BR112020002241B1

BR112020002241B1 - Método para detecção ultrassensível usando partículas fotoluminescentes

Info

Publication number: BR112020002241B1
Application number: BR112020002241-1A
Authority: BR
Inventors: Pascal Preira; Maximilian Richly; Cédric BOUZIGUES; Antigoni Alexandrou; Thierry Gacoin
Original assignee: Centre National De La Recherche Scientifique; Ecole Polytechnique
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2018-08-03
Publication date: 2024-01-09
Also published as: WO2019025618A1; US20200271586A1; CN111295580B; FR3069927B1; CN111295580A; EP3662265A1; FR3069927A1; BR112020002241A2

Abstract

a presente invenção se refere a um método para detecção e quantificação ultrassensível in vitro de uma substância de interesse em uma amostra, através da detecção da emissão de luminescência por nanopartículas inorgânicas fotoluminescentes, compreendendo (i) implementar partículas fotoluminescentes compreendendo uma nanopartícula inorgânica fotoluminescente formada de uma matriz cristalina tendo pelo menos 103 íons de terras raras, e acoplada a um agente de alvejamento para o analito sob condições que conduzem à associação da mesma com o analito da amostra; (ii) excitar os íons de terras raras das partículas através de um dispositivo de iluminação tendo uma potência de pelo menos 50 mw e uma intensidade de excitação de pelo menos 1 w/cm2; (iii) detectar a emissão de luminescência e (iv) determinar a presença e/ou concentração da substância através da interpretação da referida medição de luminescência. esta também se refere ao uso deste método para propósitos de diagnósticos in vitro, bem como a um conjunto de diagnóstico in vitro.

Description

[001] A presente invenção se refere ao campo de pesquisa, bioanálise e diagnóstico in vitro. Mais particularmente, seu objeto é um processo para a detecção e/ou quantificação ultrassensível in vitro de substâncias de interesse biológico ou químico, por exemplo biomarcadores, anticorpos, DNA, RNA e outros compostos, em uma amostra, em particular uma amostra biológica, por detecção da emissão de luminescência por nanopartículas inorgânicas fotoluminescentes com propriedades ópticas e físico-químicas controladas.

[002] A detecção e/ou quantificação de concentrações de biomarcadores, anticorpos ou DNA e RNA em amostras biológicas (sangue, soro, saliva, urina, fluido cérebro-espinhal, etc.) são essenciais para o diagnóstico médico.

[003] No campo da pesquisa, diagnóstico in vitro ou ex vivo, análise médica e bioanálise, vários métodos foram propostos para detectar e/ou determinar a presença de substâncias específicas.

[004] Estes métodos são geralmente baseados no uso de uma sonda empregada para detectar e/ou quantificar uma concentração em solução. Essas sondas são acopladas a um composto de reconhecimento, ou agente de alvejamento, para se ligar às espécies moleculares a serem analisadas. Este composto de reconhecimento pode ser uma molécula, DNA, aptâmero, proteína ou anticorpo. Em seguida, as sondas anexadas às espécies moleculares a serem analisadas graças ao composto de reconhecimento podem ser detectadas usando um ou mais métodos baseados, por exemplo, em sua luminescência, absorbância, reatividade química, radioatividade, etc.

[005] Os ensaios bioquímicos mais usados são os ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA), que geralmente dependem do uso da peroxidase de rábano como enzima para causar uma reação com um substrato e quantificar a reação química que ocorre medindo a absorbância do produto de reação em solução. A escolha do composto de reconhecimento molecular ao qual a sonda está acoplada é crítica para a eficácia dessas sondas. Mais precisamente, a eficácia desses métodos depende da afinidade específica do composto de reconhecimento com a substância alvo. Como exemplos, as publicações referenciadas [1] e [2] detalham os recursos desses mecanismos.

[006] As sondas luminescentes geralmente levam a uma detecção mais sensível do que as sondas detectadas por sua absorbância, porque, no primeiro caso, medições da intensidade da luz são feitas contra um fundo escuro, enquanto, no segundo caso, é uma questão de medir uma variação na luz intensidade (medições em campo claro).

[007] Outros métodos de ensaio atualmente disponíveis incluem eletroquimiluminescência (ECLIA), imunoensaio de fluorescência (FIA) e radioimunoensaio (RIA).

[008] No entanto, esses métodos têm várias desvantagens que limitam sua sensibilidade final à detecção, em particular limitações em termos das propriedades de luminescência das sondas utilizadas (ECLIA, FIA), riscos de segurança, equipamentos caros e a necessidade de usuários especializados (máquinas não automatizadas) para realizar testes do tipo RIA.

[009] Em particular, as sondas luminescentes atualmente disponíveis têm várias desvantagens que não permitem explorar todo o seu potencial como sensores de diagnóstico. Essas desvantagens incluem, por exemplo, o fenômeno da fotobranqueamento no caso de fluoróforos orgânicos que, após alterações estruturais irreversíveis induzidas pela iluminação, resulta em um desaparecimento da fluorescência ou no fenômeno de intermitência de emissão no caso de nanocristais semicondutores ou “pontos quânticos”; nesse caso, as sondas periodicamente deixam de emitir e, portanto, são inadequadas para produzir um sinal constante. Outras desvantagens resultam, por exemplo, do amplo espectro de emissão de sondas luminescentes. De fato, um espectro de emissão muito amplo dificulta a filtragem de qualquer sinal de fundo que possa estar presente e afeta a qualidade do sinal e, em particular, a razão sinal/ruído. Além dos fatores ópticos que contribuem para a eficácia da sonda em um bioensaio, a praticidade e facilidade de uso da sonda também devem ser consideradas. Por exemplo, algumas partículas, como nanocristais semicondutores, perdem suas características de luminescência após o congelamento, o que é uma desvantagem para o armazenamento de bioconjugados. A facilidade de acoplar as sondas ao composto molecular para alvejar as moléculas desejadas também é um aspecto a considerar ao escolher a sonda correta. Por exemplo, várias partículas, incluindo nanocristais semicondutores, são sintetizadas em solventes orgânicos. Como resultado, o uso para aplicações biológicas requer etapas adicionais de preparação da superfície para obter a dispersão dessas partículas na água, um processo que pode ser complexo de implementar e pouco estável ao longo do tempo [3].

[0010] Adicionalmente, as propriedades coloidais das partículas/sondas são críticas para a realização de bioensaios. De fato, soluções com boa estabilidade coloidal são capazes de fornecer meios de boa homogeneidade para os testes e, portanto, melhor reprodutibilidade dos resultados dos testes.

[0011] Finalmente, complexidade e custo são aspectos importantes na escolha das sondas de diagnóstico. Por exemplo, nanopartículas de ouro, e suas propriedades em termos de ressonância plasmônica de superfície, foram propostas como sondas de diagnóstico, mas não fizeram incursões como sondas para diagnóstico in vitro, possivelmente devido à complexidade do método de detecção [4], ou possivelmente alto custo. Os cristais semicondutores, por sua vez, são sintetizados em solventes orgânicos e requerem procedimentos de dispersão em meio aquoso, o que torna sua síntese complexa e, portanto, cara. Sua funcionalização com grupos químicos, permitindo o acoplamento aos compostos de reconhecimento molecular das moléculas alvo, também se baseia em ligações químicas fracas, o que limita sua estabilidade e prejudica a reprodutibilidade dos testes de detecção.

[0012] Adicionalmente, os métodos de detecção in vitro atualmente disponíveis não são totalmente satisfatórios, particularmente em termos da sensibilidade de detecção que pode ser alcançada, a fim de ampliar o escopo dos métodos de diagnóstico in vitro, por exemplo, permitindo a detecção precoce de doenças ou permitindo um diagnóstico sobre a evolução de uma doença ou o efeito de um tratamento terapêutico.

[0013] Para melhorar a sensibilidade de detecção, foram desenvolvidas duas técnicas comerciais de imunoensaio ultrassensível. Estes são os métodos desenvolvidos por Quanterix e Singulex. Eles são baseados no uso de esferas magnéticas funcionalizadas como superfícies reativas para a captura de moléculas alvo. A tecnologia Quanterix captura então as esferas individuais funcionalizadas com anticorpos para os antígenos. Cada esfera é retida em um poço e analisada por ELISA padrão. O Singulex, por sua vez, usa as esferas para concentrar os analitos capturados e, em seguida, determina sua concentração contando os sinais fluorescentes usando um dispositivo de detecção confocal e um laser de excitação que varre a amostra de maneira helicoidal.

[0014] Essas duas técnicas, embora atinjam um desempenho mais alto em termos de sensibilidade de detecção do que as tecnologias convencionais de detecção discutidas acima, são, no entanto, altamente complexas e caras. Elas exigem o uso de equipamentos especificamente dedicados a essas técnicas de detecção, que não são compatíveis com os dispositivos de diagnóstico in vitro automatizados atuais.

[0015] Nanocristais semicondutores ou “pontos quânticos” também foram propostos em testes de detecção ultrassensível ([5], [6], [7], [8] e [9]). No entanto, a eficácia desses testes é limitada pelas desvantagens associadas a esse tipo de sonda luminescente, conforme discutido acima: complexidade e alto custo de sua síntese e funcionalização, estabilidade coloidal insatisfatória, perda das propriedades de luminescência após o congelamento.

[0016] Finalmente, métodos baseados no uso de nanopartículas de ouro, explorando fenômenos como a detecção de plasmons de superfície, têmpera por fluorescência, deposição de prata em nanopartículas de ouro, etc. ([9] a [13]), atingem altas sensibilidades de detecção, mas geralmente são altamente complexos.

[0017] Portanto, permanece a necessidade de desenvolver um método de detecção/quantificação que atinja um desempenho mais alto em termos de sensibilidade de detecção do que as tecnologias convencionais, como ELISA, ECLIA, FIA ou RIA, e não possui os inconvenientes, principalmente em termos de complexidade e custo, dos métodos ultrassensíveis já propostos.

[0018] A presente invenção visa precisamente propor um novo método de detecção ultrassensível, com base no uso de nanopartículas luminescentes dopadas com íons de terras raras com propriedades ópticas e físico-químicas controladas.

[0019] Assim, a invenção diz respeito, de acordo com um primeiro de seus aspectos, a um processo para a detecção e/ou quantificação ultrassensível in vitro de uma substância de interesse biológico ou químico em uma amostra, em particular uma amostra biológica, detectando a emissão de luminescência por nanopartículas inorgânicas fotoluminescentes, compreendendo pelo menos as seguintes etapas: (i) usar partículas fotoluminescentes consistindo, no todo ou em parte, de uma nanopartícula inorgânica fotoluminescente que consiste em uma matriz cristalina com pelo menos 103 íons de terras raras e acoplada a pelo menos um agente de alvejamento para a substância a ser analisada, sob condições propícias à sua associação com a substância a ser analisada da amostra, as referidas nanopartículas com um tamanho médio maior ou igual a 20 nm e estritamente menor que 1 μm, em particular entre 20 nm e 500 nm, preferencialmente entre 20 nm e 200 nm e, principalmente, entre 20 nm e 100 nm, e sendo capazes de emitir luminescência após absorção de um fóton; (ii) excitar os íons de terras raras das partículas associadas à substância a ser analisada por um dispositivo de iluminação, em particular do tipo laser, com uma potência de pelo menos 50 mW, preferencialmente pelo menos 500 mW, e uma intensidade de excitação de pelo menos 1 W/cm2, preferencialmente pelo menos 10 W/cm2; (iii) detectar a emissão de luminescência pelas partículas, e (iv) determinar a presença e/ou concentração da substância por interpretação da dita medição de luminescência, quando apropriado por referência a um padrão ou calibração.

[0020] No sentido da invenção, a “análise” da substância em uma amostra abrange o aspecto de detecção ou caracterização qualitativa da presença ou ausência da referida substância e também o aspecto de determinação ou caracterização quantitativa da referida substância.

[0021] A amostra pode ser uma amostra biológica, em particular uma amostra humana, por exemplo selecionada a partir de sangue, soro, plasma, saliva, urina e fluido cérebro-espinhal. A amostra também pode ser fezes diluídas, esfregaço vaginal ou nasal ou escarro.

[0022] Um diluente pode ser usado com a amostra a ser testada, especialmente quando a amostra líquida é plasma, soro, sangue total, esfregaço nasal ou vaginal ou esputo, por exemplo.

[0023] Também pode ser uma solução contendo moléculas biológicas.

[0024] O processo da invenção pode assim ser implementado para a detecção e/ou quantificação de biomarcadores, anticorpos, DNA e/ou RNA em uma amostra biológica.

[0025] O processo da invenção implementa mais particularmente, na etapa (iii), a detecção de luminescência pelas partículas após a absorção de um fóton.

[0026] De acordo com o processo da invenção, o sinal detectado corresponde, assim, à emissão de luminescência pelas nanopartículas fotoluminescentes após a absorção de um único fóton, ou seja, a emissão em um comprimento de onda maior que o comprimento de onda de excitação. As nanopartículas fotoluminescentes de acordo com a invenção são assim distintas das partículas de fósforo de conversão ascendente para as quais a detecção da emissão de luminescência é realizada após uma absorção de dois fótons.

[0027] O método ultrassensível de acordo com a invenção é vantajoso de várias maneiras.

[0028] Primeiro, como ilustrado nos exemplos, o método da invenção alcança um desempenho em termos de sensibilidade de detecção que é significativamente maior que o desempenho das técnicas convencionais de detecção do tipo ELISA, ECLIA, FIA ou RIA.

[0029] Vantajosamente, o método ultrassensível da invenção permite assim uma detecção pelo menos 10 vezes, em particular pelo menos 100 vezes, mais sensível que o método de imunodetecção enzimática do tipo ELISA, usando os mesmos anticorpos de reconhecimento e alvejamento.

[0030] O método ultrassensível de acordo com a invenção permite, assim, a detecção e/ou quantificação de uma substância de interesse presente em uma amostra em um conteúdo estritamente abaixo de 10 pM, ou mesmo abaixo de 1 pM, ou mesmo abaixo de 1 pM, ou mesmo abaixo de 0,1 pM, ou mesmo abaixo de 0,01 pM (10 fM). Essas concentrações dependem da molécula alvo e, em particular, da afinidade do composto de reconhecimento, ou composto de alvejamento, acoplado à sonda, mas são comparáveis àquelas detectáveis por métodos ultrassensíveis (Quanterix ou Singulex).

[0031] Adicionalmente, o método da invenção é baseado no uso de nanopartículas dopadas com íons de terras raras, por exemplo, nanopartículas de fórmula (A1-xLnx) a (MpOq) (I), conforme definido mais precisamente a seguir, como nanopartículas do tipo YVO4: Eu ou GdVO4: Eu, YAG: Ce, que possuem propriedades particularmente vantajosas como sondas luminescentes.

[0032] Por exemplo, nanopartículas baseadas em vanadato de ítrio dopado com terras raras foram descritas em detalhes [14] e [15].

[0033] Essas nanopartículas são particularmente vantajosas em termos de excelente fotoestabilidade, o que permite a aquisição de um sinal constante e prolongado e a ausência de fenômenos de emissão intermitente. Adicionalmente, eles têm um espectro de emissão estreito e um grande deslocamento de Stokes (da ordem de 350 nm para nanopartículas dopadas com Eu) da emissão. Essas nanopartículas também contêm várias dezenas de milhares de íons que podem ser excitados e responsáveis pela luminescência. O aumento na intensidade de excitação induz, assim, a um aumento na luminosidade das partículas, uma vez que a saturação da emissão é alcançada apenas em intensidades impraticáveis.

[0034] Finalmente, essas nanopartículas não perdem sua luminescência após o congelamento.

[0035] Nanopartículas fotoluminescentes baseadas em terras raras já foram propostas como sondas luminescentes em várias aplicações [16].

[0036] Por exemplo, Dosev et al. [17] aproveitam as propriedades de luminescência das nanopartículas luminescentes de Eu: Gd2O3 por excitação da matriz Gd2O3 para a detecção de microestruturas de proteínas depositadas em um substrato. Yi et al. [18], por sua vez, usam fósforos de conversão ascendente de fótons da natureza NaYF4: Yb, Er, que absorvem dois fótons próximos ao infravermelho para emitir um fóton no visível.

[0037] Nanopartículas fotoluminescentes baseadas em terras raras também já foram implementadas para detecção de partículas únicas, bem como para rastreamento de moléculas únicas, aproveitando a falta de intermitência para detecção de partículas únicas, em comparação com nanopartículas semicondutoras ou pontos quânticos ([19] e [20]). No entanto, não era de forma alguma previsível que essas nanopartículas à base de íons lantanídeos pudessem ser usadas para detecção e quantificação ultrassensível de biomoléculas, no caso de uma detecção geral de biomoléculas. De fato, além da ausência de intermitência, as propriedades de luminescência das nanopartículas luminescentes baseadas em terras raras são consideradas inferiores às dos pontos quânticos. Nestas partículas, em particular as que consistem em uma matriz de óxido de metal na qual certos íons são substituídos por íons de terras raras, a luminescência pode ser excitada pela excitação da matriz seguida de uma transferência de energia para os íons de terras raras luminescentes, ou por excitação direta na faixa visível dos íons luminescentes de terras raras. No que diz respeito à excitação da matriz, sua banda de absorção está geralmente no UV, o que tem duas desvantagens: atualmente, poucos lasers estão disponíveis nesses comprimentos de onda, e os lasers existentes são volumosos e caros; e, nesses comprimentos de onda de absorção, as biomoléculas absorvem e emitem fortemente, o que pode produzir sinais interferentes. Em relação à excitação direta de íons de terras raras, o coeficiente de extinção para uma nanopartícula é menor que o dos pontos quânticos, mas pode ser comparável ao de um fluoróforo orgânico eficiente [16]. Adicionalmente, os picos de absorção direta de íons de terras raras no visível são geralmente muito espectralmente estreitos, o que requer o uso de um laser espectralmente estreito para excitação direta eficiente de íons de terras raras luminescentes. Este tipo de laser, particularmente na forma de um diodo laser compacto e barato, não estava disponível para os comprimentos de onda envolvidos na excitação direta de íons luminescentes de terras raras até muito recentemente.

[0038] Yuan et al. [21], em um artigo de revisão, apresentam bioensaios de luminescência resolvidos no tempo usando nanopartículas à base de lantanídeos. As sondas luminescentes à base de lantanídeo são partículas que compreendem complexos de lantanídeos, que limitam o número de íons lantanídeos por partícula para um determinado volume de partículas ou nanopartículas de conversão ascendente. Por exemplo, em publicações que utilizam nanopartículas, incluindo complexos de lantanídeos, nanopartículas de pequeno diâmetro (8-9 nm) contêm apenas entre 3.000 e 5.000 íons [28]. Somente nanopartículas de tamanhos muito maiores, especialmente aquelas maiores que 100 nm, podem conter 30.000 ou mais íons [22] e [23].

[0039] Da mesma forma, Corstjens et al. [24] usam nanopartículas de conversão ascendente para a detecção in vitro de IFN-gama em células mononucleares do sangue periférico humano. Nanopartículas de conversão ascendente são adequadas para formação de imagem de tecidos profundos (normalmente excitação na região próxima do infravermelho de Yb3+, onde o tecido absorve pouco em comparação com o visível). Por outro lado, como a excitação requer a absorção de dois fótons, são necessárias altas intensidades de excitação e o número de fótons emitidos é relativamente baixo.

[0040] Complexos de lantanídeos ou quelatos também são propostos como sondas luminescentes para imunoensaios em publicações [23], [25], [26] e [27]. No entanto, esses complexos ou quelatos contêm tipicamente apenas um único íon lantanídeo ou, na melhor das hipóteses, alguns (menos de 10) íons lantanídeos.

[0041] Finalmente, também pode ser mencionada a publicação Zhou et al. [28], que propõe um método de detecção com sensibilidade aprimorada baseada em nanopartículas inorgânicas dopadas com lantanídeos, seguindo um protocolo complexo para dissolver as nanopartículas e detectar a emissão de micelas contendo os lantanídeos assim formados.

[0042] O documento EP 1 282 824, por sua vez, descreve o uso de nanopartículas luminescentes inorgânicas modificadas na superfície como sondas para detectar substâncias biológicas ou outras substâncias orgânicas. O método de detecção proposto neste documento é baseado no princípio da detecção ELISA. No entanto, este documento não propõe de maneira alguma o seu uso para detecção ultrassensível.

[0043] Também pode ser mencionado o documento US 7.550.201, que propõe o uso de nanopartículas inorgânicas dopadas com íons lantanídeos, principalmente para sua aplicação em diagnósticos. No entanto, este documento não propõe de maneira alguma o seu uso para um método de detecção ultrassensível.

[0044] Adicionalmente, as publicações Son et al. [36] e Nichkova et al. [37] propõem o uso de nanopartículas Eu: Gd2O3 como uma alternativa aos fluoróforos orgânicos como sondas para a detecção de DNA e ácido fenoxibenzóico, respectivamente. No entanto, esses documentos não sugerem, de forma alguma, seu uso para detecção ultrassensível.

[0045] Assim, nunca foi proposto tirar vantagem das nanopartículas fotoluminescentes como definidas anteriormente, combinando propriedades ópticas e físico-químicas específicas, em um método de detecção ultrassensível de acordo com a invenção.

[0046] Estas nanopartículas fotoluminescentes podem ser obtidas por métodos de síntese convencionais conhecidos pelo especialista na técnica.

[0047] A matriz cristalina que forma a nanopartícula inorgânica fotoluminescente pode ser uma matriz de óxido, por exemplo uma matriz de vanadato ou fosfato; uma matriz de halogênio, por exemplo uma matriz de fluoreto; ou uma matriz de calcogeneto, por exemplo telúrio, sulfeto, seleneto.

[0048] Alternativamente, vantajosamente, conforme detalhado a seguir, os inventores desenvolveram uma nova maneira de sintetizar nanopartículas dopadas com íons de terras raras usando cátions tetra- alquilamônio na superfície das nanopartículas e possibilitando obter melhor estabilidade das nanopartículas em meio aquoso e, vantajosamente, melhor reprodutibilidade de sua síntese e as etapas subsequentes de funcionalização e acoplamento a um agente de alvejamento.

[0049] Finalmente, o método ultrassensível da invenção prova ser particularmente vantajoso em termos de facilidade de implementação e custo, em comparação com as tecnologias ultrassensíveis discutidas acima.

[0050] Vantajosamente, e ao contrário das tecnologias complexas desenvolvidas pela Quanterix e Singulex, ele implementa um aparelho de detecção compacto de custo limitado, cada componente prontamente disponível para compra, para a excitação e medição da luminescência emitida pelas nanopartículas, conforme detalhado abaixo, e não requer nenhum componente de aparelho especificamente dedicado ao método de detecção ultrassensível da invenção. Vantajosamente, é, portanto, compatível com a integração em um dispositivo de análise automatizado com adaptação ergonômica limitada.

[0051] O método da invenção é ainda adaptado para análise multiplexada. Assim, o método da invenção pode ser implementado para a detecção e/ou quantificação simultânea de pelo menos duas substâncias diferentes em uma amostra, seguindo um procedimento apresentado abaixo (Figura 22).

[0052] Adicionalmente, conforme detalhado a seguir, é possível tirar proveito da longa duração de emissão (maior que 1 μs, ainda maior que 10 μs ou até maior que 100 μs) das partículas da invenção para realizar a detecção resolvida no tempo, em detecção de emissão retardada em particular. Uma medição de luminescência resolvida no tempo foi descrita, por exemplo, no documento WO 03008974. O método ultrassensível da invenção permite vantajosamente que a detecção de luminescência resolvida no tempo seja realizada usando um aparelho de baixa sofisticação e baixo custo, em particular um cortador mecânico, um fotomultiplicador convencional e um conversor AD de 100 kHz, como descrito abaixo.

[0053] A invenção se refere, de acordo com outro de seus aspectos, ao uso do processo definido acima para fins de diagnóstico in vitro. Vantajosamente, a possibilidade de detectar níveis ultrabaixo de certas substâncias em amostras biológicas pelo método ultrassensível permite, por exemplo, usar o método da invenção para a detecção mais precoce de doenças ou diagnosticar o curso de uma doença ou o efeito de um tratamento terapêutico. Adicionalmente, esse método de detecção ultrassensível permite o uso como biomarcadores de substâncias cuja concentração é atualmente muito baixa para ser detectada com métodos convencionais. Também torna os biomarcadores detectáveis em meios biológicos facilmente acessíveis (saliva, urina, sangue, etc.) cuja concentração é muito baixa para ser detectada com métodos convencionais e requer métodos invasivos, como amostragem de fluido cérebro-espinhal, por exemplo.

[0054] De acordo com ainda outro se seus aspectos, a invenção se refere a um kit de diagnóstico in vitro, compreendendo pelo menos: - partículas fotoluminescentes constituídas, no todo ou em parte, por uma nanopartícula inorgânica fotoluminescente, como definida acima, sendo as referidas partículas funcionalizadas na superfície com grupos químicos, por exemplo grupos carboxila, amina, tiol, aldeído ou epóxi, providos por moléculas, por exemplo, ácido cítrico ou ácido poliacrílico e/ou acoplados a moléculas, por exemplo estreptavidina, os referidos grupos ou moléculas químicas capazes de permitir o acoplamento das referidas partículas a um agente de alvejamento para a substância a ser analisada; ou as referidas partículas já sendo acopladas a pelo menos um agente de alvejamento para a substância a ser analisada; e - um sistema de detecção e/ou quantificação que inclua pelo menos: . um dispositivo de iluminação, preferencialmente do tipo laser, com uma potência de pelo menos 50 mW ou até pelo menos 500 mW, e um arranjo óptico para conformar o feixe de laser, permitindo obter uma intensidade de excitação no nível da amostra de pelo menos 1 W/cm2, preferencialmente pelo menos 10 W/cm2; . um dispositivo para detectar a intensidade da luz emitida pelas partículas.

[0055] O dispositivo de iluminação também pode incluir outra fonte de excitação, como uma lâmpada ou um diodo emissor de luz (LED).

[0056] Esse kit de diagnóstico in vitro permite a fácil implementação de um método de detecção e/ou quantificação ultrassensível de acordo com a invenção, por exemplo, para a determinação de biomarcadores ou anticorpos em uma amostra biológica.

[0057] As doenças que podem ser diagnosticadas com o kit de diagnóstico in vitro da invenção não são limitadas e incluem todas as doenças reveladas pela presença de um marcador específico para a doença, do tipo de molécula de interesse biológico (proteína, ácido nucleico, etc.), para os quais existem um ou mais parceiros de ligação específicos (ligante, anticorpos, ácidos nucleicos complementares, aptâmeros, etc.).

[0058] Os exemplos incluem doenças infecciosas (bacterianas, parasitárias ou virais, como AIDS), doenças inflamatórias e autoimunes, doenças cardiológicas, neurológicas ou oncológicas (por exemplo, cânceres sólidos, como câncer de mama ou próstata).

[0059] O processo de detecção ultrassensível da invenção não está limitado às aplicações acima mencionadas. Assim, pode ser usado para a detecção de DNA de OGM em sementes, por exemplo, ou para a detecção de um poluente ou patógeno na água ou em alimentos para consumo.

[0060] As aplicações do processo de detecção ultrassensível de acordo com a invenção podem assim se estender dos campos imunológicos à genética molecular ou à detecção de DNA e RNA, conforme ilustrado nas Figuras 24 e 25 anexas. Pode ser usado para marcar uma ou mais fitas de RNA de uma amostra biológica, com um fragmento de sonda parcialmente complementar ligado a uma nanopartícula e depois detectá-los por hibridação em fragmentos complementares de outra região enxertada em um substrato sólido, seguindo uma abordagem semelhante aos chips de DNA do tipo Affymetrix. Uma característica significativa da invenção se encontra então na ausência da etapa de amplificação normalmente necessária para estas abordagens.

[0061] Adicionalmente, o termo “nanopartícula” será usado mais simplesmente para se referir a uma nanopartícula inorgânica fotoluminescente que consiste em uma matriz cristalina dopada com íons de terras raras.

[0062] Adicionalmente, o termo “partícula” é usado para se referir a uma partícula compreendendo pelo menos a referida nanopartícula, por exemplo consistindo na referida nanopartícula, cuja superfície pode ser localizada, de acordo com uma modalidade variante, cátions de tetra- alquilamônio e acoplada por um ou mais agente de alvejamento para a substância a ser analisada, conforme detalhado abaixo.

[0063] Outras características, variantes e vantagens do processo de acordo com a invenção se tornarão mais claras após a leitura da descrição, exemplos e figuras que se seguem, dados a título ilustrativo não limitativo da invenção.

[0064] A seguir, as expressões “entre ... e ...”, “na faixa de ... a ...” e “variando de ... a ...” são equivalentes e tem a intenção de significar que os limites estão incluídos, a menos que especificado de outra forma.

[0065] Salvo indicação em contrário, a expressão “compreendendo um” deve ser entendida como “compreendendo pelo menos um”.

PARTÍCULAS LUMINESCENTES DA INVENÇÃO

[0066] Como mencionado acima, o processo de detecção ultrassensível de acordo com a invenção é baseado na detecção da emissão de luminescência de partículas fotoluminescentes compreendendo, em particular, uma nanopartícula inorgânica fotoluminescente com propriedades ópticas e físico-químicas específicas e acoplada a pelo menos um agente de alvejamento para a substância a ser analisada.

Nanopartículas inorgânicas fotoluminescentes

[0067] As propriedades das nanopartículas usadas condicionarão a sensibilidade que pode ser alcançada pelo método da invenção.

[0068] As nanopartículas inorgânicas da invenção consistem em uma matriz cristalina com pelo menos 103 íons de terras raras.

[0069] Os íons de terras raras nas nanopartículas da invenção não estão na forma de complexos de íons de terras raras ou quelatos que consistem em íons de terras raras em combinação com ligantes orgânicos adequados, como por exemplo descrito na publicação Yuan et al. [21]

[0070] Preferivelmente, as nanopartículas da invenção compreendem entre 1.000 e 6.000.000 íons de terras raras, em particular entre 5.000 e 500.000 e mais particularmente entre 20.000 e 100.000 íons de terras raras.

[0071] As nanopartículas da invenção podem ser dopadas com íons de terras raras da mesma natureza ou de diferentes naturezas.

[0072] Em particular, esses podem ser íons lantanídeos selecionados entre európio (Eu), disprósio (Dy), samário (Sm), praseodímio (Pr), neodímio (Nd), érbio (Er), itérbio (Yb), cério (Ce), hólmio (Ho), térbio (Tb), túlio (Tm) e suas misturas.

[0073] Em particular, os íons lantanídeos podem ser selecionados de Eu, Dy, Sm, Nd, Er, Yb, Tm e Tb e suas misturas, em particular de Eu, Dy, Sm, Nd, Er, Yb e suas misturas, e mais particularmente Eu.

[0074] A matriz cristalina que forma a nanopartícula inorgânica fotoluminescente pode ser uma matriz de óxido, em particular uma matriz de vanadato ou fosfato; uma matriz de haleto, em particular uma matriz de fluoreto; ou uma matriz de calcogeneto, em particular uma matriz de telúrio, sulfeto ou seleneto.

[0075] As matrizes de fluoreto incluem, em particular, matrizes de YF3, GdF3, NaGdF4, NaYF4, NaLuF4, Ba4Lu3F17, Na3ZrF7, Na5Zr2F13 and Na7Zr6F31.

[0076] De acordo com uma modalidade específica, as nanopartículas inorgânicas da invenção têm a seguinte fórmula (I): (A1-xLnx)a(MpOq) (I) em que: - M representa um ou mais elementos capazes de se associar ao oxigênio (O) para formar um composto cristalino; - Ln corresponde a um ou mais íons lantanídeos luminescentes; - A corresponde a um ou mais íons constituintes da matriz cristalina cujos níveis eletrônicos não estão envolvidos no processo de luminescência; - 0 <x <1, em particular 0,1 < x < 0,9, em particular 0,2 < x < 0,6, em particular 0,2 < x < 0,4 e mais particularmente x é 0,4; e - os valores de p, q e a são tais que a eletroneutralidade de (A1-xLnx)a(MpOq) é respeitada.

[0077] A pode ser mais particularmente selecionado a partir de ítrio (Y), gadolínio (Gd), lantânio (La), bismuto (Bi), lutécio (Lu) e suas misturas, em particular A pode ser selecionado dentre Y, Gd, La e suas misturas; em particular, A representa Y ou Gd, preferivelmente A representa Y.

[0078] Em particular, M na fórmula acima mencionada (I) pode representar um ou mais elementos selecionados dentre V, P, W, Mo, As, Al, Hf, Zr, Ge, Ti, Sn, Mn e Si. Preferivelmente, M representa um ou mais elementos selecionados de V, P, Al, Hf, Zr, Ge, Ti, Sn, Mn e Si e, em particular, selecionados de V, P, W, Mo, As e Al. A matriz cristalina das nanopartículas usadas de acordo com a invenção pode incorporar um ou mais tipos de ânions MpOq. Em particular, M pode representar V1-yPy com y na faixa de 0 a 1.

[0079] De acordo com uma modalidade particular, p na fórmula acima mencionada (I) é diferente de zero.

[0080] A título de exemplo, uma nanopartícula da invenção pode ter a fórmula (I) em que M representa V e/ou P, p é 1, de modo que a matriz da referida nanopartícula compreende os ânions VO43- e/ou PO43-.

[0081] Em outro exemplo de modalidade, M representa Al, A representa Y ou Lu, p é 5 e q é 12, de modo que a matriz Aa(MpOq) da referida nanopartícula é a granada Y3Al5O12 (YAG) ou Lu3Al5O12 (LuAG).

[0082] De acordo com outra modalidade específica, uma nanopartícula da invenção pode ter a fórmula (I) em que M representa Hf ou Zr, Ge, Ti, Sn, Mn, p é 2 e q é 7, de modo que a matriz da referida partícula é AaHf2O7, AaZr2O7, AaGe2O7, AaTi2O7, AaSn2O7 ou AaMn2O7. Em particular, A pode representar La, Y, Gd ou Lu, nesse caso, a = 2.

[0083] Em outro exemplo de modalidade, p é zero e A é Y ou Gd, de modo que a matriz Aa(MpOq) da referida nanopartícula seja do tipo Y2O3 ou Gd2O3.

[0084] De acordo com uma modalidade específica, as nanopartículas usadas em um método de acordo com a invenção podem ser mais particularmente nanopartículas de óxido de metal dopadas com um ou mais íons terras raras, em particular com um ou mais íons lantanídeos.

[0085] A taxa de substituição dos íons da matriz cristalina das nanopartículas de acordo com a invenção, em particular da matriz de óxido metálico, por íons de terras raras pode ser mais particularmente entre 10% e 90%, em particular entre 20% e 60 %, notavelmente entre 20% e 40% e, mais particularmente, pode ser 40%.

[0086] Era contraintuitivo escolher níveis tão altos de doping. De fato, de um modo geral, as taxas usuais de dopagem de nanopartículas luminescentes dopadas com íons de terras raras são mantidas abaixo de 10% para evitar o efeito de têmpera que ocorre em concentrações mais altas [29] a [31].

[0087] Vantajosamente, a cristalinidade imperfeita das nanopartículas de acordo com a invenção, como descrito mais precisamente abaixo, torna possível eliminar o efeito de têmpera. Adicionalmente, o processo de acordo com a invenção, ao excitar diretamente os íons de terras raras das nanopartículas (e não apenas a matriz como é convencionalmente o caso), possibilita, em combinação com maior dopagem com íons de terras raras, acessar um número maior de fótons de excitação absorvidos e, portanto, um número maior de fótons emitidos e detectados.

[0088] As nanopartículas fotoluminescentes da invenção têm um tamanho médio maior ou igual a 20 nm e estritamente menor que 1 μm.

[0089] Em particular, eles têm um tamanho médio entre 20 nm e 500 nm, em particular entre 20 nm e 200 nm e especialmente entre 20 nm e 100 nm.

[0090] Em particular, o tamanho médio das nanopartículas fotoluminescentes da invenção pode ser maior que ou igual a 25 nm, em particular maior que ou igual a 30 nm, notadamente entre 30 e 60 nm.

[0091] Em particular, como ilustrado nos exemplos a seguir, as nanopartículas fotoluminescentes de acordo com a invenção podem ter um tamanho médio na faixa de 30 a 50 nm.

[0092] Nanopartículas maiores podem ser obtidas, por exemplo, por separação centrífuga de tamanho das partículas, como exemplificado para reter apenas as partículas maiores na distribuição de tamanho, ou podem ser obtidas por trituração do material sólido. Qualquer outra técnica conhecida pelo especialista na técnica também pode ser usada.

[0093] As nanopartículas fotoluminescentes utilizadas no processo da invenção têm, assim, um volume suficiente para conter um grande número de íons de terras raras e, assim, emitem um sinal luminescente suficiente para permitir a detecção de baixas concentrações. A título de exemplo, uma nanopartícula esférica Y0,6Eu0,4VO4 com um diâmetro de 30 nm contém 70.000 íons Eu3+ (cálculo do número de íons de acordo com a referência [35] Casanova et al. APL 2006). Adicionalmente, as nanopartículas fotoluminescentes não devem ser muito grandes para evitar impedimentos estéricos quando combinadas com a substância a ser ensaiada imobilizada, por exemplo, na superfície de um suporte, como descrito abaixo.

[0094] O tamanho médio pode ser medido por microscopia eletrônica de transmissão. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão podem ser usadas para determinar o formato das nanopartículas (esféricas, elipsoidais) e deduzir as dimensões médias das nanopartículas. No caso de partículas geralmente esféricas, o tamanho médio se refere ao diâmetro médio das partículas.

[0095] No caso de partículas elipsoidais, o tamanho médio é o tamanho médio de uma esfera do mesmo volume que o elipsoidal. É geralmente assumido que o terceiro eixo geométrico do elipsoidal, não visível nas imagens de transmissão que são projeções 2D, é igual em comprimento ao eixo geométrico menor.

[0096] De acordo com uma modalidade particular, as nanopartículas da invenção são prolatadas, isto é, têm uma forma elipsoidal geralmente alongada.

[0097] Podem ter mais particularmente um comprimento de eixo geométrico principal, denotado a, entre 20 e 60 nm; e um comprimento menor do eixo geométrico, denotado b, entre 10 e 30 nm. Em particular, as nanopartículas da invenção podem ter um valor médio do comprimento do eixo geométrico maior, a, de 40 nm e um valor médio menor do comprimento do eixo geométrico, b, de 20 nm.

[0098] Vantajosamente, as nanopartículas da invenção têm uma baixa polidispersividade. O índice de polidispersividade, que pode ser deduzido das medições de MET, pode ser, em particular, estritamente menor que 0,2.

[0099] De acordo com uma modalidade específica, o produto entre a taxa de dopagem com íons de terras raras, por exemplo no európio (Eu), e a eficiência quântica da emissão pela nanopartícula é maximizada.

[00100] Isso é particularmente vantajoso para uma excitação, de acordo com a etapa (ii) do processo da invenção, de íons de terras raras por excitação direta, isto é, em ressonância com os estados de elétrons desses íons, e não por excitação do Aa(MpOq) como definido acima, por exemplo, AVO4(1-y)(PO4)y e subsequente transferência de energia para esses íons.

[00101] Essa otimização do produto entre a taxa de dopagem com íons Ln e a eficiência quântica pode ser alcançada usando-se uma dopagem com íons Ln alta, por exemplo, entre 0,2 e 0,6 e notavelmente 0,4, sem reduzir a eficiência quântica, em particular limitando os processos de transferência entre íons dopantes, levando à têmpera da concentração. Em particular, para manter uma alta eficiência quântica, a nanopartícula possui cristalinidade imperfeita. De fato, a excelente cristalinidade favorece os processos de transferência entre os íons dopantes, especialmente quando eles estão próximos, como é o caso na alta dopagem, e, portanto, favorece os processos de excitação dos íons por processos não-radiativos, ligados à superfície e à presença do solvente. Em particular, um processo de síntese em temperatura ambiente, ou pelo menos a uma temperatura não superior a 600 °C, é favorável à cristalinidade imperfeita necessária para essas nanopartículas.

[00102] A cristalinidade das nanopartículas é considerada “imperfeita” quando o comprimento de coerência determinado pelo difratograma de raios- X em pelo menos uma direção cristalográfica é inferior a 80% do tamanho de partícula nessa direção, conforme medido a partir de imagens de microscopia eletrônica de transmissão. Diferentes tipos de cristalinidade imperfeita podem ser considerados: policristalinidade, defeitos, porosidade, etc.

[00103] Vantajosamente, as nanopartículas usadas no contexto do processo da invenção são capazes de emitir mais de 108 fótons antes que a emissão pare, em particular mais de 109 ou até mais de 1010 fótons. Em muitos casos, especialmente no caso de partículas YVO4 ou GdVO4 dopadas com Eu, não é observada cessação de emissão.

[00104] Em uma modalidade variante particularmente vantajosa da invenção, a variação relativa do sinal de luminescência em relação ao sinal esperado para o comportamento linear sob as condições de excitação usadas no contexto do processo da invenção, é sempre inferior a 30%.

[00105] Em particular, as nanopartículas usadas no contexto do processo de detecção da invenção são tais que não há saturação do sinal de luminescência em altas intensidades de excitação (em particular, maiores que 1 W/cm2). Isso é mais particularmente o resultado da presença de um grande número de íons de terras raras (maior que 103 íons de terras raras) dentro da partícula.

[00106] Vantajosamente, o processo de detecção da invenção não é, portanto, restrito por fenômenos de saturação e outros efeitos adversos, como fotobranqueamento, que podem ocorrer com alta excitação com certas sondas fotoluminescentes, como fluoróforos orgânicos ou proteínas fluorescentes. A ausência de saturação e outros efeitos, portanto, permite vantajosamente a excitação de acordo com o processo da invenção em alta potência (pelo menos 50 mW) e alta densidade de excitação (pelo menos 1 W/cm2).

[00107] Adicionalmente, vantajosamente, as nanopartículas da invenção têm uma vida útil de emissão longa. Em particular, eles podem ter uma vida útil de emissão maior ou igual a 5 μs, em particular maior ou igual a 10 μs, notavelmente maior ou igual a 20 μs ou maior ou igual a 50 μs.

[00108] O tempo de vida da emissão é entendido como o tempo de vida do estado excitado da nanopartícula emissora e é determinado na prática pela duração da emissão de fótons de luminescência após a excitação ter parado, ou seja, o tempo característico do declínio exponencial da luminescência após a excitação ter parado.

[00109] O método ultrassensível da invenção vantajosamente permite tirar vantagem da longa duração de emissão das partículas da invenção (algumas centenas de μs no caso de partículas Yi-xEuxVO4, em comparação com a vida útil dos fluoróforos usuais da ordem de nanossegundos), a fim de realizar a detecção resolvida no tempo, em particular a detecção atrasada de emissões, com resolução de tempo suficiente (10 μs), usando um aparelho de baixa sofisticação e baixo custo, em particular um cortador mecânico, um fotomultiplicador convencional e um conversor AD de 100 kHz, conforme descrito abaixo.

[00110] Vantajosamente, as nanopartículas da invenção exibem boa estabilidade coloidal em solução.

[00111] A estabilidade das nanopartículas em solução é particularmente crítica para atender aos requisitos de reprodutibilidade dos resultados da detecção do uso dessas partículas como sondas.

[00112] O “potencial zeta” é um dos elementos representativos da estabilidade de uma suspensão. Por exemplo, ele pode ser medido diretamente com um Zetasizer Nano ZS da Malvern. Este aparelho utiliza dispositivos ópticos para medir as velocidades de movimento das partículas em função do campo elétrico aplicado a elas.

[00113] Em particular, as nanopartículas da invenção apresentam vantajosamente, no final de sua síntese, um potencial zeta, em valor absoluto, denotado em meio aquoso a pH 5, superior a 30 mV.

[00114] Mais particularmente, as nanopartículas da invenção têm vantajosamente um potencial zeta menor ou igual a -28 mV, preferencialmente menor ou igual a -30 mV, em meio aquoso de pH > 5, em particular pH > 5,5, e mais particularmente de pH > 6 e de condutividade iônica estritamente menor que 100 μs.cm-1.

[00115] Em particular, as nanopartículas da invenção possuem um potencial zeta menor ou igual a —30 mV, em meio aquoso de pH > 6,5, em particular de pH > 7, notavelmente de pH > 8, e de condutividade iônica estritamente menor que 100 μs.cm-1.

[00116] O “potencial zeta”, denotado Ç, pode ser definido como a diferença de potencial existente entre o interior da solução e o plano de cisalhamento da partícula. É representativo da estabilidade de uma suspensão. O plano de cisalhamento (ou raio hidrodinâmico) corresponde a uma esfera imaginária em torno da partícula na qual o solvente se move com a partícula à medida que as partículas se movem pela solução. O potencial zeta pode ser determinado por métodos conhecidos do especialista na técnica, por exemplo, movendo a partícula com sua camada de solubilização em um campo elétrico, conforme detalhado abaixo.

[00117] Esse potencial zeta negativo das nanopartículas menor ou igual a -28 mV, em particular menor ou igual a -30 mV, em meio aquoso a pH > 5, em particular a pH > 6,5, aumenta os fenômenos de repulsão eletrostática do nanopartículas em solução aquosa uma em relação à outra, tornando possível suprimir os fenômenos de floculação. De fato, é empiricamente conhecido pelo especialista na técnica que um alto potencial zeta absoluto, especialmente acima de 28 mV, geralmente suprime os efeitos da floculação em meios com baixa força iônica.

[00118] De acordo com uma modalidade variante, uma nanopartícula usada no método de detecção ultrassensível de acordo com a invenção é uma nanopartícula da seguinte fórmula (II): A1-xLnxVO4 (1-y)(PO4)y (II) em que: . A é selecionado a partir de ítrio (Y), gadolínio (Gd), lantânio (La), lutécio (Lu) e suas misturas, em particular A é selecionado a partir de Y, Gd, La e suas misturas e mais particularmente A representa Y; . Ln é selecionado entre európio (Eu), disprósio (Dy), samário (Sm), neodímio (Nd), érbio (Er), itérbio (Yb), túlio (Tm), térbio (Tb) e suas misturas, preferivelmente Ln representa Eu; . 0 <x <1, em particular 0,2 < x < 0,6 e mais especificamente x é 0,4; e . 0 < y <1, em particular y é 0.

[00119] De acordo com uma modalidade específica, a nanopartícula possui a fórmula (II) acima mencionada, em que y é 0. Em outras palavras, a nanopartícula usada no processo da invenção é da fórmula A1-xLnxVO4 (III), em que A, Ln e x são como definidos acima.

[00120] De acordo com uma modalidade particular, A na fórmula (II) ou (III) acima mencionada representa ítrio (Y).

[00121] De acordo com outra modalidade particular, Ln na fórmula (II) ou (III) acima mencionada representa Eu.

[00122] Assim, de acordo com uma modalidade variante, as partículas da invenção compreendem uma nanopartícula de fórmula Y1-xEuxVO4 (IV) em que 0 <x <1, em particular 0,2 < x < 0,6 e mais particularmente x é 0,4.

[00123] Preferencialmente, as nanopartículas de fórmulas (II), (III) ou (IV) utilizadas de acordo com a invenção têm cátions tetra-alquilamônio em sua superfície.

[00124] Vantajosamente, o uso desses contraíons volumosos fornece uma estabilidade coloidal aprimorada das partículas em solução e evita os fenômenos de floculação de partículas em particular. Sem se limitar à teoria, essa melhoria em termos de estabilização, resultante do uso de contraíons tetra-alquilamônio, em comparação, por exemplo, com o uso de íons sódio, está ligada à diferença no potencial zeta das partículas. De fato, o uso de contraíons de tetra-alquilamônio induz um potencial zeta negativo da partícula de maior valor absoluto, em comparação com, por exemplo, o uso de contraíons de sódio.

[00125] Deve-se notar que essa estabilidade é importante mesmo em meios com alta força iônica, como é o caso no meio de síntese, mesmo antes da purificação (força iônica maior que 0,1 M). Em particular, uma suspensão aquosa de partículas de acordo com a invenção exibe pouco ou nenhum fenômeno de floculação durante períodos de várias semanas.

[00126] A imobilização de cátions do tipo tetra-alquilamônio na superfície das nanopartículas da invenção resulta mais particularmente de interações eletrostáticas entre os íons de superfície com carga negativa (O2-) da nanopartícula de fórmula (II) e os contraíons do tipo tetra-alquilamônio com carga positiva.

[00127] Assim, cátions tetra-alquilamônio estão diretamente associados à nanopartícula por meio de interações eletrostáticas com os íons de superfície com carga negativa da nanopartícula. Em particular, a imobilização de cátions tetra-alquilamônio na superfície da nanopartícula não envolve nenhum grupo “espaçador”.

[00128] Mais particularmente, o termo cátions “tetra-alquilamônio” se refere a cátions tetra(C1-C6)alquilamônio, ou seja, cátions da fórmula NR4+ com R, que podem ser idênticos ou diferentes, representando um grupo alquila C1-C6, em particular alquila C1-C4.

[00129] Preferivelmente, os cátions “tetra-alquilamônio” são cátions tetra(C1-C3)alquilamônio, isto é, cátions da fórmula NR4+ com R, que podem ser idênticos ou diferentes, representando um grupo alquila C1-C3.

[00130] “Alquila C1-C6” significa um grupo alifático saturado, linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono. Exemplos incluem metila, etila, propila, butila, isopropila, isobutila, terc-butila, etc.

[00131] Os cátions tetra-alquilamônio são preferencialmente selecionados de tetrametilamônio, tetraetilamônio, tetrapropilamônio, cátions de tetrabutilamônio e suas misturas.

[00132] De acordo com uma modalidade particular, os cátions presentes na superfície das nanopartículas da invenção são cátions de tetrametilamônio.

[00133] Como indicado acima, os cátions tetra-alquilamônio estão presentes na superfície das nanopartículas da invenção em uma quantidade suficiente para fornecer o resultado desejado em termos de estabilidade coloidal da suspensão aquosa das referidas partículas sintetizadas, isto é, o valor potencial zeta desejado.

[00134] Os cátions tetra-alquilamônio presentes na superfície das nanopartículas da invenção podem estar presentes em uma razão de 100 a 10.000 cátions tetra-alquilamônio por nanopartícula.

[00135] As nanopartículas da invenção podem assim ser nanopartículas da seguinte fórmula (II'): Ai-xLnxVO4(i-y)(PO4)y • (NR4+)z (II') em que: . A é selecionado dentre Y, Gd, La, Lu e suas misturas, em particular A é selecionado dentre Y, Gd, La e suas misturas, preferencialmente A representa Y; . Ln é selecionado dentre Eu, Dy, Sm, Nd, Er, Yb, Tm, Tb e suas misturas, preferivelmente Ln representa Eu; . 0 <x <1, em particular 0,2 < x < 0,6 e mais particularmente x é 0,4; . 0 < y <1; . R, que pode ser idêntico ou diferente, são como definidos acima, representam preferencialmente uma alquila C1-C3, em particular um grupo metila; e . z representa o número de cátions tetra-alquilamônio NR4+ localizados na superfície da referida nanopartícula, em particular z está entre 100 e 10.000.

[00136] De acordo com uma modalidade específica, a nanopartícula tem a fórmula acima mencionada (II'), em que y é 0. Em outras palavras, uma nanopartícula da invenção pode ter mais particularmente a fórmula Ai-xLnxVO4 • (NR4+)z (III'), em que A, x, Ln, R e z são como definidos acima.

[00137] De acordo com uma modalidade particular, A na fórmula acima mencionada (II') ou (III') representa ítrio (Y).

[00138] De acordo com outra modalidade particular, Ln na fórmula acima mencionada (II') ou (III') representa Eu.

[00139] Assim, de acordo com uma modalidade de variante específica, uma nanopartícula da invenção pode ter mais particularmente a fórmula Yi-xEuxVO4 • (NR4+)z (IV'), em que x, R e z são como definidos acima.

[00140] Entende-se que as diferentes modalidades mencionadas acima, notadamente em relação à natureza das nanopartículas fotoluminescentes e dos cátions tetra-alquilamônio de superfície, podem ser combinadas.

[00141] A título de exemplo, uma partícula fotoluminescente usada de acordo com a invenção pode compreender uma nanopartícula de fórmula Y0,6Eu0,4VO4 na superfície da qual os cátions de tetrametilamônio são opcionalmente imobilizados.

[00142] Em particular, pode ter a fórmula Yo,6Euo,4VO4 • (NR4+)z, z representando o número de cátions tetra-alquilamônio.

[00143] As nanopartículas de acordo com a invenção, em particular as nanopartículas da fórmula (II) acima mencionada, são predominantemente de natureza cristalina e policristalina, em particular de tamanho médio de cristalito, deduzido por difração de raios X, conforme detalhado no Exemplo 1 abaixo, entre 3 e 40 nm.

Preparação de nanopartículas

[00144] As nanopartículas de matriz cristalina dopadas com íons terras raras usadas no processo da invenção podem ser preparadas por qualquer método convencional conhecido pelo especialista na técnica.

[00145] Vantajosamente, as nanopartículas da invenção são facilmente sintetizadas, em meio aquoso, o que tem a vantagem de dispensar qualquer etapa subsequente de transferência de solvente.

[00146] Em particular, as nanopartículas de fórmula A1-xLnxVO4 (1-y)(PO4)y (II) podem ser formadas por reação de coprecipitação, em meio aquoso, a partir de precursores dos referidos elementos A e Ln, e na presença de íons ortovanadatos (VO43-) e opcionalmente íons fosfato (PO43-).

[00147] Os precursores dos elementos A e Ln podem estar convencionalmente na forma de sais dos referidos elementos, por exemplo nitratos, cloretos, percloratos ou acetatos, em particular nitratos. Os precursores dos elementos A e Ln, e suas quantidades, são naturalmente selecionados adequadamente em relação à natureza da nanopartícula desejada.

[00148] Por exemplo, a síntese de nanopartículas da fórmula Y1-xEuxVO4 (IV) pode usar, como compostos precursores de ítrio e európio, nitratos de ítrio (Y(NO3)3) e európio (Eu(NO3)3).

[00149] Vantajosamente, a reação de coprecipitação é realizada na presença de uma quantidade eficaz de cátions tetra-alquilamônio.

[00150] Os cátions tetra-alquilamônio são mais particularmente como definido acima. Eles são preferencialmente selecionados dentre tetrametilamônio, tetraetilamônio, tetrapropilamônio, cátions tetrabutilamônio e suas misturas. Eles são preferivelmente cátions tetrametilamônio.

[00151] Mais particularmente, “quantidade eficaz” significa que os cátions são usados em uma quantidade suficiente para fornecer o resultado desejado em termos de estabilidade coloidal da suspensão aquosa das referidas partículas sintetizadas.

[00152] Em particular, os cátions de tetra-alquilamônio são utilizados em uma quantidade tal que as nanopartículas obtidas a partir do processo de síntese da invenção tenham um potencial zeta como indicado acima. Como ilustrado no Exemplo 1 abaixo, os cátions tetra-alquilamônio na reação de coprecipitação de acordo com a invenção são contraíons de íons ortovanadato (VO43-) e, opcionalmente, íons fosfato (PO43-) (no caso em que y ± 0).

[00153] De acordo com uma modalidade particularmente preferida, os íons ortovanadato (VO43-) são gerados in situ a partir de um sal de metavanadato, preferencialmente metavanadato de amônio (NH4VO3).

[00154] Os íons ortovanadato podem ser mais particularmente formados in situ por reação do referido sal de metavanadato com uma base (mais precisamente com dois equivalentes de base forte).

[00155] Em particular, a base usada para a formação in situ de íons ortovanadato a partir do sal metavanadato é uma fonte de cátions tetra- alquilamônio. Pode ser, por exemplo, um hidróxido de tetra-alquilamônio, por exemplo hidróxido de tetrametilamônio.

[00156] A utilização de um sal de metavanadato, como o metavanadato de amônio, para a síntese de nanopartículas de acordo com a invenção, mostra-se particularmente vantajosa, em comparação com o uso de ortovanadato de sódio, na medida em que evita os problemas de reprodutibilidade associados a variações no conteúdo de carbonato do ortovanadato de sódio.

[00157] A título de exemplo, a reação de síntese do metavanadato de amônio e hidróxido de tetrametilamônio é mostrada no Exemplo 1.

[00158] Também pode ser previsto o uso de metavanadato de alquilamônio (não disponível comercialmente) e outra base forte, como o hidróxido de amônio.

[00159] O processo para a preparação das partículas de acordo com a invenção pode implementar mais particularmente pelo menos as seguintes etapas, consistindo em: (i) fornecer uma solução aquosa, designada solução (1), compreendendo íons ortovanadato (VO43-) e, opcionalmente, íons fosfato (PO43-) e cátions tetra-alquilamônio; (ii) adicionar à solução aquosa (1) uma solução aquosa, denominada solução (2), compreendendo os referidos precursores dos elementos A e Ln, em particular na forma de sais, principalmente nitratos, em condições propícias à formação por coprecipitação das nanopartículas de fórmula (II); e (iii) recuperar as referidas nanopartículas de fórmula (II) na superfície dos quais estão localizados cátions tetra-alquilamônio, formados no final da etapa (ii).

[00160] A solução aquosa (1) pode ser preparada mais particularmente misturando pelo menos um sal de metavanadato, em particular metavanato de amônio e pelo menos uma base, fonte de cátions tetra-alquilamônio, por exemplo um hidróxido de tetra-alquilamônio.

[00161] No caso de íons fosfato, é adicionado um sal fosfato, como fosfato de sódio ou fosfato de amônio.

[00162] Assim, de acordo com uma modalidade variante particularmente vantajosa, o processo da invenção compreende pelo menos as etapas que consistem em: (i) preparar uma solução aquosa (1) misturando, em meio aquoso, um sal de metavanadato, em particular metavanadato de amônio (NH4VO3) e, opcionalmente, um sal fosfato e uma base, fonte de cátions tetra- alquilamônio, em particular um hidróxido de tetra-alquilamônio; (ii) adicionar à solução aquosa (1) uma solução aquosa (2) compreendendo os referidos precursores dos elementos A e Ln, em particular na forma de sais, em particular de nitratos; sob condições propícias à formação por coprecipitação das referidas nanopartículas de fórmula (II); e (iii) recuperar as nanopartículas de fórmula (II) na superfície das quais estão localizados cátions tetra-alquilamônio formados no final da etapa (ii).

[00163] De acordo com uma modalidade particular, a adição na etapa (ii) da solução (2) à solução (1) é realizada gota a gota.

[00164] De acordo com outra modalidade variante, a solução (2) pode ser adicionada à solução (1) de uma só vez, não gota a gota.

[00165] O meio aquoso das soluções (1) e (2) consiste mais particularmente em água.

[00166] Em uma modalidade particular, a solução aquosa (2) contendo os precursores dos elementos A e Ln também pode conter agentes complexantes desses elementos, como citrato, por exemplo citrato de tetra- alquilamônio.

[00167] Cabe ao especialista na técnica ajustar adequadamente as quantidades dos diferentes reagentes, em particular dos precursores do íon ortovanadato, opcionalmente fosfato, e dos referidos elementos A e Ln, com relação à natureza desejada da nanopartícula de fórmula. (II) de acordo com a invenção.

[00168] Em particular, devem ser observadas as razões estequiométricas dos diferentes reagentes, de acordo com as fórmulas (II), (II'), (III), (III'), (IV) e (IV'). Quando a excitação óptica dos íons Ln é provida por excitação direta, ou seja, em ressonância com os estados eletrônicos desses íons, como é o caso no método ultrassensível de acordo com a invenção, e não por excitação da matriz AVO4(1-y)(PO4)y e subsequente transferência de energia para esses íons, como mencionado acima, é preferível ter um alto valor de x, preferencialmente entre 0,2 e 0,6 e preferencialmente 0,4.

[00169] Vantajosamente, o processo de preparação de nanopartículas não requer nenhum aquecimento da solução, diferentemente dos métodos hidrotérmicos propostos nas publicações [26] a [29]. Em particular, todas as etapas (i) a (iii) para a síntese das partículas de acordo com a invenção podem ser vantajosamente realizadas em temperatura ambiente (20-25 °C).

[00170] No entanto, processos de preparação a temperaturas mais altas, por exemplo do tipo hidrotérmico, podem produzir nanopartículas de cristalinidade semelhante, desde que a temperatura não exceda 600 °C, permitindo acesso a nanopartículas com cristalinidade imperfeita, conforme mencionado acima, e, assim, atingindo um alto rendimento quântico.

[00171] A etapa (iii) consiste mais particularmente em purificar a solução de partículas obtidas, nomeadamente para remover o excesso de íons.

[00172] As etapas de purificação podem incluir mais particularmente etapas de diálise ou de centrifugação e redispersão das partículas em meio aquoso, por exemplo por sonicação.

[00173] As partículas podem ser redispersadas em meio aquoso, em particular em água. Como mencionado acima, a suspensão coloidal aquosa das partículas da invenção exibe uma estabilidade muito boa, mesmo após armazenamento por vários meses.

[00174] A título de exemplo, as partículas que consistem, no todo ou em parte, em uma nanopartícula de fórmula Y1-xEuxVO4 (IV), com 0 <x <1, podem ser preparadas por pelo menos as etapas que consistem em: (i) fornecer uma solução aquosa (1), compreendendo íons ortovanadato e cátions tetra-alquilamônio, sendo a referida solução aquosa (1) preferencialmente obtida da mistura, em meio aquoso, de metavanadato de amônio (NH4VO3) e um hidróxido de tetra-alquilamônio; (ii) adicionar à solução aquosa (1) uma solução aquosa, denominada solução (2), compreendendo precursores de Y e Eu, em particular nitratos de ítrio e európio, em condições propícias à formação por coprecipitação das nanopartículas de fórmula (IV); e (iii) recuperar as referidas nanopartículas de fórmula (IV) na superfície das quais estão localizados cátions tetra-alquilamônio, formados no final da etapa (ii).

[00175] Como mencionado acima, ao final de sua síntese, as nanopartículas apresentam uma baixa polidispersividade. O índice de polidispersividade, que pode ser deduzido das medições de MET, pode ser, em particular, estritamente menor que 0,2.

[00176] A síntese de nanopartículas luminescentes de acordo com a invenção, em particular de tamanhos maiores, superiores a algumas dezenas de nanômetros, pode ser realizada por qualquer outra abordagem conhecida pelo especialista na técnica, por exemplo, por trituração do material sólido.

Agente de alvejamento

[00177] As partículas utilizadas como sondas luminescentes de acordo com o processo da invenção são acopladas (ou enxertadas) a pelo menos um agente de alvejamento para a substância a ser ensaiada na amostra a ser analisada.

[00178] “Agente de alvejamento” significa um composto que permite uma ligação com uma substância de interesse biológico ou químico e cuja identificação é procurada.

[00179] A natureza dos agentes de alvejamento utilizados é, é claro, selecionada em relação à substância a ser analisada na amostra.

[00180] As partículas utilizadas no método ultrassensível de acordo com a invenção são perfeitamente adaptadas a uma ampla variedade de alvejamento biológico, sendo as especificidades dependentes da natureza do(s) agente(s) de alvejamento enxertado(s) na superfície da nanopartícula.

[00181] O agente de alvejamento pode ser mais particularmente selecionado a partir de um anticorpo policlonal ou monoclonal, um fragmento de anticorpo, um nanocorpo, um oligonucleídeo, um peptídeo, um hormônio, um ligante, uma citocina, um peptidomimético, uma proteína, um carboidrato, uma proteína quimicamente modificada, um ácido nucleico quimicamente modificado, um carboidrato quimicamente modificado que tem como alvo uma proteína conhecida pela superfície celular, um aptâmero, um conjunto de proteínas e DNA/RNA ou um cloroalcano usado pelos marcadores do tipo HaloTag. Uma abordagem SNAP-Tag ou CLIP-Tag também pode ser usada.

[00182] De acordo com uma modalidade particular, é um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

[00183] Fragmentos de anticorpo adequados compreendem pelo menos um domínio variável de uma imunoglobulina, como domínios variáveis únicos Fv, scFv, Fab, (Fab‘)2 e outros fragmentos ou nanocorpos proteolíticos (anticorpos de domínio único, como fragmentos de VHH obtidos a partir de anticorpos camelídeos ou fragmentos de VNAR obtidos a partir de anticorpos cartilaginosos de peixe).

[00184] O termo “anticorpos” de acordo com a invenção inclui anticorpos quiméricos; anticorpos humanos ou humanizados, anticorpos recombinantes e modificados, anticorpos conjugados e seus fragmentos.

[00185] De acordo com uma modalidade particular, os anticorpos ou fragmentos de anticorpo utilizados de acordo com a invenção têm como alvo marcadores específicos para células cancerígenas.

[00186] O agente de alvejamento também pode ser derivado de uma molécula conhecida por se ligar a um receptor de superfície celular. Por exemplo, o fragmento de alvejamento pode ser derivado de lipoproteínas de baixa densidade, transferrina, EGF, insulina, PDGF, enzimas fibrinolíticas, anti-HER2, anti-HER3, anti-HER4, anexinas, interleucinas, interferons, eritropoietinas ou fatores estimuladores de colônias.

Acoplamento da partícula com o agente de alvejamento

[00187] Cabe ao especialista na técnica implementar os métodos de acoplamento/enxerto apropriados para preparar adequadamente as partículas acopladas a um ou mais agentes de alvejamento. A quantidade de agente(s) de alvejamento utilizado(s) é ajustada em relação à quantidade de partículas.

[00188] O agente de alvejamento pode ser enxertado na nanopartícula diretamente ou através de um espaçador ou ligante.

[00189] Os métodos para acoplar ou enxertar partículas em biomoléculas são bem conhecidos pelos especialistas na técnica. São geralmente acopladas por ligação covalente, por complexação de superfície, por interações eletrostáticas, por encapsulamento ou por adsorção.

[00190] Em alguns casos, incluindo o caso de acoplamento covalente, as partículas podem ser pré-funcionalizadas por grupos químicos que podem reagir com outro grupo químico transportado pelo agente de alvejamento para formar uma ligação covalente.

[00191] Exemplos de grupos químicos que podem estar presentes na superfície das nanopartículas incluem grupos carboxila, amino, tiol, aldeído e epóxi.

[00192] Os grupos amino podem ser providos por moléculas como os amino-organossilanos, como o aminotrietoxissilano (APTES). A vantagem do APTES é que ele forma uma cápsula ao redor da nanopartícula por meio de ligações covalentes. As aminas providas pelo APTES são, portanto, muito estáveis ao longo do tempo. Os grupos amino podem ser convertidos em grupos carboxila por reação com anidrido succínico.

[00193] Os grupos carboxila podem ser providos por moléculas como ácido cítrico ou ácido poliacrílico (PAA).

[00194] Por exemplo, as nanopartículas da invenção podem ser funcionalizadas na superfície com citrato, como ilustrado no Exemplo 1 abaixo.

[00195] De acordo com outra modalidade particular, as nanopartículas da invenção podem ser funcionalizadas na superfície por ácido poliacrílico (PAA). No caso de funcionalização com PAA, quanto mais tempo o PAA estiver em vigor, maior o número de ligações de coordenação (ligações dativas) formadas por cada molécula de PAA. Por exemplo, o PAA pode ter um grau de polimerização que varia de 3 a 10.000.

[00196] Vantajosamente, a funcionalização das nanopartículas com o PAA leva a nanopartículas funcionalizadas e a nanopartículas resultantes do acoplamento dessas nanopartículas funcionalizadas com um ou mais agentes de alvejamento, que têm excelentes propriedades em termos de estabilidade ao longo do tempo.

[00197] Em outros casos, as partículas podem ser primeiro acopladas a moléculas capazes de permitir o acoplamento subsequente com um agente de alvejamento.

[00198] Por exemplo, as partículas podem ser acopladas a estreptavidina capaz de permitir o acoplamento com um agente de alvejamento biotinilado.

[00199] A título de exemplo, o Exemplo 1 ilustra o acoplamento de nanopartículas com anticorpos biotinilados acoplando nanopartículas acopladas a estreptavidina com anticorpos biotinilados. Também pode ser realizado diretamente acoplando anticorpos em nanopartículas funcionalizadas com citrato ou ácido poliacrílico.

[00200] Em outros casos, o acoplamento de nanopartículas com anticorpos pode ser alcançado diretamente acoplando os anticorpos a nanopartículas funcionalizadas com APTES. Os grupos amino providos por APTES podem ser transformados inicialmente em grupos carboxila por reação com anidrido succínico, como mencionado acima. Os grupos carboxila podem então ser ativados por qualquer técnica conhecida pelo especialista na técnica, em particular por reação com 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodi- imida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS), para reagir com as funções amina na superfície de um polipeptídeo e forma uma ligação amida covalente, quando o agente de alvejamento é uma proteína ou um anticorpo.

[00201] A funcionalização das nanopartículas por APTES pode ser feita vantajosamente, revestindo as nanopartículas com uma camada de sílica.

[00202] O acoplamento do agente de alvejamento à superfície das nanopartículas também pode ser feito por qualquer outro método conhecido pelo especialista na técnica.

[00203] Também pode ser vantajosamente feito revestindo as nanopartículas com uma camada de sílica, seguida de uma reação de revestimento com APTES (3-aminopropiltrietoxissilano), cujas funções amina são usadas para reagir com um agente de reticulação bifuncional com duas funções NHS. As nanopartículas acopladas aos agentes de reticulação podem então reagir com as funções amina na superfície de uma proteína (anticorpos, estreptavidina, etc.). Este tipo de processo de acoplamento é notavelmente descrito nas referências [32] e [33].

[00204] Vantajosamente, as partículas utilizadas no método de detecção ultrassensível de acordo com a invenção têm uma baixa polidispersividade. É preferível que o índice de polidispersividade, que pode ser deduzido a partir de medições de TEM ou medições de espalhamento dinâmico de luz (DLS), seja estritamente menor que 0,2. Quando este não é o caso após a síntese ou funcionalização das partículas, uma polidispersividade mais baixa pode ser obtida por separação por tamanho por centrifugação ou por qualquer outra técnica conhecida pelo especialista na técnica.

ASSOCIAÇÃO DAS SONDAS LUMINESCENTES À SUBSTÂNCIA A ANALISAR

[00205] Em uma primeira etapa do método de detecção ultrassensível de acordo com a invenção, as partículas fotoluminescentes estão associadas à substância da amostra a ser analisada.

[00206] Esta etapa pode ser realizada, de maneira semelhante aos métodos convencionais, por exemplo, o ensaio de imunoabsorção ligado à enzima (ELISA), na superfície de um suporte, como mostrado esquematicamente na Figura 1.

[00207] Esta modalidade variante será discutida em mais detalhes abaixo.

[00208] Envolve notavelmente a imobilização prévia, como descrito no Exemplo 2, da substância da amostra a ser analisada, na superfície de um suporte.

[00209] Em particular, a etapa (i) do processo da invenção pode compreender as seguintes etapas: (a) ter um suporte cuja superfície seja previamente passivada e funcionalizada com um agente de alvejamento para a substância a ser detectada/quantificada, por exemplo, um primeiro anticorpo monoclonal, chamado anticorpo de captura; (b) colocar a referida amostra a ser analisada em contato com o suporte da etapa (a) sob condições propícias à associação da referida substância com o agente de alvejamento; e (c) colocar as partículas fotoluminescentes acopladas a pelo menos um agente de alvejamento em contato com o referido suporte da etapa (b) para associar as partículas com a referida substância imobilizada na superfície do suporte.

[00210] O suporte pode ser de diferentes tipos. Podem ser lâminas, por exemplo lâminas de vidro, como usadas nos exemplos, placas com múltiplos poços, microplacas, géis, tiras ou microcanais de membrana. Também pode ser um plástico de boa qualidade óptica ou qualquer outro material de qualidade óptica suficiente.

[00211] A superfície do suporte é primeiro passivada, de modo que as partículas luminescentes não se fixem a ela na ausência da substância a ser analisada.

[00212] A passivação da superfície pode ser realizada por qualquer método conhecido pelo especialista na técnica.

[00213] Por exemplo, pode ser passivação da superfície de vidro com uma molécula compreendendo polietileno glicol (PEG), por exemplo com moléculas de silano-PEG. Preferivelmente, o PEG pode ter uma massa molar de 3.000 a 20.000 gjiiol-1. Quanto maior o PEG, melhor será a passivação resultante. No entanto, o PEG não deve, preferivelmente, ser longo demais para não apresentar um impedimento estérico à ligação da substância a ser analisada.

[00214] O suporte é ainda mais funcionalizado na superfície por um primeiro agente de alvejamento para a substância a ser detectada/quantificada. Pode ser mais particularmente um anticorpo, chamado anticorpo de captura, como mostrado na fase 1 da Figura 1, principalmente quando a substância a ser analisada é do tipo de biomarcador, proteína ou polipeptídeo.

[00215] Quando a substância a ser analisada é do tipo anticorpo, o agente de alvejamento pode ser do tipo antígeno específico para o anticorpo a ser detectado.

[00216] A funcionalização da superfície pode ser realizada por qualquer método conhecido pelo especialista na técnica. Isso pode ser feito, por exemplo, por impressão por spotter (depositando microgotas de soluções contendo as moléculas alvo na superfície com a ajuda de um robô), por uma técnica de impressão por contato que transfere moléculas por contato entre os padrões topológicos de um tampão (por exemplo, um tampão PDMS de polidimetilsiloxano) e a superfície do substrato, ou por outros meios conhecidos pelo especialista na técnica para depositar os agentes de alvejamento na superfície do substrato.

[00217] A amostra a ser analisada é então colocada em contato com a superfície funcionalizada do referido suporte, de modo que permitir que a associação da substância seja detectada/analisada com o agente de alvejamento transportado pelo suporte (fases 2 e 3 da Figura 1).

[00218] Este passo envolve, como por exemplo em um ELISA convencional, uma etapa de incubar a amostra na superfície do suporte e de lavar/enxaguar o suporte para remover a solução e as moléculas não ligadas. Após a lavagem, apenas os complexos do agente de alvejamento/substância do ensaio, por exemplo anticorpo/antígeno, permanecem ligados à superfície do suporte.

[00219] Finalmente, as partículas fotoluminescentes, como descritas acima, consistindo, no todo ou em parte, em uma nanopartícula fotoluminescente e acopladas a um agente de alvejamento para a substância a ser analisada, por exemplo, um anticorpo, são acopladas à substância a ser analisada imobilizada na superfície do suporte (fase 4 da figura 1).

[00220] Esta etapa envolve incubar a solução de partículas fotoluminescentes na superfície do suporte funcionalizado e depois lavar/enxaguar o suporte para remover partículas não ligadas ao suporte. Após o enxágue, apenas o agente de alvejamento/substância de ensaio/complexo de partículas acoplado a pelo menos um agente de alvejamento, por exemplo anticorpo monoclonal/antígeno/nanopartícula de anticorpo policlonal, permanece ligado à superfície do suporte. O tempo de incubação pode ser ajustado por testes anteriores para maximizar o sinal de emissão de luminescência, como mostrado no Exemplo 4. De um modo geral, pode ser entre 45 minutos e 2 horas.

[00221] O acoplamento de partículas acopladas a um agente de alvejamento com a substância a ser analisada pode, por exemplo, envolver o reconhecimento de um par ligante/antiligante, por exemplo biotina ou compostos biotinilados/avidina ou estreptavidina, hapteno/anticorpo, antígeno/anticorpo, peptídeo/anticorpo, como digoxigenina (DIG)/anticorpo anti-DIG, açúcar/lectina, complemento de polinucleotídeo/polinucleotídeo, etc., sendo entendido que um dos elementos desses pares constitui a substância a ser analisada ou também pode ser acoplado à substância a ser analisada.

[00222] Entende-se que a substância a ser analisada pode ser imobilizada em várias áreas predefinidas e distintas da superfície do suporte.

[00223] Isso pode ser alcançado notavelmente através da implementação de uma funcionalização localizada da superfície de suporte pelo referido agente de alvejamento (por exemplo, anticorpos de captura), por exemplo, por impressão por spotter (deposição de microgotas de soluções contendo as moléculas de alvejamento na superfície de suporte por meio de um robô) ou por uma técnica de impressão por contato que permita uma funcionalização da superfície de suporte de acordo com certos padrões, por exemplo, definidos pelo tampão usado para transferir as moléculas, conforme ilustrado no Exemplo 2. Pode ser uma deposição em várias áreas predefinidas do mesmo agente de alvejamento. Nesse caso, essas várias áreas são usadas para detectar a mesma substância em várias amostras diferentes.

[00224] Essa implementação é mais particularmente realizada quando se utiliza o método de detecção ultrassensível de acordo com a invenção para uma análise multiplexada.

[00225] No contexto da análise multiplexada, permitir a detecção e/ou quantificação simultânea de pelo menos duas substâncias diferentes em uma amostra, as diferentes substâncias a serem analisadas na amostra podem ser imobilizadas em áreas predefinidas e distintas na superfície do suporte, por exemplo, funcionalizando localmente a superfície do suporte com agentes de alvejamento específicos para cada uma das substâncias a serem analisadas. A superfície é passivada primeiro para que as partículas fotoluminescentes não se fixem a ela na ausência das substâncias a serem analisadas.

[00226] Nesse caso, as partículas usadas devem ter vários agentes de alvejamento diferentes em sua superfície e, em particular, pelo menos um agente de alvejamento específico para cada uma das substâncias a serem analisadas. Dessa forma, as substâncias a serem analisadas serão quantificadas pela intensidade de emissão da partícula em cada área, a localização espacial da área em questão indicando a natureza da substância. A implementação do método ultrassensível da invenção de acordo com a multiplexação espacial é ilustrada esquematicamente na Figura 22.

[00227] Também é possível combinar abordagens multiplexadas para várias amostras e várias substâncias a serem analisadas, funcionalizando localmente áreas predefinidas e distintas da superfície de suporte por agentes de alvejamento específicos para cada uma das substâncias a serem analisadas, e isso repetidamente tantas vezes quanto o número de amostras a serem analisadas. Nesse caso, a intensidade de emissão da partícula em cada área indica a presença e/ou concentração de cada substância a ser analisada em cada amostra, a localização espacial da área em questão indicando a natureza da substância e o número de amostras.

[00228] As áreas relativas a diferentes substâncias em cada amostra podem ser separadas uma da outra por uma barreira estanque à água. Dessa forma, colocar a amostra, contendo as diferentes substâncias a serem analisadas, em contato com todas as áreas referentes à mesma amostra na superfície do suporte (etapa (b) acima) pode ser feito em uma única etapa e sem aumentar o volume necessário.

[00229] Também é possível para a detecção multiplexada usar pelo menos dois tipos de nanopartículas, dopadas com íons de terras raras distintos, com comprimentos de onda de emissão distintos, por exemplo, YVO4: Eu e YAG:Ce, e acoplados a agentes de alvejamento para cada uma das substâncias a serem analisadas. Ao detectar o sinal de luminescência usando dois filtros de emissão diferentes, cada uma das substâncias a serem analisadas pode ser detectada e/ou ensaiada.

[00230] Preferivelmente, no contexto de uma variante de detecção multiplexada, pelo menos dois tipos de nanopartículas com comprimentos de onda de emissão distintos e cada uma delas acoplada a agentes de alvejamento para cada uma das substâncias a serem analisadas, podem ser utilizadas para separar os sinais de luminescência obtidos.

[00231] A combinação das duas abordagens também pode ser usada (análise de várias amostras diferentes e várias substâncias diferentes em cada amostra), principalmente para a comparação das concentrações de moléculas alvo entre pelo menos duas amostras, sendo essa realizada comparando as intensidades das cores de emissão de cada uma das nanopartículas, cada uma acoplada ao agente de alvejamento específico de cada substância a ser analisada, para várias áreas de deposição, cada uma correspondendo a uma amostra diferente.

[00232] Alternativamente, a combinação das duas abordagens também pode ser usada — análise em várias amostras diferentes (amostras de origem diferente ou da mesma origem em momentos diferentes, sob condições diferentes, sob estímulos diferentes, etc.) de várias substâncias diferentes em cada amostra — nomeadamente para a comparação das concentrações das moléculas alvo entre pelo menos duas amostras. Isso é feito comparando as intensidades das cores de emissão de cada uma das nanopartículas, cada uma delas acoplada aos agentes de alvejamento específicos de cada substância a ser analisada, para várias áreas de deposição correspondentes a diferentes moléculas alvo. Nesse caso, a comparação das cores de emissão em um determinado local fornece uma comparação das concentrações de uma molécula entre as duas amostras.

[00233] Várias outras combinações dessas abordagens podem ser consideradas: por exemplo, analisar quatro substâncias usando dois tipos de nanopartículas com duas cores de emissão diferentes, cada uma acoplada a dois dos quatro agentes de alvejamento diferentes necessários para o reconhecimento das quatro substâncias a serem analisadas, e duas áreas distintas da superfície de suporte funcionalizadas localmente por dois dos quatro agentes de alvejamento específicos para cada uma das substâncias a serem analisadas.

[00234] A invenção, obviamente, não está limitada à modalidade variante descrita abaixo, em que a substância a ser analisada é imobilizada na superfície de um suporte (como lâminas de vidro ou placas de múltiplos poços, por exemplo). Outras configurações são concebíveis para medir a luminescência de partículas fotoluminescentes associadas à substância da amostra a ser analisada.

[00235] Outras configurações são concebíveis para a associação das partículas fotoluminescentes da invenção com a substância a ser analisada.

[00236] Modalidades de realização variantes podem envolver, por exemplo, tiras de teste em que o analito migra de uma extremidade para a outra reagindo com as moléculas alvo, ou um gel para separar as moléculas biológicas e uma membrana na qual as moléculas são especificamente ligadas e detectadas, semelhante ao método de Western blot.

[00237] Em outras variantes, a superfície da reação não é do tipo de suporte sólido, mas pode ser, por exemplo, outra nanopartícula, uma microesfera magnética etc. A medição pode ser realizada, por exemplo, diretamente na amostra a ser analisada. Se a amostra for gasosa, esse suporte de amostra pode assumir a forma de um volume fechado para evitar a dispersão da amostra de teste. O suporte de amostra também pode assumir a forma de uma célula ou cubeta, especialmente se a amostra estiver na forma de uma solução.

[00238] O processo ultrassensível da invenção também pode ser adaptado para uso em tecnologias de separação de células ativadas por fluorescência (FACS). Nesse caso, partículas da invenção, acopladas a agentes de alvejamento que visam o reconhecimento de substâncias que compõem o tipo de célula a ser analisado, são colocadas em contato com as células e o sistema de citometria deve ser adaptado para incluir uma fonte de excitação, preferencialmente um laser, em um comprimento de onda adaptado à excitação dos íons luminescentes de terras raras que compõem as nanopartículas.

[00239] O processo ultrassensível da invenção também pode ser adaptado para uso em tecnologias do tipo imunocitoquímica e imuno- histoquímica.

MEDIÇÃO DA LUMINESCÊNCIA

[00240] Como mencionado acima, o método ultrassensível de acordo com a invenção mais particularmente implementa uma etapa (ii) de excitação dos íons de terras raras das partículas fotoluminescentes por um dispositivo de iluminação tendo uma potência de pelo menos 50 mW, e uma intensidade de excitação de pelo menos 1 W/cm2 e uma etapa (iii) de detecção da emissão de luminescência pelas partículas após uma absorção de fóton único.

Arranjo de detecção

[00241] O método ultrassensível de acordo com a invenção é vantajosamente implementado com o auxílio de um aparelho de baixo sofisticação e baixo custo.

[00242] Mais precisamente, este inclui, em termos gerais : - um dispositivo de iluminação, preferivelmente do tipo laser, com uma potência de pelo menos 50 mW e uma intensidade de excitação de pelo menos 1 W/cm2; e - um dispositivo para detectar a intensidade de luz emitida pelas partículas.

[00243] A fonte de excitação também pode ser uma lâmpada ou diodo emissor de luz (LED).

[00244] Será feita referência, abaixo, às Figuras 2 e 12 a 13 em anexo, que representam, de uma maneira esquemática e parcial, instalações adequadas para a implementação do processo ultrassensível da invenção.

[00245] Além disso, o aparelho pode incluir um suporte adequado para a imobilização da substância a ser analisada a partir da referida amostra, conforme descrito acima.

[00246] De acordo com uma modalidade variante, o sistema de detecção de acordo com a invenção compreende um sistema para transladar o suporte ou dispositivo de iluminação a laser, tornando possível iluminar sucessivamente diferentes áreas localizadas do suporte. Tal variante é particularmente utilizada para a implementação do método de detecção da invenção para a multiplexação espacial (Figura 22), o sistema de translação permitindo a iluminação de laser sucessiva de cada uma das áreas pré- definidas contendo as substâncias a serem analisadas na mesma amostra, ou mesmo em diversas amostras diferentes. O sinal de transmissão é então registrado de acordo com a posição de iluminação do suporte.

[00247] O dispositivo de iluminação a laser pode ser mais particularmente composto de uma fonte de laser (1) com uma potência de pelo menos 50 mW, em particular pelo menos 500 mW, preferivelmente pelo menos 1 W e um arranjo óptico (2) para conformar o feixe de laser, pelo que uma intensidade de excitação de pelo menos 1 W/cm2, preferivelmente pelo menos 10 W/cm2, pode ser obtida no nível das partículas luminescentes.

[00248] Díodos laser de alta potência para esta modalidade, emitindo notadamente a 465 nm, se tornaram comercialmente disponíveis para a excitação de íons de Eu3+.

[00249] Tal intensidade de excitação garante a excitação direta de íons de terra, isto é, em ressonância com os estados eletrônicos desses íons, e não pela excitação da matriz de AVO4(1-y)(PO4)y, ou outra matriz de óxido metálico, e subsequente transferência de energia para estes íons.

[00250] Por nenhum meio óbvio que estas partículas fotoluminescentes poderiam ser usadas como sondas luminescentes através de excitação direta de íons terra raras. De fato, para a maioria dos íons de lantanídeos, a transição de elétrons ligada à absorção de fótons é a assim chamada transição de elétrons de um elétron 4f para outra configuração de elétrons. A absorção é assim apenas ligeiramente permitida devido a uma baixa mistura de orbitais d (as transições d-> f ou f-> d sendo permitidas). O fato de que a transição eletrônica relacionada à absorção é desimpedida, resulta em uma estreita largura espectral do pico de absorção e um baixo coeficiente de extinção dessas nanopartículas em solução.

[00251] De fato, mesmo que partículas fotoluminescentes consistindo em uma matriz cristalina dopada com íons de terras raras já tenham sido usadas, elas são geralmente usadas através de excitação de sua matriz cristalina, a última geralmente absorvendo muito mais fortemente do que os íons de absorção. Entretanto, à medida que a matriz cristalina geralmente absorve-se no UV, a implementação de uma excitação da matriz cristalina tem várias desvantagens: por um lado, os lasers emitindo-se no UV não são muito comercialmente disponíveis, frequentemente caros e não muito compactos e, por outro lado, a excitação no UV é provável de causar simultaneamente a excitação de outras biomoléculas que podem estar presentes na amostra a ser analisada. Além disso, a absorção e dispersão pelos substratos sólidos usados (vidro, plásticos, etc) durante a medição são conhecidas por absorver significativamente no UV e, consequentemente, para induzir sinais de interferência de alta amplitude.

[00252] O dispositivo de iluminação a laser também pode compreender um arranjo óptico, em particular um sistema de pelo menos uma lente, arranjada no trajeto do feixe de laser, de modo que controle o tamanho do feixe na área do suporte apresentando as partículas associadas com a substância a ser analisada.

[00253] O processo da invenção, que se baseia na excitação direta dos íons de terras raras das nanopartículas, torna possível superar as desvantagens associadas à excitação da matriz cristalina.

[00254] Além disso, conforme mencionado acima, o uso de alta potência e alta densidade de excitação de acordo com a invenção não é prejudicial à emissão de luminescência pelas nanopartículas implementadas de acordo com a invenção que não estão sujeitas a fenômenos de saturação ou fotodegradação.

[00255] Preferivelmente, o laser é monocromático, com uma largura espectral comparável à largura espectral do pico de absorção dos íons de lantanídeo luminescentes.

[00256] A excitação é realizada na faixa visível ou próxima da infravermelha.

[00257] Por exemplo, a excitação pode ser realizada em um comprimento de onda de 465 nm para partículas do tipo Y0,6Eu0,4VO4.

[00258] O arranjo óptico para conformar o feixe de laser pode incluir convencionalmente um sistema para colimação e redução do tamanho do feixe de laser, por exemplo, por meio de lentes, em particular duas lentes, conforme descrito no exemplo 3. Pode então ser usado para controlar a área iluminada na área do suporte apresentando as partículas associadas com a substância a ser analisada de modo que se obtenha uma intensidade apropriada (por exemplo, 10 W/cm2) e uma iluminação cujas dimensões são próximas ou menores do que aquelas do ponto de deposição (por exemplo, 1 mm de diâmetro).

[00259] A excitação na etapa (ii) pode ser mais particularmente realizada com um feixe de excitação a laser orientado de modo que forme um ângulo de incidência com a vertical do suporte tendo sobre sua superfície as partículas associadas com a substância a ser analisada, maior do que ou igual a 55° para uma iluminação de grande ocular da amostra; em particular menos do que 60° no caso de uma medição realizada em meio aquoso sobre um substrato de vidro ou plástico.

[00260] O uso de um grande ângulo de incidência para o feixe de laser de excitação reduz o volume de meio excitado acima da superfície, reduzindo assim os sinais de interferência.

[00261] De acordo com uma modalidade particularmente vantajosa, o processo da invenção envolve a excitação das partículas por ondas evanescentes, em particular por meio de um arranjo de iluminação de laser do tipo de fluorescência de reflexão interna (TIRF). Isto é possível pela obtenção de um ângulo de incidência do feixe de excitação maior ou igual a 61°, em particular entre 61° e 63°, no caso de uma interface vidro/água entre o suporte e a amostra a ser analisada.

[00262] Cabe ao versado na técnica fazer os ajustes necessários ao dispositivo de detecção para obter esta incidência de excitação de onda evanescente.

[00263] Conforme mostrado na Figura 13, é possível notadamente, compreender um paralelepípedo com um índice refrativo maior do que aquele da solução de reação, por exemplo, perto daquela do material usado para o suporte, permitindo um ângulo de incidência do feixe de excitação maior do que o ângulo crítico da interface de substrato/amostra sólida, em particular maior ou igual a 61° no caso de uma interface de vidro/solução aquosa, de modo que se obtenha uma reflexão total do feixe na interface suporte/amostra e uma excitação de onda evanescente das partículas associadas com a substância a ser analisada.

[00264] De acordo com uma outra modalidade particularmente vantajosa, no contexto do uso de partículas com um longo tempo de vida de emissão (em particular com um tempo de vida de emissão maior ou igual a 1 μs, em particular maior do que ou igual a 50 μs) é o uso de detecção de emissão resolvida no tempo, em particular detecção retardada do sinal emitido pelas partículas fotoluminescentes.

[00265] O versado na técnica é capaz de adaptar o sistema de detecção usado para permitir que a emissão de luminescência seja usada de uma maneira resolvida no tempo.

[00266] Para este propósito, um cortador mecânico (4) pode ser colocado no trajeto do feixe de laser incidente, por exemplo, conforme mostrado na Figura 13.

[00267] O princípio de operação deste cortador mecânico e os métodos de análise do sinal resultante para isolar o sinal de luminescência das nanopartículas são descritos em maiores detalhes no seguinte Exemplo 3.2. O uso de um cortador mecânico e uma frequência de detecção de sinal de 100 kHz pelo fotomultiplicador do dispositivo de detecção torna possível evitar a fluorescência de interferência.

[00268] Tal detecção resolvida no tempo torna assim vantajoso limitar a contribuição para o sinal de luminescência de espécies interferentes presentes na amostra (soro, sangue, etc) ou nos substratos sólidos usados (vidro, plástico, etc), separando temporalmente os sinais de luminescência de interferência do sinal emitido pelas nanopartículas, já que estes sinais interferentes geralmente possuem tempos de vida característicos menores do que 1 μs, ou mesmo menores do que 100 ns, ou mesmo menores do que 10 ns.

[00269] Entende-se que as várias modalidades particulares descritas acima podem ser combinadas para realizar diferentes modalidades variantes do processo de detecção de acordo com a invenção.

[00270] Em particular, a detecção resolvida no tempo e a excitação de onda evanescente de nanopartículas (arranjo TIRF) podem ser implementadas juntas, conforme mostrado na figura 13, ou não.

[00271] Assim, de acordo com uma modalidade preferida, o processo de detecção ultrassensivel de acordo com a invenção combina vantajosamente uma excitação das nanopartículas por onda evanescente, em particular por meio de um arranjo de iluminação a laser do tipo TIRF, e uma detecção resolvida no tempo da emissão, em particular uma detecção retardada da emissão (implementação de nanopartículas com uma longa duração de emissão, utilização de um cortador).

[00272] Assim, vantajosamente, em um processo de acordo com a invenção, o tempo de vida de emissão pelas nanopartículas é maior ou igual a 1 μs, em particular maior ou igual a 50 μs, a detecção da intensidade de luz na etapa (iii) compreendendo uma detecção resolvida no tempo da emissão, em particular uma detecção retardada da emissão.

[00273] A combinação destes dois modos torna vantajoso eliminar a emissão devido às partículas em solução, outras que não aquelas a serem analisadas imobilizadas sobre a superfície do suporte, bem como qualquer emissão de espécies interferentes presentes na amostra (soro, sangue, etc) ou nos substratos sólidos usados (vidro, plástico, etc.).

[00274] Tal modalidade variante é particularmente vantajosa pelo fato de que ela dispensa com algumas das etapas convencionais para a preparação de amostras a serem analisadas, e em particular etapas de enxágue e/ou centrifugação, por exemplo, no caso de enxágue durante a análise para remover substâncias (moléculas, proteínas, peptídeos, etc.) contido no soro sanguíneo, além daqueles preocupados pela análise a ser realizada (enxágue para ir da fase 2 para a fase 3 indicada na figura 1) ou para remover partículas que não se ligam à superfície do suporte e permanecem em solução durante a fase 4 indicada na Figura 1) ou, por exemplo, etapas de centrifugação que precedem a análise real, como mostrado na figura 1, para remover células sanguíneas de amostras de sangue, que são normalmente demoradas e realizadas manualmente, em particular para etapas de centrifugação.

[00275] A detecção de emissão de luminescência pode ser realizada medindo a intensidade de luz emitida em um comprimento de onda de luminescência das partículas fotoluminescentes usadas. A título de exemplo, no caso do uso de nanopartículas de Y1-xEuxVO4, a intensidade de luz emitida pode ser medida no comprimento de onda de luminescência de Eu3+, isto é, 617 nm.

[00276] O dispositivo de detecção de intensidade de luz pode compreender um único detector, em particular do fotomultiplicador, fotodiodo, tipo de fotodiodo de avalanche ou um detector do dispositivo sensível à luz à luz consistindo em uma área 2D de pixels de detecção, tal como uma câmera CCD ou EM-CCD ou uma câmera CMOS. Um dispositivo de detecção 2D permite a medição simultânea do sinal de emissão de nanopartículas de diferentes áreas correspondentes a diferentes amostras e/ou diferentes substâncias a serem analisadas sobre a superfície do suporte e não requerem qualquer movimento do suporte ou do feixe de excitação.

[00277] Preferivelmente, o dispositivo de detecção de intensidade de luz compreende um único detector, em particular um fotomultiplicador, por meio do qual um dispositivo de detecção menos dispendioso pode ser realizado.

[00278] Pode também incluir um arranjo óptico, em particular, um sistema de pelo menos uma lente com uma grande abertura numérica, para focalizar a emissão de luminescência em direção ao detector, em particular para o fotomultiplicador.

[00279] Filtros de interferência também podem ser colocados no trajeto do feixe emitido para eliminar de forma espectral os sinais de interferência.

[00280] A detecção pode ser realizada em reflexão, para baixo, como mostrado esquematicamente na Figura 12-a, isto é, no lado da superfície do suporte que recebe o feixe de excitação a laser.

[00281] Alternativamente, este pode ser operado em transmissão, para cima, como mostrado esquematicamente na Figura 12-b a coleta da luminescência acima é preferida no caso de excitação de onda evanescente, de modo que evitar a passagem dos fótons de luminescência através do paralelepípedo, permitindo a realização da onda evanescente. Análise da medição de luminescência.

ANÁLISE DA MEDIÇÃO DE LUMINESCÊNCIA

[00282] O processo da invenção compreende, finalmente, uma etapa (iv) de determinar a presença e/ou a concentração da substância pela interpretação da medição da luminescência.

[00283] Entende-se que o sistema de detecção de acordo com a invenção pode adicionalmente incluir qualquer meio para analisar a emissão de luminescência, por exemplo, um conversor para registrar e avaliar o sinal de luminescência.

[00284] A interpretação da medição de luminescência pode ser feita por referência a um padrão preestabelecido ou calibragem.

[00285] Mais precisamente, a quantidade da substância a ser analisada na amostra pode ser determinada por referência a uma curva de calibração pré-estabelecida por meio de medições realizadas com amostras de quantidade conhecida da referida substância, preferencialmente sob condições idênticas àquelas do estudo da amostra, estas condições idênticas incluindo, em particular, o solvente e o pH do meio.

[00286] Vantajosamente, conforme ilustrado no Exemplo 3, o processo ultrassônico de acordo com a invenção torna possível detectar e quantificar uma substância de interesse em uma amostra em um conteúdo estritamente abaixo de 10 pM, em particular abaixo de 1 pM, ou mesmo abaixo de 0,1 pM, ou abaixo de 0,01 pM (isto é, 10 fM).

[00287] De fato, permite uma detecção de pelo menos 10 vezes, em particular pelo menos 100 vezes ou mesmo 1000 vezes mais sensível do que o método de imunodetecção de enzima do tipo ELISA, usando os mesmos anticorpos de reconhecimento e alvo.

KIT DE DIAGNÓSTICO IN VITRO

[00288] A invenção se refere também, de acordo com um outro de seus aspectos, um kit de diagnóstico in vitro, compreendendo pelo menos: - partículas luminescentes consistindo, no todo ou em parte, de uma nanopartícula inorgânica fotoluminescente como definido acima, as ditas partículas sendo superficialmente funcionalizadas com grupos químicos, por exemplo, grupos carboxila, amino, tiol, aldeído ou epóxi, providas por moléculas, por exemplo, ácido cítrico ou ácido poliacrílico, e/ou acopladas a moléculas, por exemplo, estreptavidina, ditos grupos químicos ou moléculas sendo capazes de permitir o acoplamento das referidas partículas com um agente de direcionamento para a substância a ser analisada; ou

[00289] as ditas partículas já estão acopladas a pelo menos um agente de direcionamento para a substância a ser analisada; - um sistema de detecção e/ou quantificação que compreende pelo menos: - um dispositivo de iluminação a laser com uma potência de pelo menos 50 mW ou pelo menos 500 mW, e um arranjo óptico para conformar o feixe de laser de modo que uma intensidade de excitação de pelo menos 1 W/cm2, preferivelmente pelo menos 10 W/cm2, seja obtida no nível da amostra - um dispositivo para detectar a intensidade luminosa emitida pelas partículas.

[00290] O kit de diagnóstico in vitro de acordo com a invenção pode adicionalmente incluir um suporte adequado para a imobilização da substância a ser analisada da referida amostra, conforme descrito acima.

[00291] Este pode ser um suporte cuja superfície foi passivada e funcionalizada com um agente de direcionamento para a substância a ser detectada/quantificada, por exemplo, com um primeiro anticorpo, conforme descrito acima.

[00292] Em uma primeira modalidade variante, o kit de diagnóstico in vitro de acordo com a invenção pode compreender partículas fotoluminescentes de acordo com a invenção já acopladas a um agente de direcionamento, em particular a anticorpos, chamados anticorpos de detecção de leucócitos, para distingui-los de anticorpos de captura imobilizados no nível do suporte.

[00293] As partículas acopladas ao agente de direcionamento podem ser obtidas conforme descrito acima.

[00294] Em outra modalidade variante, o kit pode compreender partículas que não são acopladas a um agente de direcionamento, a partir do qual o usuário ou profissional pode preparar as partículas acopladas a um ou mais agentes de direcionamento para implementação no método ultrassônico de acordo com a invenção.

[00295] De acordo com uma modalidade particular, o kit de diagnóstico in vitro de acordo com a invenção pode, assim, compreender diversos recipientes compreendendo, de uma maneira isolada, as ditas partículas não acopladas por um lado e um ou mais agentes de direcionamento no outro.

[00296] Alternativamente, o kit de diagnóstico in vitro de acordo com a invenção não inclui um agente de direcionamento, o usuário ou profissional capaz de obter o agente de direcionamento, por exemplo, biotinilado, de sua escolha, separadamente por qualquer fornecedor competente.

[00297] A preparação das partículas acopladas aos agentes de direcionamento envolve no contexto desta modalidade variante a mistura das partículas não acopladas de acordo com a invenção com o agente de direcionamento, em razões de concentração predeterminada pelo conteúdo dos recipientes no caso da presença do agente de direcionamento dentro do conjunto de diagnóstico in vitro de acordo com a invenção, ou determinado pelo usuário, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 1.

[00298] As partículas não acopladas a um agente de direcionamento usado em um kit de diagnóstico in vitro de acordo com a invenção podem ser notavelmente partículas acopladas a moléculas, por exemplo, estreptavidina, capazes de permitir o acoplamento das referidas partículas com um agente de direcionamento, por exemplo, biotinilado, por exemplo, um anticorpo biotinilado.

[00299] Outros pares de moléculas podem ser considerados para este tipo de acoplamento, por exemplo, hapteno/anticorpo, antígeno/anticorpo, peptídeo/anticorpo, tais como digoxigenina (DIG)/anticorpo anti-DIG, açúcar/lectina e complemento de polinucleótideos/polinucleótideos.

[00300] Alternativamente, as partículas não acopladas a um agente de direcionamento usado em um kit de diagnóstico in vitro de acordo com a invenção podem ser em particular superfície de partículas funcionalizadas com grupos químicos capazes de permitir o acoplamento das referidas partículas com um agente de direcionamento para a substância a ser analisada, por exemplo, grupos carboxila, amino, tiol, aldeído ou epóxi, providos por moléculas, tais como, por exemplo, ácido cítrico ou ácido poliacrílico.

[00301] Como exemplos, as partículas podem ser funcionalizadas com citrato ou ácido poliacrílico, a preparação das partículas acopladas com os agentes de alvejamento envolvendo a ativação de funções carboxílicas, conforme descrito no Exemplo 1, seguido pela mistura das partículas não acopladas com o agente de direcionamento.

[00302] Entende-se que a funcionalização da superfície das nanopartículas pode ter mais de uma camada. Por exemplo, como mencionado acima, as partículas da invenção podem compreender uma camada de preparação ou estabilização da superfície das nanopartículas, tal como uma camada de sílica, seguida por uma camada de funcionalização por grupos químicos ativos, tal como uma camada consistindo em aminopropiltrietoxisilano (APTES).

[00303] Os exemplos e figuras apresentados abaixo são dados apenas como ilustração não limitativa da invenção.

FIGURAS

[00304] Figura 1: Representação esquemática do princípio de detecção de biomoléculas: superfície funcionalizada com um anticorpo de captura (fase 1); contato da amostra a ser analisada (fase 2), lavagem (fase 3) e associação das partículas fotoluminescentes acopladas com um agente de direcionamento (aqui um anticorpo) com a substância imobilizada sobre a superfície do suporte seguido por lavagem para remover as partículas não imobilizadas (fase 4);

[00305] Figura 2: Representação esquemática de um dispositivo de detecção de acordo com a invenção, composto de uma fonte de laser 1, um sistema para colimação e redução do tamanho do feixe de laser 2, um espelho 3 para direcionar o feixe de laser, um suporte 6 para as amostras e um sistema para detectar os fótons emitidos compreendendo uma lente com um grande orifício numérico 10 e um fotomultiplicador 12;

[00306] Figura 3: imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) das nanopartículas obtidas no Exemplo 1 (Barra de escala: 60 nm (Figura 3a) e 5 nm (Figura 3b), respectivamente);

[00307] Figura 4: Histograma de tamanho de nanopartículas determinado a partir de imagens de TEM para um conjunto de cerca de 300 nanopartículas de acordo com o Exemplo 1;

[00308] Figura 5: Difratogramas de raios-X obtidos para nanopartículas sintetizadas de acordo com o Exemplo 1 (linha preta) e 3 (linha cinza);

[00309] Figura 6: Representação esquemática das nanopartículas da invenção funcionalizada com citrato (Figura 6a) ou com ácido poliacrílico (PAA) (Figura 6b). Para maior clareza, é mostrada apenas uma molécula de citrato ou PAA. Entende-se que cada nanopartícula pode ter muitas moléculas de citrato ou PAA sobre sua superfície.

[00310] Figura 7: Representação esquemática das reações para o acoplamento de uma nanopartícula de acordo com a invenção com estreptavidina, de acordo com o Exemplo 1;

[00311] Figura 8: Representação esquemática do acoplamento de nanopartículas acopladas com estreptavidina com um anticorpo biotinilado;

[00312] Figura 9: Representação esquemática do uso de um cortador mecânico rotativo para obter iluminação periódica, e perfil de tempo da intensidade de excitação obtida. No caso do perfil de tempo mostrado, a intensidade de excitação resultante aumenta ou diminui gradualmente devido ao tamanho de feixe finito e ao tempo necessário para a pá do cortador mecânico para expor ou ocultar o feixe de excitação inteiro;

[00313] Figura 10: Os sinais obtidos no modo de excitação de onda evanescente (TIRF) após um meio ciclo de fechamento do cortador com água pura (a), nanopartículas (3 mM de gota de concentração de íons de vanadato) em água (b) e no soro (c): sinal bruto (Figura 10-a) e sinal de luminescência na detecção atrasada (detecção restrita a 150 μs após o início do apagamento do feixe de excitação) (Figura 10-b);

[00314] Figura 11: Esquerda: modelagem da luminescência com um sistema de dois níveis. Direito: sinal médio emitido por nanopartículas (Y0,6Eu0,4VO4) depositado sobre um cursor, coletado durante 500 ciclos de abertura-fechamento (círculos) do cortador, em comparação com o seu ajuste (linha sólida), determinar a quantidade de nanopartículas. Resultados obtidos no modo de excitação HI-LO (isto é, o feixe de excitação formando um grande ângulo com a vertical sobre o suporte da amostra);

[00315] Figura 12: Representação esquemática de um dispositivo de detecção de acordo com a invenção, com detecção de emissão descendente (Figura 12-a) e detecção de emissão ascendente (Figura 12-b);

[00316] Figura 13: Representação esquemática de um dispositivo de detecção de acordo com a invenção, com o cortador de feixe de laser 4 e excitação na reflexão interna total (usando um paralelepípedo Plexiglas 13 com um índice refrativo maior ou igual ao do material que serve como suporte de amostra);

[00317] Figura 14: Curva de calibração do dispositivo de detecção de acordo com a variante 2, com cortador e com excitação de onda evanescente, seguindo o protocolo descrito no Exemplo 3.2.ii (Figura 14-a); e de acordo com a variante 3, sem cortador e sem excitação de onda evanescente, seguindo o protocolo descrito no Exemplo 3.2.ii. (Figura 14-b);

[00318] Figura 15: Detecção de insulina recombinante em solução por um kit ELISA (kit ABCAM item ab100578). O limite de detecção especificado pelo fornecedor do kit é de 9 pM (50 pg/mL);

[00319] Figura 16: Detecção de insulina recombinante em solução até concentrações de 9 fM (0,05 pg/mL) com variante 1 do dispositivo de detecção descrito no Exemplo 3 (tempo de aquisição: 30 s; leitura de sinal a cada 100 ms). No inserto, o sinal correspondente a uma concentração igual a zero foi subtraído;

[00320] Figura 17: Detecção de insulina recombinante em solução até concentrações de 9 fM (0,05 pg/mL) com variante 2 do dispositivo de detecção descrito no Exemplo 3, sem cortador e sem excitação de onda evanescente (tempo de aquisição: 1 s; leitura de sinal a cada 10 μs);

[00321] Figura 18: Detecção de insulina recombinante em solução até concentrações de 9 fM (0,05 pg/mL) com variante 2 do dispositivo de detecção descrito no Exemplo 3, com cortador e com excitação de onda evanescente (tempo de aquisição: 1 s; leitura de sinal a cada 10 μs);

[00322] Figura 19: Detecção de insulina em diferentes amostras de soro em uma placa de múltiplos poços de acordo com a variante 1 do dispositivo de detecção descrito no Exemplo 3 (tempo de aquisição: 30 s; leitura de sinal a cada 100 ms);

[00323] Figura 20: Detecção de TSH recombinante em solução até concentrações de 3,2 fM de acordo com a variante 1 do dispositivo de detecção descrito no Exemplo 3 com cortador (tempo de aquisição: 1 s; leitura de sinal a cada 10 μs);

[00324] Figura 21: Mudança no sinal de luminescência detectado de acordo com a variante 1 do dispositivo de detecção como função do tempo de incubação com conjugados de nanopartículas de anticorpos de acordo com o Exemplo 4;

[00325] Figura 22: Diagrama esquemático do princípio de multiplexação espacial;

[00326] Figura 23: Representação esquemática dos dois “pontos” de nanopartículas formados de acordo com o Exemplo 5 e o sinal de luminescência detectado para diferentes localizações;

[00327] Figura 24: Representação esquemática da detecção e quantificação de DNA/RNA usando partículas de acordo com a invenção acoplada a DNA de fita simples. O DNA de fita simples, parcialmente complementar à fita a ser detectado, é fixado sobre um suporte. Então, a amostra contendo o DNA ou RNA a ser detectado é incubada com o suporte funcionalizado (esquerdo). Após o enxágue, as partículas acopladas com DNA de fita simples, parcialmente complementares à parte não emparelhada do DNA ou RNA a ser detectado, são incubadas com o suporte (meio). Após o enxágue, somente as nanopartículas imobilizadas sobre a superfície do suporte após emparelhamento com o DNA ou RNA a ser detectado estão presentes (direito). Elas podem ser detectadas e quantificadas conforme descrito no texto.

[00328] Figura 25: Representação esquemática da detecção e quantificação de DNA/RNA usando partículas de acordo com a invenção acoplada a moléculas de estreptavidina.

[00329] (a) Esta variante de detecção/quantificação de DNA ou RNA utiliza um DNA de “reconhecimento” de fita simples acoplado a uma molécula de estreptavidina em cada extremidade a ser ligada ao suporte de detecção, o DNA ou RNA de fita simples a ser detectado e um DNA de fita simples parcialmente complementar ao DNA acoplado a uma molécula de biotina. O DNA acoplado a estreptavidina é, com sua parte não complementar ao DNA acoplado a biotina, pelo menos parcialmente complementar ao DNA a ser detectado.

[00330] (b) a superfície do suporte é passivada com PEG e funcionalizada com biotina. O DNA acoplado a estreptavidina em cada extremidade fixa-se à superfície do suporte funcionalizado. Então, após a incubação com o DNA a ser detectado, ele corresponde ao DNA imobilizado sobre a superfície do suporte. Após o enxágue, as biotinas que permanecem na superfície são passivadas com estreptavidina. A imunodetecção de DNA afixada a uma biotina é incubada com a superfície e pares com a parte complementar do DNA acoplada a duas moléculas de estreptavidina.

[00331] (c) após o enxágue, as partículas da invenção acopladas a moléculas de estreptavidina são incubadas com a superfície e se ligam ao DNA “detecção” de fita simples através da interação com biotina.

[00332] Após o enxágue, as partículas imobilizadas sobre a superfície podem ser detectadas e quantificadas conforme descrito no texto. Também é possível usar um DNA de “reconhecimento” acoplado a uma única molécula de estreptavidina em uma extremidade. Neste caso, o DNA de “reconhecimento” é afixado à superfície do suporte por apenas uma de suas duas extremidades, como na variante 1.

[00333] Figura 26: Espectros de excitação e emissão da solução de nanopartículas YVO4:Dy 3% preparadas no Exemplo 6: espectro de excitação na região de absorção direta de íons Dy3+ para detecção em X = 572 nm (Figura 26-a) e espectro de emissão para excitação em X = 278 nm correspondente à excitação da matriz de vanadato (Figura 26-b).

[00334] Figura 27: Espectros de excitação e emissão da solução de nanopartículas YVO4:Sm 3% preparado no Exemplo 7: espectro de excitação na região de absorção direta de íons Sm3+ para detecção em X = 600 nm (Figura 27-a) e espectro de emissão para excitação em X = 278 nm correspondente à excitação da matriz de vanadato (Figura 27-b).

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Preparação de partículas luminescentes 1.1 Síntese de nanopartículas Y0.6Eu0.4VO4

[00335] Metavanadato de amônio NH4VO3 é usado como uma fonte de íons VO3- de metavanadato, o ortovanadato VO43- sendo obtido in situ por reação com uma base, neste caso hidróxido de tetrametilamônio, N(CH3)4OH. Nitratos de ítrio e európio foram utilizados como fontes de íons Y3+e Eu3+.

[00336] Uma solução aquosa de 10 mL de 0,1 M NH4VO3 e 0,2 M N(CH3)4OH (solução 1) é recém preparado.

[00337] Um volume de 10 mL de outra solução de Y(NO3)3 e Eu(NO3)3 com íons 0,1 M (Y3+ + Eu3+) é adicionado gota a gota por meio de um êmbolo de seringa à solução 1 em uma vazão de 1 mL/min.

[00338] A razão de concentração molar entre Y(NO3)3 e Eu(NO3)3 é selecionada como uma função da razão desejada entre íons Y3+ e Eu3+ na nanopartícula, tipicamente, a razão molar Y3+:Eu3+ é 0,6:0,4.

[00339] Assim que a solução de Y(NO3)2/Eu(NO3)3 é adicionada, a solução se torna difusiva e aparece de forma leitosa/branca sem formação precipitada. A síntese continua até que a solução de Y(NO3)2/Eu(NO3)3 seja totalmente adicionada.

[00340] A solução final de 20 mL deve agora ser purificada para remover o excesso de contraíons. Para fazer isto, as centrifugações (normalmente três) a 11.000 g (Sigma 3K10, Bioblock Scientific) durante 80 minutos cada, seguidas pela redispersão por sonicação (Bioblock Scientific, Ultrasonic processor operando a 50% em 400 W de potência para 40 s) são utilizadas até uma condutividade estritamente abaixo de 100 μS^cm-1 ser atingida.

[00341] A condutividade é medida usando um medidor de condutividade química.

[00342] A síntese das nanopartículas Y0,6Eu0,4VO4 sobre a superfície na qual os cátions tetrametilamônio são imobilizados pode ser esquematicamente resumida como se segue:

[00343] Dois testes de síntese (“síntese 1” e “síntese 2”) são realizados fora.

Resultado

[00344] A observação visual da solução de nanopartícula de acordo com a invenção, depois de ser deixada para descansar durante 16 horas em um frasco, mostra um modo uniforme de difusão de soluções.

[00345] A solução final permanece muito estável em água, mesmo depois de vários meses no pH final da síntese (cerca de pH 5). A solução permanece estável mesmo na síntese média (antes da remoção de excesso de contraíons), que tem uma força iônico alta (> 0,1 M).

[00346] O potencial zeta das nanopartículas é determinado com um dispositivo DLS-Zeta Potential (Zetasizer Nano ZS90, Malvern). Os resultados dos potenciais zeta medidos para as nanopartículas de ambas as sínteses estão resumidos na Tabela 1 abaixo. TABELA 1

[00347] Para observações de microscopia eletrônica de transmissão (TEM), soluções diluídas de nanopartículas são depositadas sobre uma grade de carbono. As observações são feitas usando um microscópio Philips CM30 operando a 300 kV com uma resolução de 0,235 nm.

[00348] A observação das nanopartículas por TEM (Figura 3) mostra que as nanopartículas têm um formato elipsoide alongado. As dimensões das nanopartículas são determinadas a partir de imagens TEM para um conjunto de cerca de 300 nanopartículas (Figura 4). As nanopartículas da invenção têm um comprimento de eixo geométrico maior, denotado a, entre 20 e 60 nm, com um valor médio de cerca de 40 nm, e um comprimento de eixo geométrico menor, denotado b, entre 10 e 30 nm, com um valor médio de cerca de 20 nm.

[00349] As imagens de MET (Figura 3) não fazem distinção entre os planos de cristal, o que é provavelmente devido ao fato de que a nanopartícula é constituída por diversos cristalitos menores do que o tamanho da nanopartícula. A natureza predominantemente cristalina e policristalina das nanopartículas é confirmada por experimentos de difração de raios-X.

[00350] O difratograma de raios-X obtido pela utilização de um difratômetro Philips X-pert com a linha de cobre Ka(= 1,5418 Â) é mostrado na figura 5. A intensidade difratada é registrada usando um detector de área X’Celerator (PANalitical).

[00351] O comprimento de coerência em uma direção cristalográfica e assim o tamanho médio dos cristalitos constituindo a nanopartícula nesta direção cristalográfica pode ser estimado a partir da largura dos picos no difratograma de RX pela aplicação da Fórmula de Scherrer. Os valores de comprimento de coerência obtidos para as diferentes direções cristalográficas estão entre 3 e 40 nm. Uma vez que o comprimento de coerência em pelo menos uma direção cristalográfica é menor do que o tamanho da nanopartícula nessa direção, pode ser deduzido que as nanopartículas são cristalinas de forma imperfeita (policristalinidade, defeitos ou porosidade). Na direção (200) (Figura 3, pico em 2θ = 25°), o comprimento de coerência é de 10,2 nm, ligeiramente mais curto do que o comprimento de coerência para as nanopartículas no exemplo 3 (11,1 nm).

1.2. Acoplamento das nanopartículas com proteína de estreptavidina i .a. Enxerto de citrato sobre a superfície de nanopartículas

[00352] Após a síntese das nanopartículas de acordo com o Exemplo 1.1. 250 μL de partículas de Y0,6Eu0,4VO4 com uma concentração de íons de vanadato de 5 mM são removidos, a solução de nanopartículas é centrifugada a 17.000 g por 30 minutos.

[00353] O grânulo é removido e dispersado em 1 mL de uma solução de água destilada contendo íon citrato (0,2 M de concentração).

[00354] A solução é então sonicada durante 5 minutos em um banho de gelo, centrifugada a 17.000 g por 30 minutos e o grânulo é recuperado e redispersado em água destilada contendo íon citrato (concentração 0,2 M). Esta etapa é repetida três vezes.

[00355] Após este enxerto, as partículas são dispersadas em água destilada, um solvente no qual elas são estáveis.

[00356] A funcionalização das nanopartículas por citrato pode ser substituída por funcionalização por PAA (por exemplo, com um grau de polimerização entre 3 e 10.000), usando um sal de PAA, tal como um sal de sódio ou amônia.

i b. Enxerto de PAAs sobre a superfície das nanopartículas

[00357] Após a síntese das nanopartículas de acordo com o Exemplo 1.1, 500 μL de partículas de Y0,6Eu0,4VO4 com uma concentração de 10 mM são removidos e a solução de nanopartículas é centrifugada a 17.000 g por 30 minutos.

[00358] O grânulo é removido e dispersado em 1 mL de uma solução de água destilada contendo um peso molecular de 1800 Da (75 mM de concentração).

[00359] A solução é então sonicada por 5 minutos, centrifugada a 17.000 g por 30 minutos e o grânulo é recuperado e redispersado em água destilada contendo peso molecular de 1800 Da (Concentração de 75 mM). Esta etapa é repetida três vezes.

[00360] Após o enxerto, as partículas são dispersadas em água destilada, um solvente no qual elas são estáveis.

[00361] A figura 6 mostra esquematicamente as nanopartículas da invenção funcionalizadas com (a) citrato e (b) ácido poliacrilico.

ii Acoplamento de nanopartículas com estreptavidina

[00362] As nanopartículas (NPs) enxertadas com íons citrato ou PAA são centrifugadas a 16.000 g por 1 hora e o grânulo é então recuperado.

[00363] O acoplamento das nanopartículas enxertadas na superfície por citrato com estreptavidina é realizado de acordo com o seguinte protocolo: 1. Preparar de maneira fresca uma solução mista de EDC 1/Sulfo-NHS 2 (concentração de 30 mg/mL, respectivamente) em tampão MES 3 (pH 5 -6). 2. Dispersar por sonicação (banho ultrassônico) o grânulo de NPs em 250 μL da solução preparada na etapa 1. Uma vez que as perdas de centrifugação são baixas, a concentração de íons de vanadato permanece em torno de 5 mM, dando uma concentração de nanopartículas de 48 nM. (a concentração de vanadato das soluções de nanopartículas foi determinada por dissolução das partículas em um meio ácido seguida por uma determinação colorimétrica da concentração de íons de vanadato como descrito em referência [34] Abdesselem et al., ACS Nano 8, 11126-11137 (2014). A concentração molar de nanopartículas foi determinada a partir da concentração de íons de vanadato, conforme descrito na referência [35]. 3. Preparar uma solução de 100 nM de estreptavidina (SA) em tampão fosfato de pH 7,4 com 10 mM de NaCl. Diluir a solução de estreptavidina em uma concentração determinada pelo número de proteínas enxertadas por nanopartícula desejada (para uma razão de estreptavidina:NP de 1:1, 5:1 e 10:1, as concentrações de escolha de 4,8 nM, 24 nM e 48 nM, respectivamente). Preferivelmente, escolher uma razão de pelo menos 20:1, isto é, uma concentração de SA de 96 nM. Adicionar 250 μL desta solução à solução de nanopartículas. 4. Permitir incubar por 2-4 horas em temperatura ambiente com agitação. 5. Adicionar 1 mL de PBST 4 e vórtice. 6. Centrifugar a 17.000 g durante 30 minutos e recuperar o grânulo para remover proteínas de não NP acopladas. Remover completamente o sobrenadante. Redispersar as NPs acopladas com proteína em 1 mL de PBST e sonicar em um banho ultrassônico. Repetir essa etapa duas vezes. 7. Recuperar NPs acopladas com proteína em 250 μL de PBS 5 com 1% de BSA6. 8. Armazenar em 4°C para uso imediato ou alíquota e armazenar em -80°C.

[00364] O acoplamento de nanopartículas com estreptavidina é mostrado esquematicamente na Figura 7.

[00365] Equipamento usado para teste funcional: 1 Cloridrato de N-(3-Dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC) (Sigma, cat # E1769). 2 Sal de sódio de N-Hidroxisulfosuccinimida (Sulfo-NHS) (Sigma, cat# 56485). 3 ácido 2-(N-Morfolino)etanossulfônico (MES) (10 mM, pH 56). 4 Solução salina tamponada com fosfato de pH 7,4 (10 mM NaCl) + 0,05% Tween 20 (PBST). 5 Albumina de soro bovino (BSA) (Sigma, cat # A3059). 6 Solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,4, 10 mM NaCl).

[00366] O número de moléculas de estreptavidina (SA) por nanopartícula (NP), denotado R, distinguido pelo término do protocolo de acoplamento, é determinado pela determinação da estreptavidina pelo método chamado de BCA, de acordo com o protocolo detalhado acima.

Protocolo para a caracterização da relação de estreptavidina:nanopartículas (SA:NP) i. Determinação de SA pelo método de BCA Princípio

[00367] Em um meio alcalino, as proteínas reduzem Cu2+ para Cu. O sal de ácido bicinconínico (BCA) forma um complexo colorido com íons Cu2+. Este complexo é quantificável devido à sua absorção a 562 nm.

Procedimento

[00368] Kit de teste de BCA da ThermoFisher (Pierce ™ BCA Kit de Ensaio de Proteína BCA No. 23225) - Preparação do reagente de teste de Cu2+/BCA de acordo com o protocolo do kit ThermoFisher. - Preparação de SA para a curva de calibração. Para a curva de calibração, o teste é realizado três vezes. TABELA 2: Concentração de estreptavidina das soluções de calibração

[00369] O procedimento é como o seguinte: - Tomar uma placa de 96 poços. Colocar 25 μL de cada tubo do padrão A-I (de concentração conhecida de SA) ou proteínas conjugadas de nanopartículas a serem ensaiadas nos poços correspondentes. - Adicionar 200 μL do reagente de teste de Cu2+/BCA em cada poço. Homogeneizar, tampar e incubar por 30 minutos a 37°C. - Ler as absorbâncias (A) a 562 nm em função da concentração final levando em conta a diluição. Estabelecer a relação de calibração A = f (concentração de SA em μg/mL) por regressão linear.

[00370] A concentração das proteínas conjugadas às nanopartículas a serem ensaiadas é deduzida a partir da equação de regressão linear obtida a partir da curva de calibração.

ii. Caracterização da razão SA:NP

[00371] A concentração de massa de estreptavidina obtida com o teste de BCA é convertida em uma concentração molar usando a seguinte fórmula:

[00372] Para obter a razão (R) do número de SA:NPs finalmente aplicamos a seguinte equação:

[00373] A Tabela 3 abaixo resume os valores obtidos para as diferentes razões de concentração entre a solução de estreptavidina e a solução de nanopartículas de partida. Tabela 3: Caracterização de acoplamento de nanopartículas-estreptavidina para diferentes razões de concentração entre solução de estreptavidina e solução de nanopartículas.

[00374] Como pode ser visto a partir dos resultados apresentados na Tabela 3, o número de moléculas de estreptavidina por nanopartícula após o acoplamento é da mesma ordem que a razão de concentração nas soluções iniciais, indicando assim uma eficiência de acoplamento muito boa.

1.3. Acoplamento de nanopartículas acopladas a estreptavidina (Nanopartículas-SA) com anticorpos biotinilados

[00375] As nanopartículas acopladas a estreptavidina são então acopladas a um anticorpo biotinilado, específico para a substância a ser ensaiada (insulina ou hormônio estimulante da tiroide (TSH)), conforme mostrado esquematicamente na figura 8.

[00376] O protocolo de acoplamento é o seguinte.

[00377] Entre 10 e 50 μg/mL de anticorpos biotinilados são colocados em contato com as nanopartículas-SA em excesso por 1 h, usando-se uma roda rotativa para promover a difusão e a interação entre biotina e estreptavidina. A concentração de anticorpos é selecionada de modo que tenha 3 anticorpos por NP. Assim, é determinado que todos os anticorpos se ligarão às nanopartículas-SA e não há necessidade de uma etapa para remover anticorpos não ligados. A concentração de anticorpos é, portanto, três vezes maior do que a concentração de nanopartículas.

[00378] Alternativamente, também é possível acoplar diretamente anticorpos a nanopartículas enxertadas com íons citrato. Neste caso, o mesmo protocolo acima deve ser usado pela substituição da solução de estreptavidina com uma solução de anticorpos.

1.4. Método alternativo de acoplamento através de acoplamento direto de nanopartículas com anticorpos

[00379] De acordo com um método alternativo, o acoplamento das nanopartículas com os anticorpos não biotinilados pode ser realizado diretamente através do acoplamento dos anticorpos a nanopartículas funcionalizadas com APTES (transformação dos grupos amino em grupos carboxila, ativação dos grupos carboxila e reação direta com os grupos amino na superfície dos anticorpos), de acordo com o seguinte protocolo detalhado.

1.4.1. Nanopartículas de revestimento com uma camada de sílica

[00380] Após a síntese das nanopartículas na etapa 1.1, a solução de nanopartículas é centrifugada a 17.000 g por 3 minutos para precipitar quaisquer agregados de nanopartículas e o sobrenadante é recuperado. Uma seleção de tamanho é feita. Para realizar isto, várias centrifugações a 1900 g por 3 minutos são realizadas. Cada centrifugação é seguida por uma redispersão das nanopartículas no sonicador, após isso o tamanho das nanopartículas é determinado usando-se um dispositivo de DLS-Zeta Potential (Zetasizer Nano ZS90, Malvern).

[00381] Um volume de 25 mL de partículas de Y0,6Eu0,4VO4 com uma concentração de íons de vanadato de 20 mM é preparado. Um volume de 2,5 mL de outra solução pura de silicato de sódio (Merck Millipore 1.05621.2500) é adicionado gota a gota com uma pipeta para revestir a superfície das partículas. Nós permitimos que esta solução trabalhe sob agitação por pelo menos 5 horas.

[00382] A solução é então purificada para remover os contraíons de silicato e sódio em excesso. A solução é centrifugada a 11.000 g (Sigma 3K10, Bioblock Scientific) por 60 minutos e então redispersada por sonicação (Bioblock Scientific, Ultrasonic processor, funcionando a 50% em 400W). Esta etapa é repetida até que a condutividade da solução esteja abaixo de 100 μs/cm.

1.4.2. Enxerto de aminas sobre a superfície das nanopartículas

[00383] Em um frasco de fundo redondo de gargalo triplo de 500 mL, colocar 225 mL de etanol absoluto e adicionar 265 μL de 3- aminopropiltrietoxisilano (APTES) (Pm 221,37 g/mol Sigma Aldrich), que corresponde a uma concentração final de 1,125 mM. Esta quantidade corresponde a 5 equivalentes de vanadato que são introduzidos. Um refrigerante é então conectado ao frasco de fundo redondo. O conjunto é colocado sobre um aquecedor de fundo redondo e colocado sob uma coifa. A mistura é refluxada a 90°C. Uma solução coloidal de nanopartículas (concentração de íons de vanadato [V] = 3 mM) em 75 mL de água em pH 9 é adicionada gota a gota a uma das entradas do frasco de três gargalos por meio de uma bomba peristáltica a uma vazão de 1 mL/min. O conjunto é aquecido sob agitação por 24 horas.

[00384] Após 48 horas, utilizamos um evaporador rotativo (rotavapor R-100, BUCHI) para concentrar parcialmente as nanopartículas. A solução é girada em um frasco de fundo redondo adequado e aquecida em um banho a 50°C

[00385] A solução recuperada é purificada por várias centrifugações em um solvente de etanol:água (3:1). Após a purificação, uma classificação de tamanho é realizada seguindo o protocolo descrito acima.

1.4.3 Enxerto de carboxila à superfície de nanopartículas aminadas

[00386] Antes de iniciar o enxerto, uma transferência de solvente é realizada.

[00387] O protocolo de enxerto é como o seguinte.

[00388] Transferir os NPs aminados de tampão de EtOH:H2O para DMF ou DMSO pela realização de várias centrifugações (13.000 g, 90 minutos). O grânulo é redispersado por sonicação entre cada centrifugação (20 s a 75%). Medir e determinar a concentração de NPs.

[00389] Recuperar os NPs em 5 mL de DMF e então adicionar 10% do anidrido de ácido succínico a um béquer de vidro (isto é, 0,5 g no 5 mL). Permitir a reação de pelo menos um dia para o outro em uma atmosfera inerte enquanto se agita.

[00390] Lavar os NPs carboxilados pelo menos duas vezes por centrifugação (13.000 g por 60 minutos, Legend Micro 17R, Thermo Scientific) para remover DMF e anidrido de ácido succínico em excesso.

[00391] Ressuspender as partículas carboxiladas em água ou tampão MES de pH 6 por sonicação (Bioblock Scientific, Ultrasonic processor).

1.4.4 Acoplamento direto de nanopartículas com anticorpos

[00392] O acoplamento das nanopartículas enxertadas na superfície com COOH é realizado de acordo com o protocolo abaixo: i) preparar de maneira fresca uma solução misturada de EDC/Sulfo-NHS (concentração 500 e 500 mg/mL, respectivamente) no tampão MES (pH 5 -6). ii) em 3 mL da solução previamente preparada, adicionar 90 nM de NPs (neste caso a concentração de nanopartículas calculada a partir da concentração de íons de vanadato de acordo com a referência Casanova et al. [37]) e permitir reagir durante 25 minutos em temperatura ambiente com agitação. iii) lavar rapidamente as NPs por pelo menos 2 centrifugações (13.000 g por 60 minutos, Legend Micro 17R, Thermo Scientific) com água Milli-Q para remover reagentes em excesso. iv) recuperar o último grânulo após sonicação em tampão fosfato de sódio de pH 7,3. Adicionar a quantidade de anticorpo necessária de acordo com a razão desejada (proteína:NPs), tipicamente 2 μM para uma relação de 20:1. v) permitir que esta solução reaja por 2 a 4 horas em temperatura ambiente enquanto se agita. vi) adicionar o agente de bloqueio (1% de glicina) para reagir com os COOHs livres e bloquear os sítios de reação residuais sobre a superfície dos NPs. Permitir a reação por 30 minutos. vii) lavar as NPs acopladas a proteína várias vezes por centrifugação usando-se filtros centrífugos (Amicon Ultra 0.5 mL, item UFC501096, Millipore) com PBS de pH 7,2. Transferir as NPs para seu meio de armazenamento: tampão de fosfato + Tween 20 (0,05%) + 0,1% de glicina + 10% de glicerol. Coletar 100 μL para teste de BCA. O restante da solução é aliquotado e congelado a -80°C.

[00393] As partículas luminescentes assim preparadas de acordo com qualquer um dos métodos acima mencionados, compreendendo nanopartículas fotoluminescentes Y0,6Eu0,4VO4 acopladas a um anticorpo alvejante para a substância a ser analisada (NPs-Ab), podem ser usadas para detectar e/ou quantificar a referida substância em uma amostra biológica.

EXEMPLO 2 Preparação do suporte sobre a superfície da qual é imobilizada a substância a ser analisada 1. Preparação do suporte do tipo lâmina de vidro

[00394] Em uma primeira etapa, um suporte é preparado consistindo em lâminas de vidro cuja superfície é previamente limpa, passivada e funcionalizada com anticorpos biotinilados (anticorpos de captura).

[00395] O protocolo para limpeza, passivação e funcionalização das lâminas de vidro é como o seguinte. A funcionalização pode ser feita por impressão ou por deposição de gotas usando-se um spotter.

Limpeza das lâminas

[00396] - Lavar as lâminas em água deionizada com 4% de detergente Hellmanex II (Hellma) em um tanque ultrassônico aquecido a 40 -50°C por 15 minutos.

[00397] - Enxaguar as lâminas com água deionizada em um tanque ultrassônico aquecido a 40 -50°C por 15 minutos.

[00398] - Enxaguar com etanol absoluto em um tanque ultrassônico aquecido a 40 -50°C por 15 minutos.

[00399] - Secar uma corrente de N2 ou sob uma coifa de extração por 10-15 minutos.

[00400] - Logo antes da superfície do vidro ser funcionalizada, limpar os cursores um por um em um purificador de Plasma (Harrick Plasma, modelo PDC-002) durante 2 minutos em intensidade média.

Passivação das lâminas

[00401] A molécula de passivação usada é um silano-polietileno glicol (PEG) com PEG de 10 kDa, comercializado pela Laysanbio sob o item número M-SIL-5K.

[00402] A passivação somente envolve um estágio de silanização do vidro. Quanto mais longo o PEG, melhor será a passivação resultante.

[00403] O protocolo de passivação é como o seguinte: - dissolver PEG em 10 mg/mL em etanol absoluto (EtOHAbs, concentração molar de 2 mM ou 1 mM dependendo do tamanho do PEG, respectivamente 5 kDa ou 10 kDa). Para dissolver os PEGs mais longos a 10 mg/mL, pode ser necessário aquecer os mesmos por alguns minutos a 40°C. - alguns segundos antes do uso, adicionar nesta solução um pouco de H2O e ácido acético (AcAc) para ter as razões v/v/v: EtOHAbs/ H2O / AcAc: 95/5/0,2. - No fundo de um prato de estanque ao ar, colocar um quadrado de parafilme, depois colocar uma gota de ~ 30 μL da solução preparada acima no topo e, em seguida, a lâmina de vidro (do limpador de plasma) para tomar a gota como sanduíche. Coloque um pequeno reservatório de etanol no prato hermeticamente vedado para saturar o ar com etanol e para que os 30 μL não sequem. Deixar incubar durante a noite. - Enxaguar com água deionizada, então secar em uma corrente de nitrogênio. Finalmente, colocar as tiras em placa quente a 110°C por 5 minutos.

Funcionalização das lâminas por incubação durante a noite

[00404] O protocolo para a funcionalização das lâminas previamente passivadas com anticorpos biotinilados é como o seguinte. Este é o protocolo usado para os resultados mostrados nas figuras.

[00405] Incubar a lâmina em uma solução contendo os anticorpos de captura durante a noite a 4°C. A solução de anticorpo contém 10-25 μg/mL de anticorpos em uma solução de PBS a pH 7,4 ou tampão de carbonato em pH 9 de acordo com as instruções do fornecedor.

[00406] Alternativamente, os seguintes dois protocolos podem ser usados:

Funcionalização por impressão de estreptavidina e anticorpos biotinilados

[00407] - Cortar um emplastro de PDMS (polidimetilsiloxano) com dimensões correspondentes à superfície que deve ser funcionalizada.

[00408] - Colocar o emplastro sobre uma superfície plana. Incubar no emplastro ~15-30 μL de estreptavidina a 20 μg/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 1 minuto.

[00409] - Enxaguar imediatamente com H2O (usando uma garrafa de lavagem) e passar sob uma corrente de N2 (10 segundos).

[00410] - Virar o emplastro sobre e colocar sua superfície com tinta sobre a lâmina durante 1 minuto.

[00411] - Remover o emplastro, sendo cuidado para não arrastá-lo através da superfície.

[00412] - Após a funcionalização da lâmina de vidro com estreptavidina, incubar a quantidade necessária (1 -10 μg/mL em tampão de bicarbonato de pH 7,4) de anticorpos biotinilados por 2 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C.

[00413] - Remover a solução de incubação de anticorpos e lavar com 100 μL de tampão de PBS 3 vezes.

[00414] - Adicionar 100 μL de BSA 5% p/v (5 g em 100 mL) de PBS e incubar durante 1 hora.

Funcionalidade por Spotter

[00415] A funcionalização do spotter é realizada com o dispositivo SPRi-Arrayer da Horiba de acordo com o protocolo do fornecedor usando uma agulha de 500 μm de diâmetro para depositar gotas contendo os anticorpos (1 -10 μg/mL em tampão de bicarbonato pH 7,4).

ii. Imobilização da substância a ser analisada das amostras sobre a superfície do suporte

[00416] O protocolo é como o seguinte: - Adicionar as amostras a serem submetidas ao ensaio (solução de insulina, insulina em solução de soro ou TSH) a cada poço e incubar por 2 horas. Este tempo é o mesmo que o indicado para as ELISAs convencionais correspondentes. - Após 2 horas de incubação, remover a solução e lavar com 100 μL de tampão de lavagem (0,2% PBS 2X Tween 20) 3 vezes.

EXEMPLO 3 Detecção e quantificação ultrassensitiva 3.1 Associação de partículas luminescentes com a substância a ser analisada

[00417] O protocolo é como o seguinte: - adicionar as nanopartículas acopladas aos anticorpos biotinilados preparados como descrito no exemplo 1 e incubar durante 1 hora. O tempo de incubação necessário para maximizar o sinal durante a medição da luminescência pode ser determinado com antecedência, conforme descrito no exemplo 4. - após 1 hora de incubação, remover a solução e lavar com 100 μL de tampão de lavagem (0,2% PBS 2X Tween 20) 4 vezes. - adicionar 100 μL de PBS e realizar a medição de luminescência como descrito abaixo.

3.2 Medição de luminescência i. Arranjo experimental para medição de luminescência

[00418] O arranjo de detecção é como o seguinte. Ele é mostrado esquematicamente nas Figuras 2 e Figuras 12 e 13.

[00419] O dispositivo de detecção consiste em uma fonte de laser de 1 W (1) com um comprimento de onda de 465 nm (ML-6500-465, Modulight ou F465-HS-1W, Laser2000), um sistema de redução de tamanho de feixe de colimação e feixe de laser (2) consistindo em duas lentes (duas lentes biconvexas de 01/2" de f = 100 mm e f = 30 mm (Thorlabs)), opcionalmente um cortador mecânico (4) (MC2000B-EC, Thorlabs), um suporte de lâmina (6) para as amostras e um sistema de detecção para os fótons emitidos.

[00420] Para coletar a emissão de luminescência pelas nanopartículas na amostra, uma lente de alta abertura numérica (10) (Lente biconvexa, 0 = 50,8 mm, f = 100 Mm (Thorlabs)) e dois filtros de interferência 620 ± 14 -25 (FF01-620/14-25, Semrock) para eliminar de forma espectral os sinais de interferência e um fotomultiplicador (12) (PMM02, Thorlabs) são usados.

[00421] Um conversor analógico para digital (NI9215, National Instrument) permite que o sinal seja gravado usando um software LabVIEW.

[00422] Todos os elementos de detecção estão localizados no mesmo eixo geométrico. Assim, a arranjo é tanto mais ergonômico quanto mais fácil de ajustar. Um sistema de translação do suporte de lâmina (Z8253, KCH301 Thorlabs) foi implementado A fim de ser capaz de observar diversas amostras biológicas sucessivamente por varredura.

Detecção resolvida no tempo para medir o número de nanopartículas na presença de sinais interferentes

[00423] Um cortador mecânico pode ser colocado no trajeto do feixe de laser para criar fendas de excitação A laser para eliminar sinais de interferência. De fato, durante a iluminação da amostra biológica pelo feixe de laser, é possível que moléculas diferentes das nanopartículas de interesse emitem fluorescência. O uso de um cortador mecânico e uma frequência de detecção de sinal de 100 kHz pelo fotomultiplicador (aquisição de sinal a cada 10 μs) torna possível evitar esta fluorescência de interferência.

[00424] Assim, é possível, devido ao longo tempo de emissão pelas partículas da invenção, fazer uma detecção resolvida no tempo da emissão, em particular uma detecção retardada da emissão, conforme descrito em detalhes abaixo.

[00425] Uma iluminação modulada no tempo permite limitar A contribuição para o sinal de luminescência de espécies interferentes presentes na amostra (soro, sangue, etc) ou nos substratos sólidos usados (vidro, plástico, etc). De fato, as nanopartículas usadas (YVO4:Eu ou GdVO4:Eu, por exemplo) podem ser colocadas (por iluminação a 465 nm) em um estado excitado com um longo tempo de vida, da ordem de umas poucas centenas de μs, em comparação com o tempo de vida dos fluoróforos usuais, que estão na faixa de nanossegundos. Isto permite a separação temporal dos sinais de luminescência de interferência do sinal emitido pelas nanopartículas.

[00426] A modulação pode ser implementada pelo uso de um cortador mecânico rotativo, a fim de obter iluminação periódica em frequências entre 100 e 1000 Hz. A Figura 9 mostra esquematicamente o perfil de tempo de iluminação obtido pelo corte mecânico do laser de excitação.

[00427] O sinal modulado obtido é a alternação de uma fase de declínio (fechamento do cortador) e uma fase de retorno de luminescência (abertura do cortador) de todos os emissores presentes na amostra. O declínio/retorno do sinal de luminescência é determinado por dois parâmetros separados: (i) a vida útil dos estados excitados dos emissores, e (ii) a dinâmica de ocultação/não cobertura do feixe do excitador pelo cortador mecânico. A figura 10-a mostra exemplos de declínio de luminescência após a iniciação do fechamento do cortador (t = 0). A análise de pós-processamento digital do sinal permite que o sinal, devido às nanopartículas, seja isolado, por exemplo, pelos dois métodos a seguir.

Método 1: Detecção atrasada.

[00428] Na fase de declínio de luminescência, a contribuição dos emissores de interferência é concentrada em tempos curtos, quando o feixe de excitação ainda não está completamente ocluído (Figura 10-a). Ao se remover esta parte (Figura 10-b, a detecção restrita a 170 μs após o início da ocultação do feixe de excitação pela pá do cortador), é obtido um sinal devido exclusivamente às nanopartículas (superposição das curvas (b) e (c), a contribuição da fluorescência interferente do cursor, do soro e da água é eliminada), o que assim permite a estimativa de seu número, apesar da presença de outros emissores.

Método 2: Detecção resolvida no tempo

[00429] A luminescência das nanopartículas e dos fluoróforos interferentes pode ser modelada por um sistema de dois níveis (Figura 11). Neste caso, a forma do sinal de luminescência PL (t) pode ser determinada a partir das características dos transmissores: onde I(t) é o perfil de tempo de excitação; N é o número total de emissores de um tipo e N * é o número de emissores no estado excitado; k sua taxa de desexcitação; Φ sua eficiência quântica; resolvendo numericamente o sistema de equações diferenciais resultantes do modelo.

[00430] O sinal total pode então ser escrito, onde NP e F denotam nanopartículas e fluoróforos interferentes, respectivamente, e BG denota o sinal de fundo.

[00431] O ajuste do sinal registrado por esta função, então, torna possível determinar os vários parâmetros, notavelmente NNP e kNP (Figura 11). Ele é robusto, como kNP << kF. A determinação do número de nanopartículas que aderem à superfície de NNP é então realizada sem ambiguidade, a despeito da presença de emissores de interferência na amostra contribuindo para o sinal bruto. Na prática, a cinética de mascaramento mecânico de iluminação nas frequências usadas (100 -1000 Hz) é significativamente mais lenta do que o declínio de fluorescência de emissores de interferência kF ~ 109 s-1, de modo que

[00432] A medição de NNP é então realizada pelo seguinte método: (i) determinação experimental do perfil de tempo de iluminação i (t)/i (0) medindo a autofluorescência de uma amostra de calibração sem nanopartículas; (ii) medição do sinal de luminescência da amostra alvo; e (iii) ajuste não linear (método de mínimos quadrados) deste sinal por uma função . . Este ajuste permite a identificação dos parâmetros M, kNP e ΦNPNN para dentro de um fator multiplicativo instrumental: este último parâmetro então indica, para condições de detecção fixas, o número de nanopartículas depositadas sobre a superfície.

Variantes do arranjo experimental

[00433] As nanopartículas são excitadas: . tanto pelo uso de um alto ângulo de incidência (ângulo entre a direção de propagação do feixe de laser e a vertical para o suporte de amostra) entre 60° e 63° (conforme mostrado esquematicamente na Figura 12), . quanto pelo uso de um arranjo de iluminação do tipo de fluorescência de reflexão interna (TIRF), em particular, usando-se um Paralelepípedo Plexiglas 13 com um índice refrativo maior ou igual ao da lâmina de vidro servindo como suporte de amostra (conforme mostrado esquematicamente na figura 13). Esta configuração proporciona um ângulo de incidência na interface vidro/água ou de vidro/soro maior do que 61,04°, resultando em reflexão total do feixe nesta interface e excitação de onda evanescente das nanopartículas ancoradas à substância a ser analisada.

[00434] Três variantes do arranjo experimental foram usadas.

[00435] Variante 1: Detecção refletida (para baixo) sem corte (exceto onde especificado) e sem excitação de onda evanescente (Figure.12-a). Na maioria dos casos, o tempo de aquisição é fixado a 30 s com um valor de tensão registrado a cada 100 ms. O diâmetro da lente de coleta é de 30 mm em vez de 50,8 mm.

[00436] Variante 2: Detecção de transmissão (para cima) (Figura 12b). As medições podem ser feitas com ou sem um corte e com ou sem excitação de onda evanescente. O tempo de aquisição é fixado a 1 s com um valor de tensão registrado a cada 10 μs. Esta variante inclui o sistema de translação de suporte de pá (Z8253, KCH301 Thorlabs).

[00437] Variante 3: Montagem transportável com detecção de transmissão (para baixo). As medições podem ser feitas com ou sem um corte e com ou sem excitação de onda evanescente. O tempo de aquisição é fixado a 1 s com um valor de tensão registrado a cada 10 μs.

[00438] Para cada concentração de amostra ser detectada, várias medições (N medições, N maiores ou iguais a 5) em diferentes posições da lâmina são realizadas. Cada medição é a média de 100.000 valores registrados para 1 s com uma taxa de aquisição de 100 kHz (valor de voltagem 1 registrado a cada 10 μs) exceto no caso de variante 1 do arranjo experimental onde o tempo de aquisição foi de 30 s com um valor de voltagem registrado a cada 100 ms.

[00439] O valor de sinal indicado nos gráficos e sua barra de erro corresponde, respectivamente, à média das N medições e seu desvio padrão. Na maioria dos casos, o valor de sinal para uma concentração da molécula a ser detectada igual a zero foi subtraído de todos os valores medidos para as diferentes concentrações. Assim, o valor de sinal para uma concentração igual a zero, aparece em zero. Entretanto, o desvio padrão indicado é uma medida da capacidade de detectar uma determinada concentração. Tipicamente, considera-se que o limite de detecção é determinado pela concentração que gera um sinal igual a 3 vezes o desvio padrão do sinal obtido em concentração zero (em branco). O limite de quantificação é determinado pela concentração que gera um sinal 10 vezes maior do que este desvio padrão em concentração zero.

[00440] Para experimentos realizados com excitação de onda evanescente, é preferível uma coleta da luminescência de cima. De fato, a emissão de luminescência pela amostra para baixo é refratada em direção a ângulos largos pelo paralelepípedo de Plexiglas e, como resultado, uma fração menor é coletada pela lente de coleta na presença do paralelepípedo, permitindo que a excitação da onda evanescente ocorra.

ii. Calibração do dispositivo de detecção

[00441] Antes das medições, o dispositivo de detecção foi calibrado com nanopartículas em solução, de acordo com as variantes 2 (detecção ascendente com corte e com excitação de onda evanescente) e 3 (detecção descendente, sem corte e sem excitação de onda evanescente).

[00442] O protocolo de calibração é como o seguinte:

[00443] As lâminas de vidro são ativadas antecipadamente com o limpador de plasma. - depositar uma solução de nanopartículas diluídas em PBS de concentração conhecida sobre a lâmina de vidro; - incubar por 2 horas; - enxaguar pelo menos três vezes com água ultra pura.

[00444] O tempo de aquisição é fixado a 1 s com um valor de tensão registrado a cada 10 μs.

[00445] As curvas de calibração do dispositivo de detecção obtido a partir das duas variantes são mostradas nas Figuras 14-a e 14-b.

iii. Resultados de testes de detecção/quantificação Detecção e quantificação de uma substância em uma amostra

[00446] A concentração de uma substância em uma amostra é detectável quando o sinal obtido é pelo menos três vezes maior do que o desvio padrão do sinal para uma amostra da mesma composição contendo concentração zero da substância.

[00447] A fim de realizar a quantificação da substância a ser analisada (isto é, para determinar sua concentração), o seguinte protocolo deve ser implementado: i) realizar uma série de medições de calibração com a substância a ser analisada em diferentes concentrações conhecidas, por exemplo, de substâncias comercialmente disponíveis ou de purificação. Se possível, as amostras de calibração devem ser preparadas com a mesma ou tão próximas quanto possível da composição das amostras a serem medidas. Fazer um ajuste dos pontos obtidos (sinal em mV versus concentração da substância a ser analisada); ii) realizar medições das amostras a serem analisadas (obtendo-se o valor de sinal em mV); iii) atribuir a cada amostra medida um valor de concentração da substância do sinal medido (em mV) e da curva de calibração realizada na etapa i) e seu ajuste.

[00448] A concentração de uma substância em uma amostra é quantificável quando o sinal obtido é pelo menos 10 vezes maior do que o desvio padrão do sinal para uma amostra da mesma composição contendo concentração zero da substância.

Detecção de insulina

[00449] As amostras analisadas são tanto soluções de insulina recombinante em PBS + 5% de BSA quanto insulina em soro (amostras providas por Cerba Specimen Services com concentrações de insulina previamente determinadas por técnicas de referência).

[00450] Para amostras de insulina recombinantes em solução em PBS + 5% de BSA, a insulina recombinante provida pelo kit ELISA para as experiências de calibração associadas foi usada. As várias amostras foram preparadas por diluições sucessivas de acordo com o protocolo indicado pelo fornecedor do kit.

[00451] Para amostras de insulina de soro, as soluções foram usadas como para as concentrações mais altas. Como amostras de concentração muito baixa não estavam disponíveis, elas foram preparadas por diluição das amostras contendo as concentrações mais baixas disponíveis em PBS + 5% BSA.

Detecção por ELISA

[00452] Para comparação, a detecção de insulina recombinante foi realizada em solução por um kit ELISA em uma placa de 96 poços. As condições experimentais seguidas são aquelas indicadas pelo fornecedor do kit ELISA. A absorbância do poço que não foi incubada com insulina (concentração zero) foi subtraída dos valores de absorbância medidos para os poços que foram incubados com diferentes concentrações de insulina. Dois poços foram usados para cada valor de concentração e o desvio padrão para essas duas medições é mostrado como a barra de erro na Figura 15. A concentração mais baixa medida é de 187 pg/mL (ou 33 pM). O desvio padrão para concentração zero é de 0,0035. O valor de absorbância medido para a concentração de 187 pg/mL (ou 33 pM) é de 0,0085, logo abaixo do valor limite de 0,0105 igual a 3 vezes o desvio padrão determinado para concentração zero. De acordo com as especificações do fornecedor (item ABCAM ab100578), a detecção por um kit ELISA convencional não detectará concentrações abaixo de 50 pg/mL (ou 9 pM) (figura 15).

Detecção ultrassónica de acordo com a invenção

[00453] A Figura 16 mostra o sinal obtido para amostras de insulina recombinante em solução para diferentes concentrações, com a concentração mais baixa sendo de 0,05 pg/mL (ou 9 fM), com a variante 1 do dispositivo de detecção. O tempo de aquisição é de 30 segundos, com um valor de tensão registrado a cada 100 ms.

[00454] Na inserção na Figura 16, o sinal sem insulina foi subtraído.

[00455] A concentração detectável mínima é assim 1.000 vezes menor que a concentração detectável por ELISA (50 pg/mL ou 9 pM) usando os mesmos anticorpos que o kit ELISA.

[00456] A Figura 17 mostra o sinal obtido para amostras de insulina recombinante em solução para diferentes concentrações, com a concentração mais baixa sendo de 0,05 pg/mL (ou 9 fM), com a variante 2 do dispositivo de detecção (detecção de topo), sem corte e sem excitação de onda evanescente. O tempo de aquisição é de 1 segundo, com um valor de tensão registrado a cada 10 μs.

[00457] A concentração mínima detectada é assim 1.000 vezes menor que a concentração detectável por ELISA (50 pg/mL ou 9 pM) usando os mesmos anticorpos que o kit ELISA.

[00458] A Figura 18 mostra o sinal obtido para amostras de insulina recombinante em solução para diferentes concentrações, com a concentração mais baixa sendo de 0,05 pg/mL (ou 9 fM), com a variante 2 do dispositivo de detecção (detecção de topo), com corte e com excitação de onda evanescente. O tempo de aquisição é de 1 segundo, com um valor de tensão registrado a cada 10 μs.

[00459] A concentração mínima detectada é assim 1.000 vezes menor que a concentração detectável por ELISA (50 pg/mL ou 9 pM) usando os mesmos anticorpos que o kit ELISA.

[00460] A Figura 19 mostra o sinal obtido para amostras de soro contendo insulina (amostras providas pelos Serviços de Espécime CERBA e diluídas em PBS + 5% de BSA para as concentrações mais baixas). Para se obter as amostras de concentração mais baixa, a amostra contendo insulina em aproximadamente 8 pM foi diluída em uma placa de múltiplos poços IBIDI com variante 1 do dispositivo de detecção.

[00461] O tempo de aquisição é de 30 segundos, com um valor de tensão registrado a cada 100 ms.

[00462] A concentração mínima detectada é 9 fM (ou 0,05 pg/mL), 1.000 vezes mais baixa que a concentração detectável por ELISA (50 pg/mL ou 9 pM) usando os mesmos anticorpos que o kit ELISA.

Detecção de TSH

[00463] As amostras analisadas são soluções de TSH recombinante com um peso molecular de 15.639 Da em PBS + 5% de BSA. Os anticorpos usados são aqueles do kit ABCAM do item ab 100660.

Detecção ultrassensível de acordo com a invenção

[00464] A figura 20 mostra o sinal obtido para amostras de TSH recombinantes em solução para diferentes concentrações, com a concentração mais baixa sendo 3,2 fM (1,4 fg/mL), usando a variante 1 do dispositivo de detecção com corte. O tempo de aquisição é de 1 segundo, com um valor de tensão registrado a cada 10 μs.

[00465] Em comparação, a concentração mínima que pode ser detectada pelo kit ELISA é tipicamente menor do que 4 pg/mL de acordo com o fornecedor. Assim, a concentração mínima detectada de acordo com a invenção é mais do que 1.000 vezes menor que a concentração detectável pelo kit ELISA.

EXEMPLO 4 Ajuste do tempo de incubação

[00466] O tempo de incubação necessário para maximizar o sinal no caso da detecção de insulina recombinante em solução (50 pg/mL de insulina) pode ser determinado anteriormente por medições de luminescência obtidas para diferentes tempos de incubação entre suportes de amostra com a substância a ser analisada (aqui insulina recombinante) imobilizada sobre suas superfícies (imobilização realizada de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 2ii) e conjugados de nanopartícula de anticorpo (obtidos de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 1 com 10 μg/mL de anticorpo), etapa realizada de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 3.

[00467] As medições foram feitas com a variante 1 do dispositivo de detecção descrito no Exemplo 3. O tempo de aquisição é de 30 segundos, com um valor de voltagem registrado a cada 100 ms.

[00468] A Figura 21 mostra a mudança no sinal de luminescência detectado em função do tempo de incubação.

[00469] Parece necessário incubar as nanopartículas acopladas com anticorpos com a superfície sobre a qual a substância a ser analisada (neste caso insulina recombinante) é imobilizada por pelo menos 45 minutos para maximizar o sinal de luminescência detectado. Este tempo necessário pode variar dependendo da substância a ser analisada e do anticorpo usado.

EXEMPLO 5 Experimento de multiplexação espacial

[00470] Para ilustrar a possibilidade de realizar a detecção multiplexada de acordo com o processo da invenção (diagrama esquemático de multiplexação espacial mostrado na Figura 22), o experimento a seguir foi realizado.

[00471] Duas áreas ou “pontos” contendo nanopartículas foram criadas pela deposição de duas gotas de duas soluções de nanopartículas obtidas de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 1 (parte 1.1, nanopartículas como obtidas após a síntese) de duas concentrações diferentes (4 mM e 8 mM) sobre lâminas de vidro limpas de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 2. Aqui, as gotas contendo as nanopartículas foram deixadas para secar antes das medições de luminescência começarem, sem uma etapa de enxágue.

[00472] O diagrama na Figura 23 mostra o diâmetro do feixe de laser no nível de amostra de acordo com a direção de deslocamento (3 mm), o diâmetro (2 mm) e a distância entre os dois “pontos” de varredura (1 mm).

[00473] As medições são realizadas com a variante 2 do arranjo experimental descrito no Exemplo 3 (detecção ascendente, com corte e sem excitação de onda evanescente). Graças ao sistema de deslocamento motorizado do suporte de amostra, o sinal emitido pelas nanopartículas foi detectado em várias localizações: antes do primeiro “ponto” de ruptura (posição 1), no primeiro “ponto” (posição 4), entre os dois “pontos” (posição 6), no segundo “ponto” (posição 7) e finalmente após o segundo ponto (posição 9). Para cada posição do feixe de laser de excitação, o tempo de aquisição é de 1 segundo, com um valor de tensão registrado a cada 10 μs.

[00474] A figura 23 mostra o sinal de luminescência detectado para as diferentes localizações mencionadas acima. Os dois picos com diferentes localizações e amplitudes mostram a possibilidade de diferenciar depósitos espacialmente organizados, como é necessário para uma medição multiplexada.

EXEMPLO 6 Síntese de 3% de nanopartículas YVO4:Dy.

[00475] O protocolo usado é o mesmo que para a síntese das nanopartículas Y0,6Eu0,4VO4 indicadas no ponto 1,1 do exemplo 1 acima, com a única diferença sendo que ao invés do precursor Eu(NO3)3, utilizamos o Precursor Dy(NO3)3 em uma concentração de 0,03 M.

Resultado

[00476] A Figura 26 mostra os espectros de excitação e emissão de luminescência de uma solução destas nanopartículas após sua síntese. O espectro de excitação mostra picos de excitação direta de íons Dy3+. As seguintes etapas de funcionalização e acoplamento a estreptavidina (Exemplo 1, ponto 1,2.) e em seguida a um agente de direcionamento biotinilado (Exemplo 1, ponto 1,3.), ou acoplamento direto a um agente de direcionamento (Exemplo 1, ponto 1.4.) pode ser reproduzido identicamente com estas nanopartículas, produzindo assim sondas emitindo em um comprimento de onda de emissão diferente.

EXEMPLO 7 Síntese de 3% de nanopartículas YVO4:Sm

[00477] O protocolo usado é o mesmo que para a síntese das nanopartículas Y0,6Eu0,4VO4 indicadas no ponto 1,1 do Exemplo 1 acima, com a única diferença sendo que ao invés do precursor Eu(NO3)3, utilizamos o precursor Sm(NO3)3 em uma concentração de 0,03 M.

Resultado

[00478] A Figura 27 mostra os espectros de excitação e emissão de luminescência de uma solução destas nanopartículas após sua síntese. O espectro de excitação mostra picos de excitação direta de íons Sm3+. As seguintes etapas de funcionalização e acoplamento a estreptavidina (Exemplo 1, ponto 1,2.) e em seguida a um agente de direcionamento biotinilado (exemplo 1, ponto 1, 3.), ou acoplamento direto a um agente de direcionamento (Exemplo 1, ponto 1.4.) pode ser reproduzido identicamente com estas nanopartículas, produzindo assim sondas emitindo em um comprimento de onda de emissão diferente.

Referências

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Claims

1. Método para detecção e/ou quantificação ultrassensível in vitro de uma substância de interesse biológico ou químico que está presente em uma amostra em um teor estritamente abaixo de 10pM, em particular em uma amostra biológica, através da detecção da emissão de luminescência por nanopartículas inorgânicas fotoluminescentes, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos as seguintes etapas: (i) usar partículas fotoluminescentes que consistem, no todo ou em parte, em uma nanopartícula inorgânica fotoluminescente que consiste em uma matriz cristalina tendo pelo menos 103 íons de terras raras e acoplada a pelo menos um agente de alvejamento para a substância a ser analisada, sob condições que conduzem à sua associação com a substância a ser analisada da amostra, as nanopartículas tendo um tamanho médio maior do que ou igual a 20 nm e estritamente menor do que 1 μm, e sendo capazes de emitir luminescência após a absorção de um fóton;, as nanopartículas sendo da seguinte fórmula (I): (A1-xLnx)a(MpOq) (I) em que: - M representa um ou mais elementos com capacidade de associação com oxigênio (O) para formar um composto cristalino, em particular M representa um ou mais elementos selecionados de V, P, W, Mo, As, Al, Hf, Zr, Ge, Ti, Sn, Mn e Si; em particular M representa um ou mais elementos selecionados de V, P, W, Mo, As e Al; - Ln corresponde a um ou mais íon(s) de lantanídeo luminescente(s); - A corresponde a um ou mais íon(s) constituinte(s) da matriz cristalina cujos níveis eletrônicos não estão envolvidos no processo de luminescência, em particular selecionados dentre ítrio (Y), gadolínio (Gd), lantânio (La), bismuto (Bi), lutécio (Lu) e misturas dos mesmos, em particular A representa Y ou Gd e preferivelmente A representa Y; - 0 < x < 1, em particular 0,1 < x < 0,9, em particular 0,2 < x < 0,6, notavelmente 0,2 < x < 0,4 e mais particularmente x é 0,4; e - os valores de p, q e a são tais que a eletroneutralidade de (A1-xLnx)a(MpOq) é respeitada; (ii) excitar os íons de terras raras das partículas associadas com a substância a ser analisada, através de um dispositivo de iluminação, em particular do tipo laser, com uma potência de pelo menos 50 mW, preferivelmente pelo menos 500 mW, e uma intensidade de excitação de pelo menos 1 W/cm2, preferivelmente pelo menos 10 W/cm2; (iii) detectar luminescência emitida por partículas após a absorção de fóton único, e (iv) determinar a presença e/ou concentração da substância através da interpretação da medição de luminescência, onde apropriado por referência a um padrão ou calibração.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a substância a ser analisada da amostra na etapa (i) é previamente imobilizada sobre a superfície de um suporte, a superfície sendo passivada de modo que as partículas luminescentes não se anexem à mesma na ausência da substância a ser analisada.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser para detecção e/ou quantificação de uma substância de interesse presente na amostra em um teor abaixo de 1 pM, ou mesmo abaixo de 0,1 pM, ou abaixo de 0,01 pM.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra biológica, em particular um espécime humano, e mais particularmente selecionada de sangue, soro, plasma, saliva, urina, fluido cérebro-espinhal, esfregaço nasal, esfregaço vaginal, esputo e matéria fecal diluída.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para detecção e/ou quantificação de biomarcadores, anticorpos, DNA e/ou RNA em uma amostra biológica.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o agente de alvejamento é selecionado a partir de um anticorpo policlonal ou monoclonal, um fragmento de anticorpo, um nanocorpo, um oligonucleotídeo, um peptídeo, um hormônio, um ligante, uma citocina, um peptidomimético, uma proteína, um carboidrato, uma proteína quimicamente modificada, um ácido nucleico quimicamente modificado, um carboidrato quimicamente modificado que alveja uma proteína de superfície celular conhecida, um aptâmero, uma proteína e um conjunto de DNA/RNA ou um cloroalcano usado por marcadores do tipo HaloTag, em particular um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o produto entre a taxa de dopagem de íons de terras raras e a eficiência quântica da emissão da nanopartícula é maximizado, em particular em que a nanopartícula tem uma cristalinidade imperfeita.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que as nanopartículas têm um tempo de vida de emissão maior que ou igual a 5 μs, em particular maior que ou igual a 10 μs, notadamente maior que ou igual a 20 μs, ou mesmo maior que ou igual a 50 μs.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as nanopartículas têm um tamanho médio entre 20 nm e 500 nm, preferivelmente entre 20 nm e 200 nm e notavelmente entre 20 e 100 nm, em particular entre 25 nm e 100 nm, notavelmente entre 30 e 60 nm.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que os íons de lantanídeo são selecionados a partir de európio (Eu), disprósio (Dy), samário (Sm), praseodímio (Pr), neodímio (Nd), érbio (Er), itérbio (Yb), cério (Ce), hólmio (Ho), térbio (Tb), túlio (Tm) e misturas dos mesmos, em particular selecionados de Eu, Dy, Sm, Nd, Er, Yb, Tm, Tb e misturas dos mesmos, em particular Eu.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que as nanopartículas são da fórmula: A1-xLnxVO4(1-y)(PO4)y (II) em que: . A é selecionado de ítrio (Y), gadolínio (Gd), lantânio (La), lutécio (Lu) e misturas dos mesmos, em particular A representa Y; . Ln é selecionado de európio (Eu), disprósio (Dy), samário (Sm), neodímio (Nd), érbio (Er), itérbio (Yb), túlio (Tm), térbio (Tb) e misturas dos mesmos, em particular Ln representa Eu; . 0 < x < 1; em particular 0,2 < x < 0,6 e mais particularmente x é 0,4; e . 0 < y < 1, em particular y é 0.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as referidas nanopartículas da fórmula (II) têm em sua superfície cátions de tetra-alquilamônio, em particular cátions da Fórmula NR4+ com R, que podem ser idênticos ou diferentes, representando um grupo alquila C1-C6, em particular alquila C1-C4, mais particularmente alquila C1-C3, e notavelmente selecionado de cátions de tetrametilamônio, tetraetilamônio, tetrapropilamônio, tetrabutilamônio e misturas dos mesmos, preferivelmente os cátions de tetra-alquilamônio são cátions de tetrametilamônio.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as nanopartículas são da fórmula (II‘) Ai-xLnxVθ4(i-y)(Pθ4)y • (NR4+)z (II‘) em que: 14. A é conforme definido na reivindicação 11; . Ln é conforme definido na reivindicação 11; . 0 < x < 1; em particular 0,2 < x < 0,6 e mais particularmente x é 0,4; . 0 < Y < 1, em particular y é 0; . R, que pode ser idêntico ou diferente, representa um alquila C1-C6, em particular alquila C1-C4, em particular alquila C1-C3, e mais particularmente grupo metila; e . Z representa o número de cátions de tetra-alquilamônio NR4+ localizados na superfície da nanopartícula, em particular z está entre 100 e 10.000.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que as nanopartículas são da fórmula Y1-xEuxVO4, em que 0 < x < 1, em particular, as nanopartículas tendo em sua superfície os cátions de tetra-alquilamônio, em particular como definidas na reivindicação 12.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que as nanopartículas têm, no final de sua síntese, um potencial zeta, denotado Ç menor ou igual a -28 mV, preferivelmente menor que ou igual a -30 mV, em meio aquoso de pH > 5, em particular de pH > 5,5 e mais particularmente de pH > 6, e de condutividade iônica estritamente menor do que 100 IISTIU 1.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 15, caracterizado pelo fato de que a etapa (i) compreende pelo menos as seguintes etapas: (a) ter um suporte cuja superfície é previamente passivada e funcionalizada com um agente de alvejamento para a substância a ser detectada/quantificada, por exemplo, um primeiro anticorpo monoclonal, chamado de anticorpo de captura; (b) contactar a referida amostra a ser analisada com o suporte da etapa (a) sob condições que conduzem à associação da substância com o agente de alvejamento; e (c) contactar as partículas fotoluminescentes acopladas com pelo menos um agente de alvejamento com o suporte da etapa (b) para associar as partículas com a substância imobilizada sobre a superfície do suporte.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 16, caracterizado pelo fato de que o suporte é do tipo de deslizamento, de placa de múltiplos orifícios, de microplaca, de gel de membrana, de tira ou de microcanais.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 17, caracterizado pelo fato de que a excitação na etapa (ii) é realizada com um feixe de excitação a laser orientado de modo que forme um ângulo de incidência maior ou igual a 55° com a vertical do suporte tendo na superfície as partículas associadas com a substância a ser analisada.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende a excitação das partículas através de onda evanescente, em particular por meio de um arranjo de iluminação a laser do tipo TIRF, permitindo um ângulo de incidência do feixe de excitação maior ou igual a 61° no caso de uma interface de vidro/água entre o suporte e a amostra a ser analisada.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o tempo de vida de emissão pelas nanopartículas é maior ou igual a 1 μs, em particular maior ou igual a 50 μs, a detecção da intensidade de luz na etapa (iii) compreendendo uma detecção resolvida no tempo da emissão, em particular uma detecção retardada do sinal emitido pelas partículas fotoluminescentes.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de ser para detecção e/ou quantificação simultânea de pelo menos duas substâncias diferentes em uma amostra.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que as substâncias a serem analisadas da amostra são imobilizadas em áreas predefinidas e distintas sobre a superfície de um suporte, a superfície sendo passivada de modo que as partículas fotoluminescentes não se liguem à mesma na ausência das substâncias a serem analisadas.

23. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que usa pelo menos dois tipos de nanopartículas tendo comprimentos de onda de emissão distintos e acopladas a agentes de alvejamento para cada uma das substâncias a serem analisadas.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de iluminação a laser na etapa (ii) compreende um arranjo óptico, em particular um sistema de pelo menos uma lente, arranjado no trajeto do feixe de laser, de modo que controle o tamanho do feixe na área do suporte tendo as partículas associadas com a substância a ser analisada.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que a detecção da emissão de luminescência na etapa (iii) é realizada por um dispositivo para detecção de intensidade de luz compreendendo um único detector, por exemplo, do tipo fotomultiplicador, de fotodiodo, de fotodiodo de avalanche ou um detector do tipo de série de dispositivo fotossensível consistindo em uma área 2D de pixels de detecção tal como uma câmera CCD ou EM-CCD ou câmera CMOS.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o dispositivo para detecção compreende um arranjo óptico, em particular um sistema de pelo menos uma lente com uma grande abertura numérica, para focar a emissão de luminescência para o detector, em particular para o fotomultiplicador.

27. Uso de um método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de ser para propósitos de diagnóstico in vitro.

28. Kit de diagnóstico in vitro, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos: - partículas fotoluminescentes consistindo, no todo ou em parte, em uma nanopartícula inorgânica fotoluminescente como definida em qualquer uma das reivindicações 1 e 8 a 15, as partículas sendo superficialmente funcionalizadas com grupos químicos, por exemplo, grupos carboxila, amina, tiol, aldeído ou epóxi, providas por moléculas, por exemplo, ácido cítrico ou ácido poliacrílico, e/ou acopladas a moléculas, por exemplo, estreptavidina, os grupos químicos ou moléculas sendo capazes de permitir o acoplamento das partículas com um agente de alvejamento para a substância a ser analisada; ou as partículas sendo já acopladas a pelo menos um agente de alvejamento para a substância a ser analisada; e - um sistema para detecção e/ou quantificação que compreende pelo menos: . um dispositivo de iluminação, preferivelmente do tipo laser, com uma potência de pelo menos 50 mW ou mesmo pelo menos 500 mW, e um arranjo óptico para conformar o feixe de laser tornando possível obter uma intensidade de excitação no nível da amostra de pelo menos 1 W/cm2, preferivelmente de pelo menos 10 W/cm2. . um dispositivo para detectar a intensidade luminosa emitida pelas partículas.

29. Kit de diagnóstico de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um suporte adequado para imobilizar a substância a ser analisada da amostra.