포 시트의 제조 방법.
제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 캐리어의 형상이 중심부를 잘라낸 링형상인 것을 특징으로 하는, 각막 상피 형성용 세포 시트의 제조 방법.
제 16 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 박리가 단백질 분해 효소에 의한 처리가 실시되어 있지 않은, 각막 상피 형성용 세포 시트의 제조 방법.
전안부 조직의 일부 혹은 전부가 손상 또는 결손된 환부에 대하여, 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 각막 상피 형성용 세포 시트를 이식하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제 22 항에 있어서, 이식이 환부에 대하여 봉합하지 않고 피복하는 것을 특징으로 하는, 치료 방법.
제 23 항에 있어서, 환부에 피복할 때, 각막 상피 형성용 세포 시트를 환부의 크기, 형상을 따라 절단하는 것을 특징으로 하는, 치료 방법.
제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 대상이, 각막 미란, 각막 궤양, 혹은 양안성 난치성 각결막 질환인 것을 특징으로 하는, 치료 방법.
제 22 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료를 RK 법, PRK 법, LASIK 법, 또는 LASEK 법에 의한 굴절 교정에 의해 행하는 것을 특징으로 하는, 치료 방법.