CN110785472B - 基于稀土元素的发光颗粒及其作为诊断剂的应用 - Google Patents

基于稀土元素的发光颗粒及其作为诊断剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包括式A1‑xLnxVO4(1‑y)(PO4)y(I)的纳米颗粒的发光颗粒，其中，A选自钇(Y)、钆(Gd)、镧(La)及其混合物；并且Ln选自铕(Eu)、镝(Dy)、钐(Sm)、钕(Nd)、铒(Er)、镱(Yb)及其混合物；0<x<1；并且0≤y<1；其特征在于，纳米颗粒在表面上具有一定量的四烷基铵阳离子，使得所述纳米颗粒在pH≥5，特别地pH≥5.5并且离子传导率>100μS.cm‑1的水性介质中具有的zeta电势，标记为ζ，小于或等于‑28mV。本发明还涉及用于产生这种发光颗粒的方法，涉及所述颗粒的胶体悬浮液，并且涉及其作为诊断剂的用途，还涉及包括这种发光颗粒的诊断试剂盒。

Description

基于稀土元素的发光颗粒及其作为诊断剂的应用
本发明涉及用于检测和/或定量生物样品中目标物质的探针领域。其主题更具体地是新型的发光无机颗粒，其制备方法及用于检测和/或测量生物学样品中蛋白质、抗体、DNA、RNA和其他化合物的存在的用途。
生物样品(血液、血清、唾液、尿液、脑脊液等)中生物标志物、抗体或DNA和RNA的检测和/或浓度定量，对于医学诊断是必不可少的。
在体外或离体诊断、医学分析和生物分析的领域，已经提出了许多用于检测和/或测量特定物质的存在的技术。
一般来说，这些技术依赖于应用于检测和/或定量溶液中浓度的探针的使用。这些探针与分子、DNA或蛋白质连接，其直接或经由一系列反应附连至待分析的分子物类。随后，可以借助于基于例如它们的发光、它们的吸收、它们的化学反应性、它们的放射性等的一种或多种技术，来检测已经反应的探针。
最常应用的生物化学测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)，其通常依赖于辣根过氧化物酶的使用以引起与底物的反应，并通过测量溶液中反应产物的吸收来定量已经发生的化学反应。选择与探针连接的分子化合物对于这些探针的效力至关重要。更具体地，这些技术的效力取决于化合物与靶标物质的特异性亲和力。作为示例，引用的出版物[1]和[2]详述了这些机制的特点。
通常发光探针引起的检测比通过它们的吸收检测的探针更灵敏，因为在第一种情况下，发光强度的测量是针对暗背景进行的，而在第二种情况下，测量的是发光强度(针对明亮背景进行的测量)的变化。当前可用的发光探针显示出许多缺点，这些缺点阻止了它们用作诊断探针的潜力的充分利用。这些缺点包括，例如，在有机荧光团的情况下的光漂白现象，这种现象在不可逆的结构改变后表现为荧光消失；或者当探针经历周期性的发射中断并因此不适合产生恒定信号时，半导体纳米晶体或“量子点”的发射闪烁现象。其他缺点是例如由发光探针的发射光谱的宽度引起。实际上，发射光谱太宽使得难以滤除可能存在的背景信号，并影响该信号的质量，并且，尤其是影响信噪比。除了有助于生物学测试中探针效力的光学因素外，还需要考虑的其他因素是探针的实用性和易用性。如在半导体纳米晶体的情况下，某些颗粒会在冷冻后失去其发光特性，这体现出生物缀合剂的储存方面的缺点。当选择合适的探针时，允许目标分子被靶向的探针与分子化合物连接的容易性也是需要考虑的一方面。实际上，许多颗粒，包括半导体纳米晶体，是在有机溶剂中合成的。因此，它们用于生物学应用的用途需要额外的表面制备步骤，以在水中产生这些颗粒的分散体，该方法实施起来可能非常复杂并且可能随时间而缺乏稳定性。
此外，颗粒/探针的胶体性质对于生物学测定的进行至关重要。具有较高胶体稳定性的溶液实际上能够为较高一致性的测定提供介质，并且，因此在这些测定的结果方面提供更好的可再现性。
最终，在选择用于诊断的探针中，复杂性和成本是重要方面。例如，金纳米颗粒以及它们在表面等离振子共振方面的性质已经被提出作为诊断探针，但是尚未被确立为用于体外诊断的探针，这可能是由于检测方法的复杂性[3]，或者，也许是成本较高。就其本身而言，半导体晶体是在有机溶剂中合成的，并且需要用于在水性介质中进行分散的程序，由此，使得其变得复杂并且因此合成成本高。此外，用允许其与用于识别靶标分子的分子化合物连接的化学基团对它们的官能化依赖于弱的化学键，因此限制了它们的稳定性，这不利于检测测试的可再现性。
在这方面，掺杂有稀土离子的纳米颗粒，诸如YVO4:Eu纳米颗粒，被证明特别有利于用作用于检测/定量生物分子的探针。
在Riwotzki等人[4]和Huignard等人[5]中已经详细描述了基于钒酸钇掺杂有稀土元素的纳米颗粒。
这些纳米颗粒由于其优异的光稳定性而特别有利，其光稳定性允许获取恒定且延长的信号，并且不存在发射闪烁现象。此外，它们具有较窄的发射光谱和较大的斯托克斯(Stokes)发射位移。这两个特性允许有效过滤纳米颗粒的发射信号，使其免受干扰信号的影响，从而提供优异的信噪比。这些纳米颗粒还含有成千上万个引起发光的可激发离子。因此，激发强度增加会引起颗粒发光的线性增加，仅在不可实行的强度下才会达到发射饱和。
最终，这些纳米颗粒在冷冻后不会失去它们的发光。
在有机溶剂介质中合成掺杂有稀土离子的发光纳米颗粒已经被提出了，在例如文献EP 1 232 226或出版物[6]、[7]和[8]中。
在水性介质中合成这些发光纳米颗粒的方法也已经被提出了，例如，通过将硝酸钇和硝酸铕的溶液逐滴添加到原钒酸盐溶液((Na3VO4)中([9]、[10]、[11]、[12]和[13])。
此外，出版物[14]-[19]提出了应用偏钒酸铵或原钒酸铵作为前体水热合成掺杂有稀土离子的YVO4纳米颗粒的技术。
可以引用的另一文件是US 8 337 804，其提出了一种通过应用含有水和至少一种多元醇的反应介质来制备基于原钒酸根离子VO4 3-的纳米颗粒(例如YVO4:Eu)的技术。
文献EP 1 282 824描述了表面改性的无机发光纳米颗粒作为探针用于检测生物物质或其他有机物质的用途。
然而，通过上述已知的合成途径获得的并应用于水性介质中的发光纳米粒子易发生絮凝现象，并且不会产生稳定的胶体悬浮液。因此，随着时间推移悬浮液中纳米颗粒的数量不稳定并且不能精确确定。
当将它们用作诊断技术中的探针时，在所应用的胶体悬浮液中，在发光颗粒的数量方面，这种不确定性是非常有害的，因为在检测/定量例如被测样品中的生物分子的浓度中它会影响所获得的结果的可再现性。
因此，掺杂有稀土离子并通过现有技术获得的发光颗粒不能完全令人满意地用作诊断的探针。
特别地，本发明旨在提出允许克服上述缺点的新的发光颗粒及用于其合成的新途径。
更特别地，本发明提出了一种获得发光纳米颗粒的方法，该发光纳米颗粒在水性介质中表现出增强的胶体稳定性，该方法有利地具有更加可再现的合成以及官能化和与分子靶向剂连接的更加可再现的后续步骤。
因此，根据其第一方面，本发明提供了一种发光颗粒，该发光颗粒包括下式的纳米颗粒：
A1-xLnxVO4(1-y)(PO4)y (I)
其中：
.A选自钇(Y)、钆(Gd)、镧(La)及其混合物；
.Ln选自铕(Eu)、镝(Dy)、钐(Sm)、钕(Nd)、铒(Er)、镱(Yb)及其混合物；
.0＜x＜1，更特别地0.2≤x≤0.6，并且，非常特别地x为0.4；以及
.0≤y<1；
其特征在于，纳米颗粒在表面具有四烷基铵阳离子。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于制备这种颗粒的方法，该方法应用在水性介质中由元素A和Ln的前体开始并且在原钒酸根离子(VO4 3-)和可选的磷酸根离子(PO4 3-)存在下进行的共沉淀反应，所述反应是在有效量的四烷基铵阳离子的存在下进行。
更特别地，四烷基铵阳离子的量使得所述纳米颗粒在pH≥5的水性介质中具有的zeta电势ζ小于或等于-28mV。
优选地，所述纳米颗粒在pH≥6.5，更特别地在pH≥7，并且尤其在pH≥8的水性介质中具有的zeta电势ζ小于或等于-30mV。
本发明的发光颗粒及其合成途径在许多方面被证明是有利的。
这种新的合成途径依赖于大的四烷基铵抗衡离子的使用。
因此，发明人发现在基于稀土离子的纳米颗粒的合成中这些大的抗衡离子的使用为溶液中的颗粒提供了改善的胶体稳定性，并且特别地防止了颗粒的絮凝现象。
如前所述，溶液中颗粒的稳定性对于满足将这些颗粒用作体外或离体诊断的探针的可再现性方面的要求特别关键。
不希望受理论的束缚，与例如钠离子的使用相比，由于四烷基铵抗衡离子的使用而引起的这种稳定性改善与颗粒的zeta电势差异有关。
“zeta电势”或“ζ”可以定义为溶液主体(bulk，内部)与颗粒的滑动面之间存在的电势差。它代表了悬浮液的稳定性。滑动面(或流体动力学半径)对应于颗粒周围的假想球，当颗粒在溶液中移动时，在滑动面中溶剂与颗粒一起移动。zeta电势可以通过本领域技术人员已知的技术来确定，例如，如本文稍后详细描述的通过在电场中移动具有其增溶层的颗粒来确定。
如以下实施例所说明的，事实上，与例如钠抗衡离子的使用相比，四烷基铵抗衡离子的使用实际上引起绝对值增加的颗粒的负zeta电势。在pH≥5，更特别地在pH≥6.5的水性介质中，小于或等于-28mV，更特别地小于或等于-30mV的纳米颗粒的负zeta电位增加了水溶液中纳米颗粒的相互静电排斥的现象，从而可以抑制絮凝现象。实际上，本领域技术人员凭经验可知，具有较高绝对值，更特别地绝对值大于28mV的zeta电位使得通常可以抑制离子强度较低的介质中的絮凝作用。
因此，如本文稍后详细描述的，在表面具有四烷基铵阳离子的本发明的纳米颗粒在pH≥5的水性介质中具有的zeta电势小于或等于-28mV。更特别地，在表面具有四烷基铵阳离子的本发明的纳米颗粒在pH≥6.5的水性介质中具有的zeta电势小于或等于-30mV。
可以理解的是，zeta电势的测量是在纯化颗粒的水性悬浮液之后进行的，并且因此是对具有的离子传导率严格小于100μS.cm-1的水性悬浮液进行的。
允许对所述悬浮液中存在的离子水平进行评估的悬浮液的离子传导率可以通过任何已知的电导仪在环境温度(25℃)下进行测量。
因此，根据本发明另一方面，本发明提供了包括本发明发光颗粒的胶体水性悬浮液。
因此，本发明的悬浮液表现出优异的胶体稳定性。
此外，在合成方面，本发明的颗粒是直接在水性介质中合成的，并且该合成方案只需要共沉淀反应。因此，本发明的纳米颗粒的制备能够有利地消除去除有机溶剂和将纳米颗粒转移到其他溶剂中的步骤。另外，根据本发明的纳米颗粒的合成可以有利地在环境温度下进行。
另外，如本文稍后详细描述的，用于共沉淀反应以形成本发明的纳米颗粒的原钒酸根离子(VO4 3-)可以有利地由偏钒酸盐(例如偏钒酸铵(NH4VO3)或偏钒酸钠(NaVO3))通过加入两当量的强碱(有利的是四烷基氢氧化铵)原位产生。
偏钒酸作为前体的使用有利地允许作为所使用的强碱的抗衡离子来引入大的四烷基铵抗衡离子。因此，根据本发明合成颗粒的技术表现出非常高的胶体稳定性。
最后，如下文描述的，本发明的颗粒可以经由各种官能化/连接反应，在体内、在离体或体外，容易地连接至用于诊断目的的靶向剂。因此，发现根据本发明合成的纳米颗粒作为探针具有特别有利的应用，其允许生物样品中离体或体外的检测和/或定量具有优异的可再现性。
因此，根据本发明另一方面，本发明提供了根据本发明的颗粒的用途，该颗粒更特别地与至少一种靶向剂连接，作为诊断剂，更特别地作为离体或体外的诊断剂。
根据本发明的又一方面，本发明涉及一种诊断试剂盒，更特别地用于体外或离体诊断，换言之，用于体外或离体检测和/或定量样品中生物或化学目标物质的试剂盒，该试剂盒包括至少根据本发明的发光颗粒，更特别地为胶体水性悬浮液形式。
在本文的其余部分中，术语“根据本发明的纳米粒子”将更简单地指在其表面上存在四烷基铵阳离子的上述式(I)的纳米颗粒。
此外，表述“官能化的纳米颗粒”用于表示根据本发明的纳米颗粒，该纳米颗粒也被一种或多种基团(诸如，例如，柠檬酸、聚丙烯酸(PAA)、醛官能团、羧酸官能团(COOH)、胺官能团等表面官能化。
最终，表述“连接的纳米颗粒”将用于表示在表面官能化之后与一种或多种靶向剂(诸如蛋白质、抗体、DNA、RNA、适体等)连接结束时的本发明的纳米颗粒，如随后下文中详细描述的。
通过阅读下面的通过举例说明而非限制本发明的方式给出的描述、实施例和附图，根据本发明的颗粒、其合成方法以及将其用作诊断探针的用途的其他特征、变体和优点将变得更加清楚。
在本文的其余部分中，表述“……与……之间”，“从……至……的范围”和“从……变化至……”是等同的，并且除非另有说明，否则表示包括端点。
除非另有说明，否则表述“包括”应该被理解为“包括至少一个”。
发光颗粒
如上所述，本发明的发光颗粒包括式A1-xLnxVO4(1-y)(PO4)y(I)的纳米颗粒或者甚至由式A1-xLnxVO4(1-y)(PO4)y(I)的纳米颗粒形成，其中，A、x、Ln和y是如上限定的，其表面上带有四烷基铵阳离子。
四烷基铵阳离子在本发明的纳米颗粒表面上的固定更特别地由式(I)的纳米颗粒的带负电荷的表面离子(O2-)与带正电荷的四烷基铵抗衡离子之间的静电相互作用产生。
因此，四烷基铵阳离子经由与纳米颗粒带负电荷的表面离子的静电相互作用直接与纳米颗粒缔合。更特别地，四烷基铵阳离子在纳米颗粒表面上的固定不使用任何“间隔基”基团。
“四烷基铵”阳离子非常特别地指四(C1-C6)烷基铵阳离子，换言之，式NR4 +的阳离子，其中，R相同或不同，是代表C1-C6烷基，更特别地代表C1-C4烷基的基团。
“四烷基铵”阳离子优选为四(C1-C3)烷基铵阳离子，换言之，式NR4 +的阳离子，其中，R相同或不同，代表的C1-C3烷基。
“C1-C6烷基”表示包括1至6个碳原子的饱和的直链或支链脂肪族基团。示例包括甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、叔丁基等基团。
四烷基铵阳离子优选选自阳离子四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵、四丁基铵及其混合物。
根据一种特定的实施方式，本发明的纳米颗粒的表面上存在的阳离子是四甲基铵阳离子。
如上说明的，就所述合成颗粒的水性悬浮液的胶体稳定性方面，四烷基铵阳离子以足以获得所期望结果(换言之，所期望zeta电势)的量存在于本发明的纳米颗粒的表面上。
存在于本发明的纳米颗粒的表面上的四烷基铵阳离子可以以每个纳米颗粒100至10000个四烷基铵阳离子存在。
因此，本发明的纳米颗粒非常特别地符合下式(I’)：
A1-xLnxVO4(1-y)(PO4)y·(NR4 +)z (I’)
其中：
.A选自Y、Gd、La及其混合物，A优选代表Y；
.Ln选自Eu、Dy、Sm、Nd、Er、Yb及其混合物，Ln优选代表Eu；
.0<x<1，更特别地0.2≤x≤0.6，并且非常特别地x为0.4；
.0≤y<1；
.R相同或不同，为如上所限定的，优选代表C1-C3烷基，并且更特别地代表甲基；以及
.z代表位于所述纳米颗粒表面上的四烷基铵阳离子NR4 +的数量，z更特别地在100至10000之间。
根据一种特定的实施方式，纳米颗粒符合上述式(I)或(I’)，其中，y为0。
换言之，本发明的纳米颗粒具有式A1-xLnxVO4(II)，其表面上存在四烷基铵阳离子。
因此，本发明的纳米颗粒可以非常特别地符合式A1-xLnxVO4·(NR4 +)z(II’)，其中，A、x、Ln、R和z是如上所限定的。
根据一种特定的实施方式，上述式(I)、(I’)、(II)或(II’)中的A代表钇(Y)。
根据另一特定的实施方式，上述式(I)、(I’)、(II)或(II’)中的Ln代表Eu。
因此，在一种特定的变体实施方式中，本发明的颗粒全部或部分由式Y1-xEuxVO4(III)的纳米颗粒形成，其中，0＜x＜1，所述纳米颗粒在表面上具有四烷基铵阳离子。
非常特别地，本发明的纳米颗粒可以非常特别地符合式Y1-xEuxVO4·(NR4 +)z(III’)，其中，x、R和z是如上所限定的。
根据一种特定的实施方式，最大化Ln离子(更特别地铕(Eu))的掺杂度x与由纳米颗粒发射的量子产率的乘积。
更特别地，当希望Ln离子的光学激发是通过直接激发，即与这些离子的电子状态共振，而不是通过基质AVO4(1-y)(PO4)y的激发以及随后向这些离子的能量转移时，这是有用的。
对Ln离子的掺杂程度x和量子产率的乘积的这种优化可以如下实现：通过使用Ln离子的高掺杂水平，例如在0.2至0.6之间，并且尤其是0.4，但是不减少量子产率，特别是通过限制导致浓度消失的掺杂离子之间的转移过程。更特别地，为了保持较高的量子产率，必须使颗粒的结晶度不完美。原因是优异的结晶度会促进了掺杂离子之间的转移过程，更特别地当这些离子彼此紧邻时，如在高掺杂水平的情况下，并且因此其促进了通过连接至溶剂的非辐射过程的离子的去激发过程。更特别地，在环境温度或至少在不超过600℃的温度下的合成方法对于这些纳米颗粒所期望的不完美结晶度是有利的。
当通过X射线衍射图在至少一个给定的结晶方向上所确定的相干长度小于如通过透射电子显微照片测量的该方向上的颗粒尺寸的80％时，纳米颗粒的结晶度被认为是“不完美”。可以考虑不同类型的不完美结晶度：多晶性、缺陷或孔隙率。
举例来说，纳米颗粒可以具有式Y0.6Eu0.4VO4，四烷基铵阳离子位于表面。更特别地，它可以符合式Y0.6Eu0.4VO4·(NR4 +)z，其中，z代表四烷基铵阳离子的数量。
可以理解的是，以上提到的各种实施方式，尤其是关于光致发光纳米颗粒和表面四烷基铵阳离子的性质，是可以组合的。
举例来说，根据本发明的光致发光颗粒可以由在其表面上固定有四甲基铵阳离子的式Y0.6Eu0.4VO4的纳米颗粒形成。
本发明的纳米颗粒非常特别地具有细长的椭球形的整体形状(也称为术语“长椭球形”)。
尺寸可以通过透射电子显微镜来测量。透射电子显微照片允许确定纳米颗粒(细长的椭球体)的形状并推导出椭球体的两个轴的平均尺寸。通常认为，在呈2D投影的透射显微照片中不可见的椭球体的第三轴具有等于最小轴的长度。
具有细长的椭球体形状的本发明的纳米颗粒可以具有的长轴长度α为20nm至60nm之间的；并且短轴长度b为10至30nm之间。更特别地，本发明的纳米颗粒可以具有的平均长轴长度a为40nm以及平均短轴长度b为20nm。
如上所述，根据本发明的发光颗粒允许获得表现出非常高的胶体稳定性的水性悬浮液。应当注意的是，即使在高离子强度的介质中，如在纯化之前的合成介质中(离子强度大于0.1M)，该稳定性也很明显。更特别地，根据本发明的颗粒的水性悬浮液几乎没有或没有表现出絮凝现象。
更特别地，在pH≥5，更特别地pH≥5.5并且具有的离子传导率严格小于100μS.cm-1的水性介质中，根据本发明的在其表面上存在四烷基铵阳离子的颗粒具有的zeta电势ζ小于或等于-28mV。
换言之，在pH≥5，更特别地pH≥5.5的水性介质中，本发明的颗粒的zeta电势的绝对值，称为|ζ|，大于28mV。
“zeta电势”是代表悬浮液稳定性的要素之一。例如，其可以使用购自Malvern的Zetasizer Nano ZS仪器直接测量。该仪器采用光学设备来测量随着施加到它们的电场而变化的颗粒位移速率。
在pH≥6，更特别地pH≥6.5，并且离子传导率严格小于100μS.cm-1的水性介质中，本发明的纳米颗粒非常特别地具有的zeta电势小于或等于-28mV，优选小于或等于-30mV。
更特别地，在pH≥6.5，更特别地pH≥7，尤其是pH≥8，并且离子传导率严格小于100μS.cm-1的水性介质中，本发明的纳米颗粒具有的zeta电势小于或等于-30mV。
根据本发明的纳米颗粒性质上主要是结晶和多晶的，更特别地具有的平均微晶尺寸为如在以下实施例中详述的通过X射线衍射推断的3至40nm之间。
根据本发明的一种特定实施方式，将本发明的纳米颗粒连接(或接枝)到至少一种靶向剂上，尤其是用于将其用作诊断技术中的探针的目的，更特别地在体外或离体诊断中，用于检测和/或定量生物样品中生物物类。
换言之，本发明的颗粒可以包括至少一种固定在纳米颗粒表面上的靶向剂。
如本文其余部分详细描述的，靶向剂可以是各种类型，这取决于本发明的发光颗粒的所期望的应用。
颗粒的制备
如前所描述的，本发明在其另一方面中，还提供了一种制备包括下式的纳米颗粒的发光颗粒的方法：
A1-xLnxVO4(1-y)(PO4)y(I)
其中：
.A选自钇(Y)、钆(Gd)、镧(La)及其混合物，其中，A优选代表Y；
.Ln选自铕(Eu)、镝(Dy)、钐(Sm)、钕(Nd)、铒(Er)、镱(Yb)及其混合物，其中，Ln优选代表Eu；
.0<x<1；以及
.0≤y<1
通过在水性介质中由所述元素A和Ln的前体并且在原钒酸根离子(VO4 3-)和可选的磷酸根(PO4 3-)离子的存在下共沉淀反应；所述反应在有效量的四烷基铵阳离子的存在下进行。
更特别地，本发明提供了一种制备包括式(I’)的纳米颗粒的发光颗粒的方法：
A1-xLnxVO4(1-y)(PO4)y·(NR4 +)z (I’)
其中：
.A代表Y、Gd、La及其混合物，其中，A优选代表Y；
.Ln选自Eu、Dy、Sm、Nd、Er、Yb及其混合物，其中，Ln优选代表Eu。
.0<x<1；
.0≤y<1；
.R，其相同或不同，为如前所限定的，并且优选代表C1-C3烷基；以及
.z代表位于所述纳米颗粒的表面上的四烷基铵阳离子NR4 +的数量。
本发明非常特别地提供一种制备包括如前所限定的式(II)、(II’)、(III)或(III’)的纳米颗粒的发光颗粒的方法。
元素A和Ln的前体通常可以采用所述元素的盐的形式，例如硝酸盐、氯化物、高氯酸盐或乙酸盐，更特别地硝酸盐。当然，元素A和Ln的前体及其量是根据所期望的纳米颗粒的性质适当选择的。
例如，式Y1-xEuxVO4(III)的纳米颗粒的合成可以采用钇的硝酸盐形式(Y(NO3)3)和铕的硝酸盐形式(Eu(NO3)3)的钇和铕前体化合物。
根据本发明方法的一个基本特征，共沉淀反应是在有效量的四烷基铵阳离子的存在下进行的。
非常特别地四烷基铵阳离子是如先前所限定的。它们优选地选自四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵和四丁基铵阳离子及其混合物。所讨论的阳离子优选为四甲基铵阳离子。
非常特别地，“有效量”指阳离子的用量足以就所述合成颗粒的水性悬浮液的胶体稳定性方面获得所期望的结果。
更特别地，四烷基铵阳离子的使用量使得在本发明方法的结果中获得的纳米颗粒显示出如前说明的zeta电位。如下文实施例1中所说明，在根据本发明的共沉淀反应中，四烷基铵阳离子是原钒酸根离子(VO4 3-)和可选的磷酸根离子(PO4 3-)的抗衡离子(其中，y≠0)。
根据一种特别优选的实施方式，原钒酸根离子(VO4 3-)是由偏钒酸盐，优选偏钒酸铵(NH4VO3)原位产生的。
原钒酸根离子可以非常特别地通过所述偏钒酸盐与碱(更特别地与两当量的强碱)反应而原位形成的。
更特别地，用于由偏钒酸盐原位形成原钒酸根离子的碱是四烷基铵阳离子的来源。例如，其可以是四烷基氢氧化铵，例如四甲基氢氧化铵。
与使用原钒酸钠相比，使用偏钒酸盐诸如偏钒酸铵例如来合成根据本发明的纳米颗粒被证明是特别有利的，因为它避免了与原钒酸钠的碳酸盐(根)含量变化有关的可再现性问题。
举例来说，实施例1代表了由偏钒酸铵和四甲基氢氧化铵的合成反应。
还可以考虑使用烷基铵偏钒酸盐(不是商购的)和另一种强碱，诸如氢氧化铵。
纳米颗粒表面上四烷基铵离子的存在有利地不仅允许合成结果中较高的胶体稳定性，而且还允许整个合成过程中形成的颗粒的稳定性，并且因此允许合成方法本身具有更好的可再现性。
根据本发明的制备颗粒的方法可以更特别地至少采用以下步骤，即：
(i)提供称为溶液(1)的水性溶液，其包括原钒酸根离子(VO4 3-)和可选的磷酸根离子(PO4 3-)，以及四烷基铵阳离子；
(ii)在有利于通过共沉淀形成式(I)的纳米颗粒的条件下，将水性溶液(1)与称为溶液(2)的水性溶液混合；该溶液(2)包括元素A和Ln的所述前体，更特别地以盐尤其是硝酸盐的形式；以及
(iii)回收在步骤(ii)结束时形成的具有位于其表面上的四烷基铵阳离子的所述式(I)的纳米颗粒。
水溶液(1)可以非常特别地通过将至少一种偏钒酸盐，更特别地偏钒酸铵和作为四烷基铵阳离子来源的至少一种碱(例如四烷基氢氧化铵)混合来制备。
在磷酸根离子的情况下，添加磷酸盐，诸如磷酸钠或磷酸铵。
因此，根据一种特别有利的变体实施方式，本发明的方法至少包括以下步骤：
(i)通过以下步骤制备水性溶液(1)：在水性介质中混合偏钒酸盐，更特别地偏钒酸铵(NH4VO3)和可选的磷酸盐，以及四烷基铵阳离子来源的碱，更特别地四烷基氢氧化铵；
(ii)在有利于通过共沉淀形成式(I)的纳米颗粒的条件下，将水性溶液(1)与水性溶液(2)混合，水性溶液(2)包括元素A和Ln的所述前体，更特别地以盐尤其是硝酸盐的形式；以及
(iii)回收在步骤(ii)结束时形成的具有位于其表面上的四烷基铵阳离子的式(I)的纳米颗粒。
根据一种特定的实施方式，在步骤(ii)中将溶液(2)添加至溶液(1)中是逐滴进行的。
根据另一变体实施方式，可以将溶液(2)一次性而非逐滴地添加至溶液(1)中。
溶液(1)和(2)的水性介质非常特别地由水形成。
在一种特定的实施方式中，含有元素A和Ln的前体的水性溶液(2)还可以包括用于这些元素的络合剂，诸如柠檬酸盐，例如四烷基柠檬酸铵。
关于根据本发明的式(I)的纳米颗粒的期望性质，适当地调节各种反应物的量，更特别地是原钒酸盐和可选地磷酸根离子以及所述元素A和Ln的前体的量，在本领域技术人员的能力范围内。
更特别地，必须遵守根据式(I)、(I’)、(II)、(II’)、(III)和(III’)的各种反应物的化学计量比例。如前所述，当设想Ln离子的光学激发是通过直接激发，即与这些离子的电子态共振，而不是通过基质AVO4(1-y)(PO4)y的激发以及随后向这些离子的能量转移，x的值优选较高，优选在0.2至0.6之间，并且优选为0.4。
有利地，与出版物[13]-[18]中提出的水热技术相比，特别地，用于制备本发明的颗粒的方法不需要对溶液进行任何加热。更特别地，用于合成根据本发明的颗粒的所有步骤(i)至(iii)可以有利地在环境温度(20-25℃)下进行。
然而，例如，用于在高温下制备的例如水热型方法可以产生具有相似结晶度的纳米颗粒，条件是温度不超过600℃，从而允许获得如前说明的表现出不完美结晶度的纳米颗粒，并且因此实现较高的量子产率。
步骤(iii)非常特别地涉及纯化获得的颗粒的溶液，尤其是为了去除过量的抗衡离子。
纯化步骤可以非常特别地包括将颗粒在水性介质中进行透析或离心和例如通过超声进行再分散的步骤。
可以将颗粒再分散在水性介质中，更特别地在水中。如前说明的，本发明的颗粒的水性胶体悬浮液即使在储存数月后仍表现出非常高的稳定性。
在本发明的另一方面，本发明还提供了通过如上描述的方法的结果中获得的颗粒。
根据一种特定的变体实施方式，本发明提供了一种用于制备全部或部分由式Y1- xEuxVO4(III)的纳米颗粒(其中，0＜x＜1)形成的颗粒的方法，该方法至少包括以下步骤：
(i)提供包括原钒酸根离子和四烷基铵阳离子的水性溶液(1)，所述水性溶液(1)优选是由偏钒酸铵(NH4VO3)和四烷基氢氧化铵在水性介质中的混合物获得的；
(ii)在有利于通过共沉淀形成式(III)的纳米颗粒的条件下，将水性溶液(1)与称为溶液(2)的水性溶液混合，该溶液(2)包括Y和Eu的前体，更特别地是硝酸钇和硝酸铕；以及
(iii)回收在步骤(ii)的结果中形成的具有位于其表面上的四烷基铵阳离子的所述式(III)的纳米颗粒。
根据一种特定的实施方式，该方法还可以包括将获得的颗粒与一种或多种靶向剂连接(接枝)的一个或多个步骤，特别地目的是将它们用于体外、离体或体内的诊断技术。
使用适合于适当地制备颗粒的连接/接枝技术以将它们用作诊断探针的目的在本领域技术人员的能力范围内。相对于颗粒的量对所使用的靶向剂的量进行调节。
靶向剂可以直接或经由间隔基(也称为术语“接头”)接枝至纳米颗粒。
将颗粒连接(也称为接枝)至生物分子的技术是本领域技术人员众所熟知的。它们通常涉及通过共价键结合、通过表面络合、通过静电相互作用、通过包封或通过吸附来进行连接。在某些情况下，包括通过共价键进行连接的情况，可以预先用一种或多种化学基团对颗粒进行官能化，化学基团随后能够与靶向剂携带的另一化学基团反应形成共价键。
可以存在于纳米颗粒表面上的化学基团的实例包括羧基、氨基、硫醇基、醛基和环氧基。
例如，本发明的纳米颗粒可以使用柠檬酸盐进行表面官能化，如以下实施例4中所说明的。
根据另一种特定的实施方式，本发明的纳米颗粒可以使用聚丙烯酸(PAA)进行表面官能化。在使用PAA进行官能化的情况下，由每个PAA分子形成的配位键(配价键)的数量与PAA的长度成比例地增加。PAA可以具有例如范围为3至10000的聚合度。
使用PAA对纳米颗粒进行的官能化有利地获得官能化的纳米颗粒，以及由这些官能化的纳米颗粒与一种或多种靶向剂的连接产生的纳米颗粒，该纳米颗粒在长期稳定性方面表现出优异的性能。
氨基可以由诸如氨基有机硅烷，例如氨基三乙氧基硅烷(APTES)的分子提供。APTES的优势在于，它经由共价键在纳米颗粒周围形成封装体的事实。因此，由APTES提供的胺随时间推移非常稳定。氨基可以通过与琥珀酸酐反应而转化成羧基。
羧基可以由诸如柠檬酸或聚丙烯酸(PAA)的分子提供。
羧基可以通过本领域技术人员已知的任何技术进行活化，更具体地，当靶向剂是蛋白质或抗体时，通过与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应进行活化，随后与多肽表面上的胺官能团反应并形成共价酰胺键。
使用APTES对纳米颗粒的官能化可以有利地在用二氧化硅层覆盖纳米颗粒之后进行。
应用：
如前描述的，根据本发明合成的颗粒，更特别地与至少一种靶向剂连接的颗粒，发现在生物样品中作为探针或生物标志物特别有利的应用。
在另一方面，本发明提供了之前描述的或通过之前描述的方法获得的颗粒，更特别地与至少一种靶向剂连接的颗粒，或这些颗粒的胶体水性悬浮液作为诊断剂的用途——即，用于检测和/或定量生物学或化学上的目标物质。
纳米颗粒尤其可以用作体外或离体诊断剂，换言之，用于检测和/或定量样品中，更特别地生物样品中生物学或化学上的目标物质。
本发明的颗粒可以与各种靶向剂连接。
“靶向剂”指允许化合物与生物学或化学上感兴趣的并且需要鉴定的物质键合。
根据本发明的探针非常适合于多种生物靶标，其特异性取决于靶向剂或接枝到纳米颗粒表面的试剂的性质。
靶向剂可以更特别地是多克隆或单克隆抗体、抗体片段、寡核苷酸、肽、激素、配体、细胞因子、拟肽、蛋白质、碳水化合物、化学修饰的蛋白质、化学修饰的核酸、靶向已知细胞表面蛋白质的化学修饰的碳水化合物、适体、蛋白和DNA/RNA的装配体或HaloTag标签使用的氯烷烃。
根据一种特定的实施方式，试剂是抗体或抗体片段。
适当的抗体片段包括免疫球蛋白的至少一个可变结构域，诸如简单的可变结构域Fv、scFv、Fab、(Fab')2和其他蛋白水解片段或“纳米抗体”(单-结构域抗体，诸如从骆驼抗体获得的VHH片段或从鱼软骨抗体获得的VNAR片段)。
根据本发明的术语“抗体”包括嵌合抗体、人或人源化抗体、重组和修饰的抗体、缀合的抗体，及其片段。
根据一种特定的实施方式，根据本发明使用的抗体或抗体片段靶向癌细胞的特异性标志物。
靶向剂还可以衍生自已知的结合细胞表面受体的分子。例如，靶向片段可以衍生自低密度脂蛋白、转铁蛋白、EGF、胰岛素、PDGF、纤溶酶、抗HER2、抗HER3、抗HER4、膜联蛋白、白细胞介素、干扰素、促红细胞生成素或集落刺激因子。
根据本发明的与靶向剂连接的颗粒可以用于涉及识别配体/抗配体对的体外、离体或体内诊断技术中，例如，生物素或生物素化化合物/亲和素或链霉亲和素、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体、糖/凝集素、多核苷酸/多核苷酸互补体等，条件是这些对中的一个要素构成目标生物分子，或者也可以连接至目标生物分子。
在下文的实施例4中给出了将根据本发明的Y0.6Eu0.4VO4型颗粒与蛋白质、链霉亲和素和抗体连接的实例。
根据本发明的颗粒允许例如在生物样品中确定将与靶向剂结合的目标分子的存在；特别地在去除未与目标分子连接的靶向剂之后，通过本发明的颗粒的发光性质揭示该结合。
因此，本发明的颗粒可用于检测和/或定量生物样品中生物标志物、抗体、DNA、RNA等的浓度。
生物学样品可以例如选自包括血液、血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液等的列表。
能够采用本发明的颗粒的体外或离体诊断技术是本领域技术人员普遍熟知的。例如，它们可以包括以下技术：免疫测定、免疫标记、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫标识、蛋白质印迹技术、“斑点印迹”技术、流式细胞术、荧光激活细胞分选FACS方法，以及更一般地在活细胞或固定细胞表面或低温或非低温组织切片上的任何类型的生物分子检测，ELISA、ELOSA、ELISPOT、多重/多次检测分析、荧光原位杂交或FISH等
本发明的颗粒还可以用于通过杂交来检测DNA的方法或通过RT-PCR然后杂交来检测RNA的方法。
用于体外或离体分析的载体可以是各种类型。它们可以是板、多孔板、微板(microplaques)、凝胶、膜、条、微通道等。
检测可以通过任何常规的装置来执行，通常包括用于激发颗粒的辐射源，例如激光照明装置，更特别地单色装置，以及用于检测由颗粒发射的发光强度的装置，例如，以照相机形式的装置，诸如CCD照相机、电子倍增CCD(EM-CCD)照相机，或者单个光电探测器形式的装置，尤其是光电倍增器或光电二极管的形式。
可以用本发明的颗粒诊断的疾病不受限制，并且包括通过对该疾病特异性的一种或多种标志物的存在而揭示的任何疾病，标志物包括具有特定结合伴侣的生物目标分子。
实例包括感染性(细菌性、寄生虫性或病毒性)疾病(诸如AIDS)、炎性和自身免疫性疾病、心脏病、神经性或肿瘤性疾病(例如实体癌，诸如乳腺癌或前列腺癌)。
在本发明另一方面，本发明还提供了用于体外、离体或体内诊断的试剂盒，该试剂盒包括至少根据本发明的颗粒或这些颗粒的水性胶体悬浮液。
本发明更特别地提供了一种用于体外或离体检测和/或定量样品中生物学或化学上的目标物质的试剂盒，该试剂盒包括至少根据本发明的颗粒或这些颗粒的胶体水性悬浮液。
该检测试剂盒可以非常特别地包括：
-在其表面上固定有用于检测/定量的被分析物的靶向剂的载体，例如称为“捕获抗体”的第一抗体，其特异于待检测/定量的生物学或化学上的目标物质；以及
-一个或多个容器，其包括至少根据本发明的纳米颗粒和以与纳米颗粒连接或不连接形式的至少一种靶向剂。
如前说明的，载体可以是任何类型的，尤其是玻璃或塑料，诸如板、柱、凝胶、磁珠等。有利地是多孔板。通常通过吸附或通过共价键在孔表面上实现固定。
根据第一替代方案，试剂盒可以包括已经与靶向剂连接的根据本发明的纳米颗粒，更特别地已经与称为“可视化抗体”的抗体连接，以将它们与固定在载体上的捕获抗体区分开。
可以获得根据本发明的试剂盒中使用的抗体连接的纳米颗粒，例如——如实施例4中描述的和图6中说明的——通过将与链霉亲和素连接的纳米颗粒与生物素化抗体连接，或者直接地通过将抗体连接在柠檬酸或聚丙烯酸官能化的纳米颗粒上。
替代地，试剂盒可以包括多个容器，容器单独地包括根据本发明的纳米颗粒和靶向剂，并且医生能够从中制备与靶向剂连接的根据本发明的纳米颗粒。
例如，试剂盒可以包括第一容器和第二容器，第一容器包括使用柠檬酸或聚丙烯酸官能化的本发明的纳米颗粒；第二容器包括生物素化抗体；如实施例4所描述的，制备与抗体连接的纳米颗粒涉及活化包含在第一容器中的羧基官能团，然后混合第一容器和第二容器的内容物。
当然，包括根据本发明的颗粒的根据本发明的检测试剂盒不限于上述试剂盒变体。
根据另一种实施方式，本发明的颗粒还可以用作诊断剂以用于体内光学成像，或者用作放大基于辐射的体内治疗的试剂。
根据本发明的又一方面，本专利申请因此提供了与至少一种靶向剂连接或不连接的根据本发明的发光颗粒，当颗粒包括钆时在体内用作用于光学成像或磁共振成像的诊断剂，或在体内用作用于X射线成像的诊断剂。更特别地，它们可以用作MRI造影剂。
由于它们的敏化能力，本发明的纳米颗粒还可以用于放射治疗。
根据本发明的又一方面，本专利申请因此提供了与至少一种靶向剂连接或不连接的根据本发明的发光颗粒，其在体内用作试剂以在体内放大通过电离辐射(电子、质子、X或γ光子等)对癌症的治疗。
因此，纳米颗粒被用来增强放射疗法在肿瘤细胞中的破坏力，同时降低对健康组织的毒性。
下面给出的实施例和附图仅通过说明而不是限制本发明的方式给出。
附图说明
图1：根据实施例1获得的纳米颗粒的通过透射电子显微镜(TEM)获得的显微照片(比例尺：分别为60nm(图1a)和5nm(图1b))；
图2：根据对根据实施例1的约300个纳米颗粒的集合进行的TEM显微照片确定的纳米颗粒的尺寸图(histogram，直方图)；
图3：根据实施例1(黑线)和实施例3(灰线)合成的纳米粒子获得的X射线衍射图；
图4：使用柠檬酸(图4a)或使用聚丙烯酸(PAA)(图4b)官能化的本发明的纳米颗粒的示意图。为了清楚起见，示出了单个柠檬酸或PAA分子。应当理解的是，每个纳米颗粒在其表面上可以含有大量PAA或柠檬酸盐(根)分子。
图5：根据实施例4，将根据本发明的纳米颗粒与链霉亲和素进行连接的反应的示意图；
图6：将与链霉亲和素连接的纳米颗粒与生物素化抗体进行连接的示意图；
应当理解的是，图4至图6是原理图，特别是关于表面分子的结构，其可以具有除这些图中示出之外的许多构型。
实施例
实施例1
合成根据本发明的Y0.6Eu0.4VO4纳米颗粒
所使用的偏钒酸根VO3 -离子的来源是偏钒酸铵NH4VO3，在与碱，目前为四甲基氢氧化铵，N(CH3)4OH，反应后原位获得原钒酸根VO4 3-。硝酸钇和硝酸铕用作Y3+和Eu3+离子的来源。
新鲜制备10mL的0.1M NH4VO3和0.2M N(CH3)4OH的水性溶液(溶液1)。
使用注射器驱动器以1mL/ml的速度向溶液1中逐滴添加另一种体积为10mL的Y(NO3)3和Eu(NO3)3的离子(Y3++Eu3+)浓度为0.1M的溶液。
根据纳米颗粒中离子Y3+和Eu3+之间的期望比例来选择Y(NO3)3和Eu(NO3)3之间的摩尔浓度比例；通常，Y3+:Eu3+的摩尔比为0.6:0.4。
当添加了Y(NO3)2/Eu(NO3)3溶液时，溶液会扩散并呈现白色/乳白色而不形成沉淀。合成继续进行直到所有Y(NO3)2/Eu(NO3)3溶液都添加完。
现在必须纯化最终的20mL溶液，以去除过量的抗衡离子。为此，以11000g(Sigma3K10，Bioblock Scientific)多次离心80分钟(通常3次)，每次之后都使用通过超声(Branson Sonifier 450，在50％，以400W的功率运行)进行的再分散，直到所得的电导率严格小于100μS.cm-1。
使用化学电导仪测量电导率。
在其表面上固定有四甲基铵阳离子的Y0.6Eu0.4VO4纳米颗粒的合成可以示意性地表示如下：
VO4 3-+2N(CH3)4 ++NH4 ++0.6Y(NO3)3+0.4Eu(NO3)3→Y0.6Eu0.4VO4+2N(CH3)4 ++NH4 ++3NO3
进行了两个试验合成(“合成1”和“合成2”)。
结果
在烧瓶中静置16小时后，目视观察根据本发明的纳米颗粒的溶液，显示出均匀扩散的溶液。
最终的溶液在水中仍然保持非常稳定，即使在合成的最终pH(约pH 7-9)下数月后。溶液保持稳定，甚至在合成介质中(去除过量的抗衡离子之前)，但其具有的离子强度较高(＞0.1M)。
使用DLS-Zeta电位仪(Zetasizer Nano ZS90，Malvern)测定了纳米颗粒的zeta电势。下表1中总结了由两种合成方法测得的纳米颗粒的zeta电势的结果。
为了通过透射电子显微镜(TEM)进行观察，将纳米颗粒的稀溶液放在碳网格上。使用在300kV运行的具有0.235nm分辨率的Philips CM30显微镜进行观察。
通过TEM观察的纳米颗粒(图1)示出了纳米颗粒具有细长的椭球体形状。根据对约300个纳米颗粒的集合进行的TEM显微照片确定了纳米颗粒的尺寸(图2)。本发明的纳米颗粒具有的长轴长度a为20至60nm之间，平均值约为40nm；并且短轴长度b为10至30nm之间，平均值约为20nm。
TEM显微照片(图1)不允许形成晶体平面，这一事实可能归因于纳米颗粒由许多尺寸小于纳米颗粒尺寸的微晶组成。纳米颗粒的主要晶体和多晶性质是通过X射线衍射实验证实的。
图3中表示了使用铜Kα1射线借助于Philips X-pert衍射仪获得的X射线衍射图。使用X'Celerator面检测器(PANalytical)记录了衍射强度。
一个结晶方向上的相干长度，并且因此在该结晶方向上组成纳米颗粒的微晶的平均尺寸可以通过应用Scherrer公式由XR衍射图中的峰的宽度来估计。对于各个结晶方向获得的相干长度值在3至40nm之间。在至少一个结晶方向上的相干长度小于在该方向上的纳米颗粒的尺寸，并且由此可以推断出纳米颗粒的结晶度是不完美的(多晶性、缺陷或孔隙率)。在该方向(200)上(图3，在处的峰)，相干长度为10.2nm，比实施例3的纳米颗粒(11.1nm)的相干长度稍弱。/>
实施例2(非发明的)
在无大抗衡离子的情况下，由偏钒酸钠合成Y0.6Eu0.4VO4纳米颗粒
对于通过金属盐的共沉淀来进行合成，将硝酸钇和硝酸铕用作Y3+和Eu3+离子的来源。所使用的偏钒酸根VO3 -离子的来源是偏钒酸钠NaVO3，其与碱，目前为氢氧化钠NaOH，反应后原位获得原钒酸根VO4 3-。
新鲜制备10mL的0.1M NaVO3和0.2M NaOH的水性溶液(溶液1)。
使用注射器驱动器以1mL/ml的速度向溶液1中逐滴添加另一种体积为10mL的Y(NO3)3和Eu(NO3)3的离子(Y3++Eu3+)浓度为0.1M的溶液。
根据纳米颗粒中离子Y3+和Eu3+之间的期望比例来选择Y(NO3)3和Eu(NO3)3之间的摩尔浓度比例；通常，Y3+:Eu3+的摩尔比为0.6:0.4。
当添加了Y(NO3)2/Eu(NO3)3溶液时，会出现乳状沉淀。合成继续进行直到所有Y(NO3)2/Eu(NO3)3溶液都添加完。
现在必须纯化最终的20mL溶液，以去除过量的抗衡离子。为此，以11000g(Sigma3K10，Bioblock Scientific)多次离心80分钟(通常3次)，每次之后都使用通过超声(Branson Sonifier 450，在50％，以400W的功率运行)进行的再分散，直到所得的电导率严格小于100μS.cm-1。
结果
在静置16小时后，将所得溶液与实施例1中获得的根据本发明的纳米颗粒的溶液(对于相同的最终钒酸根离子浓度)进行比较，表明与来自实施例1的溶液相比，溶液扩散的不好(较少白色)；烧瓶底部已经形成了细小沉淀。
如实施例1中所述确定的纳米颗粒的zeta电势在下表1中给出。
实施例3(非发明的)
在无大抗衡离子的情况下，由原钒酸钠合成Y0.6Eu0.4VO4纳米颗粒
对于通过金属盐的共沉淀来进行合成，将硝酸钇和硝酸铕用作Y3+和Eu3+离子的来源。使用原钒酸钠Na3VO4作为原钒酸根离子VO4 3-的来源。
新鲜制备10mL的0.1M Na3VO4的水性溶液(溶液1)。测量pH值，并在必要时进行调节以获得12.6至13之间的值。
使用注射器驱动器以1mL/ml的速度向溶液1中逐滴添加另一种体积为10mL的Y(NO3)3和Eu(NO3)3的离子(Y3++Eu3+)浓度为0.1M的溶液。
根据纳米粒子中离子Y3+和Eu3+之间的期望比例来选择Y(NO3)3和Eu(NO3)3之间的摩尔浓度比例；通常，Y3+:Eu3+的摩尔比为0.6:0.4。
当添加了Y(NO3)2/Eu(NO3)3溶液时，会出现乳状沉淀。合成继续进行直到所有Y(NO3)2/Eu(NO3)3溶液都添加完。
现在必须纯化最终的20mL溶液，以去除过量的抗衡离子。为此，以11000g(Sigma3K10，Bioblock Scientific)多次离心80分钟(通常3次)，每次之后都使用通过超声(Branson Sonifier 450，在50％，以400W的功率运行)进行的再分散，直到所得的电导率严格小于100μS.cm-1。
结果
在静置16小时后，将所得溶液与实施例1中获得的根据本发明的纳米颗粒的溶液(对于相同的最终钒酸根离子浓度)进行比较，表明与来自实施例1的溶液相比，大部分纳米颗粒已经沉积在烧瓶的底部；溶液的上部几乎是透明的，表明不存在扩散，并且因此溶液中不存在纳米颗粒。
如实施例1中所述确定的纳米颗粒的zeta电势在下表1中给出。
图3中表示了使用Philips X-pert衍射仪获得的X射线衍射图。
正如实施例1，可以通过应用Scherrer公式来估计结晶方向(200)上组成纳米颗粒的微晶的平均尺寸，并且得到3至40nm之间的值。微晶的尺寸在总体上小于纳米颗粒的尺寸，并且由此可以推断出，根据实施例3合成的纳米颗粒也是多晶的。
*纯化后得到电导率<100μS.cm-1，然后使用酸性水稀释后进行zeta电势测量。
表1：按照根据本发明的实施例1(基于偏钒酸铵与大抗衡离子的合成)以及按照非根据本发明的实施例2和3(在无大抗衡离子的情况下基于偏钒酸钠的合成，以及在无大体积抗衡离子的情况下基于原钒酸盐的合成)获得的纳米颗粒的zeta电势ζ的比较。
根据实施例1至3获得的纳米颗粒的zeta电势的比较证实了，与在无四烷基铵阳离子的情况下获得的纳米颗粒(实施例2和3)相比，根据本发明的纳米颗粒(实施例1)表现出改善的胶体稳定性，其中，|ζ|>30mV。
根据与实施例1的合成中相同的方案，进行根据本发明的纳米颗粒Y0.6Eu0.4VO4的替代合成，唯一的区别是10mL的Y(NO3)3和Eu(NO3)3的离子(Y3++Eu3+)浓度为0.1M的溶液不是逐滴添加而是一次添加到溶液1中。
合成结束时，纯化后，在7.8的pH下，zeta电势为-35mV。
实施例4
将纳米颗粒与蛋白质链霉亲和素连接
i.将柠檬酸盐(根)接枝到纳米颗粒的表面
在根据实施例1的纳米颗粒的合成结果中，将纳米颗粒溶液以17000g离心3分钟，以沉淀任何纳米颗粒聚集体，并回收上清液。
移出约250μL钒酸根离子浓度为5mM的Y0.6Eu0.4VO4颗粒，并将其分散在1mL含柠檬酸根离子(浓度为0.2M)的蒸馏水溶液中。
然后将溶液超声处理5分钟，并且然后以17000g离心3分钟。重复此步骤3次。
在接枝结束时，将颗粒分散在蒸馏水中——其中颗粒是稳定的一种溶剂。
使用柠檬酸盐(根)对纳米颗粒的官能化可以通过使用PAA(例如，其中聚合度在3至10000之间)的官能化来替代，通过使用PAA的盐，例如钠盐或铵盐。
图4示意性地示出了使用(a)柠檬酸和(b)聚丙烯酸官能化的本发明的纳米颗粒。
ii.将纳米颗粒与链霉亲和素连接
将接枝有柠檬酸根离子的纳米颗粒(NP)以16000g离心1小时，然后回收沉淀(pellet)。
根据以下方案，将在其表面接枝有柠檬酸根的纳米颗粒与链霉亲和素进行连接：
1.在MES缓冲液3(pH 5-6)中新鲜制备EDC 1/磺基-NHS 2的混合溶液(浓度分别为30和30mg/mL)。
2.通过超声处理(超声波浴)，将NP的沉淀分散在250μL步骤1中制备的溶液中。由于离心期间的损失较低，因此钒酸盐离子的浓度保持在5mM左右，获得48nm的纳米颗粒浓度。
(如参考文献Abdesselem等人，ACS Nano 8，11126-11137(2014)中所描述的，通过将颗粒溶解在酸性介质中，然后比色法确定钒酸根离子的浓度来确定纳米颗粒溶液的钒酸盐(根)浓度。如参考文献Casanova等人，Appl.Phys.Lett 89,253103(2006)中所描述的，由钒酸根离子的浓度来确定纳米颗粒的摩尔浓度。)
3.使用含有10mM氯化钠的pH 7.4的磷酸盐缓冲液中制备100nm的链霉亲和素(SA)溶液。将链霉亲和素溶液稀释至一定浓度，该浓度是由每个纳米颗粒期望接枝的蛋白质数量所决定的(对于链霉亲和素:NP比例为1:1、5:1和10:1时，分别选择4.8nm、24nm和48nm的浓度)。将250μL该溶液添加到纳米颗粒溶液中。
4.在环境温度下温育2至4h。
5.加入1mL PBST 4并进行涡旋。
6.以6500g进行离心30分钟，然后回收沉淀以去除未与NP连接的蛋白质。丢弃所有上清液。将与蛋白质连接的NP重新分散在1mLPBST中，并在超声浴中进行超声处理。重复此步骤两次。
7.在250μL PBS 5中用1％BSA6的来回收与蛋白质连接的NP。
8.保持在4℃供立即使用或者分装并保持在-80℃。
在图5中示意性地表示了纳米颗粒与链霉亲和素的连接。
用于官能化试验的材料：
1N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(Sigma,cat#E1769)。
2N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(磺基-NHS)(Sigma,cat#56485).
32-(N-吗啉)乙磺酸(MES)(10mM,pH 5-6).
4磷酸盐缓冲盐水pH 7.4(10mM NaCl)+0.05％吐温20(PBST).
5牛血清白蛋白(BSA)(Sigma,cat#A3059).
6磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4,10mM NaCl).
根据上述方案，通过使用BCA方法测定链霉亲和素来确定在连接方案结束时表征的每纳米颗粒(NP)的链霉亲和素(SA)的分子数——以R表示。
用于表征链霉亲和素：纳米颗粒(SA：NP)比例的方案
i.通过BCA方法测定SA
原理
在碱性介质中，蛋白质将Cu2+还原为Cu。双辛可宁酸(BCA)的盐与Cu2+离子形成有色络合物。该络合物可以通过其在562nm处的吸收来定量。
程序
来自ThermoFisher的BCA分析试剂盒(PierceTMBCA蛋白质分析试剂盒，Cat.Num.23225)
·根据ThermoFisher试剂盒中的方案制备Cu2+/BCA测试试剂。
·制备用于标准曲线的SA。为了校准曲线，测定进行了三次。
管 最终SA浓度(μg/mL)
A 2000
B 1500
C 1000
D 750
E 500
F 250
G 125
H 25
I 0＝空白
表2：标准溶液的链霉亲和素浓度
程序如下：
-取96孔板。将25μL的各个标准试管A至I(具有已知浓度的SA)或用于测定的缀合了纳米颗粒的蛋白质放置于相应的孔中。
-向每个孔中添加200μL Cu2+/BCA测试试剂。均质化，覆盖并在37℃下温育30min。
-读取562nm处的吸光度(A)，作为考虑到稀释度的最终浓度的函数。通过线性回归建立标准化关系A＝f(SA的浓度，单位为μg/mL)。
根据使用标准曲线获得的线性回归方程式，推论出用于测定的缀合了纳米颗粒的蛋白质的浓度。
ii.SA:NP比例的表征
经由以下公式将通过BCA测定获得的链霉亲和素的质量浓度转换为摩尔浓度：
为了获得SA:NP数量的比例(R)，我们最后应用以下公式：
下表3总结了链霉亲和素溶液与起始纳米颗粒溶液的各种浓度比例下所获得的值。
链霉亲和素溶液与纳米颗粒溶液的浓度比例 1:1 5:1 10:1
连接结束时测定的每个纳米颗粒的链霉亲和素分子的数量 0.97 3.8 9.29
表3：在链霉亲和素溶液与纳米颗粒溶液的各种浓度比例情况下，纳米颗粒-链霉亲和素连接的表征。
从表3中给出的结果可以明显看出，连接后每个纳米颗粒的链霉亲和素分子的数量与初始溶液中的浓度比例具有相同数量级，并且因此表明了较高效的连接。
如图6所示，通过将纳米颗粒与生物素化抗体连接，以这种方式与链霉亲和素连接的纳米颗粒可以有利地用于体外诊断技术中。
替代地，也可以将抗体直接连接至嫁接有柠檬酸根离子的纳米颗粒。在这种情况下，应该使用与上述相同的方案，其中，将链霉亲和素溶液替换为抗体溶液。
实施例5(非发明的)
在合成结束时添加四烷基铵离子的情况下，由偏钒酸钠合成Y0.6Eu0.4VO4纳米颗粒
根据实施例2的合成，由钠盐制备Y0.6Eu0.4VO4纳米颗粒的胶体悬浮液。
纯化是通过透析进行的。
加入一当量(相对于钒酸根离子)的四甲基氢氧化铵N(CH3)4OH，将悬浮液静置20分钟，并且，然后再次透析以去除多余的抗衡离子，直到得到的电导率严格低于100μS.cm-1。
在所得悬浮液的pH为8.9时，如实施例1所述确定的zeta电位为-2.20mV。
使用标准的纳米颗粒合成方法并且然后在合成结束时添加大的四烷基铵离子，不可能获得与本发明方法相同的结果。
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Claims (23)

1.一种发光颗粒，包括下式的纳米颗粒：
A1-xLnxVO4(1-y)(PO4)y (I)
其中：
.A选自钇(Y)、钆(Gd)、镧(La)及其混合物；
.Ln选自铕(Eu)、镝(Dy)、钐(Sm)、钕(Nd)、铒(Er)、镱(Yb)及其混合物；
.0<x<1；以及
.0≤y<1；
其特征在于，所述纳米颗粒在表面具有一定量的四烷基铵阳离子，使得所述纳米颗粒在pH≥5，并且具有的离子传导率严格小于100μS.cm-1的水性介质中具有的zeta电势ζ小于或等于-28mV。
2.根据权利要求1所述的颗粒，其特征在于，所述四烷基铵阳离子经由与所述纳米颗粒的带负电荷的O2-表面离子的静电相互作用而与所述纳米颗粒缔合。
3.根据权利要求1或2所述的颗粒，其特征在于，所述四烷基铵阳离子是式NR4 +的阳离子，其中，R是相同的或不同的，代表C1-C6烷基。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的颗粒，其特征在于，所述四烷基铵阳离子选自四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵、四丁基铵及其混合物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒在pH≥6.5，并且具有的离子传导率严格小于100μS.cm-1的水性介质中具有的zeta电势ζ小于或等于-30mV。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的颗粒，所述纳米颗粒具有式(I’)
A1-xLnxVO4(1-y)(PO4)y·(NR4 +)z (I’)
其中：
.A选自Y、Gd、La及其混合物；
.Ln选自Eu、Dy、Sm、Nd、Er、Yb及其混合物；
.0<x<1；
.0≤y<1；
.R，相同或不同，代表C1-C6烷基；以及
.z代表位于所述纳米颗粒表面上的四烷基铵阳离子NR4 +的数量。
7.根据权利要求6所述的颗粒，其中，z在100至10000之间。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的颗粒，其中，y为0。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的颗粒，其中，A代表Y。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的颗粒，其中，Ln代表Eu。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒具有式Y1- xEuxVO4·(NR4 +)z (III')，其中，x、R和z如权利要求6所限定。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的颗粒，其特征在于，所述式(I)的纳米颗粒具有细长的椭球体形状。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的颗粒，其中，所述Ln离子的掺杂度x与由所述纳米颗粒发射的量子产率的乘积是最大化的。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒与至少一种靶向剂连接。
15.一种用于制备发光颗粒的方法，所述发光颗粒包括下式的纳米颗粒：
A1-xLnxVO4(1-y)(PO4)y (I)
其中：
.A选自钇(Y)、钆(Gd)、镧(La)及其混合物；
.Ln选自铕(Eu)、镝(Dy)、钐(Sm)、钕(Nd)、铒(Er)、镱(Yb)及其混合物；
.0<x<1；以及
.0≤y<1；
通过在水性介质中由所述元素A和Ln的前体并且在原钒酸根(VO4 3-)和可选的磷酸根(PO4 3-)离子的存在下的共沉淀反应；
所述反应在有效量的四烷基铵阳离子的存在下进行，使得所述纳米颗粒在pH≥5，并且具有的离子传导率严格小于100μS.cm-1的水性介质中具有的zeta电势ζ小于或等于-28mV。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法包括至少以下步骤：
(i)提供称为溶液(1)的水性溶液，溶液(1)包括原钒酸根离子(VO4 3-)和可选的磷酸根离子(PO4 3-)，以及四烷基铵阳离子；
(ii)在有利于通过共沉淀形成式(I)的纳米颗粒的条件下，将所述水性溶液(1)与称为溶液(2)的水性溶液混合，溶液(2)包括所述元素A和Ln的前体；以及
(iii)回收在步骤(ii)结束时形成的具有位于其表面上的四烷基铵阳离子的式(I)的所述纳米颗粒。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述四烷基铵阳离子选自四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵、四丁基铵及其混合物。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，用于制备权利要求6至12中任一项所限定的颗粒。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中，所述原钒酸根离子(VO4 3-)是通过偏钒酸盐与碱反应而原位产生的。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述颗粒与一种或多种靶向剂连接的一个或多个步骤。
21.一种胶体水性悬浮液，包括权利要求1至14中任一项所限定的颗粒或通过权利要求15至20中任一项所限定的方法获得的颗粒。
22.权利要求1至13中任一项所限定的颗粒或通过权利要求15至20中任一项所限定的方法获得的颗粒或这些颗粒的胶体水性悬浮液作为诊断剂的用途。
23.一种诊断试剂盒，包括至少权利要求1至14中任一项所限定的颗粒或通过权利要求15至20中任一项所限定的方法获得的颗粒，或这些颗粒的胶体水性悬浮液。
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