KR101712429B1 - 표면-증강 라만 산란 기반의 탄저균 검출용 미세유체칩 및 이를 이용한 탄저균 검출 방법 - Google Patents

표면-증강 라만 산란 기반의 탄저균 검출용 미세유체칩 및 이를 이용한 탄저균 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101712429B1
KR101712429B1 KR1020150135087A KR20150135087A KR101712429B1 KR 101712429 B1 KR101712429 B1 KR 101712429B1 KR 1020150135087 A KR1020150135087 A KR 1020150135087A KR 20150135087 A KR20150135087 A KR 20150135087A KR 101712429 B1 KR101712429 B1 KR 101712429B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
channel
anthrax
sample
sensing
magnetic
Prior art date
Application number
KR1020150135087A
Other languages
English (en)
Inventor
이기은
전준호
차기원
주재범
최종훈
고주희
고영과
Original Assignee
대한민국(관리부서 질병관리본부장)
한양대학교 에리카산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국(관리부서 질병관리본부장), 한양대학교 에리카산학협력단 filed Critical 대한민국(관리부서 질병관리본부장)
Priority to KR1020150135087A priority Critical patent/KR101712429B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101712429B1 publication Critical patent/KR101712429B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/0098—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor involving analyte bound to insoluble magnetic carrier, e.g. using magnetic separation

Abstract

본 발명은 시료 내에 탄저균 마커 항원이 존재하는지 여부를 검출하기 위한, 센싱 채널을 포함하는 센싱부; 상기 센싱부와 이격되어 위치하는, 컨트롤 채널을 포함하는 컨트롤부; 및 상기 센싱 채널과 컨트롤 채널에 연결되어, 탄저균 마커 항원과 라만 표지자가 결합된 금속 나노프로브가 상기 센싱부 및 컨트롤부로 이동하기 위한 통로를 제공하는 금속 나노프로브 채널부;를 포함하는 미세유체칩에 대한 것이다. 본 발명은 상기 미세유체칩 내에서의 경쟁 면역반응을 통해 생화학 테러에서 사용되는 탄저균을 빠른 시간에 고감도로 검출할 수 있다.

Description

표면-증강 라만 산란 기반의 탄저균 검출용 미세유체칩 및 이를 이용한 탄저균 검출 방법{MICROFLUIDIC CHIP OF DETECTING ANTHRAX BASED ON A SURFACE-ENHANCED RAMAN SCATTERING AND METHOD USING THE SAME}
본 발명은 표면-증강 라만 산란(Surface-Enhanced Raman Scattering; 이하, 'SERS'라고 함)에 기반한 탄저균 검출용 미세유체집 및 이를 이용하여 탄저균을 검출하는 방법에 대한 것이다.
탄저는 그람 양성 간균인 탄저균(Bacillus anthracis)에 의하여 주로 가축에게 감염되나, 사람에게도 발병하는 인수 공통 감염성 질환이다. 이 탄저균은 오래 전부터 생물학 무기로 개발되어 왔다. 최근에는 실전에도 배치될 정도가 되어 1990년 걸프전 때와 1998년에 재외 주둔 미군에게 탄저 백신을 접종하기도 하였다. 이 사건을 통해 탄저균은 일반인에게도 주요 관심사로 대두되고 있다. 탄저균 감염에 의해서 발생하는 탄저병은 매우 치사율이 높은 것으로 알려져 있다.
생물무기는 저렴한 가격에 대량생산이 가능하고, 쉽게 은닉 및 살포가 가능하여 미량으로도 막대한 피해를 야기할 수 있다. 또한 전염이 가능하기 때문에 테러를 인식하였을 때는 이미 넓은 지역으로 확산되어 다수의 사람들이 이미 감염된 후일 수 있다. 따라서 만일의 경우 발생할 수 있는 생물테러의 피해를 최소화하기 위해서는 신속하고 정확한 원인병원체의 탐지가 필요하다.
효소면역측정법 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 마이크로어레이는 바이오 마커 후보를 확인하는 도구로 널리 사용되었다. 이 기술을 이용하면 적은 부피를 가지는 샘플 내 수 개의 단백질의 농도를 동시에 측정할 수 있다. 게다가, ELISA 방법은 종래의 방법보다 단번에 많은 양을 처리할 수 있고(high-throughput performance), 비용이 적게 들뿐만 아니라 임상에 쉽게 적용할 수 있는 이점이 있다. ELISA 분석에서는, 각각의 어레이 웰에 고정된 바이오 마커 샘플을 수득하기 위해서 형광-기반 마이크로어레이 스캐너가 사용된다. 그러나 이 형광 이미징 기술은 신호 대 노이즈 비율이 좋지 않고 검출 한계값(limit of detection: LOD)도 좋지 않은 단점이 있다. 또한 이 방법은 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다.
표면 증강 라만 산란 (Surface-enhanced Raman scattering: SERS) 기반 검출 방법은, 라만 분광법의 검출 감도 한계를 극복할 수 있는 분석법이다. 이 분석법은 라만 리포터 분자의 증폭된 특징적인 SERS 피크의 세기(intensity) 변화를 측정하여 타겟 물질을 정량할 수 있는 방법이다. 리포터 분자가 거친 금속 표면에 흡착되고 여기광(레이저 광)에 노출되면, “측정 접점(hot junction)”이라고 알려진 리포터 분자의 SERS 활성 사이트에서 전자기적이고 화학적인 증강이 발생하여 SERS 신호가 대폭 증가한다(비특허문헌 1, 2 및 3). 이 증강 효과는 종래 라만 검출법이 가지는 단점인 저감도성의 문제를 해결해 줄 것으로 기대되며, 종래의 화학발광분석법, 방사능 기반 면역분석법의 정확도와 검출한계를 뛰어 넘을 수 있을 것으로 판단된다.
미세유체칩(microfluidic chip)은 미세유체공학(microfluidics) 기술을 토대로 미세유체 채널을 통해 유체를 흘려보내 여러 가지 복잡한 실험을 한꺼번에 수행할 수 있는 기능을 가지고 있다. 플라스틱, 유리, 실리콘 등의 기판을 이용하여 나노리터 이하의 미세 채널을 만들고, 이 채널을 통해 수 나노리터 이하의 적은 양의 액체 시료를 이동시켜서 실험이나 연구를 신속하게 수행할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 연구를 계속하여 SERS와 경쟁 면역분석 방법을 이용하여 탄저균을 단시간 내에 검출할 수 있는 검출 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
1. Kneipp, J. et al., 1997. Phys. Rev. Lett. 78, pp. 1667-1670 2. Nie, S. M. and Emory, S. R., 1997. Science 275, pp. 1102-1106 3. Kneipp, J. et al., 2006. Nano Lett. 6(10), pp. 2225-2231
본 발명의 목적은 경쟁 면역반응을 이용한 표면-증강 라만 산란(Surface-Enhanced Raman Scattering: SERS) 기반의 탄저균 검출용 미세유체칩을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 경쟁 면역반응을 이용한 표면-증강 라만 산란(Surface-Enhanced Raman Scattering: SERS) 기반의 탄저균 검출 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 경쟁 면역반응을 이용한 표면-증강 라만 산란(Surface-Enhanced Raman Scattering: SERS) 기반의 탄저균 검출용 미세유체칩을 제공한다.
상기 미세유체칩은 센싱부; 컨트롤부; 금속나노채널부를 포함한다.
본 발명에 따른 미세유체칩은 센싱부와 컨트롤부를 갖춘 이중 미세유체칩이다.
구체적으로, 본 발명에 따른 미세유체칩은 다음을 포함한다:
시료 내에 탄저균 마커 항원이 존재하는지 여부를 검출하기 위한, 센싱 채널을 포함하는 센싱부;
상기 센싱부와 이격되어 위치하는, 컨트롤 채널을 포함하는 컨트롤부; 및
상기 센싱 채널과 컨트롤 채널에 연결되어, 탄저균 마커 항원과 라만 표지자가 결합된 금속 나노프로브가 상기 센싱부 및 컨트롤부로 이동하기 위한 통로를 제공하는 금속 나노프로브 채널부.
상기 센싱 채널과 컨트롤 채널에는 각각 상기 탄저균 마커 항원에 특이적인 항체가 고정화된 자성입자가 주입되며, 상기 탄저균 마커 항원과 상기 금속 나노프로브(탄저균 마커 항원이 고정되어 있음)는, 상기 자성입자의 항체와 경쟁적으로 면역반응을 할 수 있다.
상기 금속 나노프로브에 고정화되는 탄저균 마커 항원은 특정 구조(예, 그물망 구조)에 의해 응집될 가능성이 높다. 본 발명에서는 이를 해결하고자 가수분해 (hydrolysis)방법을 이용하여 분자량을 낮춘 것으로, 이로 인하여 면역분석시 발생할 것으로 예상되는 응집 현상이 최소화되는 효과가 발휘될 수 있다.
상기 센싱부는 다음을 포함할 수 있다:
상기 시료가 주입되는 제1 시료 주입구;
상기 탄저균 마커 항원에 특이적인 항체가 고정화된 자성입자가 주입되는 제1 자성입자 주입구;
일단이 분기되어 상기 제1 시료 주입구와 제1 자성입자 주입구에 연결되고, 상기 제1 시료와 상기 제1 자성입자가 이동하는 통로를 제공하는 제1 센싱 채널과 제2 센싱 채널로 이루어진 센싱 채널; 및
상기 센싱 채널의 타단에 연결되고 상기 제1 자성입자에 자력을 가하는 자력 수단을 포함하는 제1 포획공간.
상기 컨트롤부는 다음을 포함할 수 있다:
탄저균 마커 항원이 함유되지 않은 제2 시료가 주입되는 제2 시료 주입구;
상기 항원에 특이적인 항체가 고정화된 자성입자가 주입되는 제2 자성입자 주입구;
일단이 분기되어 상기 제2 시료 주입구와 제2 자성입자 주입구에 연결되고, 상기 제2 시료와 제2 자성입자가 이동하는 통로를 제공하는 제1 컨트롤 채널과 제2 컨트롤 채널로 이루어진 컨트롤 채널; 및
상기 컨트롤 채널의 타단에 연결되고 상기 제2 자성입자에 자력을 가하는 자력수단을 포함하는 제2 포획공간.
상기 금속 나노프로브 채널부는 다음을 포함할 수 있다:
탄저균 마커 항원과 라만 표지자가 결합된 금속 나노프로브가 주입되는 금속 나노프로브 주입구; 및
상기 금속 나노프로브 주입구로부터 분기되어 상기 센싱부의 센싱 채널의 타단과 상기 컨트롤부의 컨트롤 채널의 타단에 연결되는 금속 나노프로브 채널부.
상기 금속 나노프로브 채널은 센싱부의 제1 센싱 채널, 그리고 컨트롤부의 제1 컨트롤 채널에 연결될 수 있다.
상기 미세유체칩은 세척 채널부를 더 포함할 수 있다.
상기 세척 채널부는 다음을 포함할 수 있다:
세척용 시료를 주입하는 세척용 시료 주입구; 및
상기 세척용 시료 주입구로부터 분기되어, 상기 제2 센싱 채널의 타단과 제2 컨트롤 채널의 타단에 연결되는 세척 채널.
상기 세척 채널부는 상기 금속 나노프로브 채널부 하부에 위치할 수 있다.
상기 탄저균 마커 항원은 PGA(poly-γ-D-glutamic acid)일 수 있으나, 반드시 이로 한정되는 것은 아니다.
상기 항체는 탄저균 마커 항원과 특이적 결합성이 뛰어난 단클론 항체인 A-12 항체일 수 있으나, 반드시 이로 한정되는 것은 아니다.
상기 센싱부와 상기 컨트롤부는 병렬로 위치할 수 있다.
상기 금속 나노프로브 채널부는 상기 센싱부와 상기 컨트롤부 사이에 위치할 수 있다.
상기 세척 채널부는 상기 센싱부와 상기 컨트롤부 사이에 위치할 수 있다.
상기 센싱부의 제1 포획공간의 자력 수단과 상기 컨트롤부의 제2 포획공간의 자력수단은 자기장을 발생시키는 미니솔레노이드일 수 있다.
상기 제1 포획공간 및 제 2 포획공간은 항원-항체반응에 의하여 형성되는 면역복합체를 포획할 수 있다. 구체적으로, 미니솔레노이드에 전류를 가하면 자기장이 발생하여 면역복합체를 형성한 자성입자(자성 면역복합체)를 포획하고 이곳에 레이저 광을 조사하여 SERS 신호를 측정할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 미세유체칩을 이용한 탄저균 검출방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 경쟁 면역반응을 이용한 SERS 기반 탄저균 검출용 미세유체칩을 이용한 탄저균 검출방법을 제공한다:
센싱부에서, 검출 대상 시료 내 탄저균 마커 항원과 탄저균 마커 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 자성입자와 사이의 제 1 면역반응과, 탄저균 마커 항원과 라만 표지자가 결합된 금속 나노프로브와 탄저균 마커 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 자성입자 사이의 제 2 면역반응의 경쟁 면역반응을 유도하고;
컨트롤부에서, 탄저균 마커 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 자성입자와 탄저균 마커 항원과 라만 표지자가 결합된 금속 나노프로브가 면역반응을 하여 자성 면역복합체를 형성하고; 그리고
상기 센싱부 및 컨트롤부에 레이저광을 조사하여 표면-증강 라만 산란(Surface-Enhanced Raman Scattering: SERS) 신호를 측정하여 상기 탄저균의 존재 여부를 확인하는 단계.
다른 구체예로서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 경쟁 면역반응을 이용한 SERS 기반 탄저균 검출방법을 제공한다:
i) 검출 대상인 제1 시료, 탄저균 마커 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 자성입자, 탄저균 마커 항원과 라만 표지자가 결합된 금속 나노프로브 및 탄저균 마커 항원이 함유되지 않은 제2 시료를 각각 준비하고;
ii) 상기 제1 시료 및 상기 자성입자를 각각 센싱부의 제1 시료 주입구 및 제1 자성입자 주입구에 주입하여, 상기 센싱부에서 상기 제1 시료와 상기 자성입자 사이의 제1 면역반응을 유도하고;
iii) 상기 제2 시료 및 상기 자성입자를 각각 컨트롤부의 제2 시료 주입구 및 제2 자성입자 주입구에 주입하고;
iv) 상기 금속 나노프로브를 금속 나노프로브 주입구에 주입하여 상기 센싱부 및 컨트롤부로 각각 이동시키고;
v) 상기 센싱부에서 상기 금속 나노프로브 및 상기 제1 시료가 상기 자성입자와 경쟁적으로 면역반응을 하도록 제2 면역반응을 유도하고, 그리고 상기 컨트롤부에서 상기 자성입자와 상기 금속 나노프로브가 면역반응을 하여 면역복합체를 형성하고;
vi) 상기 센싱부의 제1 포획공간에서 상기 제1 면역반응 및 제2 면역반응의 결과 얻어진 면역복합체를 포획하고, 그리고 상기 컨트롤부의 제2 포획공간에서 상기 컨트롤부의 자성 면역복합체를 포획하고;
vii) 상기 센싱부 및 컨트롤부에서 각각 포획된 면역복합체에 레이저광을 조사하여 SERS 신호를 측정하여 상기 탄저균의 존재 여부를 확인하는 단계.
상기 vi) 단계 이후에, 세척용 시료를 세척용 시료 주입구에 주입하여 면역반응을 하지 않은 제1 시료, 제2 시료, 자성입자 및 금속 나노프로브를 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 시료는 조직 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액 및 복막액으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 시료는 적어도 한 개의 탄저균 마커 항원에 해당하는 항원이 포함될 수 있으며, 복수 개의 탄저균 마커 항원이 포함되는 것이 바람직하다.
상기 탄저균 검출 방법에 소요되는 총 시간은 5 내지 15분 일 수 있다.
상기 방법에 따른 경우의 탄저균 검출한계(LOD)는 100 pg/mL일 수 있다.
본 발명은 자성입자에 고정화된 탄저균 마커 항원에 특이적인 항체에, 금속 나노프로브에 결합되어 있는 항원과 시료(예, 환자의 혈액)에 존재하는 항원이 경쟁적으로 반응하게 하는 "경쟁 면역반응"을 이용하였다.
본 발명에서 "탄저균 마커 항원"이란, 탄저균 바이오마커의 기능을 하는 물질을 의미한다.
본 발명에서 "경쟁 면역반응"이란, 검출하고자 하는 항원과 일정량의 표지된 항원이 일정량의 항체에 대하여 경쟁하여 항원-항체반응을 일으키는 것이다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 시료에 포함된 탄저균 마커 항원 및 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 마이크로 자성입자 사이의 제 1 면역반응과, 탄저균 마커 항원이 결합된 금속 나노프로브 및 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 마이크로 자성입자 사이의 제2 면역반응이 경쟁적으로 일어난다.
본 발명에서 "면역복합체"란 항원-항체 반응을 통해 결합된 물질을 말한다. 구체적으로 탄저 마커 항원과 이에 특이적인 항체가 항원-항체 반응을 통해 결합한 물질을 의미한다. 특히, 본 발명에서는 탄저 마커 항원에 특이적인 항체가 자성입자에 고정화되어 탄저 마커 항원과 항원-항체 반응을 수행하고, 이 결과 만들어진 면역복합체는 "자성 면역복합체"라고 부르기도 한다.
본 발명에서 금속 나노프로브에 결합하는 "라만 표지자"는 라만 리포터 분자를 의미하고 이 기술분야에 공지된 것이라면 어느 것이나 사용가능하며, 예를 들면, X-로다민-5-아이소티오시아네이트(X-rhodamine-5-(and-6)-isothiocyanate, XRITC), 크리스탈 바이올렛(crystal violet, CV) 또는 말라카이트 그린 아이소티오시아네이트(malachite green isothiocyanate, MGITC) 일 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하는 자성입자(자성 비드 또는 자성 마이크로입자) 및 금속 나노프로브는 이 기술분야에 널리 알려져 있다. 구체적으로, 금속 나노구체를 제조하는 방법(Frens, G., 1972. Colloid Polym. Sci. 250, 736??741.) 자성입자 및 할로우 금속 나노구체를 제조하는 방법(한국 등록특허 제10-0979727 및 한국 공개특허 제10-2012-0017358호)이 알려져 있다.
도 1은 본 발명에 따른 SERS 기반 탄저균 검출용 미세유체칩을 모식적으로 나타낸 것이다.
본 발명에 따른 미세유체칩(10)은 기본적으로 시료에 탄저균이 들어 있는지 확인하기 위한 검출이 이루어지는 센싱부(100)와, 대조군의 역할을 하는 컨트롤부(200), 그리고 금속 나노프로브 채널부(300)로 이루어져있다.
본 발명에 따른 미세유체칩은 센싱부와 컨트롤부의 이중 채널로 구성됨으로써, 재현성을 확보하였다.
도 1에 나타난 것과 같이, 상기 센싱부(100)와 컨트롤부(200)는 서로 이격되어 위치하고, 상기 센싱부(100)와 컨트롤부(200)는 금속 나노프로브 채널부(300)와 연결된다. 상기 금속 나노프로브 채널부(300)를 통해, 탄저 마커 항원과 라만 표지가가 결합된 금속 나노프로브가 상기 센싱부(100)와 컨트롤부(200)로 각각 이동한다.
상기 금속 나노프로브에 라만 표지자가 붙어 있으므로, SERS 신호를 발생시킬 수 있다.
상기 센싱부(100)는, 상기 시료가 주입되는 제1 시료 주입구(111); 상기 탄저균 마커 항원에 특이적인 항체가 고정화된 자성입자가 주입되는 제1 자성입자 주입구(112); 일단이 분기되어 상기 제1 시료 주입구와 제1 자성입자 주입구에 연결되고 상기 제1 시료와 상기 제1 자성입자가 이동하는 통로를 제공하는 제1 센싱 채널(110)과 제2 센싱 채널(120)을 포함하여 이루어진 센싱 채널(140); 및 상기 센싱 채널(140)의 타단에 연결되고 상기 제1 자성입자에 자력을 가하는 자력 수단을 포함하는 제1 포획공간(130)를 포함한다.
상기 컨트롤부(200)는, 탄저균 마커 항원이 함유되지 않은 제2 시료가 주입되는 제2 시료 주입구(211); 상기 항원에 특이적인 항체가 고정화된 자성입자가 주입되는 제2 자성입자 주입구(212); 일단이 분기되어 상기 제2 시료 주입구와 제2 자성입자 주입구에 연결되고, 상기 제2 시료와 제2 자성입자가 이동하는 통로를 제공하는 제1 컨트롤 채널(210)과 제2 컨트롤 채널(220)을 포함하여로 이루어진 컨트롤 채널(240); 및 상기 컨트롤 채널의 타단에 연결되고 상기 제2 자성입자에 자력을 가하는 자력수단을 포함하는 제2 포획공간(230)을 포함한다.
상기 금속 나노프로브 채널부(300)는, 탄저균 마커 항원과 라만 표지자가 결합된 금속 나노프로브가 주입되는 금속 나노프로브 주입구(311); 및
상기 금속 나노프로브 주입구로부터 분기되어 상기 센싱부의 센싱 채널의 타단과 상기 컨트롤부의 컨트롤 채널의 타단에 연결되는 금속 나노프로브 채널(310)을 포함한다.
도 2와 같이, 본 발명에 따른 미세유체칩은, 세척 채널부(400)을 더 포함할 수 있다.
상기 세척 채널부(400)는, 세척용 시료를 주입하는 세척용 시료 주입구(411); 및 상기 세척용 시료 주입구로부터 분기되어, 상기 제2 센싱 채널의 타단과 제2 컨트롤 채널의 타단에 연결되는 세척 채널(410)을 포함한다.
또한 본 발명에 따른 미세유체칩은 반응이 끝난 물질들이 배출되는 배출부를 추가로 더 포함할 수 있다(도 9 참고).
도 3은 본 발명의 미세유체칩에 이용되는 자성입자와 금속 나노프로브를 모식적으로 나타낸 것이다. 자성입자에는 탄저균 특이적 항체인 A-12 항체가 고정화된다(도 3A). 그리고 금속 나노프로브에는 탄저 마커 항원인 PGA와 라만 표지가가 고정화되어 있다.
도 4는 본 발명의 면역복합체 형성 과정을 모식적으로 보여준다.
탄저균이 존재하는 시료, 즉 탄저 마커 항원(예, PGA)이 존재하는 경우, 센싱부(100)의 제1 시료 주입구(111)와 제 1 자성입자 주입구(112)로 주입된 시료와 자성입자가 항원-항체 반응(제1 면역반응)을 하여 면역복합체를 형성한다. 그 이후, 금속 나노프로브 채널부(300)를 통해 들어온 금속 나노프로브는, 제1 자성입자가 이미 탄저 마커 항원과 결합해버렸기 때문에, 자성입자와 거의 결합하지 못한다(도 4의 왼쪽 그림).
상기 시료와 자성입자 사이의 면역복합체(자성 면역복합체)는 포획공간에 포획되고, 면역복합체를 형성하지 못한 금속 나노프로브는 포획공간에 포획되지 못한다. 이 포획공간에 레이저광을 조사하면, 라만 표지자를 가지고 있는 금속 나노프로브가 거의 존재하지 않으므로 SERS 신호가 매우 약하게 잡힌다(도 5 위쪽 그림, "Off").
이와 반대로, 만약 시료에 탄저균이 존재하지 않는 경우, 센싱부(100)의 제1 시료 주입구(111)와 제 1 자성입자 주입구(112)로 주입된 시료와 자성입자는 항원-항체 반응을 하지 못하므로 면역복합체를 형성할 수 없다. 그 이후, 금속 나노프로브 채널부(300)를 통해 들어온 금속 나노프로브는, 제1 자성입자 표면의 항체와 항원-항체 반응을 하여 면역복합체를 형성한다.
상기 금속 나노프로브와 자성입자의 면역복합체는 포획공간에 포획되고, 이 포획공간에 레이저광을 조사하면, 라만 표지자를 가지고 있는 금속 나노프로브가 다수 존재하므로 SERS 신호가 강하게 잡힌다(도 5 아래쪽 그림, "On").
한편, 컨트롤부의 경우, 탄저 마커 항원이 없는 시료를 대조구로 사용한다. 따라서 상기 언급한 "시료에 탄저균이 존재하지 않는 경우"와 동일한 반응 양상이 펼쳐진다. 즉, 컨트롤부는 항상 도 5의 아래쪽 그림과 같이 SERS 신호가 강하게 잡힌다.
본 발명은 탄저균 마커 항원 유무를 확인하여 탄저균을 정확하고 신속하게 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 미세유체칩을 이용하여 다음과 같이 탄저균을 검출할 수 있다.
센싱부(100)에서, 검출 대상 시료 내 탄저균 마커 항원과 탄저균 마커 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 자성입자와 사이의 제 1 면역반응과, 탄저균 마커 항원과 라만 표지자가 결합된 금속 나노프로브와 탄저균 마커 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 자성입자 사이의 제 2 면역반응의 경쟁 면역반응을 유도하고;
컨트롤부(200)에서, 탄저균 마커 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 자성입자와 탄저균 마커 항원과 라만 표지자가 결합된 금속 나노프로브가 면역반응을 하여 면역복합체를 형성하고; 그리고
상기 센싱부 및 컨트롤부에 레이저광을 조사하여 SERS 신호를 측정하여 상기 탄저균의 존재 여부를 확인한다.
도 6은 본 발명에 따른 미세유체 칩 내에서 탄저균을 검출하는 방법을 모식적으로 나타낸 것이다. 도 6A 시료 탄저 마커 항원이 10,000 ng/mL 존재할 때, 센싱부(100)획득한 라만 신호이며, 도 6B 시료는 탄저 마커 항원이 없는 컨트롤부(200)에서 획득한 라만 신호이다.
구체적으로, 미세유체 채널 상에서 ⅰ) 탄저 마커 항원이 포함된 시료를 흘려주고, 동시에 ⅱ) 자성입자(도 6에는 자성 마이크로입자라고 표기함)를 흘려주어 제1 면역반응을 통한 면역복합체가 형성되도록 유도한다. 그리고 ⅲ) PGA가 부착된 금속 나노프로브를 유체 채널을 통해 유입시켜 자성입자와 제2 면역반응이 일어나도록, 즉 제 1 면역반응과 제2 면역반응이 경쟁적으로 일어나도록 한다. ⅳ) 미세유체 채널 말단에 설치된 자력 수단(예, Ferroelectric yoke)에 의하여 발생된 자기장에 의하여 측정 시료로부터 자성입자를 포함하는 면역복합체만을 분리한다. ⅴ) 이때 채널 말단에 분리된 면역복합체로부터 발생되는 금속 나노프로브의 SERS 신호 세기를 측정하여 탄저 마커 항원을 검출한다.
본 발명의 일 실시예에서는 탄저균의 외막에 존재하는 마커 항원, 예를 들면 PGA(poly-γ-D-glutamic acid)를 이용하여 탄저균을 신속하게 검출하는 방법을 제공한다. PGA가 시료(예, 환자의 혈액)에 존재하는지 확인하기 위하여, PGA가 결합된 금속 나노프로브와 항PGA 항체인 A-12 항체가 고정화된 마이크로 자성입자를 준비하고 상기 시료에 자성입자를 첨가하여 제 1 면역반응을 유도한 후, 금속 나노프로브를 첨가하여 제 2 면역반응을 유도한다. 두 단계의 경쟁 면역반응 후, 자성입자가 포함된 면역복합체를 자력 수단으로 분리하여 레이저광을 조사하여 탄저균을 검출하였다.
본 발명에 이용된 금속 나노프로브는 표면 증강 라만 산란 효과가 매우 우수하여 탄저균 마커 항원을 검출하는 데에 용이하게 사용될 수 있다. 보편적으로 사용되는 효소면역측정법 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)에 비해 본 발명은 10~100배 발전된 민감도를 나타내었으며, 종래의 진단 단계를 단순화함으로써 5분 내지 15분 이내에 검출이 완료될 수 있다.
본 발명에 따른 경쟁 면역반응을 이용한 SERS 기반의 탄저균 검출 방법은 생화학 테러에서 사용되는 탄저균에 대한 마커 항원의 빠른 검출에 직접적으로 적용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 탄저균 검출용 미세유체칩은 컨트롤 채널부를 이용하여 SERS 측정 신뢰도를 매우 높게 향상시켰다.
도 1은 본 발명에 따른 SERS 기반 탄저균 검출용 미세유체칩을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 SERS 기반 탄저균 검출용 미세유체칩을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 미세유체칩에 이용되는 자성입자와 금속 나노프로브를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 자성 입자의 면역복합체 형성 과정을 나타낸 도이다; 왼쪽: 시료에 PGA가 존재할 경우, 오른쪽: 시료에 PGA가 존재하지 않는 경우.
도 5는 본 발명에 따른 경쟁 면역반응을 이용한 SERS 기반 탄저균 검출 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 미세유체칩 내의 탄저 마커 항원 검출 과정 및 분석 결과를 나타낸 것이다. A는 시료에 탄저 마커가 10,000 ng/mL 존재할 때 센싱부에서 획득한 라만 신호이며, B 는 탄저 마커가 없는 컨트롤부에서 획득한 라만 신호이다.
도 7은 PGA 단클론 항체의 유용성 평가를 나타낸 도이다.
도 8은 경쟁 면역반응을 이용한 SERS 기반 PGA 검출 기술 전략도를 나타낸 것이다; A: 시료액에 PGA가 존재할 경우, B: 시료액에 PGA가 존재하지 않는 경우.
도 9는 본 발명에 따른 미세유체 칩을 제작하는 과정을 나타낸 것이다. 상부층은 수용액을 수집하여 배출하는 배출부를, 하부층은 본 발명에 따른 미세유체칩이다.
도 10A는 본 발명에 따른 경쟁 면역반응을 이용한 SERS 기반 미세유체칩의 모식도이다. B는 4 가지의 서로 다른 색깔의 잉크로 채워진 미세유체칩의 이미지이다. C는 자성 면역복합체가 포획된 포획공간부 사진이다.
도 11은 3.6 x 10-3 M RB (Rhodamine B) 용액 및 6 x 10-5 M R6G (Rhodamine 6G)를 이용한 혼합 효율 평가 결과이다. A는 미세유체 채널의 형광 이미지이다. B는 헤링본 그루브 믹서의 명시야상이다. C는 i 내지 iv 위치에서의 형광 세기이다. X 및 Y는 각각 채널 너비 및 상대 형광 세기를 나타낸다.
도 12A는 본 발명에 따른 미세유체 채널의 자성 면역복합체의 SERS 측정용 장치를 보여준다. B는 본 발명의 미세유체 채널의 포획공간에 레이저 초점을 맞추는 광학 장치를 보여준다.
도 13은 본 발명에 따른 미세유체칩의 6곳의 위치에서의 SERS 스펙트럼이다.
도 14A는 솔레노이드 채널 내부에 포획된 자성 면역복합체 이미지이고, B는 1612 cm-1에서 SERS 세기이다.
도 15A는 센싱부 포획 공간의 솔레노이드 채널에서 서로 다른 PGA 농도를 함유한 세럼의 자성 면역복합체로부터 수집한 SERS 스펙트럼이다. B는 PGA 농도 함수로서 1612 cm-1에서의 SERS 세기이다. C는 PGA 농도 함수로서 1612 cm-1에서의 I sensing /I control 의 피크 세기 비율의 변화를 나타낸다.
도 16은 비교예로서 다양한 PGA 농도에서 ELISA 분석법을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
< 실시예 1> 탄저균 마커 항원에 대한 단클론 항체의 생산 및 유용성 평가
탄저균 마커 항원에 대한 단클론 항체의 유용성을 평가하기 위하여, 탄저균 마커 항원의 하나인 PGA(poly-γ-D-glutamic acid)를 분리·정제하였다 (Rhie, G. E., Roehrl, M. H., Mourez M., Collier R. J., Mekalanos J. J., Wang J. Y., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100(19) 10925-10930.) 또한, PGA 인자와 특이적 결합성이 뛰어난 A-12 항체를 스크리닝하여 생산하였다.
보다 구체적으로, A-12 항체를 생산하기 위하여 열처리에 의해 사균화된 탄저균 H9401(대한민국 질병관리본부)을 생쥐에 주입한 후, 형성된 IgG2 타입의 단클론항체 A-12를 추출하였다.
분리 및 정제한 A-12 항체의 PGA에 대한 결합 친화도를 확인하고자 면역효소반응법(Enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)을 시행하였다. 가수분해 유/무에 따른 PGA를 흡착완충 용액으로 각각 희석하여(200 μg/mL, 100 μg/mL, 50 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0 μg/mL의 농도로 단계적 희석) 96 웰 마이크로플레이트에 50 μL씩 넣고, 12시간 이상 4℃ 냉장고에서 흡착시켰다. 흡착된 웰을 PBS(Phosphate-buffered saline)로 3~5회 세척한 후 1% BSA (Albumin from bovine serum)를 50 μL씩 넣어 상온에서 2 시간 블로킹(blocking)하였다. 블로킹된 웰을 PBS로 3~5회 세척한 후, 단클론항체 A-12를 20 μg/mL 농도로 희석하여 50 μL씩 넣어 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 PBS로 세척하고 염소로부터 얻은 퍼옥시다아제가 결합된 항 생쥐항체를 1% BSA에 20 μg/mL 농도로 희석하여 50 μL씩 넣어 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 각 웰을 PBS로 세척하고, TMB 발색제 용액(3,3',5,5'-tetraethylbenzidine one tablet, phosphate citrate buffer 10mL, 30% H2O2 2 μL) 50 μL를 넣어 10분간 발색시켰으며 416 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1과 같이 탄저균 마커 항원를 검지할 수 있는 A-12 항체를 확보하였다.
<실시예 2> 자성입자 및 금속 나노프로브 합성
표면-증강 라만 산란 기술을 기반으로 한 탄저균 마커 항원의 검출을 위하여, 도 3과 같이 이질기능적(heterofunctional) 바이오링커를 이용하여 A-12 항체를 고정화한 분리용 마이크로 자성입자 및 PGA를 고정화한 금속 나노프로브를 합성하였다.
보다 구체적으로, A-12 항체를 고정화한 분리용 마이크로 자성입자를 합성하기 위하여(도 3A), Biotin-PEG (polyethylene glycol, 5kDa)-NHS (4 mg/mL) 0.1 mL(Santa Cruz Biotechnology, USA)와 A-12 항체 (2 mg/mL) 1 mL를 혼합하여 4~12 시간 이상 반응시켰다. 반응용액을 스트렙타아비딘(streptavidin)으로 코팅된 자성입자(1 mg/mL) 0.2 mL와 혼합하여 실온에서 1 시간 반응시킨 결과, 자성입자 위에 free-PEG 리간드와 항체가 결합된 PEG 리간드가 4:1 비율로 고정되었다. 반응 완료된 시약은 자석으로 세척하며, 최종 자성입자는 PBS 완충액(0.1% BSA 포함) 0.2 mL에 용해하였다.
PGA를 고정화한 금속 나노프로브를 합성하기 위하여(도 3B), 구 형태 금 나노 입자를 합성하였다(Frens, 1973, nature physical science 241, 20-22.). HAuCl4 0.01% 용액 50 mL를 끓인 후, 구연산나트륨(sodium citrate) 1% 용액 0.5 mL를 적가하였다. 초기 HAuCl4 수용액은 나노 입자 시드(seed) 형성시 푸른색으로 변하였으며, 시간의 경과에 따라 나노 입자가 성장하면서 점차 붉은 색으로 변하였다. 최종적으로 합성하고자 하는 나노 입자의 색을 확인한 후, 30분간 더 끓여 반응을 종료하였다. 반응이 종료된 금 나노 입자의 온도를 상온까지 낮추며, 4 시간 이상의 숙성 (aging) 과정을 거치도록 하였다. 합성한 금 나노 입자는 자외선/가시-스펙트럼 (UV/visible-spectrum)과 전자투과현미경(Transmission Electron Microscope, TEM) 측정을 통하여 약 40 nm 정도 크기로 균일하고 안정하게 합성되었음을 확인하였다. 이후, SERS 기질로 사용하기 위하여 금 나노 입자에 라만 표지자인 X-로다민-5-아이소티오시아네이트(X-rhodamine-5-(and-6)-isothiocyanate, XRITC)를 도포하였다. 0.1 nM 40-nm 금 나노입자 1 mL에 라만 표지자가 최종 농도가 50 nM이 되도록 적가한 후 0.01 mM DHLA와 0.01 mM EDC/NHS를 5 μL씩 적가하여 1시간 동안 반응시켰다. 가수분해된 PGA 1 mg/mL를 5 μL씩 적가하여 1시간 충분히 반응시킨 후, 반응용액에 비특이적 결합을 갖는 화합물을 원심분리기를 이용해(3,000 rpm, 20 min) 제거하였다. 금 나노 입자 표면에 반응하지 못한 NHS-그룹을 에탄올아민(ethanolamine) 0.01 mM, 0.5 μL로 적가하여 비활성화하였다.
합성된 A-12 항체가 고정된 마이크로 자성입자는 PEG(polyethylene glycol) 고분자를 이용하여 비드 표면을 코팅 처리함으로써 안정성이 증대되어 빠른 액상 반응 역학을 보이며, 정제와 분석에서 변동성을 낮추어 재현성 높은 결과를 확보할 수 있었다. 또한, 합성된 나노프로브는 PGA의 그물망 구조에 의해 응집될 가능성이 높으므로 이를 해결하고자 가수분해 (hydrolysis)방법을 이용하여 분자량을 낮췄으며, 면역분석시 발생할 것으로 예상되는 응집 현상을 최소화하였다.
도 8과 같이, 마이크로 자성입자는 실제 타겟인 PGA가 고정된 금속 나노프로브 간의 농도와 결합 감도에 따라, 면역복합체 양상이 나타날 것으로 분석되었다. 도 8A와 같이 시료에 PGA가 있는 경우, 자성입자에 금속 나노프로브가 결합하지 못한다(1~3). 도 8B와 같이 시료에 PGA가 없는 경우, 자성입자에 금속 나노프로브가 결합한다(4~6).
이러한 양상은 라만 표지자가 결합된 금속 나노프로브를 통해 정량적인 광학 신호를 획득함으로써 분석하였다.
<실시예 3> 미세유체 채널 제작
3-1: 미세유체 채널 제작
PDMS (Polydimethylsiloxane, Sylgard 184 Silicone. Elastomer Kit)는 다우코닝 사에서 구입하였다. 솔레노이드가 봉입된 PDMS 미세유체 채널은 표준 소프트 리소그래피 및 래피드 프로토타이핑법에 의해 제작되었다. 양성 SU-8 50-100 포토레지스트(Microchem Corp.) 몰드를, 레이저 프린터를 사용하여 해상도 20,000 dpi로 투명 마스크 패턴을 이용하여 실리콘 웨이퍼 위에서 제작하였다(Duffy, D.C., McDonald, J.C., Schueller, O.J.A., Whitesides, G.M., 1998. Anal. Chem. 70, 4974-4984.). 그루브형 믹서를 포함하는 패턴을 고행상도 포토마스크를 통해 실리콘 웨이퍼에 옮겼다(AutoCAD 2008/AutoDesk Inc., OR, U.S.A.). 그 다음 PDMS 프리폴리머와 경화제(Sylgard 184, Dow Corning)를 10:1의 비율(w/w)로 혼합하였고 진공 펌프를 이용하여 가스를 제거하였다. 그루브형 믹서는 채널 속에 통합되어 혼합 효율을 향상시킨다(Stroock, A.D., Dertinger, K.W., Ajdari, A., Mezic, I., Stone, H.A., Whiteside, G.M., 2002. Science 295, 647-651.; DeMello, A.J., 2006. Nature 442, 394-402.). 그 다음, 두 개의 홈메이드 미니 솔레노이드를 채널과 나란히 위치시켰다. 상기 PDMS 프리폴리머를 상기 몰드에 붓고 알루미늄 디스크를 이용하여 압축시켰다. 상기 프리폴리머는 진공 오븐에서 70 ℃, 2 시간 동안 경화되었고 그 다음 구조층(structured layer)을 마스크 몰드에서 벗겨 내었다. 상기 구조층 복제물에 유체적 접근을 위한 주입구 및 배출구를 펀치로 뚫었다. 산소 플라즈마 처리 후에 구조가 만들어진 PDMS 기질의 아래 층을 글래스 슬라이드 위에 나란히 놓고 비가역적 결합을 형성하였다. 모든 채널은 250 mm 너비와 100 mm 깊이를 가졌다. 솔레노이드는 1 mm 직경, 9 mm 높이, 4 mm 그리고 1 mm 채널 사이 갭을 가진 강유전성 요크(ferroelectric yoke) 상에서 구리선(래커로 절연, 직경 300 μm)으로 26회 감아서 제작하였다. Agilent E3631A(Agilent Technologies, Inc., U.S.A.) 전력공급원을 이용하여 전류를 공급하였다. 솔레노이드의 N과 S극 사이의 최고 자력은 약 27 mT로 측정되었다. 이러한 자기장 강도는 채널 벽 상에서 자성 면역복합체를 포획하기에 충분한 세기이다. 최종적으로 도 9와 같이, 수용액을 수집하여 배출하기 위한 상부 PDMS 층이 솔레노이드가 봉입된 하부 층과 나란히 배열되었다.
위험성 물질의 안전한 탐지 및 분석을 확인하기 위해서는 짧은 분석 시간과 정확한 유체 조절이 필수적이다. 따라서 본 발명자들은 자동화된 방식으로 PGA 면역분석을 수행하기 위해 듀얼 채널 미세유체칩을 고안하고 제작하였다. 도 10은 본 발명에서 이용된 미세유체칩을 개략적으로 보여준다. 이 칩은 두 개의 평행한 채널부로 구성된다. PGA 센싱을 위한 센싱부와 대조군 측정을 위한 컨트롤부이다. 상기 센싱 채널은 다양한 PGA 농도를 가지는 시료(예, serum)를 분석한다. 반대로 컨트롤부는 외부 표준으로서 PGA가 없는 시료(PGA-free serum)만을 감지한다. 양쪽 채널은 모두 수직 방향으로 세 개의 부분으로 구성된다. 센싱부의 주입구에서는, PGA 항원을 포함하는 세럼, 항PGA 항체가 고정화된 자성입자가 두 개의 주입구를 통해 채널 속으로 주입된다. 그 다음 금속 나노프로브 채널부에서, PGA-고정화된 금 나노프로브(AuNPs)가 미세유체칩의 중앙부에 위치한 주입구를 통해 채널 속으로 주입된다. 여기서, PGA 항원 및 PGA-고정화된 AuNPs가 유체 조건 하에서 자성입자 상의 항체와 경쟁 면역반응을 수행한다. 도 11B와 같이, 믹싱 효율을 증진시키기 위해, 구부러진 헤링본(herringbone) 그루브 형태의 믹서가 채널 속에 포함되어 있다. 포획 공간은 스트림 내에서 효과적인 자성 면역복합체의 검출 및 포획을 위한 부분이다. 스트림 상에서 효과적인 자성입자의 포획을 위해, 두 개의 요크형 미니 솔레노이드가 배열되었고(Afshar, R., Moser, Y., Lehnert, T., Gijs, M.A.M., 2011. Sens. Actuators B 154, 73-80.; Han, B., Choi, N., Kim, K.H., Lim, D.W., Choo, J., 2011. J. Phys. Chem. C 115, 6290-6296.; Liu, Y.J., Guo, S.S., Zhang, Z.L., Huang, W.H., Baigl, D., Chen, Y., Pang, D.W., 2007. J. Appl. Phys. 102, 084911.), 각 채널의 말단부에 배열되었다. 면역복합체의 포획 후에, 미결합 PGA 항원 및 AuNPs를 세척하기 위해, PGA가 없는 세럼이, 미세유체 기구 중앙부에 위치한, 주입부에 주입되었고, 마지막으로, 각각의 미세유체 채널 내에 레이저빔을 쏘아서 SERS 신호를 측정하였다. 대조군 측정을 위한 분석 및 SERS 검출도, 컨트롤부에서 동일한 과정으로 수행되었다.
3-2: 형광현미경을 이용한 미세유체 채널의 반응 효율 측정
미세유체 채널에서 PGA를 SERS 기반으로 정량분석을 수행하기 전에, 그루브 형 믹서의 혼합 효율을 평가하기 위해 형광현미경을 사용하여 색깔을 측정하였다. 도 11은 3.6 x 10-3 M RB(Rhodamine B) 용액 및 6 x 10-5 M R6G(Rhodamine 6G)를 이용하여 혼합 효율을 평가한 결과를 보여준다. 형광 측정을 위한 최적의 유속 흐름을 찾기 위해, 마이크로시린지 펌프를 사용하여 0.1 에서 5.0 mL min-1 로 수용성 유속 흐름을 다양하게 하였다. 직접 이미지 분석을 토대로, 최적의 유속은 센싱부와 컨트롤부의 주입구(도 11에 inlet 1로 표시됨-PGA 항원, PGA 없는 세럼 및 자성 입 자), 금속 나노프로브 채널부의 주입구(도 11에 inlet2로 표시됨-PGA가 결합된 AuNPs) 및 세척부의 주입구(도 11에 inlet 3으로 표시됨, 세척용 세럼)에서, 각각 1.0, 3.0, 및 2.0 mL min-1 로 결정되었다. 혼합 과정에 대해 더욱 이해하기 위해, 채널 너비를 가로지르는 형광 프로필을 채널의 서로 다른 위치에서 4번 측정하였다.
도 11을 보면, 채널의 절반(# i)에서 채널 전체로(# ii) 적색 형광 염료의 확산이 일어났다. 녹색 형광 염료가 채널에 주입되었을 때, # iii 형광 프로필에서 보이는 것과 같이, 이것은 다른 라미나 흐름을 형성하였고, 채널 위치 #iv에서 적색 및 녹색 형광 염료가 완전히 혼합되었다. 이는 구부러진 헤링본 그루브형 믹서에 의해 혼합이 더욱 효율적으로 이루어짐을 보여준다.
<실시예 4> SERS 기반 탄저균 검출
4-1: 이미지 측정 및 SERS 신호 측정
포획된 면역복합체의 명시야상(bright field image)은 DP20 CCD 카메라가 포함된 올림푸스 IX71 인버티드 현미경으로 측정하였다(Olympus Co., Japan). 초정밀 주사기 펌프(PHD 2000, Harvard Apparatus, USA), 1 mL 놈-젝트 플라스틱 주사기(Norm-Ject Plastic syr- inges) (Henke-Sass Wolf GmbH, Germany), 32 mm, 22 G 니들(KOVAX-NEEDLEs, Korea Vaccine Co., Ltd., Seoul, Korea), 및 타이곤 마이크로보어 튜빙(Ty gon microbore tubing) (IDㅌ 0.02 IN, Saint-Gobain PPL Corp.)를 이용하여 시료를 미세유체 채널에 주입하였다. 형광 측정은 올림푸스 IX81 인버티드 현미경(Olympus Co., Japan)으로 하였다. Q-이미징 소프트웨어로 미세유체 채널 내 믹싱 효율을 평가하는 이미지를 얻어서 분석하였다.
라만 분석은 다음과 같이 수행하였다. 레니쇼 2000 라만 스펙트로미터(Renishaw 2000 Raman spectrometers, Renishaw, U.K.)가 멜레-그리옷 He-Ne 632.8 nm 레이저(Melles Griot He-Ne 632.8 nm laser)와 함께 사용되었다. 라만 산란은 CCD(charge coupled device) 카메라를 사용하여 스펙트럼 해상도 1 cm-1에서 수집하였다. 20 x 대물렌즈를 사용하여 미세유체 채널 내 자성 면역복합체 상 레이저 스팟에 초점을 맞추었다. 노출시간은 10초이고 레이저 스팟 크기는 1 mm이었다. Renishaw WiRE 4.0 소프트웨어를 사용하여 데이터를 모으고 제어하였다. 도 12는 미세유체 채널의 자성 면역복합체의 SERS 측정용 장치를 보여준다. 유속은 3개의 마이크로 시린지로 동시에 조절하였다.
4-2: SERS 기반 탄저균 검출
도 13은 본 발명에 따른 SERS-기반 탄저균 검출 방법의 개략도를 나타낸다. 도 13의 왼쪽 센싱부의 분석 과정은 도 5 상단 그림("Off")에 대응된다. 다른 한편으로, 도 13의 오른쪽 컨트롤부의 분석 과정은 도 5 하단 그림("On")의 대응된다. PGA-고정화된 AuNPs가 미세유체 칩의 중앙부에 위치한 금속 나노프로브 채널의 주입구를 통해 채널에 주입되었을 때, 강한 SERS 신호가 센싱부 및 컨트롤부 양쪽 채널에서 측정되었다. 센싱부 및 컨트롤부의 포획부에서, 강한 SERS 신호는 단지 컨트롤부에서만 측정되었는데, 그 이유는, 컨트롤부에서, 모든 PGA-고정화된 AuNPs가 자성입자에 포획되었기 때문이다. 반대로, 센싱부에서는, 과다 PGA 항원이 센싱 채널에 주입되었을 때 SERS 신호가 급격하게 감소했다. 그 이유는 PGA 항원이 자성입자와 면역반응을 먼저 수행함으로써, AuNPs 가 자성입자와 면역반응을 수행하지 못하게 되어 자성입자에 로딩되는 밀도가 감소했기 때문이다. AuNPs가 로딩된 자성입자는 3분 동안 수집되었고, 미결합 항원 및 AuNPs 가 PGA가 없는 세럼으로 1분 동안 세척된 후에, 마지막으로 SERS 신호가 측정되었다. 총 분석 시간은 8분에서 10분 사이 이었다. SERS 감지시, 라만 세기는, 타겟 물질(species)이 금속 나노입자 근처에서 포획될 때, 전자기장 공명 효과의 증폭에 의해 증강되었다.
"핫 스팟(hot spots)"의 형성이 SES 세기를 강하게 증강시킨다는 것이 알려져 있다. 강한 밀도의 "핫 스팟"을 가지는 2차원 나노 패턴 기질이 검출 한계를 향상시키는 데 이용된다. 그러나 평면 기질 상의 핫 스팟의 불균일성은 플랫폼의 사이트 의존성을 야기시킨다. 이 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 자성입자를 이용한 SERS 기반 면역 분석을 개발하였다. 이 방법은 평면 기판에 고정화시키는 과정을 이용하지 않는다. 대신에, 항원 지지 물질로 자성입자를 사용하였다. SERS 신호가 용액 내에 모인 평균 "핫 스팟" 나노입자들의 평균으로 측정되기 때문에, 더욱 재현성 있는 결과를 얻을 수 있다. 또한, 자성입자 상의 포획 항원의 로딩 밀도가 3차원 마이크로스피어 상에서 급격하게 증가하기 때문에 검출 민감도가 매우 크게 증가하였다.
도 14A는 솔레노이드 채널 내부에 포획된 자성 면역복합체 이미지를 보여 준다. 전원공급장치를 이용하여 자기장을 "on과 off"로 조절하였고, 전력 스위치를 켰을 때 이미지가 기록되었다.
요크형 솔레노이드가 빠르게 스위치 온/오프가 가능하기 때문에 본 발명에 따른 미세유체칩에 적용하였다. 자성 면역복합체의 포획 후에 SERS 신호의 변화는 최적의 포획 시간을 결정하기 위한 시간의 함수로서 관찰되었다. 도 14B에 나타난 것과 같이, 1612 cm-1에서 SERS 세기가 안정된 것으로 보아 포획 과정은 3분 후에 완료되는 것을 알 수 있다.
도 15A는 센싱부 포획 공간의 솔레노이드 채널에서 서로 다른 PGA 농도를 함유한 세럼의 자성 면역복합체로부터 수집한 SERS 스펙트럼이다. 여기서, 1612 cm-1에 집중된 라만 피크가 PGA 타겟 추적의 정량 평가에 사용되었다. 라만 피크 세기는 PGA 농도가 증가함에 따라 감소하였다. 도 15B에 나타난 것과 같이, 100 pg/mL 에서 100 μg/mL 의 농도 범위에서 선형 반응(R2 = 0.96)이 달성되었다. 그러나 본 발명의 SERS 기술을 이용한 정량분석에서 가장 중요한 점은, 실험의 재현성이다. 레이저 파워, 입자 크기 분포, 편재화된 열 및 다양한 혼합 시간 등의 많은 실험 변수가 잠재적으로 재현성에 영향을 줄 수 있다.
<실시예 6> 컨트롤부의 외부 표준을 이용한 신뢰도 향상
이러한 문제점을 해결하기 위해, 각각의 실험군의 컨트롤부 채널을 이용하여 외부 표준값을 측정하였다. 외부 표준값을 사용하여 정량분석시 발생할 수 있는 거의 모든 실험 변수의 영향을 제거하였다. 본 발명에서, 센싱 채널의 PGA 함유 세럼의 SERS 세기에 대한 컨트롤 채널의 PGA 없는 세럼(외부 표준값)의 비율은 서로 다른 농도의 PGA 세럼에서 측정되었다. 도 15B에서 상단의 점선은 대조군 채널의 1612 cm-1 에서 외부 표준의 SERS 세기 변수를 나타낸다. 도 15C에 나타난 바와 같이, 외부 표준의 변수가 PGA 정량분석에 고려되었을 때, 상관계수가 0.96에서 0.99로 증가되었다. 도 15의 에러 막대는 3개 측정값의 표준편차로 나타냈다. 표준편차로부터 측정된 LOD는 100 pg/mL 이었다. 이는 본 발명에 따른 미세유체칩인, 솔레노이드 봉입형 듀얼 미세유체칩을 이용하여 SERS 기반으로 PGA를 매우 민감도 높게 검출할 수 있음을 보여주는 것이다.
<비교예> ELISA 기반 분석
실시예 1을 보면, 분리 및 정제한 A-12 항체의 PGA에 대한 결합 친화도를 확인하고자 면역효소반응법 (Enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)을 시행하였다. 이 ELISA 결과를 다시 한 번 상기하여 보면, 도 16에 나타난 것과 같이, PGA를 검출하기 위해, ELISA 기반의 면역분석법을 이용할 경우, 0.1-200 μg/mL에서 검출이 가능하고 LOD는 0.1-1.0 μg/mL임을 알 수 있다.
본 발명은 인간의 혈액 등에서 탄저균 바이오마커인 PGA를 고감도도 검출할 수 있는 SERS 기반 미세유체칩 및 이를 이용한 탄저균 검출방법에 대한 것이다. 인간 혈액에서 위험성 물질을 빠르고 안전하게 검출하기 위해서, 솔레노이드 봉힙형 듀얼 채널 미세유체 디바이스를 이용하여 자동화된 방법으로 PGA 면역분석을 수행하였다.
미세유체 채널에서 PGA 및 PGA-고정화된 AuNPs가, PGA 항체가 고정화된 자성입자와 경쟁 면역반응을 하였다. 그 다음으로 자성 면역복합체가 미세유체 채널에 봉입된 요크형 솔레노이드에 포획되었다. 그리고 이들의 SERS 신호를 측정하고 분석하였다.
SERS 측정 신뢰도를 향상시키기 위해, PGA가 없는 세럼의 외부 표준값을 대조군 미세유체 채널을 이용하여 각각의 시간에 측정하였다. 대부분의 실험 변수의 영향을 최소화하면서 신뢰도를 매우 높게 향상시켰다.
본 발명에 따른 SERS 기반 미세유체칩에 의해 결정된 LOD 값은 100 pg/mL이었다. 이러한 낮은 LOD는 본 발명의 SERS 기반 면역분석법이 ELISA 방법에 비해 약 1000배 이상 민감한 것이다. 따라서 본 발명에 따른 SERS 기반 미세유체칩은 고감도 및 고재현성을 갖추고 있고, 자동화된 방법으로 위험성 물질을 검출할 수 있게 해 준다.
10, 20: 미세유체칩
100: 센싱부
111: 제1 시료 주입구
112: 제1 자성입자 주입구
110: 제1 센싱 채널
120: 제2 센싱 채널
130: 제1 포획 공간
140: 센싱 채널
200: 컨트롤부
211: 제2 시료 주입구
212: 제2 자성입자 주입구
210: 제1 컨트롤 채널
220: 제2 컨트롤 채널
230: 제2 포획 공간
240: 컨트롤 채널
300: 금속 나노프로브 채널부
400: 세척 채널부

Claims (18)

  1. 시료 내에 탄저균 마커 항원이 존재하는지 여부를 검출하기 위한, 센싱 채널을 포함하는 센싱부;
    상기 센싱부와 이격되어 위치하는, 컨트롤 채널을 포함하는 컨트롤부; 및
    상기 센싱 채널과 컨트롤 채널에 연결되어, 탄저균 마커 항원과 라만 표지자가 결합된 금속 나노프로브가 상기 센싱부 및 컨트롤부로 이동하기 위한 통로를 제공하는 금속 나노프로브 채널부;
    를 포함하고,

    상기 센싱부는,
    상기 시료가 주입되는 제1 시료 주입구;
    상기 탄저균 마커 항원에 특이적인 항체가 고정화된 자성입자가 주입되는 제1 자성입자 주입구;
    일단이 분기되어 상기 제1 시료 주입구와 제1 자성입자 주입구에 연결되고, 상기 제1 시료와 상기 제1 자성입자가 이동하는 통로를 제공하는 제1 센싱 채널과 제2 센싱 채널로 이루어진 센싱 채널; 및
    상기 센싱 채널의 타단에 연결되고 상기 제1 자성입자에 자력을 가하는 자력 수단을 포함하는 제1 포획공간;
    을 포함하고,
    상기 컨트롤부는,
    탄저균 마커 항원이 함유되지 않은 제2 시료가 주입되는 제2 시료 주입구;
    상기 항원에 특이적인 항체가 고정화된 자성입자가 주입되는 제2 자성입자 주입구;
    일단이 분기되어 상기 제2 시료 주입구와 제2 자성입자 주입구에 연결되고, 상기 제2 시료와 제2 자성입자가 이동하는 통로를 제공하는 제1 컨트롤 채널과 제2 컨트롤 채널로 이루어진 컨트롤 채널; 및
    상기 컨트롤 채널의 타단에 연결되고 상기 제2 자성입자에 자력을 가하는 자력수단을 포함하는 제2 포획공간;
    을 포함하고,

    상기 센싱 채널과 컨트롤 채널에는 각각 상기 탄저균 마커 항원에 특이적인 항체가 고정화된 자성입자가 주입되며,
    상기 탄저균 마커 항원과 상기 금속 나노프로브는, 상기 자성입자와 경쟁적으로 면역반응을 하고,
    상기 제1 포획공간 및 제2 포획공간에 레이저광을 조사하여 표면-증강 라만 산란 신호를 측정하는 것을 특징으로 하는, 표면-증강 라만 산란(surface-enhanced Raman scattering: SERS) 기반 탄저균 검출용 미세유체칩.

  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 금속 나노프로브 채널부는,
    탄저균 마커 항원과 라만 표지자가 결합된 금속 나노프로브가 주입되는 금속 나노프로브 주입구; 및
    상기 금속 나노프로브 주입구로부터 분기되어 상기 센싱부의 센싱 채널의 타단과 상기 컨트롤부의 컨트롤 채널의 타단에 연결되는 금속 나노프로브 채널;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, SERS 기반 탄저균 검출용 미세유체칩.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 센싱 채널은 제1 센싱 채널이고, 상기 컨트롤 채널은 제1 컨트롤 채널인, SERS 기반 탄저균 검출용 미세유체칩.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 미세유체칩은 세척 채널부를 더 포함하고,
    상기 세척 채널부는,
    세척용 시료를 주입하는 세척용 시료 주입구; 및
    상기 세척용 시료 주입구로부터 분기되어, 상기 제2 센싱 채널의 타단과 제2 컨트롤 채널의 타단에 연결되는 세척 채널;
    을 포함하고,
    상기 금속 나노프로브 채널부 하부에 위치하는 것인, SERS 기반 탄저균 검출용 미세유체칩.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 탄저균 마커 항원은 PGA(poly-γ-D-glutamic acid)인, SERS 기반 탄저균 검출용 미세유체칩.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 센싱부와 상기 컨트롤부는 병렬로 위치하는 것인, SERS 기반 탄저균 검출용 미세유체칩.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 금속 나노프로브 채널부는 상기 센싱부와 상기 컨트롤부 사이에 위치하는 것인, SERS 기반 탄저균 검출용 미세유체칩.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 세척 채널부는 상기 센싱부와 상기 컨트롤부 사이에 위치하는 것인, SERS 기반 탄저균 검출용 미세유체칩.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 제1 포획공간의 자력 수단은 자기장을 발생시키는 미니솔레노이드이고,
    상기 제1 포획공간은 항원-항체반응에 의하여 형성되는 면역복합체를 포획하는 것인, SERS 기반 탄저균 검출용 미세유체칩.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 제2 포획공간의 자력 수단은 자기장을 발생시키는 미니솔레노이드이고,
    상기 제2 포획공간은 항원-항체반응에 의하여 형성되는 면역복합체를 포획하는 것인, SERS 기반 탄저균 검출용 미세유체칩.
  13. 삭제
  14. 다음 단계를 포함하여 이루어지는, 제1항, 및 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 SERS 기반 탄저균 검출용 미세유체칩을 이용한 탄저균 검출방법:
    i) 검출 대상인 제1 시료, 탄저균 마커 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 자성입자, 탄저균 마커 항원과 라만 표지자가 결합된 금속 나노프로브 및 탄저균 마커 항원이 함유되지 않은 제2 시료를 각각 준비하고;
    ii) 상기 제1 시료 및 상기 자성입자를 각각 센싱부의 제1 시료 주입구 및 제1 자성입자 주입구에 주입하여, 상기 센싱부에서 상기 제1 시료와 상기 자성입자 사이의 제1 면역반응을 유도하고;
    iii) 상기 제2 시료 및 상기 자성입자를 각각 컨트롤부의 제2 시료 주입구 및 제2 자성입자 주입구에 주입하고;
    iv) 상기 금속 나노프로브를 금속 나노프로브 주입구에 주입하여 상기 센싱부 및 컨트롤부로 각각 이동시키고;
    v) 상기 센싱부에서 상기 금속 나노프로브 및 상기 제1 시료가 상기 자성입자와 경쟁적으로 면역반응을 하도록 제2 면역반응을 유도하고, 그리고 상기 컨트롤부에서 상기 자성입자와 상기 금속 나노프로브가 면역반응을 하여 면역복합체를 형성하고;
    vi) 상기 센싱부의 제1 포획공간에서 상기 제1 면역반응 및 제2 면역반응의 결과 얻어진 면역복합체를 포획하고, 그리고 상기 컨트롤부의 제2 포획공간에서 상기 컨트롤부의 면역복합체를 포획하고; 그리고
    vii) 상기 센싱부 및 컨트롤부에서 각각 포획된 자성 면역복합체에 레이저광을 조사하여 SERS 신호를 측정하여 상기 탄저균의 존재 여부를 확인하는 단계;
    를 포함하는, 경쟁 면역반응을 이용한 SERS 기반의 탄저균 검출 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 vi) 단계 이후에,
    세척용 시료를 세척용 시료 주입구에 주입하여 면역반응을 하지 않은 제1 시료, 제2 시료, 자성입자 및 금속 나노프로브를 세척하는 단계;
    를 더 포함하는, 경쟁 면역반응을 이용한 SERS 기반의 탄저균 검출 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 시료는 조직 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액 및 복막액으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 경쟁 면역반응을 이용한 SERS 기반의 탄저균 검출 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 탄저균 검출 방법에서, 상기 방법에 소요되는 총 시간은 5 내지 15분인, 경쟁 면역반응을 이용한 SERS 기반의 탄저균 검출 방법.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 탄저균 검출 방법에서, 상기 탄저균 검출한계(LOD)는 100 pg/mL인, 경쟁 면역반응을 이용한 SERS 기반의 탄저균 검출 방법.


















KR1020150135087A 2015-09-24 2015-09-24 표면-증강 라만 산란 기반의 탄저균 검출용 미세유체칩 및 이를 이용한 탄저균 검출 방법 KR101712429B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150135087A KR101712429B1 (ko) 2015-09-24 2015-09-24 표면-증강 라만 산란 기반의 탄저균 검출용 미세유체칩 및 이를 이용한 탄저균 검출 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150135087A KR101712429B1 (ko) 2015-09-24 2015-09-24 표면-증강 라만 산란 기반의 탄저균 검출용 미세유체칩 및 이를 이용한 탄저균 검출 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101712429B1 true KR101712429B1 (ko) 2017-03-08

Family

ID=58403933

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150135087A KR101712429B1 (ko) 2015-09-24 2015-09-24 표면-증강 라만 산란 기반의 탄저균 검출용 미세유체칩 및 이를 이용한 탄저균 검출 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101712429B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110244036A (zh) * 2019-07-01 2019-09-17 北京乐普医疗科技有限责任公司 一种用于免疫检测的微流控检测芯片及方法
WO2022108218A1 (ko) * 2020-11-23 2022-05-27 고려대학교 산학협력단 자성 마이크로입자와 표면증강라만 신호를 이용한 바이오물질 검출 방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100089826A (ko) * 2007-09-20 2010-08-12 아이라인 마이크로시스템즈, 에스.엘. 미소유체 장치 및 유체 응고 시간 결정 방법
KR20120017358A (ko) * 2010-08-18 2012-02-28 한양대학교 산학협력단 표면-증강 라만 산란 기반 면역분석용 미세유체칩 및 이를 이용한 온-칩 면역분석방법
KR20120025694A (ko) * 2010-09-08 2012-03-16 광주과학기술원 초점 이탈 이미징을 이용한 미세 굴절계
KR20150008291A (ko) * 2013-07-12 2015-01-22 한양대학교 에리카산학협력단 경쟁 면역반응을 이용한 표면-증강 라만 산란 기반의 질병 진단용 마커 검출 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100089826A (ko) * 2007-09-20 2010-08-12 아이라인 마이크로시스템즈, 에스.엘. 미소유체 장치 및 유체 응고 시간 결정 방법
KR20120017358A (ko) * 2010-08-18 2012-02-28 한양대학교 산학협력단 표면-증강 라만 산란 기반 면역분석용 미세유체칩 및 이를 이용한 온-칩 면역분석방법
KR20120025694A (ko) * 2010-09-08 2012-03-16 광주과학기술원 초점 이탈 이미징을 이용한 미세 굴절계
KR20150008291A (ko) * 2013-07-12 2015-01-22 한양대학교 에리카산학협력단 경쟁 면역반응을 이용한 표면-증강 라만 산란 기반의 질병 진단용 마커 검출 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1. Kneipp, J. et al., 1997. Phys. Rev. Lett. 78, pp. 1667-1670
2. Nie, S. M. and Emory, S. R., 1997. Science 275, pp. 1102-1106
3. Kneipp, J. et al., 2006. Nano Lett. 6(10), pp. 2225-2231

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110244036A (zh) * 2019-07-01 2019-09-17 北京乐普医疗科技有限责任公司 一种用于免疫检测的微流控检测芯片及方法
CN110244036B (zh) * 2019-07-01 2024-04-12 北京乐普诊断科技股份有限公司 一种用于免疫检测的微流控检测芯片及方法
WO2022108218A1 (ko) * 2020-11-23 2022-05-27 고려대학교 산학협력단 자성 마이크로입자와 표면증강라만 신호를 이용한 바이오물질 검출 방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gao et al. Fast and sensitive detection of an anthrax biomarker using SERS-based solenoid microfluidic sensor
US20220016630A1 (en) Micro-Fluidic System Using Micro-Apertures for High Throughput Detection of Cells
Brazhnik et al. Quantum dot-based lab-on-a-bead system for multiplexed detection of free and total prostate-specific antigens in clinical human serum samples
Porter et al. SERS as a bioassay platform: fundamentals, design, and applications
CN102405411B (zh) 用于捕获循环细胞的装置
US10350599B2 (en) Non-invasive monitoring cancer using integrated microfluidic profiling of circulating microvesicles
CN111413138B (zh) 基于双重图像的生物成像装置和技术
JP6099108B2 (ja) 被検出物質の検出装置および方法
WO2017087940A1 (en) Non-invasive monitoring cancer using integrated microfluidic profiling of circulating microvesicles
AU2010206657A1 (en) Apparatus and methods for detecting inflammation using quantum dots
US9274056B2 (en) Use of non-chelated fluorochromes in rapid test systems
EP2960651B1 (en) Bioanalysis device and biomolecule analyser
US20230375547A1 (en) Methods, devices, and related aspects for detecting ebola virus
EP3054283B1 (en) Method for detecting target substance
JP2010145272A (ja) プラズモン励起センサを用いたアッセイ法
WO2020235607A1 (ja) 標的分子の検出方法
KR101712429B1 (ko) 표면-증강 라만 산란 기반의 탄저균 검출용 미세유체칩 및 이를 이용한 탄저균 검출 방법
KR102260007B1 (ko) 광산란을 이용한 면역 분석 장치 및 방법
US8026108B1 (en) Detection of biotargets using bioreceptor functionalized nanoparticles
JP2011506923A (ja) バイオセンサ用磁気洗浄
JPWO2018194152A1 (ja) アルドステロン及びレニンの検出方法
Chen et al. Upconversion nanoparticle‐assisted single‐molecule assay for detecting circulating antigens of aggressive prostate cancer
KR101612094B1 (ko) 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체를 포함하는 바이오마커 탐지용 조성물 및 이의 이용방법
JP2021081359A (ja) 分子間相互作用の解析方法および解析装置
JP5541003B2 (ja) プラズモン励起センサチップおよびこれを用いたアッセイ法

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200228

Year of fee payment: 4