CN111295580A

CN111295580A - 使用光致发光颗粒的超灵敏检测方法

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Publication number: CN111295580A
Application number: CN201880061006.6A
Authority: CN
Inventors: 帕斯卡尔·普瑞拉; 马克西米利安·里奇伊; 塞德里克·布兹格; 安蒂戈尼·亚历桑德罗; 蒂埃里·加库安
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Ecole Polytechnique
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Ecole Polytechnique
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2018-08-03
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2038-08-03
Also published as: BR112020002241B1; WO2019025618A1; CN111295580B; US20200271586A1; FR3069927B1; BR112020002241A2; FR3069927A1; EP3662265A1

Abstract

本发明涉及一种通过检测由光致发光无机纳米颗粒的发光发射来对样品中的感兴趣物质进行超灵敏体外检测和/或定量的方法，该方法包括：(i)采用光致发光颗粒，该光致发光颗粒包括具有至少10³个稀土离子的晶体基质形成的光致发光无机纳米颗粒并在有利于它们与分析样品联接的条件下与用于分析物的靶向剂连接；(ii)通过具有至少50mW的功率和至少1W/cm²的激发强度的照明装置来激发颗粒的稀土离子；(iii)检测发光发射；以及(iv)通过解析所述发光测量值来确定物质的存在和/或浓度。本发明还涉及该方法用于体外诊断的目的的用途以及体外诊断试剂盒。

Description

使用光致发光颗粒的超灵敏检测方法

本发明涉及研究、生物分析和体外诊断领域。更具体地，其主题是一种用于通过检测具有受控光学和物理化学性质的光致发光无机纳米颗粒发射的发光来对样品(特别是生物样品)中生物学或化学上感兴趣的物质(例如生物标志物、抗体、DNA、RNA和其他化合物)进行超灵敏体外检测和/或定量的方法。

检测和/或定量生物样品(血液、血清、唾液、尿液、脑脊髓液等)中生物标志物、抗体或DNA和RNA的浓度对于医学诊断至关重要。

在研究、体外或离体诊断、医学分析和生物分析领域，已经提出了许多方法来检测和/或确定特定物质的存在。

这些方法通常基于用于检测和/或定量溶液中浓度的探针的使用。这些探针与识别化合物或靶向剂连接，以结合待分析的分子物质。识别化合物可以是分子、DNA、适配体、蛋白质或抗体。然后，可以使用一种或多种方法(例如基于它们的发光、吸光度、化学反应性、放射性等)检测借由识别化合物与待分析分子物质附连的探针。

最常用的生化测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)，其通常依靠辣根过氧化物酶作为酶来引起与底物发生反应并通过测量溶液中反应产物的吸光度来定量发生的化学反应。选择与探针连接的分子识别化合物对于这些探针的有效性至关重要。更准确地说，这些方法的有效性取决于识别化合物与目标物质的特异性亲和力。作为示例，参考出版物[1]和[2]详细介绍了这些机制的特点。

发光探针通常会产生比通过其吸光度检测的探针更灵敏的检测，因为在第一种情况下，光强度的测量是在黑暗背景下进行的，而在第二种情况下，测量光强度变化是一个问题(明场测量)。

当前可用的其他测定方法包括电化学发光(ECLIA)、荧光免疫测定(FIA)和放射免疫测定(RIA)。

然而，这些方法具有各种缺点，这些缺点限制了它们的最终检测灵敏度，特别是在所用探针(ECLIA、FIA)的发光特性、安全风险、昂贵的设备以及需要专门用户(非自动化机器)进行RIA型测试方面的限制。

特别地，当前可用的发光探针具有几个缺点，这些缺点使得其作为诊断传感器的潜力不能充分利用。这些缺点包括，例如，在有机荧光团的情况下发生光漂白的现象，在由于照明引起的不可逆的结构变化后，导致荧光消失，或者在半导体纳米晶体或“量子点”的情况下出现发射闪烁的现象，在这种情况下，探针周期性地停止发射，并且因此不适合产生恒定的信号。其他缺点，例如，由发光探针的宽发射光谱引起的缺点。事实上，发射光谱太宽使得难以滤除可能存在的任何背景信号，并影响信号的质量，特别是信噪比。除了有助于生物测定中探针有效性的光学因素外，还应该考虑探针的实用性和易用性。例如，某些颗粒，诸如半导体纳米晶体，在冷冻后失去其发光特性，这不利于生物缀合物的存储。在选择合适的探针时，探针与靶向所需分子的分子化合物连接难易程度也是应考虑的一方面。例如，在有机溶剂中合成了包括半导体纳米晶体的许多颗粒。因此，对于生物应用的用途需要额外的表面准备步骤以实现这些颗粒在水中的分散，该过程实施起来可能很复杂并且随着时间的推移不是很稳定[3]。

此外，颗粒/探针的胶体性质对于进行生物测定的进行至关重要。事实上，具有良好胶体稳定性的溶液能够为测试提供良好均质性的介质，并且，因此提供测试结果的更好再现性。

最终，在选择诊断探针中复杂性和成本是重要方面。例如，金纳米颗粒以及它们在表面等离振子共振方面的特性已被提出作为诊断探针，但尚未作为一种体外诊断探针取得进展，可能由于检测方法的复杂性[4]，或者，成本较高。半导体晶体转而在有机溶剂中合成并且需要在水性介质中的分散步骤，这使得它们的合成复杂并且因此昂贵。允许与目标分子的分子识别化合物连接的化学基团的官能化还依赖于弱化学键，因此限制了它们的稳定性，并且不利于检测测试的可再现性。

此外，当前可用的体外检测方法还不能完全令人满意，特别是在可以实现的检测灵敏度以便扩大体外诊断方法的范围方面，例如，通过允许疾病的早期检测或通过允许诊断疾病的进展或治疗性处理的效果。

为了提高检测灵敏度，已经开发了两种商用的超灵敏免疫测定技术。这些是由Quanterix和Singulex开发的方法。它们基于使用功能化的磁珠作为反应性表面以用于捕获目标分子。然后，Quanterix技术捕获通过抗原抗体功能化的单个磁珠。将每个磁珠捕获在孔中并通过标准ELISA进行分析。Singulex转而使用磁珠来浓缩捕获的分析物，并且，然后通过使用共聚焦检测设备和螺旋地扫描样品的激发激光器对荧光信号进行计数来确定它们的浓度。

尽管这两种技术在检测灵敏度方面比上面讨论的常规检测技术实现了更高的性能，但是它们仍然非常复杂且昂贵。他们需要使用专门用于这些检测技术的设备，该设备与当前的自动体外诊断装置不兼容。

半导体纳米晶体或“量子点”也已在超灵敏检测测试中提出([5]、[6]、[7]、[8]和[9])。然而，如上所述，这些测试的有效性受到与这种类型的发光探针相关的缺点的限制：它们的合成和官能化的复杂性和高成本，不令人满意的胶体稳定性，冷冻后发光特性的损失。

最终，通过应用诸如表面等离子体的检测、荧光猝灭、金纳米颗粒上的银沉积等现象基于使用金纳米颗粒的方法([9]至[13])，实现较高的检测灵敏度，但通常高度复杂。因此，仍然需要开发检测/定量方法，其在检测灵敏度方面比常规技术诸如ELISA、ECLIA、FIA或RIA具有更高的性能，并且不具有已经提出的超灵敏方法的缺点，特别是在复杂性和成本方面的缺点。

基于使用掺杂有稀土离子的具有受控的光学和物理化学性质的发光纳米颗粒，本发明的目的正是在于提出一种新颖的超灵敏检测方法。

因此，根据本发明的第一方面，本发明涉及一种通过检测由光致发光无机纳米颗粒的发射发光对样品(特别是生物样品)中生物学或化学上感兴趣的物质进行超灵敏体外检测和/或定量的方法，该方法至少包括以下步骤：

(i)使用光致发光颗粒，光致发光颗粒全部或部分由光致发光无机纳米颗粒组成，并且在有利于它们与样品中待分析物质联接的条件下与用于待分析物质的至少一种靶向剂连接，该光致发光无机纳米颗粒由具有至少10³个稀土离子的晶体基质组成，

所述纳米颗粒具有的平均尺寸大于或等于20nm并且严格小于1μm，特别是在20nm至500nm之间，优选在20nm至200nm之间，并且尤其是在20nm至100nm之间，并且能够在吸收光子后发射发光；

(ii)通过照明装置，特别是激光类型的照明装置，来激发与待分析物质联接的颗粒的稀土离子，功率为至少50mW，优选至少500mW，并且激发强度为至少1W/cm²，优选至少10W/cm²；

(iii)检测由颗粒发射的发光，以及

(iv)通过解析所述发光测量值来确定物质的存在和/或浓度，在适当的情况下参考标准或校准。

在本发明的意义上，样品中物质的“分析”涵盖检测或定性表征所述物质存在或不存在的方面，以及测定或定量表征所述物质的方面。

样品可以是生物学样品，特别是人样品，例如选自血液、血清、血浆、唾液、尿液和脑脊髓液。样品也可以是稀释粪便物、阴道或鼻拭子或痰液。

稀释剂可以与待测样品一起使用，尤其是例如当液体样品为血浆、血清、全血、鼻腔或阴道涂片或痰液时。

它也可以是含有生物分子的溶液。

因此，本发明的方法可以用于检测和/或定量生物样品中的生物标志物、抗体、DNA和/或RNA。

本发明的方法更具体地在步骤(iii)中实施，检测单光子吸收后由颗粒的发光。

因此，根据本发明的方法，所检测的信号对应于在吸收单个光子之后由光致发光纳米颗粒发射的发光，换言之，在比激发波长更长的波长处发射。因此，根据本发明的光致发光纳米颗粒与上转换荧光颗粒不同，对于上转换荧光体颗粒，发光发射的检测在双光子吸收之后进行。

根据本发明的超灵敏方法在几方面是有利的。

首先，如实施例中所示，本发明的方法在检测灵敏度方面实现的性能显著高于常规ELISA、ECLIA、FIA或RIA类型检测技术的性能。

有利地，因此本发明的超灵敏方法允许的灵敏度是使用相同识别和靶向抗体的ELISA型酶免疫检测方法的至少10倍，特别是至少100倍。

因此，根据本发明的超灵敏方法允许检测和/或定量样品中存在的感兴趣物质，其含量严格低于10pM，或者甚至低于1pM，或者甚至低于0.1pM，或者甚至低于0.01pM(10fM)。这些浓度取决于目标分子，并且，特别地取决于与探针连接的识别化合物或靶向化合物的亲和力，但是与通过超灵敏方法(Quanterix或Singulex)可检测的浓度相当。

此外，本发明的方法基于掺杂有稀土离子的纳米颗粒的使用，例如下文更精确定义的式(A_1-xLn_x)_a(M_pO_q)(I)的纳米颗粒，诸如YVO₄:Eu或GdVO₄:Eu，YAG:Ce类型的纳米颗粒，它们作为发光探针具有特别有利的性能。

例如，已经详细描述了基于稀土掺杂的钒酸钇的纳米颗粒[14]和[15]。

这些纳米颗粒由于它们的优异光稳定性方面而特别有利，这允许获取恒定且延长的信号，并且不存在闪烁的发射现象。此外，它们具有发射的较窄的发射光谱和较大的斯托克斯(Stokes)位移(对于Eu掺杂的纳米颗粒约为350nm)。这些纳米颗粒还含有数万个可以被激发并引起发光的离子。因此，激发强度增加会引起颗粒亮度的增加，因为仅在不能实行的强度下达到了发射饱和。

最终，这些纳米颗粒在冷冻后不会失去它们的发光。

基于稀土的光致发光纳米颗粒已经被提出作为各种应用中的发光探针[16]。

例如，Dosev等人[17]通过激发Gd₂O₃基质来利用Eu:Gd₂O₃发光纳米颗粒的发光特性来检测沉积在基底上的蛋白质微结构。Yi等人[18]转而使用NaYF₄:Yb,Er类型(nature，性质)光子的上转换荧光体，其吸收两个近-IR光子以可见形式发射一个光子。

与半导体纳米粒子或量子点相比，利用了单颗粒检测缺乏闪烁的优势，基于稀土的光致发光纳米颗粒还已经被实现以用于单颗粒检测以及用于单分子示踪([19]和[20])。然而，在总体上检测生物分子的情况下，绝对不能预言这些基于镧系元素离子的纳米颗粒可以用于生物分子的超灵敏检测和定量。实际上，除了没有闪烁之外，基于稀土的发光纳米颗粒的发光性能被认为不如量子点。在这些颗粒中，特别是由在其中某些离子被稀土离子替换的金属氧化物基质组成的颗粒中，可以通过激发基质然后将能量转移到发光稀土离子，或者通过在发光稀土离子的可见光范围内直接激发，来激发发光。关于基质的激发，其吸收带通常在UV中，这具有两个缺点：目前在这些波长处可用的激光器很少，并且现有的激光器大且昂贵；以及，在这些吸收波长处，生物分子会强烈吸收和发射，从而产生干扰信号。关于稀土离子的直接激发，纳米颗粒的消光系数低于量子点的消光系数，但可以与有效有机荧光团相当[16]。另外，可见光中稀土离子的直接吸收峰通常在光谱上非常窄，这需要使用光谱上较窄的激光器来有效地直接激发发光稀土离子。这种类型的激光器，特别是以紧凑且便宜的激光二极管形式的激光器，直到最近才可用于与直接激发发光稀土离子有关的波长。

Yuan等人[21]在一篇综述文章中，提出了使用基于镧系元素的纳米颗粒的时间分辨发光生物测定方法。基于镧系元素的发光探针是包括镧系元素络合物的颗粒或上转换纳米颗粒，镧系元素络合物会限制对于给定颗粒体积的每个颗粒中的镧系元素离子的数量。例如，在使用包括镧系元素络合物的纳米颗粒的出版物中，较小直径(8-9nm)的纳米颗粒仅含有3000至5000个离子[28]。只有更大尺寸的纳米颗粒，尤其是那些尺寸大于100nm的纳米颗粒，才能含有30000或更多的离子[22]和[23]。

类似地，Corstjens等人[24]使用上转换纳米颗粒用于人外周血单核细胞中IFN-γ的体外检测。上转换纳米颗粒适用于深层组织成像(通常在Yb³⁺的近红外区域激发，与可见光相比，该区域的组织吸收很少)。另一方面，因为激发需要双光子吸收，所以需要高激发强度并且发射的光子数量相对较低。

在出版物[23]、[25]、[26]和[27]中也提出了镧系元素络合物或螯合物作为用于免疫测定的发光探针。然而，这些络合物或螯合物通常仅含有单个镧系元素离子，或者最多含有少数(少于10个)镧系元素离子。

最终，还可以提及出版物Zhou等人[28]，其提出了一种基于掺杂镧系元素的无机纳米颗粒的具有提高的灵敏度的检测方法，遵循复杂的方案来溶解纳米颗粒并检测由此形成的含有镧系元素的胶束的发射。

文献EP 1 282 824转而描述了使用表面改性的无机发光纳米颗粒作为探针用于检测生物或其他有机物质。该文献中提出的检测方法基于ELISA检测的原理。然而，该文献决不建议将它们用于超灵敏检测。

还可以提及文献US 7,550,201，该文献提出了掺杂镧系元素离子的无机纳米颗粒的用途，特别是它们在诊断中的应用。然而，该文献决不建议将它们用于超灵敏检测方法。

另外，出版物Son等人[36]和Nichkova等人[37]提出使用Eu:Gd₂O₃纳米颗粒作为有机荧光团的替代物作为探针以分别用于DNA和苯氧基苯甲酸的检测。然而，这些文献决不建议将它们用于超灵敏检测。

因此，从未提出过在根据本发明的超灵敏检测方法中利用先前定义的光致发光纳米颗粒，结合特定的光学和物理化学性质。

这些光致发光纳米颗粒可以通过本领域技术人员已知的常规合成方法获得。

形成光致发光无机纳米颗粒的晶体基质可以是氧化物基质，例如钒酸盐或磷酸盐基质；卤素基质，例如氟化物基质；或硫族化合物基质，例如碲，硫化物，硒化物。

替代地，有利地，如下文详述，发明人开发了一种新颖的使用纳米颗粒表面上的四烷基铵阳离子来合成掺杂有稀土离子的纳米颗粒的方法，并且该方法使得有可能实现纳米颗粒在水性介质中的改进的稳定性，以及，有利地，它们的合成以及随后的官能化和连接至靶向剂的步骤的更好的再现性。

最终，与以上讨论的超灵敏技术相比，本发明的超灵敏方法在实施的容易性和成本方面被证明是特别有利的。

有利地，与Quanterix和Singulex开发的复杂技术不同，它实现了一种成本有限的紧凑的检测设备，其每个部件都易于购买获得，用于激发和测量由纳米颗粒发射的发光，如下所述，以及，该设备不需要任何专用于本发明的超灵敏检测方法的设备部件。有利地，其因此与整合至人机工程适应性有限的自动化分析装置兼容。

本发明的方法还适用于多重(多路)分析。因此，本发明的方法可以被实现为用于按照以下呈现的程序(图22)同时检测和/或定量样品中的至少两种不同的物质。

另外，如下文详述，可以利用本发明的颗粒的长发射持续时间(大于1μs，甚至大于10μs，或者甚至大于100μs)来进行时间分辨检测，特别是延迟发射检测。例如在WO03008974中描述了时间分辨的发光测量。本发明的超灵敏方法有利地允许使用低复杂度、低成本设备、特别是机械斩波器、常规的光电倍增管和100kHz A-D转换器来执行时间分辨的发光检测，如下所述。

根据本发明的另一方面，本发明涉及将上述定义的方法用于体外诊断目的。有利地，通过超灵敏方法检测生物样品中某些物质的超低水平的可能性使得例如可以将本发明的方法用于疾病的较早检测或诊断疾病的进程或治疗性处理的效果。另外，这种超灵敏检测方法允许将浓度目前太低而不能用常规方法检测的物质用作生物标志物。它还使生物标志物可在浓度太低而无法用常规方法检测的易于获得的生物介质(唾液、尿液、血液等)中检测到，以及需要侵入性方法，例如脑脊髓液采样。

根据其另一方面，本发明涉及体外诊断试剂盒，至少包括：

-全部或部分由以上限定的光致发光无机纳米颗粒组成的光致发光颗粒，

所述颗粒被由例如柠檬酸或聚丙烯酸的分子提供的例如羧基、氨基、硫醇、醛或环氧基基团的化学基团表面官能化，和/或与例如链霉亲和素的分子连接，所述化学基团或分子能够使所述颗粒与用于待分析物质的靶向剂连接；或者

所述颗粒已经与用于待分析物质的至少一种靶向剂连接；以及

-检测和/或定量系统，其至少包括：

.照明装置，优选为激光类型的照明装置，具有至少50mW或甚至至少500mW的功率，以及用于成形激光束的光学装备，使得在样品水平可以获得至少1W/cm²，优选至少10W/cm²的激发强度；

.用于检测由颗粒发射的光强度的装置。

照明装置还可以包括另一激发源，诸如灯或发光二极管(LED)。

这样的体外诊断试剂盒允许容易地实施根据本发明的超灵敏检测和/或定量方法，例如用于确定生物样品中的生物标志物或抗体。

可以用本发明的体外诊断试剂盒诊断的疾病不受限制，并且包括通过特异于疾病的标志物，具有一种或多种特异性结合伴侣(配体、抗体、互补核酸、适配体等)的生物学上感兴趣的分子类型(蛋白质，核酸等)的存在而揭示的所有疾病。

实例包括传染病(细菌、寄生虫或病毒，诸如AIDS)、炎性和自身免疫性疾病、心脏病、神经病或肿瘤疾病(例如，实体癌，诸如乳腺癌或前列腺癌)。

本发明的超灵敏检测方法不限于上述应用。因此，它可以用于检测种子中的GMODNA，例如，或者用于检测用于食用的水或食品中的污染物或病原体。

因此，根据本发明的超灵敏检测方法的应用可以从免疫学领域扩展到分子遗传学或DNA和RNA的检测，如所附的图24和图25所说明的。它可以用于用结合到纳米颗粒的部分互补的探针片段标记生物样品的一条或多条RNA链，并且然后通过接枝到固体基底上的另一区域的互补片段上的杂交来检测它们，遵照与Affymetrix-型DNA芯片类似的方法。因此，本发明的一个重要特征在于缺少这些方法通常必需的扩增步骤。

在下文中，术语“纳米颗粒”将更简单地用于指由掺杂有稀土离子的晶体基质组成的光致发光无机纳米颗粒。

此外，术语“颗粒”用于指包括至少所述纳米颗粒的颗粒，例如由所述纳米颗粒组成，根据变型实施方式，在其表面上可以定位有四烷基铵阳离子，并且与用于待分析物质的一种或多种靶向剂连接，如下所述。

通过阅读以下以本发明的非限制性说明方式给出的说明书、实施例和附图，根据本发明的方法的其他特征、变型和优点将变得更加清楚。

在下文中，表述“在...和...之间”、“从...到...的范围”和“从...到...变化”是等同的，并且旨在表示包括边界，除非另有规定。

除非另有规定，否则表述“包括一个(一种)”应理解为“包括至少一个(一种)”。

本发明的发光颗粒

如上所述，根据本发明的超灵敏检测方法基于光致发光颗粒的发光发射的检测，光致发光颗粒包括特别是由具有特定光学和物理化学性质的光致发光无机纳米颗粒组成，并且与用于待分析物质的至少一种靶向剂连接。

光致发光无机纳米颗粒

所使用的纳米颗粒的性质将决定可以通过本发明的方法实现的灵敏度。

本发明的无机纳米颗粒由具有至少10³个稀土离子的晶体基质组成。

本发明的纳米颗粒中的稀土离子不是由稀土离子与合适的有机配体组合而组成的稀土离子络合物或螯合物形式，如例如在文献Yuan等人[21]中公开的。

优选地，本发明的纳米颗粒包括1000至6000000个稀土离子，特别是5000至500000，并且更特别地20000至100000个稀土离子。

本发明的纳米颗粒可以掺杂有相同性质或不同性质的稀土离子。

特别地，这些可以是选自铕(Eu)、镝(Dy)、钐(Sm)、镨(Pr)、钕(Nd)、铒(Er)、镱(Yb)、铈(Ce)、钬(Ho)、铽(Tb)、铥(Tm)及其混合物的镧系元素离子

特别地，镧系元素离子可以选自Eu、Dy、Sm、Nd、Er、Yb、Tm和Tb及其混合物，特别是选自Eu、Dy、Sm、Nd、Er、Yb及其混合物，并且更特别地为Eu。

形成光致发光无机纳米颗粒的晶体基质可以是氧化物基质，特别是钒酸盐或磷酸盐基质；卤化物基质，特别是氟化物基质；或硫族化合物基质，特别是碲，硫化物或硒化物基质。

氟化物基质特别地包括YF₃、GdF₃、NaGdF₄、NaYF₄、NaLuF₄、Ba₄Lu₃F₁₇、Na₃ZrF₇、Na₅Zr₂F₁₃和Na₇Zr₆F₃₁的基质

根据特定实施方式，本发明的无机纳米颗粒具有下式(I)：

(A_1-xLn_x)_a(M_pO_q)(I)

其中：

-M代表能够与氧(O)联接以形成晶体化合物的一种或多种元素；

-Ln对应于一个或多个发光镧系元素离子；

-A对应于其电子能级不参与发光过程的晶体基质的一个或多个组成离子；

-0<x<1，特别是0.1≤x≤0.9，特别是0.2≤x≤0.6，特别是0.2≤x≤0.4，并且更特别地x为0.4；以及

-p、q和a的值使得符合(A_1-xLn_x)_a(M_pO_q)呈电中性。

A可以更特别地选自钇(Y)、钆(Gd)、镧(La)、铋(Bi)、镥(Lu)及其混合物，特别地，A可以选自Y、Gd、La及其混合物；特别地，A代表Y或Gd，优选A代表Y。

特别地，上述式(I)中的M可以表示选自V、P、W、Mo、As、Al、Hf、Zr、Ge、Ti、Sn、Mn和Si中的一种或多种元素。优选地，M代表选自V、P、Al、Hf、Zr、Ge、Ti、Sn、Mn和Si的一种或多种元素，并且，特别地选自V、P、W、Mo、As和Al。根据本发明使用的纳米颗粒的晶体基质可以包括一种或多种类型的M_pO_q阴离子，特别地，M可以代表V_1-yP_y，其中Y范围为0至1。

根据特定实施方式，上述式(I)中的p不同于零。

举例来说，本发明的纳米颗粒可以具有式(I)，其中，M代表V和/或P，p为1，使得所述纳米颗粒的基质包括VO₄ ^3-和/或PO₄ ^3-阴离子。

在另一示例性实施方式中，M代表Al，A代表Y或Lu，p为5且q为12，使得所述纳米粒子的A_a(M_pO_q)基质为石榴石族Y₃Al₅O₁₂(YAG)或Lu₃Al₅O₁₂(LuAG)。

根据另一特定的实施方式，本发明的纳米颗粒可以具有式(I)，其中，M代表Hf或Zr、Ge、Ti、Sn、Mn，p为2且q为7，使得所述颗粒的基质为A_aHf₂O₇、A_aZr₂O₇、A_aGe₂O₇、A_aTi₂O₇、A_aSn₂O₇或A_aMn₂O₇。特别地，A可以代表La、Y、Gd或Lu，在这种情况下，a＝2。

在另一示例性实施方式中，p为零并且A为Y或Gd，使得所述纳米颗粒的A_a(M_pO_q)基质为Y₂O₃或Gd₂O₃类型。

根据特定的实施方式，在根据本发明的方法中使用的纳米颗粒可以更特别地是掺杂有一种或多种稀土离子，特别是掺杂有一种或多种镧系元素离子的金属氧化物纳米颗粒。

根据本发明的纳米颗粒的晶体基质，特别是金属氧化物基质的离子被稀土离子的替换率可以更特别地在10％至90％之间，特别地在20％至60％之间，尤其是在20％和40％之间，并且更特别地可以为40％。

选择如此高水平的掺杂是违背常规的。实际上，一般而言，掺有稀土离子的发光纳米颗粒的常规掺杂率保持在低于10％以避免在较高浓度下发生猝灭效应[29]至[31]。

有利地，如以下更精确地描述的，根据本发明的纳米颗粒的不完美结晶性使得可以消除淬灭效应。另外，根据本发明的方法，通过直接激发纳米颗粒的稀土离子(并且不仅是常规情况下的基质)，使之可以与更多掺杂的稀土离子结合，以实现更多数量的吸收的激发光子，并且，因此实现更多数量的发射的和检测的光子。

本发明的光致发光纳米颗粒具有的平均尺寸大于或等于20nm并且严格小于1μm。

特别地，它们具有的平均尺寸在20nm至500nm之间，特别是在20nm至200nm之间，并且尤其是在20nm至100nm之间。

特别地，本发明的光致发光纳米颗粒的平均尺寸可以大于或等于25nm，特别是大于或等于30nm，尤其是在30至60nm之间。

特别地，如以下实例所说明的，根据本发明的光致发光纳米颗粒具有的平均尺寸可以在30至50nm的范围内。

例如，如实例所示，可以通过对颗粒进行离心尺寸分选以在尺寸分布中仅保留最大的颗粒来获得较大的纳米颗粒，或者可以通过研磨固体材料获得较大的纳米颗粒。也可以使用本领域技术人员已知的任何其他技术。

因此，在本发明的方法中使用的光致发光纳米颗粒具有足够的体积以包含大量的稀土元素离子，并因此发射足以允许检测较低浓度的发光信号。举例来说，直径为30nm的球形纳米颗粒Y_0.6Eu_0.4VO₄含有70000个Eu³⁺离子(根据参考文献[35]Casanova等人，APL 2006计算离子数)。另外，光致发光纳米颗粒不应过大而无法避免当与固定在例如载体表面上的待分析物质结合时的空间位阻，如下所述。

通过透射电子显微镜可以测量平均尺寸。透射电子显微镜图像可以用于确定纳米颗粒的形状(球形、椭圆形)并用于推导纳米颗粒的平均尺寸。在通常为球形颗粒的情况下，平均尺寸是指颗粒的平均直径。

对于椭圆形颗粒的情况下，平均尺寸是与椭圆形体积相同的球体的平均尺寸。通常假设椭圆形的第三轴(在二维投影的透射图像中不可见)在长度上等于较小的轴。

根据特定实施方式，本发明的纳米颗粒是长球形，即具有大体上拉长的椭圆形形状。

它们可以更具体地具有在20nm至60nm之间的长轴长度，以a表示；以及在10到30nm之间的短轴长度，以b表示。特别地，本发明的纳米颗粒可以具有40nm的平均长轴长度值a和20nm的平均短轴长度值b。

有利地，本发明的纳米颗粒具有低的多分散性。可以从MET测量推导出的多分散指数可以特别严格地小于0.2。

根据特定实施方式，使稀土离子的掺杂率(例如，以铕(Eu)的形式)与由纳米颗粒发射的量子效率之间的乘积最大化。

对于根据本发明方法的步骤(ii)，特别有利的是通过直接激发(即与这些离子的电子态共振)来激发稀土离子，而不是通过激发如上限定的A_a(M_pO_q)基质(例如AVO_4(1-y)(PO₄)_y)以及随后的能量转移到这些离子来激发稀土离子。

在不降低量子效率(特别是通过限制导致浓度猝灭的掺杂离子之间的转移过程)的情况下，使用例如在0.2至0.6之间，并且，尤其是0.4的高掺杂Ln-离子，可以实现Ln-离子掺杂率x与量子效率之间乘积的优化。特别地，为了维持高量子效率，纳米颗粒具有不完美的结晶性。实际上，优异的结晶性有利于掺杂离子之间的转移过程，尤其是当它们彼此非常接近时(如在高掺杂的情况下)，并且，因此有利于通过非辐射过程对离子进行去激发的过程，其与表面和溶剂的存在有关。特别地，在室温或至少在不超过600℃的温度下的合成方法对于这些纳米颗粒所需的不完美结晶性是有利的。

如根据透射电子显微镜图像测量的，当由X射线衍射图在至少一个晶体学方向上确定的相干长度小于在该方向上的颗粒尺寸的80％时，纳米颗粒的结晶性被认为是“不完美的”。可以考虑不同类型的不完美结晶性：多晶性、缺陷、孔隙率等。

有利地，在本发明方法的上下文中使用的纳米颗粒能够在发射停止之前发射超过10⁸个光子，特别是超过10⁹个或甚至超过10¹⁰个光子。在许多情况下，尤其是在Eu掺杂的YVO₄或GdVO₄颗粒的情况下，未观察到发射停止。

在本发明的特别有利的变型实施方式中，在本发明的方法的上下文中使用的激发条件下，发光信号相对于线性行为所期望信号的相对变化总是小于30％。

特别地，在本发明检测方法的上下文中使用的纳米颗粒使得在高激发强度(特别是大于1W/cm²)下发光信号没有饱和。更特别地，这是颗粒中存在大量稀土离子(超过10³个稀土离子)的结果。

有利地，因此，本发明的检测方法不受饱和现象和诸如光降解的其他不利影响(诸如光降解，这在某些光致发光探针诸如有机荧光团或荧光蛋白的高激发下会发生)的限制。因此，饱和和其他影响的不存在有利地允许在高功率(至少50mW)和高激发密度(至少1W/cm²)的情况下进行根据本发明方法的激发。

此外，有利地，本发明的纳米颗粒具有较长发射寿命。特别地，它们具有的发射寿命可以大于或等于5μs，特别是大于或等于10μs，尤其是大于或等于20μs，或大于或等于50μs。

发射寿命被理解为发射纳米颗粒的激发态的寿命，并且在实践中由激发停止后发光光子的发射持续时间来确定，即激发停止后发光的指数下降的特征时间。

本发明的超灵敏方法有利地使得可以利用本发明颗粒的长发射持续时间(在Y_1- _xEu_xVO₄颗粒的情况下为几百μs，与通常的纳秒级荧光团的寿命相比)，以便以足够的时间分辨率(10μs)，使用低复杂度、低成本的设备，特别是机械斩波器、常规的光电倍增管和100kHz AD转换器，来进行时间分辨检测，特别是延迟发射检测，如下所述。

有利地，本发明的纳米颗粒在溶液中表现出良好的胶体稳定性。

纳米颗粒在溶液中的稳定性对于满足将这些颗粒用作探针的检测结果的可再现性要求至关重要。

“ζ电位”是代表悬浮液稳定性的元素之一。例如，可以直接使用来自Malvern的Zetasizer Nano ZS进行测量。该设备使用光学装置来测量随着施加到颗粒的电场变化的颗粒的运动速度。

特别地，本发明的纳米颗粒在它们合成结束时在pH为5的水性介质中有利地呈现出大于30mV的以绝对值表示的ζ电位，表示为|ζ|。

更特别地，本发明的纳米颗粒在pH≥5，特别是pH≥5.5，并且更特别是pH≥6且离子电导率严格小于100μs.cm^-1的水性介质中有利地具有小于或等于-28mV，优选小于或等于-30mV的ζ电位。

特别地，本发明的纳米颗粒在pH≥6.5，特别是pH≥7，尤其是pH≥8，且离子电导率严格小于100μs.cm^-1的水性介质中具有小于或等于-30mV的ζ电位。

表示为ζ的“ζ电位”可以定义为溶液内部与颗粒剪切平面之间存在的电位差。它代表了悬浮液的稳定性。剪切平面(或流体动力学半径)对应于围绕颗粒的假想球体，在其中当颗粒移动通过溶液时，溶剂与颗粒一起移动。ζ电位可以通过本领域技术人员已知的方法来确定，例如，如下所述，通过将具有其增溶层的颗粒在电场中移动。

在pH≥5，特别是pH≥6.5的水性介质中，纳米颗粒的负ζ电位小于或等于-28mV，特别是小于或等于-30mV，增加了水性溶液中纳米颗粒相对彼此的静电排斥的现象，因此可以抑制絮凝现象。实际上，根据经验，本领域技术人员已知，高绝对值的ζ电位，尤其是高于28mV，通常会抑制低离子强度的介质中的絮凝作用。

根据变型实施方式，在根据本发明的超灵敏检测方法中使用的纳米颗粒是下式(II)的纳米颗粒：

A_1-xLn_xVO_4(1-y)(PO₄)_y (II)

其中：

.A选自钇(Y)、钆(Gd)、镧(La)、镥(Lu)及其混合物，特别地A选自Y、Gd、La及其混合物，并且更特别地，A代表Y；

.Ln选自铕(Eu)、镝(Dy)、钐(Sm)、钕(Nd)、铒(Er)、镱(Yb)、铥(Tm)、铽(Tb)及其混合物，优选地Ln代表Eu；

.0<x<1，特别地0.2≤x≤0.6，并且更特别地x为0.4；以及

.0≤y<1，特别地y为0。

根据特定实施方式，纳米颗粒具有上述式(II)，其中，y为0。换言之，在本发明的方法中使用的纳米颗粒具有式A_1-xLn_xVO₄(III)，其中，A、Ln和x如上定义。

根据特定实施方式，上述式(II)或(III)中的A代表钇(Y)。

根据另一特定实施方式，上述式(II)或(III)中的Ln代表Eu。

因此，根据变型实施方式，本发明的颗粒包括式Y_1-xEu_xVO₄(IV)的纳米颗粒，其中，0＜x＜1，特别地0.2≤x≤0.6，并且更特别地x为0.4。

优选地，根据本发明使用的式(II)、(III)或(IV)的纳米颗粒在它们的表面上具有四烷基铵阳离子。

有利地，这些大量抗衡离子的使用提供了溶液中颗粒的改善的胶体稳定性，并且特别地防止了颗粒絮凝现象。不希望受理论束缚，与例如使用钠离子相比，由于使用四烷基铵抗衡离子而引起的稳定性方面的这种改善与颗粒的ζ电位的差异有关。实际上，与例如使用钠抗衡离子相比，使用四烷基铵抗衡离子引起颗粒的绝对值增加的负ζ电位。

应该注意的是，即使在具有高离子强度的介质中，该稳定性也很重要，就像在纯化前(离子强度大于0.1M)的合成介质中的情况一样。特别地，根据本发明的颗粒的水性悬浮液在几周的时间内几乎没有或没有絮凝现象。

四烷基铵型阳离子在本发明的纳米颗粒表面上的固定更特别地由于式(II)的纳米颗粒的带负电的(O^2-)表面离子与带正电的四烷基铵型抗衡离子之间的静电相互作用。

因此，四烷基铵阳离子通过与纳米颗粒带负电的表面离子的静电相互作用而直接与纳米颗粒缔合。特别地，四烷基铵阳离子在纳米颗粒表面上的固定不涉及任何“间隔基”基团。

更特别地，术语“四烷基铵”阳离子是指四(C₁-C₆)烷基铵阳离子，即式NR₄ ⁺阳离子，其中R可以相同或不同，代表C₁-C₆-烷基，特别是C₁-C₄-烷基基团。

优选地，“四烷基铵”阳离子是四(C₁-C₃)烷基铵阳离子，即式NR₄ ⁺的阳离子，其中R可以相同或不同，代表C₁-C_3-烷基。

“C₁-C_6-烷基”是指具有1至6个碳原子的饱和、直链或支链的脂族基团。实例包括甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、叔丁基等。

四烷基铵阳离子优选选自四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵、四丁基铵阳离子及其混合物。

根据特定实施方式，存在于本发明的纳米颗粒表面上的阳离子是四甲基铵阳离子。

如上所述，本发明的纳米颗粒表面上存在的四烷基铵阳离子的量足以在所述合成颗粒的水性悬浮液的胶体稳定性方面提供所需的结果，即所需的ζ电位值。

在本发明的纳米颗粒表面上存在的四烷基铵阳离子可以每纳米颗粒100至10000个四烷基铵阳离子的比例存在。

因此，本发明的纳米颗粒可以是下式(II')的纳米颗粒：

A_1-xLn_xVO_4(1-y)(PO₄)_y·(NR₄ ⁺)_z (II′)

其中：

.A选自Y、Gd、La、Lu及其混合物，特别地，A选自Y、Gd、La及其混合物，优选A代表Y；

.Ln选自Eu、Dy、Sm、Nd、Er、Yb、Tm、Tb及其混合物，优选Ln代表Eu；

.0＜x＜1，特别地0.2≤x≤0.6，并且更特别地x为0.4；

.0≤y<1；

.R可以相同或不同，如上所限定，优选代表C₁-C₃烷基，特别是甲基；以及

.z代表位于所述纳米颗粒表面上的四烷基铵阳离子NR₄ ⁺的数目，特别地z在100至10000之间。

根据特定实施方式，该米颗粒具有上述式(II')，其中，y为0。换言之，本发明的纳米颗粒可以更特别地具有式A_1-xLn_xVO₄·(NR₄ ⁺)_z(III')，其中，A、x、Ln、R和z如上限定。

根据特定实施方式，上述式(II')或(III')中的A代表钇(Y)。

根据另一特定实施方式，上述式(II')或(III')中的Ln代表Eu。

因此，根据具体的变型实施方式，本发明的纳米颗粒可以更特别地具有式Y_1- _xEu_xVO₄·(NR4⁺)_z(IV')，其中，x、R和z如上所限定。

应当理解，可以将上述不同的实施方式，尤其是关于光致发光纳米颗粒的性质和表面四烷基铵阳离子的性质进行组合。

举例来说，根据本发明使用的光致发光颗粒可以包括式Y_0.6Eu_0.4VO₄的纳米颗粒，在其表面上任选地固定有四甲基铵阳离子。

特别地，它可以具有式Y_0.6Eu_0.4VO₄·(NR₄ ⁺)_z，z代表四烷基铵阳离子的数目。

根据本发明的纳米颗粒，特别是上述式(II)的纳米颗粒，在本质上主要为晶体状和多晶体状，特别地具有如以下实施例1中详述的如通过X射线衍射推导出的在3至40nm之间的平均晶粒尺寸。

纳米颗粒的制备

可通过本领域技术人员已知的任何常规方法来制备在本发明的方法中使用的掺杂稀土离子的晶体基质纳米颗粒。

有利地，本发明的纳米颗粒易于在水性介质中合成，其具有的优点在于无需进行任何后续的溶剂转移步骤。

特别地，式A_1-xLn_xVO_4(1-y)(PO₄)_y(II)的纳米颗粒可以在水性介质中由所述元素A和Ln的前体以及在原钒酸根离子(VO₄ ^3-)和任选的磷酸根离子(PO₄ ^3-)的存在下通过共沉淀反应形成。

元素A和Ln的前体通常可以是所述元素的盐的形式，例如硝酸盐、氯化物、高氯酸盐或乙酸盐，特别是硝酸盐。当然，元素A和Ln的前体以及它们的含量是根据所需纳米颗粒的性质适当选择的。

例如，式Y_1-xEu_xVO₄(IV)的纳米颗粒的合成可以使用作为钇和铕前驱体化合物的硝酸钇(Y(NO₃)₃)和硝酸铕(Eu(NO₃)₃)。

有利地，共沉淀反应在有效量的四烷基铵阳离子的存在下进行。

四烷基铵阳离子更特别地如上限定。它们优选选自四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵、四丁基铵阳离子及其混合物。它们优选是四甲基铵阳离子。

更特别地，“有效量”是指阳离子的使用量足以在所述合成颗粒的水悬浮液的胶体稳定性方面提供所需的结果。

特别地，四烷基铵阳离子的使用量使得从本发明的合成方法获得的纳米颗粒具有如上所述的ζ电位。如以下实施例1所说明的，根据本发明的共沉淀反应中的四烷基铵阳离子是原钒酸根离子(VO₄ ^3-)的抗衡离子，并且任选地是磷酸根离子(PO₄ ^3-)的抗衡离子(在y≠0的情况下)。

根据特别优选的实施方式，原钒酸根离子(VO₄ ^3-)由偏钒酸盐，优选偏钒酸铵(NH₄VO₃)原位产生。

原钒酸根离子可以更特别地通过所述偏钒酸盐与碱(更确切地说与两当量的强碱)反应而原位形成。

特别地，用于由偏钒酸盐原位形成原钒酸根离子的碱是四烷基铵阳离子的来源。例如，它可以是四烷基氢氧化铵，例如四甲基氢氧化铵。

与使用原钒酸钠相比，将偏钒酸盐诸如偏钒酸铵用于合成本发明的纳米颗粒证明是特别有利的，因为它避免了与原钒酸钠的碳酸盐含量变化相关的可再现性问题。

举例来说，实施例1中示出了由偏钒酸铵和四甲基氢氧化铵的合成反应。

还可以设想使用偏钒酸烷基铵(不可商购获得)和另一种强碱诸如氢氧化铵。

用于制备根据本发明的颗粒的方法可以更具体地实施至少以下步骤，包括：

(i)提供一种水性溶液，表示为溶液(1)，其含有原钒酸根离子(VO₄ ^3-)和任选的磷酸根离子(PO₄ ^3-)，以及四烷基铵阳离子；

(ii)在有助于通过共沉淀形成式(II)的纳米颗粒的条件下，将含有元素A和Ln的所述前体(特别地为盐形式，尤其是硝酸盐形式)水性溶液，称为溶液(2)，添加至水性溶液(1)中；以及

(iii)回收在步骤(ii)结束时形成的所述式(II)的纳米颗粒，四烷基铵阳离子位于其表面上。

水性溶液(1)可以更特别地通过混合至少一种偏钒酸盐(特别是偏钒酸铵)和至少一种碱(四烷基铵阳离子的来源)(例如四烷基氢氧化铵)来制备。

在磷酸根离子的情况下，添加磷酸盐，诸如磷酸钠或磷酸铵。

因此，根据特别有利的变型实施方式，本发明的方法至少包括以下步骤：

(i)通过在水性介质中混合偏钒酸盐(特别是偏钒酸铵(NH₄VO₃))，以及任选的磷酸盐和碱(四烷基铵阳离子的来源)(特别是四烷基氢氧化铵)来制备水溶液(1)；

(ii)在有利于通过共沉淀形成所述式(II)的纳米颗粒的条件下，将含有元素A和Ln的所述前体(特别地是盐形式，特别地是硝酸盐)的水性溶液(2)添加至水性溶液(1)中；以及

(iii)回收在步骤(ii)结束时形成的式(II)的纳米颗粒，四烷基铵阳离子位于其表面上。

根据特定实施方式，在步骤(ii)中将溶液(2)添加至溶液(1)中是逐滴进行的。

根据另一变型实施方式，溶液(2)可以一次性地添加至溶液(1)中，而不是逐滴地添加。

溶液(1)和(2)的水性介质更特别地由水组成。

在特定实施方式中，含有元素A和Ln的前体的水性溶液(2)还可以含有这些元素的络合剂，诸如柠檬酸盐，例如柠檬酸四烷基铵。

依据根据本发明的式(II)的纳米颗粒所需的性质，由本领域技术人员决定适当地调节各种试剂的量，特别是原钒酸离子前体、任选地磷酸盐以及所述元素A和Ln的量。

特别地，必须注意根据式(II)、(II')、(III)、(III')、(IV)和(IV')的不同试剂的化学计量比例。当通过直接激发(即与这些离子的电子态共振)来提供Ln离子的光学激发时(如根据本发明的超灵敏方法一样)，而不是通过如上所述的激发AVO_4(1-y)(PO₄)_y基质以及随后的能量转移到这些离子上，其优选具有较高的x值，优选0.2至0.6，并且优选为0.4。

有利地，与出版物[26]至[29]中提出的水热方法不同，用于制备纳米颗粒的方法不需要对溶液进行任何加热。特别地，用于合成根据本发明的颗粒的所有步骤(i)至(iii)可以在室温(20-25℃)下有利地进行。

然而，更高温度的制备方法(例如水热型方法)可以生产具有类似结晶性的纳米颗粒，只要温度不超过600℃，因此允许获得如上所述的具有不完美结晶性的纳米颗粒，并且从而实现高量子产率。

步骤(iii)更具体地包括纯化获得的颗粒的溶液，尤其是除去过量的抗衡离子。

纯化步骤可以更特别地包括颗粒的透析或离心和例如通过超声将再分散在水性介质中的步骤。

可以将颗粒再分散在水性介质中，特别是在水中。如上所述，本发明颗粒的水性胶体悬浮液即使在储存数月后仍显示出非常好的稳定性。

举例来说，全部或部分由式Y_1-xEu_xVO₄(IV)的纳米颗粒组成的颗粒，其中，0＜x＜1，可以至少通过以下步骤制备：

(i)提供含有原钒酸根离子和四烷基铵阳离子的水性溶液(1)，所述水溶液(1)优选是由偏钒酸铵(NH₄VO₃)和四烷基氢氧化铵的混合物在水性介质中获得的；

(ii)在有助于通过共沉淀形成式(IV)的纳米颗粒的条件下，将含有Y和Eu的前体(特别是硝酸钇和硝酸铕)的水性溶液(称为溶液(2))添加至水性溶液(1)中；以及

(iii)回收在步骤(ii)结束时形成的所述式(IV)的纳米颗粒，四烷基铵阳离子位于其表面上。

如上所述，在它们的合成结束时，纳米颗粒具有较低的多分散性。可以根据MET测量推导出的多分散指数可以特别严格地小于0.2。

可以通过本领域技术人员已知的任何其他方法，例如通过研磨固体材料，来合成根据本发明的发光纳米颗粒，特别是尺寸较大的，超过几十纳米的发光纳米颗粒。

靶向剂

根据本发明的方法，用作发光探针的颗粒与用于待分析样品中物质的至少一种靶向剂连接(或接枝)。

“靶向剂”是指允许与生物学或化学上感兴趣的物质键合的化合物，并且寻求对其鉴定。

当然，所用的靶向剂的性质是根据样品中待分析的物质选择的。

用于根据本发明的超灵敏方法中的颗粒完全适合于多种生物靶向，特异性取决于接枝到纳米颗粒表面上的靶向剂(一种或多种)的性质。

靶向剂可以更特别地选自多克隆或单克隆抗体、抗体片段、纳米抗体、寡核苷酸、肽、激素、配体、细胞因子、拟肽、蛋白质、碳水化合物、化学修饰的蛋白质、化学修饰的核酸、靶向已知细胞表面蛋白质的化学修饰的碳水化合物、适配体、蛋白质和DNA/RNA组装物或HaloTag型标志物所使用的氯烷。也可以使用SNAP-Tag或CLIP-Tag方法。

根据特定实施方式，它是抗体或抗体片段。

合适的抗体片段包括免疫球蛋白的至少一个可变结构域，诸如单个可变结构域Fv、scFv、Fab、(Fab′)²和其他蛋白水解片段或纳米抗体(单结构域抗体，诸如从骆驼科抗体获得的V_HH片段或从软骨鱼抗体获得的V_NAR片段)。

根据本发明的术语“抗体”包括嵌合抗体；人或人源化抗体，重组和修饰抗体，缀合抗体及其片段。

根据特定实施方式，根据本发明使用的抗体或抗体片段靶向特异于癌细胞的标志物。

靶向剂还可以衍生自已知的结合细胞表面受体的分子。例如，靶向片段可衍生自低密度脂蛋白、转铁蛋白、EGF、胰岛素、PDGF、纤溶酶、抗HER2、抗HER3、抗HER4、膜联蛋白(annexins)、白介素、干扰素、促红细胞生成素或集落刺激因子。

颗粒与靶向剂的连接

由本领域技术人员决定实施适当的连接/接枝方法以充分制备与一种或多种靶向剂连接的颗粒。相对于颗粒的量来调节所使用的靶向剂(一种或多种)的量。

靶向剂可以直接或通过间隔基或接头接枝到纳米颗粒上。

将颗粒连接或接枝到生物分子上的方法是本领域技术人员熟知的。它通常通过共价键结合、通过表面络合、通过静电相互作用、通过包封或通过吸附来进行连接。

在某些情况下，包括共价连接的情况，颗粒可以通过化学基团进行预官能化，然后其可以与靶向剂携带的另一化学基团反应以形成共价键。

可以存在于纳米颗粒表面上的化学基团的实例包括羧基、氨基、硫醇、醛和环氧基基团。

氨基可以由诸如氨基有机硅烷诸如氨基三乙氧基硅烷(APTES)的分子提供。APTES的优势在于它通过共价键在纳米颗粒周围形成囊腔。因此，通过APTES提供的胺随时间推移非常稳定。通过与琥珀酸酐反应，可以将氨基转化为羧基。

羧基可以由诸如柠檬酸或聚丙烯酸(PAA)的分子提供。

例如，本发明的纳米颗粒可以用柠檬酸(根/盐)来进行表面官能化，如以下实施例1所说明的。

根据另一特定实施方式，本发明的纳米颗粒可以通过聚丙烯酸(PAA)进行表面官能化。在使用PAA进行官能化的情况下，PAA在位置上越长，通过每个PAA分子形成的配位键(配价键)的数量就越大。例如，PAA具有的聚合度可以为3至10000。

有利地，通过PAA对纳米颗粒进行的官能化得到官能化的纳米颗粒，并且得到由这些官能化的纳米颗粒与一种或多种靶向剂的连接产生的纳米颗粒，其在随着时间推移的稳定性方面具有优异的性能。

在其他情况下，可以首先将颗粒连接至能够允许随后与靶向剂连接的分子。

例如，可以将颗粒连接至能够与生物素化靶向剂连接的链霉亲和素。

举例来说，实施例1说明了通过将链霉亲和素连接的纳米颗粒与生物素化抗体连接来使纳米颗粒与生物素化抗体连接。其也可以通过将抗体连接在用柠檬酸或聚丙烯酸官能化的纳米颗粒上直接进行。

在其他情况下，可以通过将抗体与用APTES官能化的纳米颗粒连接来直接实现纳米颗粒与抗体的连接。如上所述，通过与琥珀酸酐反应，可以将由APTES提供的氨基先转化为羧基。然后可以通过本领域技术人员已知的任何技术，特别是通过与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应来活化羧基，然后当靶向剂是蛋白质或抗体时，与多肽表面上的胺官能团反应并形成共价酰胺键。

通过APTES对纳米颗粒进行的官能化可以有利地通过使用二氧化硅层涂覆纳米颗粒来完成。

还可以通过本领域技术人员已知的任何其他方法来完成靶向剂与纳米颗粒表面的连接。

也可以有利地通过用二氧化硅层涂覆纳米颗粒来完成，然后与APTES(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)进行涂覆反应，APTES的胺官能团用于与具有两个NHS官能团的双官能交联剂反应。然后，与交联剂连接的纳米颗粒可以与蛋白质(抗体、链霉亲和素等)表面上的胺官能团反应。参考文献[32]和[33]中特别描述了这种类型的连接过程。

有利地，在根据本发明的超灵敏检测方法中使用的颗粒具有较低的多分散性。优选地，可以根据TEM测量或动态光散射(DLS)测量值推导出的多分散指数严格小于0.2。不是在颗粒合成或官能化之后的情况下，可以通过离心或通过本领域技术人员已知的任何其他技术进行尺寸分选来获得较低的多分散性。

发光探针与待分析物质的联接

在根据本发明的超灵敏检测方法的第一步中，将光致发光颗粒与待分析样品的物质进行联接。

该步骤可以类似于常规方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA))在载体表面上进行，如图1中示意性示出的。

该变型实施方式将在下文中更详细地讨论。

如实施例2所述，其尤其涉及将待分析的样品的物质预先固定在载体表面上。

特别地，本发明方法的步骤(i)可以包括以下步骤：

(a)得到载体，该载体的表面事先钝化并且使用用于待检测/定量物质的靶向剂进行官能化，靶向剂例如第一单克隆抗体，称为捕获抗体；

(b)在有利于所述物质与靶向剂联接的条件下，使所述待分析的样品与步骤(a)的载体接触；以及

(c)使与至少一种靶向剂连接的光致发光颗粒与来自步骤(b)的所述载体接触，以使颗粒与固定在载体表面上的所述物质进行联接。

载体可以是不同类型的。这些可以是载玻片，例如在实施例中使用的玻璃载玻片、多孔板、微孔板、膜凝胶、条带或微通道。它也可以是具有良好光学质量的塑料或具有足够光学质量的任何其他材料。

首先对载体的表面进行钝化，以便在不存在待分析物质的情况下，发光颗粒不会附连在其上。

表面钝化可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。

例如，它可以是用含有聚乙二醇(PEG)的分子，例如用硅烷-PEG分子进行钝化的玻璃表面。优选地，PEG具有的摩尔质量可以在3000至20000g·mol^-1之间。PEG越长，钝化效果越好。然而，PEG优选不要太长，以免对待分析物质的结合产生空间位阻。

通过用于待检测/定量的物质的第一靶向剂将载体进一步表面官能化。如图1的阶段1所示，它更特别地可以是称为捕获抗体的抗体，尤其是当待分析的物质是生物标志物、蛋白质或多肽类型时。

当待分析的物质是抗体类型时，靶向剂可以是对待检测抗体具有特异性的抗原类型。

表面官能化可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。例如，其可以如下完成：通过点样器印刷(spotter printing)(借助机器人将含有目标分子的溶液的微滴沉积在表面上)，通过接触印刷技术来实现(其通过缓冲剂(例如聚二甲基硅氧烷PDMS缓冲液)的拓扑结构和基底的表面之间进行接触来转移分子)，或通过本领域技术人员已知的用于将靶向剂沉积在基底表面上的其他方法。

然后将待分析的样品与所述载体的官能化表面接触，以使待检测/测定的物质与载体携带的靶向剂联接(连接)(图1的阶段2和阶段3)。

例如，在常规ELISA中，该步骤包括以下步骤：在载体表面上孵育样品，以及洗涤/冲洗载体以去除溶液和未结合的分子。冲洗后，只有靶向剂/测定物质复合物(例如抗体/抗原)保持与载体表面附连。

最终，将如上所述全部或部分由光致发光纳米颗粒组成并与用于待分析物质(例如抗体)的靶向剂连接的光致发光颗粒与固定在载体表面的待分析物质连接(图1的阶段4)。

该步骤包括在官能化载体的表面上孵育光致发光颗粒的溶液，并且然后洗涤/冲洗载体以去除未结合至载体的颗粒。冲洗后，只有靶向剂/测定物质/与至少一种靶向剂连接的颗粒复合物(例如单克隆抗体/抗原/多克隆抗体-纳米颗粒)保持与载体表面附连。可以通过预先测试来调节孵育时间以最大化发光发射信号，如实施例4中所示。通常来说，孵育时间可以在45分钟至2小时之间。

与靶向剂连接的颗粒与待分析物质的连接可以例如涉及配体/抗配体对的识别，例如生物素或生物素化化合物/亲和素或链霉亲和素、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体，诸如地高辛(DIG)/抗DIG抗体、糖/凝集素、多核苷酸/多核苷酸补体等，应理解的是，这些对的要素之一构成了待分析的物质，或者也可以与待分析的物质连接。

应当理解，待分析的物质可以被固定在载体表面的几个预定且不同的区域中。

这可以通过用所述靶向剂(例如捕获抗体)实施载体表面的局部官能化来特别地实现，例如通过点样器印刷(借助机器人将含有靶向分子的溶液的微滴沉积在载体表面上)，或通过接触印刷技术，其允许载体表面根据某些图案进行官能化，例如，由用于转移分子的缓冲液所限定的图案，如实施例2所说明的。它可以是同一靶向剂在几个预定区域内的沉积。在这种情况下，这些多个区域用于检测几个不同样品中的相同物质。

当将根据本发明的超灵敏检测方法用于多重分析时，更特别地进行这种实施。

在多重分析的上下文中，允许同时检测和/或定量样品中的至少两种不同物质，可以将样品中待分析的不同物质固定在载体表面的预定且不同的区域中，例如，用对每种待分析物质特异性的靶向剂对载体表面进行局部官能化。首先对表面进行钝化处理，以便在不存在待分析物质的情况下，光致发光颗粒不会与其附连。

在这种情况下，所使用的颗粒应在它们的表面上具有多种不同的靶向剂，并且，特别是对每种待分析物质特异性的至少一种靶向剂。这样，待分析的物质将通过每个区域中颗粒的发射强度来进行量化，所讨论区域的空间位置表明了物质的性质。在图22中示意性地示出了根据空间多重复用的本发明的超灵敏方法的实现。

还可以通过对每种待分析物质特异性的靶向剂局部官能化载体表面的预定且不同的区域，并且，重复次数与待分析的样品数相同，将用于待分析的多个样品和多种物质的多重方法结合起来。在这种情况下，每个区域中颗粒的发射强度指示每个样本中每种待分析物质的存在和/或浓度，所讨论区域的空间位置指示物质的性质(身份)和样本编号两者。

涉及每个样品中不同物质的区域可以通过水密屏障彼此隔开。这样，将含有不同待分析物质的样品与载体表面上涉及同一样品的所有区域进行接触(上述步骤(b))可以在单个步骤中完成且无需增加所需的体积。

对于多重检测，也可以使用至少两种类型的纳米颗粒，该至少两种类型的纳米颗粒掺杂有不同的稀土离子，具有不同的发射波长，例如YVO₄:Eu和YAG:Ce，并与用于每种待分析物质的靶向剂连接。通过使用两个不同的发射滤波器来检测发光信号，可以检测和/或测定每种待分析的物质。

优选地，在这种多重检测变体的上下文中，可以使用至少两种类型的具有不同发射波长的纳米颗粒，并且每种纳米颗粒都与用于每种待分析物质的靶向剂连接，以分离所获得的发光信号。

也可以使用两种方法的组合(分析几个不同的样品和每个样品中的几种不同物质)，尤其是用于比较至少两个样品之间目标分子的浓度，这是通过比较样品的强度来进行的。这是通过比较每种纳米颗粒的发射颜色的强度来实现的，每种纳米颗粒与对每种待分析物质特定性的靶向剂连接，对于几个沉积区域，每个区域对应于不同的样品。

或者，也可以使用两种方法的组合——在几个不同的样品中进行分析，每个样品中有几种不同物质(不同来源的样品，或相同来源的在不同时间、不同条件下、不同刺激下等的样品)——尤其是用于比较至少两个样品之间目标分子的浓度。这是通过比较每种纳米颗粒的发射颜色的强度来完成的，每种纳米颗粒与对每种待分析物质特异性的靶向剂连接，用于对应于不同目标分子的几个沉积区域。在这种情况下，给定点上的发射颜色的比较提供了两个样品之间分子浓度的比较。

可以设想这些方法的各种其他组合：例如，使用具有两种不同发射颜色的两种类型的纳米颗粒来分析四种物质，每种纳米颗粒都与识别四种待分析物质所需的四种不同靶向剂中的两种连接，并且，载体表面的两个不同区域通过对每种待分析物质特异性的四种靶向剂中的两种进行局部官能化。

当然，本发明不限于下面描述的变型实施方式，其中，待分析的物质被固定在载体(诸如，例如玻璃载玻片或多孔板)的表面上。为了测量与待分析的样品物质联接的光致发光颗粒的发光，可以想到其他构型。

为了将本发明的光致发光颗粒与待分析的物质联接，可以想到其他构型。

各种实施方式可能涉及例如试纸条(其中分析物通过与目标分子反应从一端迁移到另一端)，或分离生物分子的凝胶和特异性结合和检测分子的膜，类似于蛋白质印迹法。

在其他变型中，反应表面不是固体载体类型，而是例如可以是另一纳米颗粒，磁性微珠等。例如可以直接在待分析的样品中进行测量。如果样品是气态的，则样品载体可以采取封闭体积的形式以防止测试样品分散。样品载体也可以采用池或比色皿的形式，尤其是如果样品为溶液形式。

本发明的超灵敏方法也可以适用于荧光激活细胞分选(FACS)技术。在这种情况下，使与旨在识别构成待分析细胞类型的物质的靶向剂连接的本发明的颗粒与细胞接触，并且细胞术系统必须适合于包括激发源，优选激光，其波长适合于激发构成纳米颗粒的发光稀土离子。

本发明的超灵敏方法也可以适用于免疫细胞化学和免疫组织化学类型的技术。

发光测量

如上所述，根据本发明的超灵敏方法更具体地执实施了通过照明装置激发光致发光颗粒的稀土离子的步骤(ii)，功率为至少50mW，且激发强度为至少1W/cm²以及检测单光子吸收后由颗粒发射的发光的步骤(iii)。

检测装备

根据本发明的超灵敏方法可借助于低复杂度、低成本的设备有利地实施。

更确切地说，它一般包括：

-照明装置，优选是激光类型的照明装置，具有的功率至少为50mW，激发强度至少为1W/cm²；以及

-用于检测由颗粒发射的光强度的装置。

激发源也可以是灯或发光二极管(LED)。

在下文中，将参考所附的图2和图12-图13，它们以示意性和局部的方式展现了适用于实施本发明的超灵敏方法的装置。

另外，如上所述，该设备可以包括用于固定来自所述样品的待分析物质的合适载体。

根据变型实施发射，根据本发明的检测系统包括用于平移载体或激光照明装置的系统，使得可以连续地照射载体的不同局部区域。这种变型尤其用于实施用于空间多重复用的本发明的检测方法(图22)，平移系统允许连续激光照射含有相同样品中或者甚至几个不同样品中的待分析物质的每个预定义区域。然后根据载体的照明位置记录传输(transmission，透射)信号。

激光照明装置特别地可以由功率至少为50mW，特别是至少为500mW，优选至少为1W的激光源(1)和用于成形激光束的光学装备(2)组成，因此，在发光颗粒的水平上可以实现至少1W/cm²，优选至少10W/cm²的激发强度。

用于该实施发射的大功率激光二极管，尤其是在465nm处发射的大功率激光二极管，最近已经在商业上可用于激发Eu³⁺离子。

这样的激发强度确保直接激发稀土离子，即与这些离子的电子态共振，而不是通过激发AVO_4(1-y)(PO₄)_y基质或另一种金属氧化物基质以及随后的能量转移到这些离子。

通过直接激发稀土离子将这些光致发光颗粒用作发光探针绝不是显而易见的。实际上，对于大多数镧系元素离子，与光子吸收有关的电子跃迁是从一个4f电子构型到另一个4f电子构型的所谓的“禁止”跃迁。由于d轨道的低混合(重叠)，因此仅略微地允许吸收(允许d->f或f->d跃迁)。吸收相关的电子跃迁被“禁止”的事实使得吸收峰的光谱宽度较窄，并且溶液中这些纳米颗粒的消光系数较低。

实际上，即使已经使用了由掺杂有稀土离子的晶体基质组成的光致发光颗粒，也通常通过激发它们的晶体基质来使用它们，后者通常比吸收离子吸收得强得多。然而，由于晶体基质通常在UV中吸收，因此激发晶体基质的实施具有几个缺点：一方面，在UV中发射的激光不是很容易商购获得，经常很昂贵并且不是很紧凑，并且，另一方面，UV中的激发可能会同时引起待分析样品中可能存在的其他生物分子的激发。另外，已知在测量期间所用的固体基底(玻璃，塑料等)的吸收和散射会在UV中显著吸收，并且，因此，会引起高振幅的干扰信号。

激光照明装置还可以包括光学装备，特别是具有至少一个透镜的系统，布置在激光束的路径中，以便控制在具有与待分析物质联接的颗粒的载体区域处的光束尺寸。

基于直接激发纳米颗粒的稀土离子的本发明方法使得可以克服与激发结晶基质有关的缺点。

此外，如上所述，根据本发明的高功率和高激发密度的使用不会损害根据本发明实施的纳米颗粒的发光，其不受饱和或光降解现象的影响。

优选地，激光器是单色的，其光谱宽度与发光镧系元素离子的吸收峰的光谱宽度相当。

激发在可见光或近红外范围内进行。

例如，对于Y_0.6Eu_0.4VO₄型颗粒，可以在465nm处的波长下进行激发。

用于成形激光束的光学装备通常可以包括用于准直和减小激光束尺寸的系统，例如通过透镜，特别是两个透镜，如实施例3中所述。然后可以将其用于控制呈现与待分析物质联接的颗粒的载体区域中的照明区域，以便获得适当的强度(例如10W/cm²)和直径接近或小于沉积点直径(例如直径为1mm)的照明。

步骤(ii)中的激发可以更具体地用定向成与在表面上具有与待分析物质联接的所述颗粒的载体竖直方向形成用于宽角度照明样品的大于或等于55°的入射角的激光激发束来进行；特别地，在玻璃或塑料基底上在水性介质中进行测量的情况下，入射角小于60°。

用于激发激光束的宽入射角的使用减少了表面上方被激发介质的体积，从而减少了干扰信号。

根据特别有利的实施方式，本发明的方法包括通过消逝波，特别是借助于全内反射荧光(TIRF)型激光照明装备来激发颗粒。在载体和待分析样品之间是玻璃/水界面的情况下，这可以通过使激发光束的入射角大于或等于61°，特别是61°至63°之间来实现。

本领域技术人员决定对检测装置进行必要的调整，以获得用于消逝波激发的入射。

如图13所示，它尤其可以包括平行六面体，其折射率大于反应溶液的折射率，例如，接近用于载体的材料的折射率，从而允许激发光束的入射角大于固体基底/样品界面的临界角，特别地，在玻璃/水性溶液界面的情况下大于或等于61°，以便获得光束在载体/样品界面处的全反射和与待分析物质联接的颗粒的消逝波激发。

根据另一特别有利的实施方式，在使用具有长发射寿命(特别是发射寿命大于或等于1μs，特别是大于或等于50μs)的颗粒的情况下，使用的是时间分辨的发射检测，特别是由光致发光颗粒发射的信号的延迟检测。

本领域技术人员能够适应用于使发光发射能够以时间分辨的方式使用的检测系统。

为此，可以将机械斩波器(4)放置在入射激光束的路径中，例如，如图13所示。

在以下实施例3.2中更详细地描述了这种机械斩波器的操作原理以及分析所得信号以分离来自纳米颗粒的发光信号的方法。检测装置的光电倍增管使用机械斩波器和100kHz的信号检测频率可以避免干扰荧光。

因此，这种时间分辨检测有利于通过从纳米颗粒发射的信号中在时间上分离干扰发光信号来限制对样品(血清，血液等)或所使用的固体基底(玻璃，塑料等)中存在的干扰物质的发光信号的贡献，因为这些干扰信号通常具有的特征寿命小于1μs，或者甚至小于100ns，或者甚至小于10ns。

应该理解的是，可以组合上述各种具体实施方式以实现根据本发明的检测方法的不同变型实施方式。

特别地，纳米颗粒的时间分辨检测和消逝波激发(TIRF装备)可以一起实施，如图13所示，也可以不一起实施。

因此，根据优选的实施方式，根据本发明的超灵敏检测方法有利地结合了通过消逝波，特别是借助于TIRF型激光照明装备对纳米颗粒的激发，和发射的时间分辨，特别是发射的延迟检测(实现长发射持续时间的纳米颗粒，使用斩波器)。

因此，有利地，在根据本发明的方法中，纳米颗粒的发射寿命大于或等于1μs，特别地大于或等于50μs，步骤(iii)中的光强度的检测包括发射的时间分辨检测，特别是发射的延迟检测。

两种模式的组合使得有利于消除溶液中颗粒而不是固定在载体表面上的待分析的那些颗粒的发射，以及样品(血清，血液，等)中或所用的固体基底(玻璃，塑料等)中存在的任何干扰物质的发射。

这样的变型实施方式是特别有利的，因为它省去了一些用于制备待分析样品的常规步骤，并且特别是冲洗和/或离心步骤，例如在分析过程中冲洗以去除除了待进行的分析所涉及的那些物质以外的血液血浆所含物质(分子、蛋白质、肽等)的情况下(如图1所示冲洗从阶段2进行到阶段3)，或除去其自身未附连至载体表面并且在图1)的阶段4期间保持在溶液中的颗粒，或者，例如，在进行实际分析之前的离心步骤，如在图1中所示，以从血液样品中除去血细胞，这通常是费时的并且手动执行的，特别是离心步骤。

发光发射检测可以通过测量在所使用的光致发光颗粒的发光波长下发射的光强度来进行。举例来说，在使用Y_1-xEu_xVO₄纳米颗粒的情况下，可以在Eu³⁺的发光波长即617nm处测量发射光的强度。

光强度检测装置可以包括单个检测器，特别是光电倍增管、光电二极管、雪崩光电二极管类型，或者由感应像素的2D区域组成的光敏装置阵列类型的检测器，诸如CCD或EM-CCD相机或CMOS相机。2D检测装置允许同时测量来自对应于载体表面上待分析的不同样品和/或不同物质的不同区域的纳米颗粒的发射信号，并且不需要载体或激发束的任何移动。

优选地，光强度检测装置包括单个检测器，特别是光电倍增管，由此可以实现较便宜的检测装置。

它还可以包括光学装备，特别是至少一个具有大数值孔径的透镜的系统，以将发光发射聚焦至检测器，特别是聚焦至光电倍增管。

干扰滤波器也可以放置在发射光束的路径中，以光谱反式消除干扰信号。

如图12-a示意性所示，该检测可以在向下反射中进行，即在接收激光激发光束的载体表面的一侧进行。

或者，如图12-b示意性所示，检测可以在向上传输中进行。在消逝波激发的情况下，优选从上方收集发光，以便避免发光光子穿过允许实现消逝波的平行六面体。

发光测量值的分析

本发明的方法最后包括步骤(iv)，通过解析发光测量值来确定物质的存在和/或浓度。

应该理解的是，根据本发明的检测系统可以另外包括用于分析发光发射的任何装置，例如用于记录和评估发光信号的转换器。

发光测量值的解析可以通过参考预先建立的标准或校准来进行。

更确切地说，样品中待分析物质的量可以参考通过测量预先建立的校准曲线来确定，该测量是使用具有已知量所述物质的样品进行的，优选在与样品研究相同的条件下进行，这些相同的条件特别地包括溶剂和介质的pH。

有利地，如实施例3所示，根据本发明的超灵敏方法使得可以检测和定量样品中含量严格低于10pM，特别是低于1pM，或者甚至低于0.1pM，或低于0.01pM(即10fM)的感兴趣物质。

实际上，使用相同的识别和靶向抗体，它允许的检测灵敏度是ELISA型酶免疫检测方法的检测灵敏度的至少10倍，特别是至少100倍，或者甚至1000倍。

体外诊断试剂盒

根据本发明的另一方面，本发明还涉及体外诊断试剂盒，其至少包括：

-全部或部分由上述光致发光无机纳米颗粒组成的发光颗粒，

所述颗粒已经与用于待分析物质的至少一种靶向剂连接；

-检测和/或定量系统，其至少包括：

.激光照明设备，其具有至少50mW或至少500mW的功率，以及用于成形激光束的光学装备，以便在样品水平获得至少1W/cm²，优选至少10W/cm²的激发强度

.用于检测由颗粒发出的光强度的装置。

如上所述，根据本发明的体外诊断试剂盒可以另外包括用于固定所述样品的待分析物质的合适载体。

如上所述，这可以是以下载体，其表面已经被钝化并且被用于待检测/定量物质的靶向剂，例如第一抗体，官能化。

在第一变型实施方式中，根据本发明的体外诊断试剂盒可以包括已经与靶向剂(特别是称为“检测抗体”的抗体)连接的根据本发明的光致发光颗粒，以将它们与固定在载体水平的捕获抗体区分开。

与靶向剂连接的颗粒可以如上所述获得。

在另一变型实施方式中，试剂盒可以包括不与靶向剂连接的颗粒，由此使用者或从业者可以制备与用于在根据本发明的超灵敏方法中实施的一种或多种靶向剂连接的颗粒。

根据特定实施方式，因此，根据本发明的体外诊断试剂盒可以包括几个容器，几个容器以分离的方式含有一方面所述未连接的颗粒以及另一方面一种或多种靶向剂。

或者，根据本发明的体外诊断试剂盒不包括靶向剂，使用者或从业者能够通过任何合格的供应商独立地获得他选择的例如生物素化的靶向剂。

与靶向剂连接的颗粒的制备在该变型实施方式的上下文中包括将根据本发明的非连接颗粒与靶向剂混合，浓度比在根据本发明的体外诊断套装中存在靶向剂的情况下通过容器的含量来预确定，或者由使用者来确定，例如实施例1中所述。

在根据本发明的体外诊断试剂盒中使用的未与靶向剂连接的颗粒可以尤其是与能够使所述颗粒与靶向剂(例如被生物素化的靶向剂，例如生物素化抗体)连接的分子(例如链霉亲和素)连接的颗粒。

对于这种类型的连接，可以设想其他分子对，例如半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体，诸如地高辛(DIG)/抗DIG抗体、糖/凝集素和多核苷酸/多核苷酸补体。

或者，在根据本发明的在体外诊断试剂盒中使用的未与靶向剂连接的颗粒特别地可以是用能够允许所述颗粒与用于待分析物质的靶向剂连接的化学基团(诸如例如柠檬酸或聚丙烯酸的分子提供的例如羧基、氨基、硫醇、醛或环氧基基团的化学基团)表面官能化的颗粒。

作为实例，可以用柠檬酸或聚丙烯酸对颗粒进行官能化，制备与靶向剂连接的颗粒包括羧基官能团的活化，如实施例1中所述，然后将未连接的颗粒与靶向剂混合。

应当理解的是，纳米颗粒的表面官能化可以超过一层。例如，如上所述，本发明的颗粒可以包括制备或稳定纳米颗粒表面的层，诸如二氧化硅层，然后是通过活性化学基团的官能化层，诸如由氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)组成的层。

以下给出的实施例和附图仅通过非限制性说明本发明的方式给出。

附图说明

图1：生物分子检测原理的示意图：用捕获抗体进行表面官能化(阶段1)；接触待分析样品(阶段2)，洗涤(阶段3)，以及将与靶向剂(此处为抗体)连接的光致发光颗粒与固定在载体表面上的物质联接(连接)，然后洗涤以除去未固定的颗粒(阶段4)；

图2：根据本发明的检测装置的示意图，主要由激光源1，用于准直和减小激光束尺寸的系统2，用于引导激光束的反射镜3，用于样品的载体6，以及用于检测发射的光子的系统，该系统包括具有大数值孔径的透镜10和光电倍增器12；

图3：实施例1中获得的纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)图像(比例尺：分别为60nm(图3a)和5nm(图3b))；

图4：根据实施例1的一组约300个纳米颗粒的TEM图像确定的纳米颗粒尺寸的直方图；

图5：对于根据实施例1(黑线)和实施例3(灰线)合成的纳米颗粒获得的X射线衍射图。

图6：用柠檬酸(根/盐)(图6a)或用聚丙烯酸(PAA)(图6b)官能化的本发明的纳米颗粒的示意图。为了清楚起见，仅示出了一个柠檬酸(根/盐)或PAA分子。应当理解的是，每个纳米颗粒可以在其表面上具有许多柠檬酸(根/盐)或PAA分子。

图7：根据实施例1，用于将根据本发明的纳米颗粒与链霉亲和素进行连接的反应的示意图；

图8：链霉亲和素连接的纳米颗粒与生物素化抗体连接的示意图；

图9：使用旋转机械斩波器以获得周期性照明的示意图，以及所获得的激发强度的时间曲线。在所示的时间曲线的情况下，由于有限的光束尺寸和机械斩波器叶片暴露或隐藏整个激发光束所需的时间，所得的激发强度会逐渐增加或减少；

图10：纯水(a)、水中的纳米颗粒(3mM钒酸根离子浓度的滴)(b)和血清中的纳米颗粒(3mM钒酸根离子浓度的滴)(c)的情况下，在斩波器的半个关闭半周期后以消逝波激发模式(TIRF)获得的信号：原始信号(图10-a)以及延迟检测中的发光信号(在激发光束消隐开始后检测限制为150μs)(图10-b)；

图11：左图：具有两级系统的发光建模。右图：在斩波器的500个打开-关闭循环(圆圈)期间收集的沉积在载玻片上的纳米颗粒(Y_0.6Eu_0.4VO₄)发射的平均信号，与其调整(实线)相比较，确定了纳米颗粒的数量。在HI-LO激发模式下获得的结果(即激发束与样品载体上的竖直方向形成宽角度)；

图12：根据本发明的检测装置的示意图，该装置具有向下发射检测(图12-a)和向上发射检测(图12-b)；

图13：根据本发明的检测装置的示意性图，具有激光束斩波器4和全内反射激发(使用折射率大于或等于用作样品载体的材料的Plexiglas 13平行六面体)；

图14：按照实施例3.2.ii中所述的方案，根据变型2的具有斩波器和消逝波激发的检测装置的校准曲线(图14-a)；以及按照实施例3.2.ii中所述的方案，根据变型3，没有斩波器并且没有消逝波激发的检测装置的校准曲线(图14-b)；

图15：通过ELISA试剂盒(ABCAM商品ab100578)检测溶液中的重组胰岛素。试剂盒供应商指定的检测极限为9pM(50pg/mL)；

图16：使用实施例3中所述的检测装置的变型1检测溶液中浓度最高达9fM(0.05pg/mL)的重组胰岛素(采集时间：30s；每100ms读取信号)。在插图中，已经减去了对应于浓度等于零的信号；

图17：使用实施例3中所述的检测装置的变型2，其中没有斩波器且没有消逝波激发的情况下，以检测溶液中浓度最高达9fM(0.05pg/mL)的重组胰岛素(采集时间：1s；每10μs读取信号)：

图18：使用实施例3中所述的检测装置的变型2，具有斩波器和消逝波激发的情况下，来检测溶液中浓度最高达9fM(0.05pg/mL)的重组胰岛素(采集时间：1s；每10μs读取信号)；

图19：根据实施例3中所述检测装置的变型1，在多孔板上检测不同血清样品中的胰岛素(采集时间：30s；每100ms读取信号)；

图20：根据实施例3中所述检测装置的变型1，具有斩波器的情况下，来检测溶液中浓度最高达3.2fM的重组TSH(采集时间：1s；每10μs读取信号)；

图21：根据实施例4，根据检测装置的变型1检测到的发光信号随着使用的抗体-纳米颗粒缀合物的孵育时间的变化；

图22：空间多重复用原理的示意图；

图23：根据实施例5形成的两个纳米颗粒“斑点”的示意图，以及在不同位置检测到的发光信号；

图24：使用根据本发明的颗粒与单链DNA连接来对DNA/RNA进行检测和定量的示意图。与待检测的链部分互补的单链DNA被固定在载体上。然后将含有待检测的DNA或RNA的样品与官能化载体一起孵育(左图)。冲洗后，将与单链DNA(与待检测的DNA或RNA的未配对部分部分互补)连接的颗粒与载体一起孵育(中间图)。冲洗后，在与待检测的DNA或RNA配对后，只存在固定在载体表面上的纳米颗粒(右图)。如上下文所述，可以对它们进行检测和定量。

图25：使用与链霉亲和素分子连接的根据本发明的颗粒来检测和定量DNA/RNA的示意图。

(a)这种DNA或RNA检测/定量变型使用待附连至检测载体的每端都与链霉亲和素分子连接的单链“识别”DNA，待检测的单链DNA或RNA，以及与生物素分子连接的与DNA部分互补的单链DNA。链霉亲和素连接的DNA(具有与生物素连接DNA的非互补部分)与待检测的DNA至少部分地互补。

(b)载体的表面用PEG进行钝化，并用生物素官能化。每端都与链霉亲和素连接的DNA附连到官能化的载体的表面。然后，在与待检测的DNA一起孵育后，它与固定在载体表面上的DNA匹配。冲洗后，用链霉亲和素钝化残留在表面的生物素。将与生物素附连的“检测”DNA与表面孵育，并与连接两分子链霉亲和素的DNA互补部分配对。

(c)冲洗后，将与链霉亲和素分子连接的本发明的颗粒与表面孵育，并通过与生物素的相互作用与单链“检测”DNA结合。

冲洗后，可以检测和定量固定在表面的颗粒，如上下文中所述。也可以使用在一端与单个链霉亲和素分子连接的“识别”DNA。在这种情况下，如变型1，“识别”DNA仅通过其两端中的一端附连到载体表面。

图26：实施例6中制备的纳米颗粒溶液YVO₄:Dy 3％的激发和发射谱：在λ＝572nm处检测的在Dy³⁺离子直接吸收区中的激发谱(图26-a)以及在λ＝278nm处激发(对应于钒酸盐基质的激发)的发射谱(图26-b)。

图27：实施例7中制备的纳米颗粒溶液YVO₄:Sm 3％的激发和发射谱：在λ＝600nm处检测的Sm³⁺离子直接吸收区的激发谱(图27-a)以及在λ＝278nm处激发(对应于钒酸盐基质的激发)的发射谱(图27-b)。

实施例

实施例1

发光颗粒的制备

1.1.Y_0.6Eu_0.4VO₄纳米颗粒的合成

偏钒酸铵NH₄VO₃用作偏钒酸根VO³-离子的来源，原钒酸根VO₄ ³-是通过与碱反应原位获得的，在这种情况下为四甲基氢氧化铵，N(CH₃)₄OH。硝酸钇和硝酸铕用作Y³⁺和Eu³⁺离子的来源。

新鲜制备10mL的0.1M NH₄VO₃和0.2M N(CH₃)₄OH的水性溶液(溶液1)。

通过注射器柱塞以1mL/min的流速向溶液1滴加10mL体积的另一种Y(NO₃)₃和Eu(NO₃)₃的具有0.1M离子(Y³⁺+Eu³⁺)的溶液。

选择Y(NO₃)₃和Eu(NO₃)₃之间的摩尔浓度比作为纳米颗粒中Y³⁺和Eu³⁺离子之间所需比例的函数，典型地，Y³⁺:Eu³⁺的摩尔比为0.6:0.4。

一旦添加了Y(NO₃)₂/Eu(NO₃)₃溶液，该溶液就会扩散并呈现乳/白色，没有沉淀物形成。合成一直持续到Y(NO₃)₂/Eu(NO₃)₃溶液完全加入为止。

现在必须将最终的20mL溶液进行纯化，以去除多余的抗衡离子。为此，以11000g离心(Sigma 3K10，Bioblock Scientific)(通常为3次)，每次80分钟，然后通过超声进行再分散(Bioblock Scientific，Ultrasonic Processor，以50％在400W功率下运行40s)，直到电导率严格低于100μS·cm^-1。

使用化学电导率仪测量电导率。

在其表面上固定有四甲基铵阳离子的纳米颗粒Y_0.6Eu_0.4VO₄的合成可以示意性地概括如下：

VO₄ ^3-+2N(CH₃)₄ ⁺+NH₄ ⁺+0.6Y(NO₃)₃+0.4Eu(NO₃)₃

→Y_0.6Eu_0.4VO₄+2N(CH₃)₄ ⁺+NH₄ ⁺+3NO₃ ^-

进行了两种合成试验(“合成1”和“合成2”)。

结果

在小瓶中静置16小时后，肉眼观察根据本发明的纳米颗粒溶液，显示出均匀分散的溶液。

最终的溶液在水中保持非常稳定，即使在合成的最终pH值(约pH 5)数月之后。即使在具有高离子强度(＞0.1M)的合成介质中(在去除多余的抗衡离子之前)，溶液也保持稳定。

用DLS-Zeta电位仪(Zetasizer Nano ZS90，Malvern)测定纳米颗粒的ζ电位。下表1中总结了来自两种合成的纳米颗粒的ζ电位的测量结果。

表1

为了进行透射电子显微镜(TEM)观察，将纳米颗粒的稀溶液沉积在碳格栅上。使用Philips CM30显微镜在300kV以0.235nm分辨率运行以进行观察。

通过TEM观察纳米颗粒(图3)显示纳米颗粒具有细长的椭圆形形状。根据TEM图像中确定了一组约300个纳米颗粒的纳米颗粒尺寸(图4)。本发明的纳米颗粒具有的表示为a的长轴长度在20至60nm之间，平均值为约40nm，以及表示为b的短轴长度在10至30nm之间，平均值为约20nm。

MET图像(图3)无法区分晶面，这可能是由于纳米颗粒由比纳米颗粒尺寸小的几个微晶组成的事实。通过X射线衍射实验证实了纳米颗粒的主要结晶和多晶性质。

图5显示了使用Philips X-pert衍射仪获得的X射线衍射图，铜K_α1线

使用X’Celerator面积检测器(PANalytical)记录了衍射强度。

通过应用Scherrer公式根据RX衍射图中的峰宽度可以估计晶体学方向上的相干长度以及由此估计在该晶体学方向上构成纳米颗粒的微晶的平均尺寸。对于不同的晶体学方向获得的相干长度值在3至40nm之间。由于至少一个晶体学方向上的相干长度小于在该方向上的纳米颗粒的尺寸，因此可以推断出纳米颗粒是不完美结晶的(多晶性、缺陷或孔隙率)。在(200)方向上(图3，在

处的峰)，相干长度为10.2nm，比实施例3中的纳米颗粒的相干长度(11.1nm)略短。

1.2.纳米颗粒与链霉亲和素蛋白的连接

i.a.将柠檬酸(根/盐)接枝到纳米颗粒的表面

在根据实施例1.1.合成纳米颗粒之后，取250μL具有5mM浓度的钒酸根离子的Y_0.6Eu_0.4VO₄颗粒，将纳米颗粒溶液以17000g离心30分钟。

取沉淀，并分散在1mL含有柠檬酸根离子(0.2M浓度)的蒸馏水溶液中。

然后在冰浴中将溶液超声处理5分钟，以17000g离心30分钟，然后回收沉淀，并重新分散在含柠檬酸根离子(0.2M浓度)的蒸馏水中。重复此步骤3次。

接枝后，将颗粒分散在蒸馏水(一种溶剂，在其中它们是稳定的)中。

可以通过使用PAA盐，诸如钠盐或铵盐，通过PAA(例如，聚合度在3至10000之间)的官能化代替柠檬酸(根/盐)对纳米颗粒的官能化。

i.b.将PAA接枝到纳米颗粒的表面

在根据实施例1.1合成纳米颗粒之后，取500μL的浓度为10mM的Y_0.6Eu_0.4VO₄颗粒，并将该纳米颗粒溶液以17000g离心30分钟。

取沉淀并将其分散在1mL含有1800Da分子量PAA(75mM浓度)的蒸馏水溶液中。

然后将溶液超声处理5分钟，以17000g离心30分钟，然后回收沉淀并将其重新分散在含有1800Da分子量PAA(浓度为75mM)的蒸馏水中。重复此步骤3次。

图6示意性地示出了用(a)柠檬酸和(b)聚丙烯酸官能化的本发明的纳米颗粒。

ii.纳米颗粒与链霉亲和素的连接

将接枝有柠檬酸根离子或PAA的纳米颗粒(NP)以16000g离心1小时，并且，然后回收沉淀。

通过柠檬酸(根/盐)接枝在表面的纳米颗粒与链霉亲和素的连接是根据以下方案进行的：

1.新鲜制备在MES缓冲液³(pH 5-6)中的EDC¹/磺基-NHS²的混合溶液(浓度分别为30和30mg/mL)。

2.通过超声处理(超声浴)将NP的沉淀分散在步骤1中制备的250μL溶液中。由于离心损失低，钒酸根离子的浓度保持在5mM左右，从而使纳米颗粒浓度为48nM。

(纳米颗粒溶液的钒酸盐浓度是通过将颗粒溶解在酸性介质中，然后比色法确定钒酸根离子浓度来确定的，如参考文献[34]Abdesselem等人，ACS Nano 8，11126-11137(2014)中所述。如参考文献[35]中所述，根据钒酸根离子的浓度确定纳米颗粒的摩尔浓度。

3.制备在含有10mM NaCl的pH 7.4磷酸盐缓冲液中的100nM链霉亲和素(SA)溶液。将链霉亲和素溶液稀释至由每个所需纳米颗粒接枝的蛋白质数量决定的浓度(对于链霉亲和素:NP比例为1:1、5:1和10:1，分别选择浓度为4.8nM、24nM和48nM)。优选地，选择至少20:1的比例，即SA浓度为96nM。将250μL该溶液添加至纳米颗粒溶液中。

4.在搅拌下于室温下孵育2-4小时。

5.加入1mL PBST⁴并涡旋。

6.以17000g离心30分钟，然后回收沉淀以除去非NP连接的蛋白质。完全去除上清液。将蛋白质连接的NP重新分散在1mL PBST中，并在超声浴中进行超声处理。重复此步骤两次。

7.在含有1％BSA⁶的250μL PBS⁵中中回收蛋白质连接的NP。

8.储存在4℃以便立即使用，或分装并且储存在-80℃。

在图7中示意性地示出了纳米颗粒与链霉亲和素的连接。

用于官能化测试的设备：

¹N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(Sigma，cat#E1769)。

²N-羟磺基琥珀酰亚胺钠盐(磺基-NHS)(Sigma，cat#56485)。

³2-(N-吗啉基)乙烷磺酸(MES)(10mM，pH 5-6)。

⁴磷酸盐缓冲盐水pH 7.4(10mM NaCl)+0.05％吐温20(PBST)。

⁵牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，cat#A3059)。

⁶磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4，10mM NaCl)。

在连接方案结束时表征的每个纳米颗粒(NP)的链霉亲和素(SA)分子的数量(以R表示)是根据上述方案，通过所谓的BCA方法测定链霉亲和素来确定的。

用于表征链霉亲和素:纳米颗粒(SA:NP)比例的方案

i.通过BCA法测定SA

原理

在碱性介质中，蛋白质将Cu²⁺还原为Cu。双辛可宁酸(BCA)的盐与Cu²⁺离子形成有色络合物。由于它在562nm处的吸收，因此是可以定量的。

程序

来自ThermoFisher的BCA测试试剂盒(Pierce^TMBCA蛋白测定试剂盒目录号：23225)

-根据ThermoFisher试剂盒方案制备Cu²⁺/BCA测试试剂。

-准备用于校准曲线的SA。对于校准曲线，测试进行了三次。

	最终的SA浓度(μg/mL)
		A	2000
B	1500
		C	1000
D	750
		E	500
F	250
		G	125
H	25
		I	0＝空白

表2：校准溶液的链霉亲和素浓度

程序如下:

-取96孔板。将每管25μL的标准A-I(已知浓度的SA)或待测定的纳米颗粒缀合蛋白放入相应的孔中。

-向每个孔中添加200μL Cu²⁺/BCA测试试剂。均质，覆盖并在37℃下孵育30min。

-随着最终浓度(考虑到稀释度)的变化在562nm处读取吸光度(A)。通过线性回归建立校准关系A＝f(SA浓度，单位为μg/mL)。

根据由校准曲线获得的线性回归方程式推导出待测定纳米颗粒缀合蛋白质的浓度。

ii.SA:NP比例的表征

使用以下等式将通过BCA测试获得的链霉亲和素的质量浓度转换为摩尔浓度：

为了获得SA数量:NP的比例(R)，最终应用以下等式：

下表3总结了在链霉亲和素溶液和起始纳米颗粒溶液之间的不同浓度比例下获得的值。

表3：对于链霉亲和素溶液和纳米颗粒溶液之间不同浓度比例的纳米颗粒-链霉亲和素连接的表征。

从表3中给出的结果可以看出，连接后每个纳米颗粒的链霉亲和素分子的数量与初始溶液中的浓度比例处于相同数量级，因此表明非常好的连接效率。

1.3.链霉亲和素连接的纳米颗粒(纳米颗粒-SA)与生物素化抗体的连接

然后将链霉亲和素连接的纳米颗粒与对待测定的物质(胰岛素或甲状腺刺激激素(TSH))特异性的生物素化抗体连接，如图8示意性所示。

连接方案如下。

使用旋转轮使10至50μg/mL的生物素化抗体与过量的纳米颗粒-SA接触持续1小时，以促进扩散和生物素与链霉亲和素之间的相互作用。选择抗体的浓度以使每个NP具有3个抗体。因此，可以确定所有抗体都将结合纳米颗粒-SA，并且不需要去除未结合抗体的步骤。因此，抗体的浓度是纳米颗粒的浓度的三倍。

或者，也可以将抗体直接连接至接枝有柠檬酸根离子的纳米颗粒。在这种情况下，应通过使用抗体溶液代替链霉亲和素溶液来使用与上述相同的方案。

1.4.通过将纳米颗粒与抗体直接连接的替代连接方法

根据另一种方法，可以通过将抗体与使用APTES官能化的纳米颗粒连接来直接进行纳米颗粒与非生物素化抗体的连接(将氨基转化为羧基，活化羧基并与抗体表面的氨基直接反应)，根据以下详细描述的方法。

1.4.1.用二氧化硅层涂覆纳米颗粒

在步骤1.1中合成纳米颗粒之后，将纳米颗粒溶液以17000g离心3分钟以沉淀任何纳米颗粒聚集体，并回收上清液。进行尺寸选择。为此，以1900g离心3分钟进行几次离心。每次离心之后，通过超声仪将纳米颗粒重新分散，然后使用DLS-Zeta电位仪(Zetasizer NanoZS90，Malvern)确定纳米颗粒的尺寸。

制备25mL具有20mM浓度的钒酸根离子的Y_0.6Eu_0.4VO₄颗粒。用移液管逐滴添加2.5mL另一种纯硅酸钠溶液(Merck Millipore1.05621.2500)，以涂覆颗粒表面。让该溶液在搅拌下至少作用5个小时。

然后将溶液纯化以去除过量的硅酸盐和钠抗衡离子。将溶液以11000g(Sigma3K10，Bioblock Scientific)离心60分钟，并且然后通过超声处理(Bioblock Scientific，Ultrasonic Processor，以50％，在400W下运行)进行再分散。重复该步骤，直到溶液的电导率低于100μs/cm。

1.4.2.将胺接枝到纳米颗粒的表面上

在500mL三颈圆底烧瓶中，放入225mL无水乙醇，并添加265μL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)(Mw 221.37g/mol Sigma Aldrich)，其对应的最终浓度为1.125mM。该量对应于引入5当量的钒酸盐(根离子)。然后，将冷凝器连接到圆底烧瓶。将组件放置在圆底烧瓶加热器上，并放置在通风橱下。将混合物在90℃回流。通过蠕动泵以1mL/min的流速将pH为9的75mL水中的纳米颗粒的胶体溶液(钒酸盐(根离子)浓度[V]＝3mM)滴加到三颈烧瓶的一个入口。将组件在搅拌下加热24h。

48小时后，使用旋转蒸发仪(rotavapor R-100，BUCHI)对纳米颗粒进行部分浓缩。将溶液在合适的圆底烧瓶中旋转，并在50℃的浴中加热。

将回收的溶液通过在乙醇:水(3:1)溶剂中进行几次离心来进行纯化。纯化后，按照上述方案进行尺寸分选。

1.4.3羧基接枝到胺化纳米颗粒的表面上

在开始接枝之前，进行溶剂转移。

接枝方案如下。

通过进行几次离心(13000g，90min)，将胺化的NP从EtOH:H₂O缓冲液转移至DMF或DMSO。每次离心(以75％，20s)之间通过超声处理将沉淀再分散。测量并确定NP的浓度。

在5mL DMF中回收NP，并且然后将10％的琥珀酸酐添加到玻璃烧杯中(即5mL中0.5g)。在搅拌下，在惰性气氛中反应至少过夜。

通过离心(13000g，60min，Legend Micro 17R，Thermo Scientific)对羧化的NP进行至少两次洗涤，以去除DMF和过量的琥珀酸酐。

通过超声处理(Bioblock Scientific，超声处理器)将羧化的颗粒重悬在水中或pH 6的MES缓冲液中。

1.4.4纳米颗粒与抗体的直接连接

根据以下方案进行表面接枝的纳米颗粒与COOH的连接：

i)在MES缓冲液(pH 5-6)中新鲜制备EDC/磺基-NHS的混合溶液(浓度分别为500和500mg/mL)。

ii)在3mL预先制备的溶液中，添加90nM NP(在这种情况下，根据参考文献Casanova等人[37]依据钒酸根离子浓度计算得出的纳米颗粒的浓度)，并使其通过搅拌在室温反应25min。

iii)用Milli-Q水至少离心2次(13000g，60min，Legend Micro 17R，ThermoScientific)对NP进行快速洗涤，以去除多余的试剂。

iv)在pH 7.3的磷酸钠缓冲液中超声处理后，回收最后的沉淀。根据所需比例(蛋白质:NP)添加所需量的抗体，通常对于20:1的比例，为2μM。

v)在搅拌的同时，使该溶液在室温反应2至4小时。

vi)添加封闭剂(1％甘氨酸)与游离COOH发生反应，并封闭NP表面上残留的反应位点。使其反应30min。

vii)通过使用pH 7.2PBS的离心过滤器(Amicon Ultra 0.5mL，商品UFC501096，Millipore)离心几次，对蛋白连接的NP进行几次洗涤。将NP转移至它们的存储介质：磷酸盐缓冲液+吐温20(0.05％)+0.1％甘氨酸+10％甘油。收集100μL用于BCA测试。将其余溶液分装并-80℃冷冻。

因此，根据前述方法中的任一种制备的发光颗粒，包括与用于待分析物质的靶向抗体(NP-Ab)连接的光致发光纳米颗粒Y_0.6Eu_0.4VO₄，可用于检测和/或定量生物样品中的所述物质。

实施例2

在其表面固定有待分析物质的载体的制备

i.制备玻璃载玻片类型的载体

在第一步骤中，制备由玻璃载玻片组成的载体，载玻片的表面事先进行清洁、钝化并用生物素化抗体(捕获抗体)进行官能化。

用于玻璃载玻片的清洁、钝化和官能化方案如下。可以通过打印或使用点样器沉积液滴来完成官能化。

清洁载玻片

-在加热至40-50℃的超声波槽中在具有4％Hellmanex II清洁剂(Hellma)的去离子水中洗涤载玻片15分钟。

-在加热到40-50℃的超声波槽中用去离子水冲洗载玻片15分钟。

-在加热到40-50℃的超声波槽中用无水乙醇冲洗15分钟。

-在N₂流中或在抽油烟机下干燥10-15min。

-就在将玻璃表面官能化之前，在等离子清洁器(Harrick Plasma，型号PDC-002)中以中等强度依次清洁载玻片持续2分钟。

载玻片的钝化

所使用的钝化分子是具有10kDa PEG的硅烷-聚乙二醇(PEG)，由Laysanbio以商品编号M-SIL-5K销售。

钝化仅涉及玻璃硅烷化的一个阶段。PEG越长，钝化效果越好。

钝化方案如下：

-以10mg/mL的浓度将PEG溶于无水乙醇(EtOHAbs，取决于PEG的5kDa或10kDa的大小，摩尔浓度分别为2mM或1mM)。为了以10mg/mL的浓度溶解较长的PEG，可能需要将它们在40℃加热几分钟。

-在使用前几秒钟，在此溶液中加入少量的H₂O和乙酸(AcAc)，以使v/v/v比例为：EtOHAbs/H₂O/AcAc:95/5/0.2。

-在气密性器皿的底部放置一个方形的石蜡膜，然后将～30μL上面制备的溶液滴放置在上面，然后将比例载玻片(来自等离子清洁器)放在上面以将溶液滴夹在中间。在牢固密封的器皿中放入少量乙醇，以使空气中充满乙醇，并且以免30μL变干。孵育过夜。

-用去离子水冲洗，然后在氮气流中干燥。最终，将试纸条放在110℃的热板上5min。

通过过夜孵育对载玻片进行官能化

使用生物素化抗体对先前钝化的载玻片进行官能化的方案如下。这是用于图中所示结果的方案。

将载玻片在含有捕获抗体的溶液中于4℃孵育过夜。根据供应商的说明书，抗体溶液含有pH 7.4的PBS溶液或pH 9的碳酸盐缓冲液中的10-25μg/mL抗体。

或者，可以使用以下两种方案：

通过链霉亲和素印刷和生物素化抗体进行官能化

-切割PDMS(聚二甲基硅氧烷)小片，其尺寸对应于待官能化的表面。

-将小片放在平整的表面上。在小片上孵育在～15-30μL磷酸盐缓冲液(PBS)中的20μg/mL浓度的的链霉亲和素1min。

-立即用H₂O进行冲洗(使用洗瓶)，并在N₂气流下通过(10sec)。

-翻转小片并将其着墨(涂覆，inked)的表面放在载玻片上1min。

-去除小片，注意不要将其拖过表面。

-用链霉亲和素对载玻片进行官能化后，孵育必要量的生物素化抗体(在pH 7.4的碳酸氢盐缓冲液中为1-10μg/mL)在室温下持续2h，或在4℃下过夜。

-去除抗体孵育溶液，并用100μL的PBS缓冲液洗涤3次。

-加入5％w/v的BSA 100μL(100mL中5g)PBS，并且孵育1h。

通过点样器的官能化

根据供应商的方案，使用来自Horiba的SPRi-Arrayer装置进行点样器功能化，点样器使用直径为500μm的针头来沉积含有抗体的液滴(在pH 7.4的碳酸氢盐缓冲液中为1-10μg/mL)。

ii.将样品的待分析物质固定在载体的表面上

方案如下。

-将待测定的样品(胰岛素溶液，血清中的胰岛素或TSH溶液)添加到每个孔中，并孵育2小时。此时间与对应的常规ELISA指示的时间相同。

-孵育2小时后，去除溶液并用100μL洗涤缓冲液(0.2％PBS 2X吐温20)洗涤3次。

实施例3

超灵敏的检测和定量

3.1.发光颗粒与待分析物质的联接

方案如下：

-添加如实施例1所述制备的连接生物素化抗体的纳米颗粒，并孵育1小时。如实施例4中所述，可以预先确定最大化发光测量期间的信号所需的孵育时间。

-孵育1小时后，去除溶液，并用100μL洗涤缓冲液(0.2％PBS 2X吐温20)洗涤4次。

-添加100μL PBS，并按如下所述进行发光测量。

3.2发光测量

i.用于测量发光的实验装备

检测装备如下。它在图2以及图12和图13中进行了示意性示出。

检测装置由以下组成：1W激光源(1)，波长465nm(ML-6500-465，Modulight或F465-HS-1W，Laser2000)；准直和激光束减小系统(2)，该系统由两个透镜(两个

双凸透镜，f＝100mm以及f＝30mm(Thorlabs))；任选的机械斩波器(4个)(MC2000B-EC，Thorlabs)；用于样本的载玻片载体；以及用于发射光子的检测系统。

为了收集样品中纳米颗粒发射的发光，使用了高数值孔径的透镜(10)(双凸透镜，

f＝100mm(Thorlabs))和两个干扰滤波器620±14-25(FF01-620/14-25，Semrock)以光谱方式消除干扰信号，以及光电倍增管(12)(PMM02，Thorlabs)。

模数转换器(NI9215，National Instruments)允许使用LabVIEW软件记录信号。

所有检测元件都位于同一轴线上。因此，该装备更符合人机工程学并且更易于调节。为了能够通过扫描连续观察多个生物样品，实施了载玻片载体的平移系统(Z8253，KCH301 Thorlabs)。

在存在干扰信号的情况下进行用于测量纳米颗粒的数量的时间分辨检测

可以将机械斩波器放置在激光束的路径中，以创建激光激发槽(狭缝)以消除干扰信号。实际上，在通过激光束照射生物样品期间，除感兴趣的纳米颗粒以外的分子有可能发射荧光。通过光电倍增管(每10μs捕获信号)使用机械斩波器和100kHz的信号检测频率，可以避免这种干扰荧光。

因此，由于本发明的颗粒的长发射时间，因此有可能对发射进行时间分辨检测，特别是对发射的延迟检测，如下文详细描述的。

时间调制照明允许限制样品(血清、血液等)或所用固体基底(玻璃、塑料等)中存在的干扰物质对发光信号的贡献。事实上，所使用的纳米颗粒(例如YVO₄:Eu或GdVO₄:Eu)可以(在465nm下照射)处于激发态，与通常荧光团的纳秒范围内的寿命相比，纳米颗粒具有数百μs的长寿命。这允许从纳米颗粒发射的信号中在时间上分离干扰发光信号。

为了获得频率在100和1000Hz之间的的周期性照明，可以通过使用旋转机械斩波器来实现调制。图9示意性地示出了通过激发激光的机械斩波获得的照明时间概况。

所获得的调制信号是样品中所有发射体的衰减阶段(斩波器关闭)和发光返回阶段(斩波器打开)的交替。发光信号的衰减/返回是由两个单独的参数确定的：(i)发射体激发态的寿命，以及(ii)通过机械斩波器掩蔽/暴露激发光束的动态。图10-a显示了斩波器关闭开始(t＝0)之后发光下降的实例。信号的数字后处理分析允许隔离由于纳米颗粒引起的信号，例如通过以下两种方法。

方法1：延迟检测

在发光衰减阶段，当激发光束尚未被完全阻塞时，干扰发射体的贡献会在短时间内集中(图10-a)。通过去除该部分(图10-b，激发光束被斩波器叶片开始遮挡后，检测限制于170μs)，获得了仅由纳米颗粒引起的信号(曲线(b)和(c)的叠加)，消除了载玻片、血清和水的干扰荧光的贡献)，因此尽管存在其他发射体，也可以估计它们的数量。

方法2：时间分辨检测

纳米颗粒和干扰荧光团的发光可以通过两级系统进行建模(图11)。在这种情况下，可以根据发射体的特性来确定发光信号PL(t)的形状：

其中，I(t)是激发时间概况；N是一种类型的发射体的总数，并且N*是处于激发态的发射体数量；k去激发率；

量子效率；通过数值求解模型产生的微分方程组。

然后可以写入总信号，

其中，NP和F分别表示纳米颗粒和干扰荧光团，并且BG表示背景信号。

通过此函数的记录的信号调整使得可以确定各种参数，尤其是N_NP和k_NP(图11)。如k_NP＜＜k_F，它是鲁棒的。然后，尽管样品中存在对原始信号有贡献的干扰发射体，但仍毫无疑义地确定了附接在N_NP表面的纳米颗粒的数量。在实践中，在所使用的频率(100-1000Hz)下照明的机械掩蔽动力学显著慢于干扰发射体的荧光衰减k_F～10⁹s^-1，使得

然后通过以下方法进行N_NP的测量：(i)通过测量不含纳米颗粒的校准样品的自发荧光，实验性确定的照明时间概况I(t)/I(0)；(ii)测量目标样品的发光信号；以及(iii)通过函数

对该信号进行非线性调整(最小二乘法)。该调整，可以将参数M、k_NP和

N_NP确定为仪器倍增因子：在固定的检测条件下，该最后一个参数指示沉积在表面上的纳米颗粒的数量。

实验装备的变型

激发纳米颗粒：

.通过使用60°和63°之间的大入射角(激光束的传播方向与样品载体竖直方向的角度)(如图12中示意性所示)，

.或通过使用全内反射荧光(TIRF)类型的照明装置，特别是使用折射率大于或等于用作样品载体的玻璃载玻片的折射率的Plexiglas 13平行六面体(如图13中示意性所示)。这种构型提供了在玻璃/水或玻璃/血清界面处的大于61.04°的入射角，从而导致光束在该界面处发生全反射，以及锚定在待分析物质上的纳米颗粒的消逝波激发。

使用了实验装备的三个变型。

变型1：反射(向下)检测，不使用斩波器(除非特别说明)，并且不使用消逝波激发(图12-a)。在大多数情况下，采集时间固定在30s，每100ms记录一次电压值。手机透镜的直径为30mm，而不是50.8mm。

变型2：传输检测(向上)(图12-b)。测量可以在使用或不使用斩波器以及使用或不使用消逝波激发的情况下进行。采集时间固定为1s，每10μs记录一次电压值。该变型包括叶片载体平移系统(Z8253，KCH301 Thorlabs)。

变型3：具有传输检测(向下)的可移动安装。测量可以在使用或不使用斩波器并且使用或不使用消逝波激发的情况下进行。采集时间固定为1s，每10μs记录一次电压值。

对于待检测的每种样品浓度，在载玻片的不同位置执行几次测量(N次测量，N大于或等于5)。每次测量是在100kHz的采集速率下记录1s的1000000个值的平均值(每10μs记录1个电压值)，这于实验装备的变型1的情况不同，变型1中采集时间为30s，每100ms记录一次电压值。

图形上指示的信号值及其误差条分别对应于N次测量的平均值及它们的标准偏差。在大多数情况下，要从所有不同浓度的测量值中减去待检测的分子浓度等于零的信号值。因此，浓度等于零的信号值显示为零。然而，所示的标准偏差是检测给定浓度的能力的度量。通常，检测极限被认为是由以下浓度确定的：该浓度所产生的信号的等于在零浓度(“空白”)获得的信号的标准偏差的3倍。定量极限由以下浓度确定的：该浓度产生的信号是在零浓度下该标准偏差的10倍。

对于用消逝波激发进行的实验，优选从上方收集发光。实际上，样品向下的发光发射被Plexiglas平行六面体向宽角度折射，结果，在存在允许消逝波激发发生的平行六面体的情况下，收集透镜收集了较小的一部分。

ii.检测装置的校准

在测量之前，根据变型2(向上检测，使用斩波器和消逝波激发)和变型3(向下检测，不使用斩波器且不使用消逝波激发)，使用溶液中的纳米颗粒对检测装置进行校准。

校准方案如下：

预先用等离子清洁器激活玻璃载玻片。

-将使用已知浓度的PBS稀释的纳米颗粒溶液沉积在载玻片上；

-孵育2小时；

-用超纯水冲洗至少三次。

采集时间固定为1s，每10μs记录一次电压值。

从这两种变型中获得的检测装置的校准曲线在图14-a和14-b中示出。

iii.检测/定量测试的结果

检测和定量样品中的物质

当所获得的信号是含有零浓度物质的组成相同的样品信号的标准偏差的至少三倍时，可以检测到样品中物质的浓度。

为了对待分析的物质进行定量(即确定其浓度)，必须执行以下方案：

i)使用不同已知浓度的待分析物质以执行一系列校准测量，例如，可商购获得的物质或纯化的物质。如果可能，应准备与被测样品组成相同或尽可能接近的校准样品。调整获得的点(以mV为单位的信号与待分析物质的浓度)；

ii)对待分析样品进行测量(获得以mV为单位的信号值)；

iii)根据测量的信号(以mV为单位)以及在步骤i)中执行的校准曲线及其拟合，为每个测量的样品赋予物质的浓度值。

当所获得的信号是含有零浓度物质的组成相同的样品信号的标准偏差的至少10倍时，可以定量样品中物质的浓度。

胰岛素检测

分析的样品是PBS+5％BSA中的重组胰岛素溶液或血清中的胰岛素溶液(样品由Cerba Specimen Services提供，其中胰岛素浓度先前通过参考技术确定)。

对于PBS+5％BSA溶液中的重组胰岛素样品，使用由ELISA试剂盒提供的用于相关校准实验的重组胰岛素。根据试剂盒供应商指示的方案，通过连续稀释来制备各种样品。

对于血清胰岛素样品，原样使用最高浓度的溶液。由于无法获得极低浓度的样品，因此可以通过使用PBS+5％BSA稀释含有最低可用浓度的样品来制备它们。

ELISA检测

为了比较，在96孔板中使用的ELISA试剂盒，在溶液中进行重组胰岛素的检测。所遵循的实验条件是ELISA试剂盒供应商指示的条件。从使用不同浓度胰岛素孵育的孔的吸光度值中减去未与胰岛素孵育的孔的吸光度(零浓度)。每个浓度值使用两个孔，并且这两个测量值的标准偏差如图15中的误差条所示。测得的最低浓度为187pg/mL(或33pM)。零浓度的标准偏差为0.0035。浓度187pg/mL(或33pM)的测量吸光度值为0.0085，刚好低于极限值0.0105，该极限值等于所确定的零浓度的标准偏差的3倍。根据供应商的说明书(ABCAM项目ab100578)，使用常规ELISA试剂盒进行的检测不会检测到浓度低于50pg/mL(或9pM)的样品(图15)。

根据本发明的超灵敏检测

·图16示出了使用检测装置的变型1获得的溶液中不同浓度的重组胰岛素样品的信号，其中，最低浓度为0.05pg/mL(或9fM)。采集时间为30秒，每100ms记录一次电压值。

在图16的插图中，减去没有胰岛素的信号。

因此，使用与ELISA试剂盒相同的抗体，最低检测浓度为使用ELISA的可检测浓度浓度(50pg/mL或9pM)的1000分之1。

·图17示出了使用检测装置的变型2(上方检测)，不使用斩波器，不使用消逝逝激发获得的溶液中不同浓度的重组胰岛素样品的信号，其中，最低浓度为0.05pg/mL(或9fM)。采集时间为1秒，每10μs记录一次电压值。

因此，使用与ELISA试剂盒相同的抗体，最低检测浓度为使用ELISA的可检测浓度(50pg/mL或9pM)的1000分之1。

·图18示出了使用检测装置的变型2(上方检测)，使用斩波器和消逝波激发获得的溶液中不同浓度的重组胰岛素样品的信号，其中，最低浓度为0.05pg/mL(或9fM)。采集时间为1秒，每10μs记录一次电压值。

因此，使用与ELISA试剂盒相同的抗体，最低检测浓度为使用ELISA(50pg/mL或9pM)的可检测浓度的1000分之1。

·图19示出了获得的含有胰岛素的血清样品的信号(样品由CERBA SpecimenServices提供，并使用PBS+5％BSA稀释为最低浓度)。为了获得最低浓度的样品，将含有约8pM胰岛素的样品在带有检测装置变型1的IBIDI多孔板上进行稀释。

采集时间为30秒，每100ms记录一次电压值。

最低检测浓度9fM(或0.05pg/mL)为使用与ELISA试剂盒相同的抗体的ELISA的可检测的浓度(50pg/mL或9pM)的1000分之1。

TSH检测

分析的样品是分子量为15 639Da重组TSH在PBS+5％BSA中的溶液。使用的抗体是ABCAM试剂盒ab 100660的那些抗体。

根据本发明的超灵敏检测

图20示出了使用带有斩波器的检测装置的变型1获得的溶液中不同浓度的重组TSH样品的信号，其中，最低浓度为3.2fM(1.4fg/mL)。采集时间为1秒，每10μs记录一次电压值。

相比之下，根据供应商，使用ELISA试剂盒可检测的最低浓度通常小于4pg/mL。因此，根据本发明检测的最低检测浓度比使用ELISA试剂盒的可检测浓度的1000倍分之1还低。

实施例4

调整孵育时间

在检测溶液中重组胰岛素(50pg/mL胰岛素)的情况下，最大化信号所需的孵育时间可以通过针对在其表面上固定有待分析物质(此处为重组胰岛素)的样品载体(根据实施例2ii中所述的方法进行固定)与抗体-纳米粒子缀合物(根据实施例1中的方法获得的，具有10μg/mL抗体)之间不同孵育时间获得的发光测量值来预先确定，根据实施例3.i所述方案进行步骤。

用实施例3中描述的检测装置的变型1进行测量。采集时间为30秒，每100ms记录一次电压值。

图21示出了检测到的发光信号随孵育时间的变化。

似乎有必要将抗体连接的纳米颗粒与在其上固定有待分析物质(在本例中为重组胰岛素)的表面一起孵育至少45分钟，以使检测到的发光信号最大化。所需的时间可能取决于待分析的物质和所用抗体而变化。

实施例5

空间多重复用实验

为了说明根据本发明的方法执行“多重复用”检测的可能性(图22中示出的空间多重复用的示意图)，执行了以下实验。

通过将两种不同浓度(4mM和8mM)的根据实施例1中所述方法获得的两种纳米颗粒溶液(第1.1部分，合成后获得的纳米颗粒)的两滴沉积在根据实施例2中描述的方案清洁的玻璃载玻片上，产生含有纳米颗粒的两个区域或“斑点”。在此，允许含有纳米颗粒的液滴在发光测量开始之前干燥，而无需冲洗步骤。

图23中的图示出了根据行进方向的样品水平的激光束直径(3mm)、直径(2mm)和两个纳米颗粒“斑点”之间的距离(1mm)。

用实施例3中描述的实验装备的变型2进行测量(向上检测，使用斩波器且不使用消逝波激发)。益于样品载体的电动位移系统，在多个位置检测到纳米颗粒发射的信号：在第一个“斑点”之前(位置1)，在第一个“斑点”中(位置4)，两个“斑点”之间(位置6)，在第二个“斑点”中(位置7)，以及最后在第二个“斑点”之后(位置9)。对于激发激光束的每个位置，采集时间为1秒，每10μs记录一次电压值。

图23示出了检测到的上述不同位置的发光信号。具有不同位置和幅度的两个峰显示了区分空间组织的沉积物的可能性，这是进行多重复用测量所必需的。

实施例6

合成3％YVO₄:Dy纳米颗粒

所使用的方案甚至与上面实施例1中的第1.1点中所述的Y_0.6Eu_0.4VO₄纳米颗粒的合成方案相同，其中，唯一区别仅在于，使用浓度为0.03M的前体Dy(NO₃)₃代替前体Eu(NO₃)₃。

结果

图26示出了合成后这些纳米颗粒的溶液的发光激发和发射谱。激发谱显示出直接激发Dy³⁺离子的峰。使用这些纳米颗粒进行的以下步骤可以同一地重现：官能化和连接至链霉亲和素(实施例1，第1.2点)，以及然后连接至生物素化的靶向剂(实施例1，第1.3点)，或直接连接至靶向剂(实施例1，第1.4点)，从而产生在不同发射波长处发射的探针。

实施例7

合成3％YVO₄:Sm纳米颗粒

所使用的方案甚至与上面实施例1中的第1.1点中所述的Y_0.6Eu_0.4VO₄纳米颗粒的合成方案相同，唯一区别仅在于，使用浓度为0.03M的前体Sm(NO₃)₃代替前体Eu(NO₃)₃。

结果

图27示出了合成后这些纳米颗粒的溶液的发光激发和发射谱。激发光谱显示出Sm³⁺离子直接激发的峰。使用这些纳米颗粒进行的以下步骤可以同一地重现：官能化和连接至链霉亲和素(实施例1，第1.2点)，并且然后连接至生物素化的靶向剂(实施例1，第1.3点)，或直接连接至靶向剂(实施例1，第1.4点)；从而产生在不同发射波长处发射的探针。

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Claims

1.一种通过检测由光致发光无机纳米颗粒的发光发射，对样品，特别是生物样品中生物学或化学上感兴趣的物质进行超灵敏体外检测和/或定量的方法，所述方法至少包括以下步骤：

(i)使用光致发光颗粒，所述光致发光颗粒全部或部分由光致发光无机纳米颗粒组成，并且在有利于其与所述样品中待分析物质联接的条件下与用于所述待分析物质的至少一种靶向剂连接，所述光致发光无机纳米颗粒由具有至少10³个稀土离子的晶体基质组成，所述纳米颗粒具有的平均尺寸大于或等于20nm且严格小于1μm，并且在吸收光子后能够发射发光；

(ii)通过照明装置，特别是激光类型的照明装置，来激发与所述待分析物质联接的所述颗粒的稀土离子，功率为至少50mW，优选至少500mW，并且激发强度为至少1W/cm²，优选至少10W/cm²；

(iii)检测单光子吸收后由所述颗粒发射的发光，以及

(iv)通过解析所述发光测量值来确定所述物质的存在和/或浓度，在适当情况下参考标准或校准。

2.根据前一权利要求所述的方法，其中，将步骤(i)中所述样品的待分析物质预先固定在载体的表面上，将所述表面钝化使得在不存在所述待分析的物质时所述发光颗粒不附连至所述表面上。

3.根据权利要求1或2所述的方法，用于检测和/或定量所述样品中存在的感兴趣物质，其含量严格低于10pM，特别是低于1pM，或者甚至低于0.1pM，或者低于0.01pM。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述样品是生物样品，特别是人样品，并且更特别地选自血液、血清、血浆、唾液、尿液、脑脊髓液、鼻涂片、阴道涂片、痰液和稀释粪便物。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，用于检测和/或定量生物样品中的生物标志物、抗体、DNA和/或RNA。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述靶向剂选自多克隆或单克隆抗体、抗体片段、纳米抗体、寡核苷酸、肽、激素、配体、细胞因子、拟肽、蛋白质、碳水化合物、化学修饰的蛋白质、化学修饰的核酸、靶向已知细胞表面蛋白质的化学修饰的碳水化合物、适配体、蛋白质和DNA/RNA组装物或HaloTag型标志物使用的氯代烷，特别是抗体或抗体片段。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，最大化所述稀土离子的掺杂率与从所述纳米颗粒发射的量子效率之间的乘积，特别地，其中所述纳米颗粒具有不完美的结晶性。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述纳米颗粒具有的发射寿命大于或等于5μs，特别是大于或等于10μs，尤其是大于或等于20μs，或者甚至是大于或等于50μs。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述纳米颗粒具有的平均尺寸在20nm至500nm之间，优选在20nm至200nm之间，以及尤其是在20至100nm之间，特别是在25nm至100nm之间并且尤其是30至60nm之间。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述稀土离子是选自铕(Eu)、镝(Dy)、钐(Sm)、镨(Pr)、钕(Nd)、铒(Er)、镱(Yb)、铈(Ce)、钬(Ho)、铽(Tb)、铥(Tm)及其混合物的镧系元素离子，特别是选自Eu、Dy、Sm、Nd、Er、Yb、Tm、Tb及其混合物的镧系元素离子，特别是Eu。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，形成所述光致发光无机纳米颗粒的晶体基质是氧化物基质，特别是钒酸盐或磷酸盐基质；卤化物基质，特别是氟化物基质；或硫族化合物基质，特别是碲，硫化物或硒化物基质。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述纳米颗粒具有下式(I)：

(A_1-xLn_x)_a(M_pO_q) (I)

其中：

-M代表能够与氧(O)联接以形成结晶化合物的一种或多种元素，特别地M代表选自V、P、W、Mo、As、Al、Hf、Zr、Ge、Ti、Sn、Mn和Si的一种或多种元素；特别地，M代表选自V、P、W、Mo、As和Al的一种或多种元素；

-Ln对应于一个或多个发光镧系元素离子，特别是如权利要求10所定义的；

-A对应于其电子能级不参与发光过程的晶体基质的一个或多个组成离子，特别地选自钇(Y)、钆(Gd)、镧(La)、铋(Bi)、镥(Lu)及其混合物，特别地A代表Y或Gd，并且优选A代表Y；

-0<x<1，特别地0.1≤x≤0.9，特别地0.2≤x≤0.6，尤其是0.2≤x≤0.4以及更特别地x为0.4；以及

-p、q和a的值使得符合(A_1-xLn_x)_a(M_pO_q)呈电中性。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述纳米颗粒具有下式：

A_1-xLn_xVO_4(1-y)(PO₄)_y (II)

其中：

.A选自钇(Y)、钆(Gd)、镧(La)、镥(Lu)及其混合物，特别地A代表Y；

.Ln选自铕(Eu)、镝(Dy)、钐(Sm)、钕(Nd)、铒(Er)、镱(Yb)、铥(Tm)、铽(Tb)及其混合物，特别地Ln代表Eu；

.0<x<1；特别地0.2≤x≤0.6并且更特别地x为0.4；以及

.0≤y<1，特别地y为0。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述式(II)的纳米颗粒在其表面上具有四烷基铵阳离子，特别是具有式NR₄ ⁺的阳离子，其中，R可以相同或不同，代表C₁-C₆-烷基，特别是C₁-C₄-烷基，更特别是C₁-C_3-烷基，并且尤其选自四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵、四丁基铵阳离子及其混合物，优选地，所述四烷基铵阳离子是四甲基铵阳离子。

15.根据前述权利要求所述的方法，所述纳米颗粒具有式(II')

A_1-xLn_xVO_4(1-y)(PO₄)_y·(NR₄ ⁺)_z (II′)

其中：

.A如权利要求13所定义；

.Ln如权利要求13所定义；

.0<x<1；特别地0.2≤x≤0.6并且更特别地x为0.4；

.0≤y<1，特别地y为0；

.R，可以相同或不同，代表C₁-C₆-烷基，特别是C₁-C_4-烷基，特别是C₁-C₃-烷基，并且更特别是甲基；以及

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述纳米颗粒具有式Y_1-xEu_xVO₄，其中，0<x<1，特别地所述纳米颗粒具有在其表面上的四烷基铵阳离子，特别是如权利要求14所定义的四烷基铵阳离子。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在其合成结束时在pH≥5，特别是pH≥5.5，并且更特别是pH≥6且离子电导率严格小于100μS.cm^-1的水性介质中，所述纳米颗粒具有的以ζ表示的ζ电势小于或等于-28mV，优选小于或等于-30mV。

18.根据权利要求2至17中任一项所述的方法，其中，步骤(i)至少包括以下步骤：

(a)得到载体，所述载体的表面事先钝化并且使用用于待检测/定量的所述物质的靶向剂进行官能化，靶向剂例如第一单克隆抗体，称为捕获抗体；

(b)在有利于所述物质与所述靶向剂联接的条件下，使所述待分析样品与步骤(a)的所述载体接触；以及

(c)使与至少一种靶向剂连接的光致发光颗粒与来自步骤(b)中所述载体接触，以使所述颗粒与固定在所述载体表面上的所述物质进行联接。

19.根据权利要求2至18中任一项所述的方法，其中，所述载体是载玻片、多孔板、微板、膜凝胶、条带或微通道类型。

20.根据权利要求2至19中任一项所述的方法，其中，进行步骤(ii)中的激发，其中激光激发光束定向成与在表面处具有与所述待分析物质联接的所述颗粒的所述载体的竖直方向形成大于或等于55°的入射角。

21.根据权利要求2至20中任一项所述的方法，包括通过消逝波，特别是借助于TIRF型激光照明装备，对所述颗粒进行激发，使得所述载体和所述待分析样品之间是玻璃/水界面的情况下，所述激发光束的入射角大于或等于61°。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述纳米颗粒的发射寿命大于或等于1μs，特别是大于或等于50μs，步骤(三)中的光强度的检测包括发射的时间分辨检测，特别是由所述光致发光颗粒发射的信号的延迟检测。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，用于同时检测和/或定量样品中的至少两种不同物质。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，将所述样品的待分析物质固定在载体表面的预定且不同的区域中，钝化所述表面使得不存在所述待分析的物质时所述光致发光颗粒不与所述表面结合。

25.根据权利要求23或24所述的方法，使用具有不同的发射波长并且与用于每种所述待分析物质的靶向剂连接的至少两种类型的纳米颗粒。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(ii)中的所述激光照明装置包括光学装备，特别是至少一个透镜的系统，布置在所述激光束的路径中，以便控制在具有与所述待分析物质联接的颗粒的所述载体的区域处的光束尺寸。

27.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，步骤(iii)中对发光发射的检测是通过光强度检测装置执行的，所述光强度检测装置包括单个检测器，例如光电倍增管、光电二极管、雪崩光电二极管类型，或者由检测像素的2D区域组成的光敏装置阵列类型的检测器，诸如CCD或EM-CCD相机或CMOS相机。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述检测装置包括光学装备，特别是具有大数值孔径的至少一个透镜的系统，用于将所述发光发射聚焦至所述检测器，特别是聚焦至所述光电倍增管。

29.根据前述权利要求中任一项所述的方法用于体外诊断目的的用途。

30.一种体外诊断试剂盒，至少包括：

-全部或部分由权利要求1和8至17中任一项所限定的光致发光无机纳米颗粒组成的光致发光颗粒，

所述颗粒被由例如柠檬酸或聚丙烯酸的分子提供的例如羧基、氨基、硫醇、醛或环氧基基团的化学基团进行表面官能化，和/或与例如链霉亲和素的分子连接，所述化学基团或分子能够使所述颗粒与用于所述待分析物质的靶向剂连接；或者

所述颗粒已经与用于所述待分析物质的至少一种靶向剂连接；以及

-检测和/或定量系统，至少包括：

.照明装置，优选激光类型的照明装置，具有为至少50mW，或者甚至至少500mW的功率；以及用于成形激光束的光学装备，使得可以在样品水平获得至少1W/cm²，优选至少10W/cm²的激发强度

.用于检测由所述颗粒发射的光强度的装置。

31.根据前述权利要求所述的诊断试剂盒，包括用于固定所述样品的待分析物质的至少一个合适载体。