BR112019024169A2 - partículas luminescentes baseadas em elementos de terra rara e sua utilização como agente de diagnóstico - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a uma partícula luminescente compreendendo uma nanopartícula de fórmula A1-xLnxVO4(1-y)(PO4)y (I) em que A é selecionado a partir de ítrio (Y), gadolínio (Gd), lantânio (La) e suas misturas; Ln é selecionado a partir de európio (Eu), disprósio (Dy), samário (Sm), neodímio (Nd), érbio (Er), itérbio (Yb) e suas misturas; 0 < x < 1; e 0 = y < 1; caracterizado pelo fato da nanopartícula em sua superfície possuir cátions tetraalquilamônio em uma quantidade tal que a nanopartícula possua um potencial zeta, ¿, menor ou igual a -28mV em um meio aquoso com pH = 5, mais particularmente com pH = 5,5 e com condutividade iônica > 100 µS.cm-1. A presente invenção também se refere a um método para preparar essas partículas luminescentes, a uma suspensão coloidal dessas partículas e a seu uso como agente de diagnóstico, e também a um kit de diagnóstico compreendendo essas partículas luminescentes.

Description

“PARTÍCULAS LUMINESCENTES BASEADAS EM ELEMENTOS DE TERRA RARA E SUA UTILIZAÇÃO COMO AGENTE DE DIAGNÓSTICO”

[001] A presente invenção refere-se ao campo de sondas para detectar e/ou quantificar substâncias de interesse em amostras biológicas. Seu objeto mais particularmente são as novas partículas inorgânicas luminescentes, um processo para prepará-las e uso das mesmas para detectar e/ou medir a presença de proteínas, anticorpos, DNA, RNA, e outros compostos em uma amostra biológica.

[002] A detecção e/ou quantificação de concentrações de biomarcadores, anticorpos ou DNA e RNA em amostras biológicas (sangue, soro, saliva, urina, líquido cefalorraquidiano, etc.) é(são) indispensável(eis) para o diagnóstico médico.

[003] No campo dos diagnósticos in vitro ou ex vivo, análise médica e bioanálise, várias técnicas foram propostas para detectar e/ou medir a presença de substâncias específicas.

[004] Estas técnicas baseiam-se, de um modo geral, no uso de uma sonda que é empregada para detectar e/ou quantificar uma concentração em solução. Essas sondas são acopladas a moléculas, DNA ou proteínas que, diretamente ou através de uma série de reações, se afixam às espécies moleculares a serem analisadas. subsequentemnte, as sondas que reagiram podem ser detectadas por meio de uma ou mais técnicas baseadas, por exemplo, em sua luminescência, sua absorção, sua reatividade química, sua radioatividade etc.

[005] Os ensaios bioquímicos mais comumente empregados são os ensaios imunoabsorventes ligados a enzimas (ELISA), que geralmente dependem do uso da enzima peroxidase de rábano para provocar uma reação com um substrato e quantificar a reação química que ocorreu medindo a absorção do produto de reação na solução. A seleção do composto molecular ao qual a sonda está acoplada é crítica para a eficácia dessas sondas. Mais especificamente, a eficácia dessas técnicas depende da afinidade específica do composto com a substância alvo. Como exemplos, as publicações referenciadas

[1] e [2] detalham as características desses mecanismos.

[006] As sondas luminescentes geralmente levam a uma detecção mais sensível do que as sondas detectadas por sua absorção, porque, no primeiro caso, as medições da intensidade luminosa são feitas contra um fundo escuro, enquanto, no segundo caso, a medição é variável em intensidade luminosa (medições contra uma luz de fundo). As sondas luminescentes atualmente disponíveis exibem uma série de desvantagens que impedem a exploração completa de seu potencial como sondas de diagnóstico. Essas desvantagens incluem, por exemplo, o fenômeno de fotodegradação no caso de fluoróforos orgânicos, que se manifesta, após modificações estruturais irreversíveis, no desaparecimento da fluorescência, ou ainda o fenômeno de oscilação de emissão para nanocristais semicondutores, ou “pontos quânticos”, quando as sondas sofrem interrupção periódica da emissão e são consequentemente inadequadas para produzir um sinal constante. Outras desvantagens resultam, por exemplo, da largura do espectro de emissão das sondas luminescentes. De fato, um espectro de emissão muito amplo dificulta a filtragem do sinal de fundo que pode estar presente, e afeta a qualidade desse sinal e, mais particularmente, afeta a razão sinal-para-ruído. Outros fatores a serem lembrados, além dos fatores ópticos que contribuem para a eficácia da sonda em um teste biológico, são a natureza prática e a facilidade de uso da sonda. Existem certas partículas, como no caso dos nanocristais semicondutores, que perdem suas características de luminescência após o congelamento, o que representa uma desvantagem para o armazenamento dos agentes bioconjugados. A facilidade de acoplamento das sondas ao composto molecular, que permite o direcionamento das moléculas desejadas, também é um aspecto a ser levado em consideração na escolha da sonda apropriada. De fato, existem várias partículas, incluindo nanocristais semicondutores, que são sintetizados em solventes orgânicos. Consequentemente, seu uso para aplicações biológicas requer etapas adicionais de preparação da superfície, a fim de produzir uma dispersão dessas partículas na água, um processo que pode ser muito complicado de implementar e pode não ter estabilidade ao longo do tempo.

[007] Além disso, as propriedades coloidais das partículas/sondas são críticas para a condução dos ensaios biológicos. Soluções com alta estabilidade coloidal são de fato capazes de prover meios para ensaios de alta homogeneidade e, consequentemente, uma melhor reprodutibilidade em termos de resultados desses ensaios.

[008] Por fim, a complexidade e o custo são aspectos importantes na seleção de sondas para diagnóstico. Por exemplo, nanopartículas de ouro, e suas propriedades em termos de ressonância de plasmon de superfície foram propostas como sondas de diagnóstico, mas não foram estabelecidas como sondas para diagnóstico in vitro, possivelmente devido à complexidade do método de detecção [3], ou talvez um custo alto. Os cristais semicondutores, por sua vez, são sintetizados em solventes orgânicos e requerem procedimentos para dispersão em um meio aquoso, tornando-os complicados e, portanto, dispendiosos para sintetizar. Sua funcionalização com grupos químicos, permitindo que sejam acoplados aos compostos moleculares para o reconhecimento das moléculas alvo, depende, além disso, de ligações químicas fracas, limitando sua estabilidade, prejudicando a reprodutibilidade dos testes de detecção.

[009] Nesse sentido, nanopartículas dopadas com íons de terras raras, tais como as nanopartículas Y VO,: Eu, provam ser particularmente vantajosas para uso como sondas para a detecção/quantificação de biomoléculas.

[0010] Nanopartículas com base em vanadato de ítrio dopado com elementos de terras raras, por exemplo, foram descritas em detalhes por Riwotzki et al. [4] e Huignard et al. [5].

[0011] Essas nanopartículas são particularmente vantajosas por sua excelente fotoestabilidade, que permite a obtenção de um sinal constante e prolongado, e a ausência do fenômeno de oscilação das emissões. Além disso, eles têm um espectro de emissão estreito e uma grande mudança na emissão de Stokes. Essas duas características permitem uma filtragem eficaz do sinal de emissão das nanopartículas, liberando-o de sinais interferentes, para prover excelentes razões de sinal-para-ruído. Essas nanopartículas também contêm várias dezenas de milhares de íons excitáveis, que são responsáveis pela luminescência. Aumentar a intensidade de excitação induz, assim, a um aumento linear na luminosidade das partículas, atingindo a saturação da emissão apenas para intensidades impraticáveis.

[0012] Por fim, essas nanopartículas não perdem sua luminescência após o congelamento.

[0013] A síntese de nanopartículas luminescentes, dopadas com íons de terras raras, em meio solvente orgânico foi proposta, por exemplo, no documento EP 1 232 226 ou nas publicações [6], [7] e [8].

[0014] A síntese dessas nanopartículas luminescentes em meio aquoso também já foi proposta, como por exemplo, adição em gotas de soluções de nitratos de ítrio e európio a uma solução de ortovanadato (Na;VO3y) ([9], [10],

[11], [12] e [13].

[0015] Além disso, as publicações [14]-[19] propõem técnicas para síntese hidrotérmica de nanopartículas de YVO, dopadas com íons de terras raras, empregando metavanato ou ortovanadato de amônio como um precursor.

[0016] Um outro documento que pode ser citado é o US 8 337 804, que propõe uma técnica para preparar nanopartículas com base em íons ortovanadatos VO4*”, por exemplo YVO4:Eu, empregando um meio de reação contendo água e pelo menos um poliol.

[0017] O documento EP 1 282 824 descreve o uso de nanopartículas inorgânicas luminescentes modificadas na superfície como sondas para detectar uma substância biológica ou outra substância orgânica.

[0018] As nanopartículas luminescentes obtidas pelas vias de síntese conhecidas mencionadas acima e empregadas em meio aquoso, são submetidas, no entanto, a fenômenos de floculação, e não resultam em suspensões coloidais estáveis. Consequentemente, a quantidade de nanopartículas em suspensão é instável ao longo do tempo e não pode ser determinada com precisão.

[0019] Essa incerteza em termos da quantidade de partículas luminescentes nas suspensões coloidais empregadas é altamente prejudicial quando usadas como sondas em técnicas de diagnóstico, uma vez que afeta a reprodutibilidade dos resultados obtidos, na detecção/quantificação, por exemplo, das concentrações de biomoléculas na amostra testada.

[0020] As partículas luminescentes dopadas com íons de terras raras e obtidas pelas técnicas da técnica anterior, portanto, não provêm satisfação completa para uso como sondas de diagnóstico.

[0021] A presente invenção é especificamente direcionada à proposição de novas partículas luminescentes e um novo caminho para sua síntese que permita superar as desvantagens acima mencionadas.

[0022] A invenção propõe mais particularmente um meio de acessar nanopartículas luminescentes que exibem estabilidade coloidal melhorada em um meio aquoso, vantajosamente com uma síntese mais reproduzível e etapas subsequentes mais reproduzíveis de funcionalização e de acoplamento a um agente de direcionamento molecular.

[0023] De acordo com um primeiro aspecto da mesma, portanto, a invenção provê uma partícula luminescente compreendendo uma nanopartícula de fórmula:

ArxLnVO1-(POs), (D) na qual: . A é selecionado de ítrio (Y), gadolínio (Gd), lantânio (La) e misturas dos mesmos; . Ln é selecionado de európio (Eu), disprósio (Dy), samário (Sm), neodímio (Nd), érbio (Er), itérbio (Yb) e misturas dos mesmos; . O<x<l, mais particularmente 0,2<x<0,6 e muito particularmente x sendo 0,4; e . 0Sy<!; caracterizado por a nanopartícula ter, à superfície, cátions de tetraalquilamônio.

[0024] De acordo com outro aspecto, a invenção provê um método para preparar essas partículas, empregando uma reação de coprecipitação em meio aquoso a partir de precursores dos elementos A e Ln e na presença de íons ortovanadato (VO4*”) e opcionalmente íons fosfato (PO? ), a referida reação sendo realizada na presença de uma quantidade eficaz de cátions tetraalquilamônio.

[0025] Mais particularmente, a quantidade de cátions tetraalquilamônio é, de modo que a referida nanopartícula tenha um potencial zeta, 6, em meio aquoso a um pH > 5 menor ou igual a -28 mV.

[0026] A referida nanopartícula tem, de preferência, um potencial zeta & em meio aquoso a um pH > 6,5, mais particularmente a um pH > 7 e especialmente a um pH > 8, menor ou igual a -30 mV.

[0027] As partículas luminescentes da invenção e a sua via de síntese provam ser vantajosas em vários aspectos.

[0028] Essa nova via de síntese se baseia no uso de contraíons volumosos de tetraalquilamônio.

[0029] Verificou-se, assim, que o uso desses contraíons volumosos na síntese de nanopartículas com base em íons de terras raras provê às partículas em solução com estabilidade coloidal melhorada e impede especialmente os fenômenos de floculação das partículas.

[0030] Como estabelecido anteriormente, a estabilidade das partículas em solução é particularmente crítica para atender aos requisitos em termos de reprodutibilidade para o uso dessas partículas como sondas para diagnóstico in vitro ou ex vivo.

[0031] Sem desejar ser vinculado pela teoria, essa melhoria na estabilização, resultante do uso de contraíons de tetraalquilamônio, em comparação, por exemplo, ao uso de íons sódio, é ligada à diferença no potencial zeta das partículas.

[0032] O “potencial zeta” , ou 6, pode ser definido como a diferença de potencial existente entre o volume da solução e o plano de corte da partícula. É representativo da estabilidade de uma suspensão. O plano de corte (ou raio hidrodinâmico) corresponde a uma esfera imaginária em torno da partícula, dentro da qual o solvente se move com a partícula quando as partículas se movem na solução. O potencial zeta pode ser determinado por técnicas conhecidas por uma pessoa habilitada na técnica, por exemplo, movendo a partícula com sua camada de solubilização em um campo elétrico, como detalhado mais adiante no texto.

[0033] Como ilustrado nos exemplos a seguir, o uso dos contraíons de tetraalquilamônio na verdade induz um potencial zeta negativo da partícula com um valor absoluto aumentado em comparação, por exemplo, com o uso dos contraíons de sódio. Esse potencial zeta negativo das nanopartículas, menor ou igual a -28 mV, mais particularmente menor ou igual a -30 mV, em meio aquoso a pH > 5, mais particularmente a pH > 6,5, aumenta os fenômenos de repulsão eletrostática mútua das nanopartículas em solução aquosa, permitindo assim suprimir os fenômenos de floculação. De fato, é conhecido empiricamente por uma pessoa habilitada na técnica que um potencial zeta com um alto valor absoluto, mais particularmente maior que 28 mV, torna possível, em geral, suprimir os efeitos da floculação em meios com baixa força iônica.

[0034] Portanto, como detalhado mais adiante no texto, as nanopartículas da invenção, tendo cátions tetraalquilamônio na superfície, têm um potencial zeta, 6, em meio aquoso a um pH > 5 menor ou igual a -28 mV. Mais particularmente, as nanopartículas da invenção, tendo cátions tetraalquilamônio na superfície, têm um potencial zeta em meio aquoso a um pH > 6,5 menor que ou igual a -30 mV.

[0035] Entende-se que as medições do potencial zeta são feitas após a purificação da suspensão aquosa das partículas e, portanto, para uma suspensão aquosa tendo uma condutividade iônica estritamente menor que 100 uS.cm”".

[0036] A condutividade iônica da suspensão, que permite avaliar o nível de íons presentes na referida suspensão, pode ser medida em temperatura ambiente (25ºC) por qualquer condutímetro conhecido.

[0037] De acordo com outro de seus aspectos, portanto, a invenção provê uma suspensão aquosa coloidal compreendendo partículas luminescentes da invenção.

[0038] Uma suspensão da invenção, portanto, exibe excelentes propriedades de estabilidade coloidal.

[0039] Além disso, em termos de síntese, as partículas da invenção são sintetizadas diretamente em meio aquoso, e o protocolo de síntese requer apenas uma reação de coprecipitação. A preparação das nanopartículas da invenção é, portanto, vantajosamente capaz de eliminar as etapas de remoção de solventes orgânicos e de transferência das nanopartículas para outros solventes. Além disso, a síntese das nanopartículas de acordo com a invenção pode vantajosamente ser realizada em temperatura ambiente.

[0040] Adicionalmente, como detalhado mais adiante no texto, os íons ortovanadato (VO4”) usados na reação de coprecipitação para formar as nanopartículas da invenção podem ser vantajosamente gerados in situ a partir de um sal metavanadato, por exemplo metavanadato de amônio (NHaVO;3) ou sódio metavanadato (NaVOs), com adição de dois equivalentes de base forte, com vantagem de hidróxidos de tetraalquilamônio.

[0041] O uso do metavanadato como precursor permite vantajosamente a introdução dos contraíons volumosos de tetraalquilamônio como contraíons da base forte usada. A técnica de sintetizar as partículas de acordo com a invenção exibe, portanto, uma estabilidade coloidal muito alta.

[0042] Por fim, como detalhado abaixo, as partículas da invenção podem ser facilmente acopladas a agentes de direcionamento para fins de diagnóstico, in vivo, ex vivo ou in vitro, através de várias reações de funcionalização/acoplamento. As nanopartículas sintetizadas de acordo com a invenção encontram, portanto, aplicação particularmente vantajosa como sondas que permitem a detecção e/ou quantificação, ex vivo ou in vitro, em amostras biológicas, com excelente reprodutibilidade.

[0043] De acordo com outro de seus aspectos, portanto, a invenção provê o uso de partículas de acordo com a invenção, mais particularmente acopladas a pelo menos um agente de direcionamento, como um agente de diagnóstico, mais particularmente como um agente de diagnóstico in vitro ou ex vivo.

[0044] De acordo com ainda outro de seus aspectos, refere-se a um kit de diagnóstico, mais particularmente para diagnóstico in vitro ou ex vivo, ou seja, um kit para detecção in vitro ou ex vivo e/ou quantificação de uma substância de interesse biológico ou químico em uma amostra, que compreende pelo menos partículas luminescentes de acordo com a invenção, mais particularmente na forma de uma suspensão aquosa coloidal.

[0045] No restante do texto, o termo “nanopartícula de acordo com a invenção” se referirá mais simplesmente à nanopartícula da fórmula (1) acima mencionada, em cuja superfície estão localizados cátions tetraalquilamônio.

[0046] Além disso, a expressão “nanopartícula funcionalizada” é usada para denotar a nanopartícula de acordo com a invenção que também é funcionalizada na superfície por um ou mais grupos, tais como, por exemplo, citrato, ácido poliacrílico (PAA), funções de aldeído, funções de ácido carboxílico (COOH), funções amina, etc.

[0047] Por fim, a expressão “nanopartícula acoplada” será empregada para denotar a nanopartícula da invenção no final de seu acoplamento, após a funcionalização da superfície, com um ou mais agente(s) de direcionamento, tal(ais) como, proteínas, anticorpos, DNA, RNA, aptâmero, etc., como detalhado mais adiante no texto.

[0048] Outras características, variantes e vantagens das partículas de acordo com a invenção, do processo para sintetizá-las e usá-las como sondas para diagnóstico, surgirão mais claramente em uma leitura da descrição, dos exemplos e das figuras a seguir, que são dados a título ilustrativo e não limitativo da invenção.

[0049] No restante do texto, as expressões “ entre ... e ...” , “que varia de ... a...” e“variando de ... a ...” são equivalentes e significam que os pontos finais são incluídos, a menos que especificado de outra forma.

[0050] Salvo indicação em contrário, a expressão “compreendendo um” deve ser entendida como “ compreendendo pelo menos um” .

PARTÍCULAS LUMINESCENTES

[0051] Como especificado acima, as partículas luminescentes da invenção compreendem, ou mesmo são formadas, uma nanopartícula de fórmula A1-xKLnxVOa4(1-y(PO4),y (D) na qual A, x, Ln e y são como definidos acima, tendo em sua superfície cátions tetraalquilamônio.

[0052] A imobilização dos cátions de tetraalquilamônio na superfície das nanopartículas da invenção resulta mais particularmente de interações eletrostáticas entre os íons de superfície carregados negativamente (0?) da nanopartícula de fórmula (1) e os contraíons de tetraalquilamônio carregados positivamente.

[0053] Por conseguinte, os cátions tetraalquilamônio estão associados diretamente à nanopartícula por meio de interações eletrostáticas com os íons de superfície carregados negativamente da nanopartículi Mais particularmente, a imobilização dos cátions tetraalquilamônio na superfície da nanopartícula não emprega nenhum grupo “espaçador”.

[0054] Por cátions “tetraalquilamônio” entende-se — muito particularmente cátions tetra (C1-Cs) alquilamônio, em outras palavras, cátions de fórmula NR,', em que R, idênticos ou diferentes, representam um grupo alquila C1-Cçs, mais particularmente alquila C1-Ca.

[0055] Os cátions “tetraalquilamônio” são, de preferência, cátions tetraalquil(C1-C3)amônio, em outras palavras, cátions de fórmula NR", em que R, que são idênticos ou diferentes, representam um grupo alquila C1-C3.

[0056] Por “alquila C-Cs” entende-se um grupo alifático saturado, linear ou ramificado compreendendo 1 a 6 átomos de carbono. Exemplos incluem os grupos metila, etila, propila, butila, isopropila, isobutila, terc-butila, etc.

[0057] Os cátions tetraalquilamônio são, de preferência, selecionados dos cátions tetrametilamônio, tetraetilamônio, tetrapropilamônio, tetrabutilamônio e misturas dos mesmos.

[0058] De acordo com uma forma de realização particular, os cátions presentes na superfície das nanopartículas da invenção são cátions tetrametilamônio.

[0059] Como indicado acima, os cátions tetraalquilamônio estão presentes na superfície das nanopartículas da invenção em uma quantidade suficiente para obter o resultado desejado em termos de estabilidade coloidal da suspensão aquosa das referidas partículas sintetizadas, ou seja, o valor desejado do potencial zeta.

[0060] Os cátions tetraalquilamônio presentes na superfície das nanopartículas da invenção podem estar presentes de 100 a 10.000 cátions tetraalquilamônio por nanopartícula.

[0061] As nanopartículis da invenção, portanto, estão em conformidade muito particularmente com a seguinte fórmula (1”): ArsLnVO41-5(POs), -(NR4), (7) na qual: . A é selecionado de Y, Gd, La e misturas dos mesmos, A de preferência representando Y; . Ln é selecionado de Eu, Dy, Sm, Nd, Er, Yb e misturas dos mesmos, Ln representando de preferência Eu; . O<x<l, mais particularmente 0,2<x<0,6 e muito particularmente x sendo 0,4; . 0Sy <I!; . R, que são idênticos ou diferentes, são como definidos acima, representando de preferência um grupo alquila C1-C;3 e, mais particularmente, metila; e . z representa o número de cátions tetraalquilamônio NR,” localizados na superfície da referida nanopartícula, z mais particularmente entre 100 e 10.000.

[0062] De acordo com uma forma de realização específica, a nanopartícula é de acordo com a fórmula (1) ou (1º) acima mencionada, na qual yéoO.

[0063] Em outras palavras, a nanopartícula da invenção tem a fórmula A1xLnxVO, (ID), na superfície na qual existem cátions de tetraalquilamônio.

[0064] Por conseguinte, uma nanopartícula da invenção pode estar em conformidade muito particularmente com a fórmula A1..LnxVO, - (NR4), (II), na qual A, x, Ln, R e z são como definidos acima.

[0065] De acordo com uma forma de realização específica, A na fórmula mencionada (D), (1), (ID) ou (II) representa ítrio (Y).

[0066] De acordo com outra forma de realização específica, Ln na fórmula mencionada (1), (1º), (ID) ou (II') representa Eu.

[0067] Por conseguinte, em uma forma de realização variante específica, as partículas da invenção são formadas total ou parcialmente de uma nanopartícula de fórmula Yi.Eu,VO,. (III), em que O<x<l, a referida nanopartícula tendo cátions tetraalquilamônio na superfície.

[0068] Muito particularmente, uma nanopartícula da invenção pode estar em conformidade muito particularmente com a fórmula Y -.KEuxVO. - (NR14*); (III), na qual x, R e z são como definidos acima.

[0069] De acordo com uma forma de realização específica, o produto do grau de dopagem, x, com íons Ln, mais particularmente com európio (Eu), e o rendimento quântico da emissão pela nanopartícula é maximizado.

[0070] Mais particularmente, isso é útil quando se espera excitação óptica dos íons Ln por excitação direta, isto é, em ressonância com os estados eletrônicos desses íons, e não por excitação da matriz AVO4-»(PO4), e subsequente transferência de energia para esses íons.

[0071] Essa otimização do produto do grau de dopagem x com íons Ln e do rendimento quântico pode ser realizada usando um alto nível de dopagem com fons Ln, por exemplo, entre 0,2 e 0,6; e especialmente de 0,4; mas sem reduzir o rendimento quântico, mais particularmente limitando os processos de transferência entre íons dopantes que levam à extinção da concentração. Mais particularmente, de modo a manter um alto rendimento quântico, é necessário que a cristalinidade da partícula não seja perfeita. A razão é que a excelente cristalinidade promove os processos de transferência entre os íons dopantes, mais particularmente, quando esses íons estão próximos um do outro, como é o caso dos altos níveis de dopagem, e consequentemente promove os processos de desexcitação dos íons por processos não radiativos ligados ao solvente. Mais particularmente, um processo de síntese em temperatura ambiente, ou pelo menos a uma temperatura não superior a 600ºC, é favorável à cristalinidade imperfeita que é necessária para essas nanopartículas.

[0072] A cristalinidade das nanopartículas é considerada “imperfeita” quando o comprimento da coerência, determinado pelo difratograma de raios X em pelo menos uma determinada direção cristalográfica, é menor que 80% do tamanho da partícula nessa direção, como medido a partir de micrografias eletrônicas de transmissão. Diferentes tipos de cristalinidade imperfeita podem ser considerados: policristalinidade, defeitos ou porosidade.

[0073] A título de exemplo, a nanopartícula pode ter a fórmula YosEuo4VO,4 com cátions tetraalquilamônio localizados na superfície. Mais particularmente, pode estar de acordo com a fórmula Yo.sEuoaVO, - (NR4”)z, com z representando o número de cátions tetraalquilamônio.

[0074] Entende-se que as várias formas de realização mencionadas acima, especialmente com relação à natureza das nanopartículas fotoluminescentes e dos cátions tetraalquilamônio de superfície, podem ser combinadas.

[0075] A título de exemplo, uma partícula fotoluminescente de acordo com a invenção pode ser formada por uma nanopartícula de fórmula Yo.sEuo 4 VO4 com cátions tetrametilamônio imobilizados em sua superfície.

[0076] As nanopartículas da invenção têm muito particularmente uma forma geral elipsoidal alongada (“prolato”, como é denominado).

[0077] O tamanho pode ser medido por microscopia eletrônica de transmissão. As micrografias eletrônicas de transmissão permitem determinar a forma das nanopartículas (elipsoides alongados) e deduzir as dimensões médias dos dois eixos do elipsoide. Pensa-se geralmente que o terceiro eixo do elipsoide, que não é visível nas micrografias de transmissão, que são projeções 2D, tem um comprimento igual ao do menor eixo.

[0078] As nanopartículas da invenção, com uma forma elipsoidal alongada, podem ter um comprimento do eixo principal, a, entre 20 e 60 nm; e um comprimento do eixo menor, b, entre 10 e 30 nm. Mais particularmente, as nanopartículas da invenção podem ter um valor médio do comprimento do eixo principal, a, de 40 nm e um valor médio do comprimento do eixo menor, b, de nm.

[0079] Como exposto acima, as partículas luminescentes de acordo com a invenção permitem o acesso a suspensões aquosas que exibem uma estabilidade coloidal muito alta. Deve ser notado que essa estabilidade é substancial mesmo em meios de alta força iônica, como é o caso no meio de síntese mesmo antes da purificação (força iônica maior que 0,1 M). Mais particularmente, uma suspensão aquosa de partículas de acordo com a invenção exibe pouco ou nenhum fenômeno de floculação.

[0080] Mais particularmente, as partículas de acordo com a invenção com cátions tetraalquilamônio presentes em sua superfície têm um potencial zeta, 6, menor ou igual a -28 mV em um meio aquoso com pH > 5, mais particularmente com pH > 5,5, e tendo uma condutividade iônica estritamente menor que 100 uS.em”".

[0081] Em outras palavras, o valor absoluto do potencial zeta, referido como |É|, das partículas da invenção em meio aquoso com um pH > 5, mais particularmente com um pH > 5,5, é maior que 28 mV.

[0082] O “potencial zeta” é um dos elementos representativos da estabilidade de uma suspensão. Por exemplo, pode ser medido diretamente, usando um instrumento Zetasizer Nano ZS da Malvern. Este instrumento emprega dispositivos ópticos para medir as taxas de deslocamento das partículas em função do campo elétrico aplicado às mesmas.

[0083] As nanopartículas da invenção possuem muito particularmente um potencial zeta menor ou igual a -28 mV, de preferência menor ou igual a -

mV, em um meio aquoso com pH > 6, mais particularmente com pH > 6,5, e condutividade iônica estritamente menor que 100 uS.cm".

[0084] Mais particularmente, as nanopartículas da invenção possuem um potencial zeta menor ou igual a -30 mV em um meio aquoso com pH > 6,5, mais particularmente com pH > 7, especialmente com pH > 8 e condutividade iônica estritamente inferior a 100 uS.cm"".

[0085] As nanopartículas de acordo com a invenção são principalmente de natureza cristalina e policristalina, mais particularmente com um tamanho médio de cristalito, deduzido por difração de raios X, como detalhado nos exemplos abaixo, entre 3 e 40 nm.

[0086] De acordo com uma forma de realização específica da invenção, as nanopartículas de acordo com a invenção são acopladas (ou enxertadas) a pelo menos um agente de direcionamento, com a finalidade especialmente de seu uso como sondas em técnicas de diagnóstico, mais particularmente em técnicas de diagnóstico in vitro ou ex vivo, para detectar e/ou quantificar espécies biológicas em uma amostra biológica.

[0087] Em outras palavras, as partículas da invenção podem compreender pelo menos um agente de direcionamento imobilizado na superfície da nanopartícula.

[0088] Os agentes de direcionamento podem ser de vários tipos, como detalhado no restante do texto, dependendo da aplicação desejada das partículas luminescentes da invenção.

PREPARAÇÃO DAS PARTÍCULAS

[0089] Como exposto anteriormente, a invenção, em outro de seus aspectos, provê adicionalmente um método para preparar partículas luminescentes compreendendo uma nanopartícula de fórmula: ArxLnVO41-(POs), (1) na qual: . A é selecionado a partir de ítrio (Y), gadolínio (Gd), lantânio

(La) e misturas dos mesmos, com A de preferência representando Y; . Ln é selecionado entre európio (Eu), disprósio (Dy), samário (Sm), neodímio (Nd), érbio (Er), itérbio (Yb) e misturas dos mesmos, com Ln representando de preferência a Eu; . 0<x<1l; e . 0<y<l por reação de coprecipitação, em meio aquoso, a partir de precursores dos referidos elementos A e Ln, e na presença de íons ortovanadato (VOZ) e opcionalmente íons fosfato (PO2*); a referida reação sendo realizada na presença de uma quantidade eficaz de cátions tetraalquilamônio.

[0090] Mais particularmente, a invenção provê um processo para preparar partículas luminescentes compreendendo uma nanopartícula de fórmula (1): ArsLnVO41-5(POs), -(NR4), (7) na qual: . A representa Y, Gd, La e misturas dos mesmos, com À de preferência representando Y; . Ln é selecionado de Eu, Dy, Sm, Nd, Er, Yb e misturas dos mesmos, com Ln representando de preferência Eu; . 0O<x<l; . 0Sy <I!; . R, que são idênticos ou diferentes, são como definidos anteriormente e representam, de preferência, um grupo alquila C1-C3; e . z representa o número de cátions tetraalquilamônio NR,” localizados na superfície da referida nanopartícula.

[0091] A invenção provê muito particularmente um método para preparar partículas luminescentes compreendendo uma nanopartícula de fórmula (II), (II), (ITD ou (TIM) como definido anteriormente.

[0092] Os precursores dos elementos A e Ln podem assumir a forma, convencionalmente, de sais dos referidos elementos, como por exemplo nitratos, cloretos, percloratos ou acetatos, mais particularmente nitratos. Os precursores dos elementos A e Ln, e sua quantidade, são naturalmente selecionados adequadamente em relação à natureza da nanopartícula desejada.

[0093] Por exemplo, a síntese de nanopartículas de fórmula Y,. xEux VO,4 (III) pode empregar compostos precursores de ítrio e európio na forma de nitratos de ítrio (Y(NO3)3) e de európio (Eu(NO3);3).

[0094] De acordo com uma característica essencial do método da invenção, a reação de coprecipitação é realizada na presença de uma quantidade eficaz de cátions tetraalquilamônio.

[0095] Os cátions tetraalquilamônio são muito particularmente como definidos anteriormente. Eles são, de preferência, selecionados de cátions tetrametilamônio, tetraetilamônio, tetrapropilamônio e tetrabutilamônio e misturas dos mesmos. Os cátions em questão são, de preferência, cátions de tetrametilamônio.

[0096] Por “quantidade eficaz” entende-se, muito particularmente, que os cátions são empregados em uma quantidade suficiente para obter o resultado desejado em termos de estabilidade coloidal da suspensão aquosa das referidas partículas sintetizadas.

[0097] Mais particularmente, os cátions de tetraalquilamônio são empregados em uma quantidade de modo que as nanopartículas obtidas no resultado do método da invenção exibem um potencial zeta como indicado anteriormente. Como ilustrado no exemplo 1 daqui em diante, os cátions tetraalquilamônio na reação de coprecipitação de acordo com a invenção são contraíons dos íons ortovanadato (VO4) e opcionalmente fosfato (PO?) (em que y=0).

[0098] De acordo com uma forma de realização particularmente preferida, os íons ortovanadato (VO4*) são gerados in situ a partir de um sal metavanadato, de preferência metavanadato de amônio (NHÇ1VO;).

[0099] Os íons ortovanadato podem muito particularmente ser formados in situ por reação do referido sal metavanadato com uma base (mais especificamente com dois equivalentes de base forte).

[00100] Mais particularmente, a base empregada para a formação in situ dos íons ortovanadato a partir do sal metavanadato é uma fonte de cátions tetraalquilamônio. Pode, por exemplo, ser um hidróxido de tetraalquilamônio, como por exemplo hidróxido de tetrametilamônio.

[00101] O uso de um sal metavanadato, tal como metavanadato de amônio, por exemplo, para sintetizar as nanopartículas de acordo com a invenção, mostra-se particularmente vantajosa em comparação com o uso de ortovanadato de sódio, na medida em que evita os problemas de reprodutibilidade associados a variações no conteúdo de carbonato de ortovanadato de sódio.

[00102] A título de exemplo, a reação de síntese a partir de metavanadato de amônio e hidróxido de tetrametilamônio é representada no exemplo 1.

[00103] Também pode ser considerado o uso de metavanadato de alquilamônio (não disponível comercialmente) e outra base forte, tal como hidróxido de amônio.

[00104] A presença de íons tetraalquilamônio na superfície das nanopartículas permite vantajosamente não apenas uma alta estabilidade coloidal no resultado da síntese, mas também a estabilidade das partículas formadas ao longo da síntese e, portanto, uma melhor reprodutibilidade do próprio método de síntese.

[00105] O método para preparar as partículas de acordo com a invenção pode empregar mais particularmente pelo menos as seguintes etapas, ou seja:

(1) prover uma solução aquosa, denominada solução (1), compreendendo íons ortovanadato (VO4Z*) e, opcionalmente, íons fosfato (PO4*) e cátions tetraalquilamônio; (1i) misturar a solução aquosa (1) com uma solução aquosa, chamada solução (2), compreendendo os referidos precursores dos elementos A e Ln, mais particularmente na forma de sais, especialmente nitratos, sob condições propícias à formação por coprecipitação das nanopartículas de fórmula (D); e (111) recuperar as referidas nanopartículas de fórmula (1) com cátions tetraalquilamônio localizados em sua superfície que são formados no final da etapa (11).

[00106] A solução aquosa (1) pode muito particularmente ser preparada misturando pelo menos um sal metavanadato, mais particularmente metavanato de amônio, e pelo menos uma base que é uma fonte de cátions tetraalquilamônio, como por exemplo um hidróxido de tetraalquilamônio.

[00107] No caso de íons fosfato, é adicionado um sal fosfato, tal como fosfato de sódio ou fosfato de amônio.

[00108] Assim, de acordo com uma forma de realização variante particularmente vantajosa, o método da invenção compreende pelo menos as etapas de: (1) preparar uma solução aquosa (1) misturando, em meio aquoso, um sal metavanadato, mais particularmente metavanadato de amônio (NHaVO;) e, opcionalmente, um sal de fosfato e uma base que é uma fonte de cátions de tetraalquilamônio, mais particularmente um hidróxido de tetraalquilamônio; (11) misturar a solução aquosa (1) com uma solução aquosa (2) compreendendo os referidos precursores dos elementos A e Ln, mais particularmente na forma de sais, especialmente nitratos, sob condições propícias à formação por coprecipitação das nanopartículas de fórmula (D); e

(1ii) recuperar as nanopartículas de fórmula (1) com cátions tetraalquilamônio localizados em sua superfície que são formados no final da etapa (ii).

[00109] De acordo com uma forma de realização particular, a adição da solução (2) à solução (1) na etapa (ii) é realizada em gotas.

[00110] De acordo com outra forma de realização variante, a solução (2) pode ser adicionada à solução (1) de uma só vez, e não em gotas.

[00111] O meio aquoso das soluções (1) e (2) é muito particularmente formado por água.

[00112] Em uma forma de realização particular, a solução aquosa (2) contendo os precursores dos elementos A e Ln pode compreender adicionalmente agentes complexantes para esses elementos, tal como citrato, como por exemplo citrato de tetraalquilamônio.

[00113] Está dentro das capacidades de uma pessoa habilitada na técnica ajustar adequadamente as quantidades dos vários reagentes, mais particularmente os precursores dos íons ortovanadato e opcionalmente fosfato e dos referidos elementos A e Ln, com relação à natureza desejada da nanopartícula de fórmula (1) de acordo com a invenção.

[00114] Mais particularmente, é necessário respeitar as proporções estequiométricas dos vários reagentes de acordo com as fórmulas (1), (11), (ID, (Il), (ID) e (UM). Quando a excitação óptica dos íons Ln é prevista por excitação direta, isto é, em ressonância com os estados eletrônicos desses íons, e não por excitação da matriz A VO41-»(PO4), e subsequente transferência de energia para esses íons, como estabelecido anteriormente, é preferível que o valor de x seja alto, de preferência entre 0,2 e 0,6 e, de preferência, 0,4.

[00115] Vantajosamente, o método para preparar as partículas da invenção não requer nenhum aquecimento da solução, em contraste, em particular, com as técnicas hidrotérmicas propostas nas publicações [13]-[18]. Mais particularmente, todas as etapas (1) a (111) para sintetizar as partículas de acordo com a invenção podem ser vantajosamente realizadas em temperatura ambiente (20-25ºC).

[00116] No entanto, métodos para preparação a uma temperatura mais alta, do tipo hidrotérmico, por exemplo, podem produzir nanopartículas com cristalinidade semelhante, desde que a temperatura não exceda 600ºC, permitindo assim o acesso a nanopartículas que exibem uma cristalinidade imperfeita, como estabelecido antes e, portanto, a realização de um alto rendimento quântico.

[00117] A etapa (11) envolve muito particularmente a purificação da solução de partículas obtidas, especialmente de modo a remover o excesso de contraíons.

[00118] As etapas de purificação podem incluir muito particularmente etapas de diálise ou centrifugação e redispersão das partículas em um meio aquoso, por sonicação, por exemplo.

[00119] As partículas podem ser redispersas em um meio aquoso, mais particularmente em água. Como estabelecido anteriormente, a suspensão coloidal aquosa das partículas da invenção exibe uma estabilidade muito alta, mesmo após vários meses de armazenamento.

[00120] Em outro dos seus aspectos, a invenção provê adicionalmente as partículas obtidas no resultado do método como descrito anteriormente.

[00121] De acordo com uma forma de realização de variante específica, a invenção provê um método para preparar partículas formadas total ou parcialmente de uma nanopartícula de fórmula Y..EuxVO, (III), com 0<x<1, compreendendo pelo menos as etapas de: (1) prover uma solução aquosa (1), compreendendo íons ortovanadato e cátions tetraalquilamônio, a referida solução aquosa (1) sendo de preferência obtida de uma mistura, em meio aquoso, de metavanadato de amônio (NH,VO;) e um hidróxido de tetraalquilamônio; (11) misturar a solução aquosa (1) com uma solução aquosa,

denominada solução (2), compreendendo precursores de Y e Eu, mais particularmente nitratos de ítrio e európio, sob condições propícias à formação por coprecipitação das nanopartículas de fórmula (III); e (ii) recuperar as referidas nanopartículas de fórmula (III) com cátions tetraalquilamônio localizados em sua superfície, como formados no resultado da etapa (1i).

[00122] De acordo com uma forma de realização específica, o método pode adicionalmente compreender uma ou mais etapas de acoplamento (enxerto) das partículas obtidas com um ou mais agente(s) de direcionamento, com o objetivo em particular de usá-las para uma técnica de diagnóstico in vitro, ex vivo ou in vivo.

[00123] Está dentro das capacidades de uma pessoa habilitada na técnica empregar técnicas de acoplamento/enxerto adequadas para preparar adequadamente as partículas com o objetivo de usá-las como uma sonda de diagnóstico. À quantidade de agente(s) de direcionamento empregado(s) é ajustada em relação à quantidade de partículas.

[00124] O agente de direcionamento pode ser enxertado na nanopartícula diretamente ou através de um espaçador (também indicado pelo termo “ligante”).

[00125] As técnicas para acoplar (também chamadas de enxertia) as partículas às biomoléculas são bem conhecidas da pessoa habilitada na técnica. Geralmente envolvem acoplamento por ligação covalente, por complexação de superfície, por interações eletrostáticas, por encapsulamento ou por adsorção. Em certos casos, incluindo o de acoplamento por ligação covalente, as partículas podem ser previamente funcionalizadas com um ou mais grupos químicos capazes, subsequentemente, de reação com outro grupo químico transportado pelo agente alvo, para formar uma ligação covalente.

[00126] Exemplos de grupos químicos que podem estar presentes na superfície das nanopartículas incluem grupos carboxila, amino, tiol, aldeído e epóxi.

[00127] Por exemplo, as nanopartículas da invenção podem ser funcionalizadas na superfície com citrato, como ilustrado no exemplo 4 a seguir.

[00128] De acordo com outra forma de realização particular, as nanopartículas da invenção podem ser funcionalizadas na superfície com ácido poliacrílico (PAA). No caso de funcionalização com PAA, o número de ligações coordenadas (ligações dativas) formadas por cada molécula de PAA aumenta proporcionalmente ao comprimento do PAA. O PAA pode, por exemplo, ter um grau de polimerização variando de 3 a 10.000.

[00129] A funcionalização das nanopartículas com o PAA leva, vantajosamente, a nanopartículas funcionalizadas e a nanopartículas resultantes do acoplamento dessas nanopartículas funcionalizadas com um ou mais agente(s) de direcionamento, que exibem excelentes propriedades em termos de estabilidade ao longo do tempo.

[00130] Os grupos amino podem ser providos por moléculas, tais como, amino-organossilanos, por exemplo, aminotrietoxissilano (APTES). A vantagem do APTES reside no fato de que, por meio de ligações covalentes, forma uma cápsula em torno da nanopartícula. As aminas providas pela APTES são, portanto, muito estáveis ao longo do tempo. Os grupos amino podem ser convertidos em grupos carboxila por reação com anidrido succínico.

[00131] Os grupos carboxila podem ser providos por moléculas, tal como ácido cítrico ou um ácido poliacrílico (PAA).

[00132] Os grupos carboxila podem ser ativados por qualquer técnica conhecida por uma pessoa habilitada na técnica, mais particularmente por reação com l1-etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N- hidroxissuccinimida (NHS), para reação subsequente com a amina funciona na superfície de um polipeptídeo e formação de uma ligação amida covalente, quando o agente de direcionamento é uma proteína ou um anticorpo.

[00133] A funcionalização das nanopartículas com APTES pode ocorrer vantajosamente após a cobertura das nanopartículas com uma camada de sílica.

APLICAÇÕES

[00134] Como especificado anteriormente, as partículas sintetizadas de acordo com a invenção, mais particularmente acopladas a pelo menos um agente de direcionamento, encontram aplicação particularmente vantajosa como sondas ou biomarcadores em amostras biológicas.

[00135] A presente invenção, em outro de seus aspectos, prevê o uso das partículas descritas antes ou obtidas pelo método descrito anteriormente, mais particularmente acopladas a pelo menos um agente de direcionamento ou a uma suspensão aquosa coloidal dessas partículas, como agente de diagnóstico - isto é, para detectar e/ou quantificar uma substância de interesse biológico ou químico.

[00136] As nanopartículas podem ser especialmente usadas como um agente de diagnóstico in vitro ou ex vivo, em outras palavras, para detectar e/ou quantificar uma substância de interesse biológico ou químico dentro de uma amostra, mais particularmente uma amostra biológica.

[00137] As partículas da invenção podem ser acopladas a vários agentes de direcionamento.

[00138] Por “agente de direcionamento” entende-se um composto que permite uma ligação com uma substância que é de interesse biológico ou químico e cuja identificação é desejada.

[00139] As sondas de acordo com a invenção são muito bem adaptadas a uma ampla diversidade de alvos biológicos, as especificidades sendo dependentes da natureza do agente ou agentes de direcionamento enxertado(s) na superfície da nanopartícula.

[00140] O agente de direcionamento pode ser mais particularmente um anticorpo policlonal ou monoclonal, um fragmento de anticorpo, um oligonucleotídeo, um peptídeo, um hormônio, um ligando, uma citocina, um peptidomimético, uma proteína, um carboidrato, uma proteína quimicamente modificada, um ácido nucleico quimicamente modificado, um carboidrato quimicamente modificado que visa uma proteína da superfície celular conhecida, um aptâmero, um conjunto de proteínas e DNA/RNA ou um cloroalcano usado pelos rótulos HaloTag.

[00141] De acordo com uma forma de realização específica, o agente é um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

[00142] Os fragmentos de anticorpo adequados incluem pelo menos um domínio variável de uma imunoglobulina, tais como, domínios variáveis simples Fv, scFv, Fab, (Fab”)º e outros fragmentos proteolíticos ou “nanocorpos” (anticorpos de domínio único, tais como os fragmentos de VÃH obtidos de anticorpos de camelídeos, ou fragmentos Var obtidos de anticorpos de cartilagem de peixe).

[00143] O termo “anticorpo” de acordo com a invenção inclui anticorpos quiméricos, anticorpos humanos ou humanizados, anticorpos recombinantes e modificados, anticorpos conjugados e fragmentos dos mesmos.

[00144] De acordo com uma forma de realização particular, os anticorpos ou fragmentos de anticorpos usados de acordo com a invenção têm como alvo marcadores específicos de células cancerígenas.

[00145] O agente de direcionamento também pode ser derivado de uma molécula conhecida por se ligar a um receptor de superfície celular. Por exemplo, o fragmento de direcionamento pode derivar de lipoproteínas de baixa densidade, transferrina, EGF, insulina, PDGF, enzimas fibrinolíticas, anti-HER2, anti-HER3, anti-HER4, anexinas, interleucinas, interferons, eritropoietinas ou fatores estimuladores de colônias.

[00146] As partículas acopladas a um agente de direcionamento de acordo com a invenção podem ser usadas em técnicas de diagnóstico in vitro, ex vivo ou in vivo envolvendo reconhecimento de um par ligando/antiligando, exemplos sendo biotina ou compostos biotinilados/avidina ou estreptavidina, hapteno/anticorpo, antígeno/anticorpo, peptídeo/anticorpo, açúcar/lectina, complemento de polinucleotídeo/polinucleotídeo, etc., submetidos à condição de que um dos elementos nesses pares constitua a molécula de interesse biológico, ou também possa ser acoplado à molécula de interesse biológico.

[00147] Um exemplo de acoplamento de partículas de acordo com a invenção do tipo Yo.sEuo.1VO, a uma proteína, estreptavidina, e a um anticorpo é dado no exemplo 4 daqui em diante.

[00148] As partículas de acordo com a invenção permitem a determinação, em uma amostra biológica, por exemplo, da presença da molécula de interesse, que entrará em associação com o agente alvo; a associação é revelada em virtude das propriedades de luminescência das partículas da invenção, após a remoção, em particular, de agentes de direcionamento que não estarão ligados à molécula de interesse.

[00149] As partículas da invenção podem assim ser empregadas para detectar e/ou quantificar concentrações de biomarcadores, anticorpos, DNA, RNA, etc., em amostras biológicas.

[00150] As amostras biológicas podem, por exemplo, ser selecionadas da lista, incluindo sangue, soro, plasma, saliva, urina, líquido cefalorraquidiano, etc.

[00151] As técnicas de diagnóstico in vitro ou ex vivo capazes de empregar as partículas da invenção são amplamente conhecidas por uma pessoa habilitada na técnica. Como exemplos, eles podem incluir as seguintes técnicas: imunoensaio, marcação imunorrotulação, imuno-histoquímica, imunocitoquímica, imunomarcação, técnica Western blot, técnica “dot blot”, citometria de fluxo, citometria de fluxo, método de FACS de classificação celular ativada por fluorescência e mais geralmente qualquer tipo de detecção de biomoléculas na superfície de células vivas ou fixas ou em seções de tecido criogênico ou não criogênico, ELISA, ELOSA, ELISPOT, análise multiplex/multidetecção, hibridização fluorescente in situ ou FISH, etc.

[00152] As partículas da invenção podem ainda ser empregadas em um método para detectar DNA por hibridação ou para detectar RNA por RT-PCR seguido de hibridação.

[00153] Os carreadores para análise in vitro ou ex vivo podem ser de vários tipos. Podem ser placas, placas de múltiplos poços, microplacas, géis, membranas, tiras, microcanais, etc.

[00154] A detecção pode ser realizada por qualquer dispositivo habitual, geralmente compreendendo uma fonte de radiação para excitação das partículas, como por exemplo um dispositivo de iluminação a laser, mais particularmente um dispositivo monocromático, e um meio para detectar a intensidade luminosa emitida pelas partículas, na forma, por exemplo, de uma câmera, tais como, uma câmera CCD, uma câmera CCD de multiplicação de elétrons (EM-CCD) ou um único fotodetector, especialmente do tipo fotomultiplicador ou fotodiodo.

[00155] As doenças que podem ser diagnosticadas com as partículas da invenção não são limitadas, e incluem quaisquer doenças reveladas pela presença de um ou mais marcador(es) específico(s) para a doença, compreendendo uma molécula de interesse biológico para a qual existe um parceiro de ligação específico.

[00156] Os exemplos incluem doenças infecciosas (bacterianas, parasitárias ou virais) (tal como AIDS), doenças inflamatórias e autoimunes, doenças cardiológicas, neurológicas ou oncológicas (por exemplo, cânceres sólidos, tal como câncer de mama ou câncer de próstata).

[00157] Em outro de seus aspectos, a invenção provê adicionalmente um kit para diagnóstico in vitro, ex vivo ou in vivo, compreendendo pelo menos partículas de acordo com a invenção ou uma suspensão coloidal aquosa dessas partículas.

[00158] A invenção provê mais particularmente um kit para detecção in vitro ou ex vivo e/ou quantificação de uma substância de interesse biológico ou químico em uma amostra, compreendendo pelo menos partículas de acordo com a invenção ou uma suspensão aquosa coloidal dessas partículas.

[00159] O kit de detecção pode muito particularmente compreender: - um carreador com um agente de direcionamento para o analito para detecção/quantificação imobilizado em sua superfície, por exemplo, um primeiro anticorpo, chamado “anticorpo de captura”, específico para a substância de interesse biológico ou químico a ser detectada/quantificada; e - um ou mais recipiente(s) compreendendo pelo menos nanopartículas de acordo com a invenção e pelo menos um agente de direcionamento em uma forma acoplada ou não às nanopartículas.

[00160] O carreador pode ser de qualquer tipo, especialmente de vidro ou plástico, tais como, uma placa, uma coluna, um gel, esferas magnéticas, etc., como estabelecido anteriormente. É vantajosamente uma placa de múltiplos poços. A imobilização é tipicamente realizada por adsorção ou por ligação covalente na superfície dos poços.

[00161] De acordo com uma primeira alternativa, o kit pode compreender nanopartículas de acordo com a invenção que já estão acopladas a um agente de direcionamento, mais particularmente a anticorpos, referidos como “anticorpos de visualização” , para distingui-los dos anticorpos de captura imobilizados no carreador.

[00162] As nanopartículas acopladas a anticorpos empregadas em um kit de acordo com a invenção podem ser obtidas, por exemplo - como descrito no exemplo 4 e ilustrado na figura 6 - acoplando as nanopartículas acopladas à estreptavidina, com anticorpos biotinilados, ou diretamente pelo acoplamento da anticorpos nas nanopartículas funcionalizadas com citrato ou com ácido poliacrílico.

[00163] Alternativamente, o kit pode compreender uma pluralidade de recipientes compreendendo, isoladamente, as nanopartículas de acordo com a invenção e o agente de direcionamento e a partir das quais o profissional é capaz de preparar nanopartículas de acordo com a invenção acopladas ao agente de direcionamento.

[00164] Por exemplo, o kit pode compreender um primeiro recipiente compreendendo as nanopartículas da invenção funcionalizadas com citrato ou ácido poliacrílico, e um segundo recipiente compreendendo os anticorpos biotinilados; a preparação das nanopartículas acopladas aos anticorpos envolve a ativação das funções carboxila contidas no primeiro recipiente, como descrito no exemplo 4, seguido pela mistura do conteúdo do primeiro e do segundo recipientes.

[00165] Obviamente, um kit de detecção de acordo com a invenção compreendendo partículas de acordo com a invenção não está limitado às variantes de kit descritas acima.

[00166] As partículas da invenção podem ainda ser empregadas, de acordo com outra forma de realização, como um agente de diagnóstico destinado a imagens ópticas in vivo ou então como um agente que amplifica tratamentos in vivo por irradiação.

[00167] De acordo com ainda outro de seus aspectos, o presente pedido de patente provê partículas luminescentes de acordo com a invenção, acopladas ou não a pelo menos um agente de direcionamento, para uso in vivo como um agente de diagnóstico destinado a geração de imagens ópticas ou geração de imagens por ressonância magnética, quando as partículas incluem gadolínio, ou para geração de imagens de raios-X. Mais particularmente, elas podem ser usadas como um agente de contraste para RMI.

[00168] As nanopartículas da invenção também podem ser usadas em radioterapia, devido ao seu poder sensibilizante.

[00169] De acordo com ainda outro de seus aspectos, o presente pedido de patente provê, assim, partículas luminescentes de acordo com a invenção, acopladas ou não a pelo menos um agente de direcionamento, para uso in vivo como agente para amplificação in vivo no tratamento de cânceres por meios de irradiação ionizante (elétrons, prótons, fótons X ou y, etc.).

[00170] As nanopartículas são usadas em conformidade para reforçar o poder destrutivo da radioterapia nas células tumorais, enquanto reduz a toxicidade para os tecidos saudáveis.

[00171] Os exemplos e as figuras apresentados abaixo são dados apenas a título ilustrativo, e não limitativo, da invenção. Figuras

[00172] Figura 1: Micrografias obtidas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) das nanopartículas obtidas de acordo com o exemplo 1 (barra de escala: 60 nm (figura la) e 5 nm (figura 1b), respectivamente);

[00173] Figura 2: Histograma de tamanho das nanopartículas, determinado a partir de micrografiass TEM para um coletivo de aproximadamente 300 nanopartículas, de acordo com o exemplo 1;

[00174] Figura 3: Difratogramas de raios X obtidos para as nanopartículas sintetizadas de acordo com o exemplo 1 (linha preta) e 3 (linha cinza);

[00175] Figura 4: Representação esquemática das nanopartículas da invenção funcionalizadas com citrato (figura 4a) ou com ácido poliacrílico (PAA) (figura 4b). Para maior clareza, uma única molécula de citrato ou PAA é representada. Será apreciado que cada nanopartícula pode conter numerosas moléculas de PAA ou citrato em sua superfície.

[00176] Figura 5: Representação esquemática das reações para acoplar uma nanopartícula de acordo com a invenção com estreptavidina, de acordo com o exemplo 4;

[00177] Figura 6: Representação esquemática do acoplamento das nanopartículas acopladas à estreptavidina com um anticorpo biotinilado.

[00178] Deverá ser apreciado que as figuras 4 a 6 são diagramas de princípio, especialmente no que se refere à estrutura das moléculas de superfície, as quais podem ter várias configurações diferentes das mostradas nestas figuras.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Síntese de nanopartículas de Yo.sEuo.1sVO: de acordo com a invenção

[00179] A fonte de íons metavanadato VO3' usada é o metavanadato de amônio NH,VO;, o ortovanadato VOZ in situ sendo obtido após a reação com uma base, atualmente hidróxido de tetrametilamônio, N(CH;3),OH. Nitratos de ítrio e európio foram usados como fontes de íons Y** e Eu”.

[00180] Uma solução aquosa de 10 mL de NH,4VO; 0,1 M e NÍCH;)<OH 0,2 M (solução 1) é preparada na hora.

[00181] Um volume de 10 mL de outra solução de Y(NOs3); e de Eu(NO;)3; com uma concentração de íons (Y** + Eu?”) de 0,1 M é adicionado em gotas à solução 1 usando um acionador de seringa a uma taxa de 1 mL/min.

[00182] A razão de concentração molar entre Y(NO3); e Eu(NO;); é selecionada de acordo com a razão desejada entre os íons Y** e Eu** na nanopartícula; tipicamente, a razão molar Y*":Eu?* é 0,6:0,4.

[00183] Quando a solução de (NO3)7/Eu(NO;s); é adicionada, a solução se torna difusa e aparece branca/leitosa sem formar precipitado. A síntese continua até que toda a solução de Y(NO53)7/Eu(NO3s); seja adicionada.

[00184] A eventual solução de 20 mL deve agora ser purificada para remover o excesso de contraíons. Para fazer isso, são usadas centrifugações

(normalmente três) a 11.000 g (Sigma 3K10, Bioblock Scientific) por 80 minutos, seguidas em cada caso por redispersão por sonicação (Branson Sonifier 450 operando a 50% com uma potência de 400 W) até a condutividade resultante ser estritamente menor que 100 uS.cm”.

[00185] A condutividade é medida usando um condutímetro químico.

[00186] A síntese de nanopartículas de YosEuoaVO4s com cátions tetrametilamônio imobilizados em sua superfície pode ser representada esquematicamente como a seguir: NH,VO; + 2 (N(CH;),)JOH x VO,? +2 N(CH3),' + NH VO, +2 N(CH3),* + NH,* + 0.6 YINO:); + 0.4 Eu(NO;); => Yo.sEUo 1VO, + 2 N(CH;),' + NH,' + 3NO;

[00187] São realizadas duas sínteses de teste (“síntese 1” e “síntese 2”). Resultado

[00188] A observação visual da solução de nanopartículas de acordo com a invenção, após ter sido deixada em repouso por 16 horas em um balão, mostra uma solução uniformemente difusa.

[00189] A solução final permanece muito estável na água, mesmo após vários meses no pH final da síntese (aproximadamente pH 7-9). A solução permanece estável, inclusive no meio de síntese (antes da remoção do excesso de contraíons), mas com uma força iônica alta (>0,1 M).

[00190] O potencial zeta das nanopartículas é determinado usando um instrumento DLS-Zeta Potential (Zetasizer Nano ZS90, Malvern). Os resultados dos potenciais zeta medidos para as nanopartículas das duas sínteses estão reunidos na tabela 1 abaixo.

[00191] Para as observações por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), soluções diluídas de nanopartículas são colocadas em uma grade de carbono. As observações são feitas usando um microscópio Philips CM30 operando a 300 kV com uma resolução de 0,235 nm.

[00192] A observação das nanopartículas por TEM (figura 1) mostra que as nanopartículas têm uma forma elipsoidal alongada. As dimensões das nanopartículas são determinadas a partir de micrografias TEM para um coletivo de aproximadamente 300 nanopartículas (figura 2). As nanopartículas da invenção têm um comprimento de eixo principal, a, entre 20 e 60 nm, com um valor médio de aproximadamente 40 nm, e um comprimento de eixo menor, b, entre 10 e 30 nm, com um valor médio de aproximadamente 20 nm.

[00193] As micrografias TEM (figura 1) não permitem a visualização dos planos cristalinos, fato provavelmente atribuível à nanopartícula sendo composta por um número de cristalitos cujo tamanho é menor que o tamanho da nanopartícula. A natureza principalmente cristalina e policristalina das nanopartículas é confirmada por experimentos de difração de raios-X.

[00194] O difratograma de raios X obtido por meio de um difratômetro Philips X- pert usando o raio Ka: de cobre (à = 1,5418 À) está representado na figura 3. A intensidade da difração é registrada usando um detector de área X'Celerator (PANalytical).

[00195] O comprimento da coerência em uma direção cristalográfica e, portanto, o tamanho médio dos cristalitos que compõem as nanopartículas nessa direção cristalográfica, pode ser estimado a partir da largura dos picos no difratograma XR, pela aplicação da fórmula de Scherrer. Os valores do comprimento de coerência obtidos para as várias direções cristalográficas estão entre 3 e 40 nm. O comprimento da coerência em pelo menos uma direção cristalográfica é menor que o tamanho da nanopartícula naquela direção e, a partir disso, pode-se deduzir que a cristalinidade das nanopartículas é imperfeita (policristalinidade, defeitos ou porosidade). Na direção (200) (fig. 3, pico a 2=25 º), o comprimento da coerência é 10,2 nm, que é ligeiramente menor que o comprimento da coerência para as nanopartículas do exemplo 3 (11,1 nm). EXEMPLO 2 (não inventivo) Síntese de nanopartículas de YosEuoaVO: a partir de metavanadato de sódio, sem contraíons volumosos

[00196] Para a síntese por coprecipitação de sais metálicos, nitratos de ítrio e európio foram usados como fontes de íons Y** e Eu?” A fonte de íons VO;3" do metavanadato usada é o metavanadato de sódio NaVO;, sendo o ortovanadato VO,Z* obtido in situ após a reação com uma base, atualmente hidróxido de sódio, NaOH.

[00197] Uma solução aquosa de 10 mL de NaVO; 0,1 M e NAOH 0,2 M (solução 1) é preparada na hora.

[00198] Um volume de 10 mL de outra solução de Y(NOs3); e de Eu(NO;); com uma concentração de íons (Y?* + Eu?) de 0,1 M é adicionado em gotas à solução 1 usando um acionador de seringa a uma taxa de 1 mL/min.

[00199] A razão de concentração molar entre Y(NO3); e Eu(NOs;); é selecionada de acordo com a razão desejada entre os íons Y** e Eu” na nanopartícula; tipicamente, a razão molar Y**":Eu?* é 0,6:0,4.

[00200] Quando a solução Y(NO5)7/Eu(NO3s); é adicionada, aparece um precipitado leitoso. A síntese continua até que toda a solução de Y(NOs)2/Eu(NO3s); seja adicionada.

[00201] A eventual solução de 20 mL deve agora ser purificada para remover o excesso de contraíons. Para fazer isso, são usadas centrifugações (tipicamente três) a 11.000 g (Sigma 3K10, Bioblock Scientific) por 80 minutos, seguidas em cada caso por redispersão por sonicação (Branson Sonifier 450 operando a 50% com uma potência de 400 W) até a condutividade resultante ser estritamente menor que 100 uS.cm”. Resultado

[00202] Uma comparação da solução resultante com a solução de nanopartículas de acordo com a invenção, obtida no exemplo 1 (para a mesma concentração final de íons vanadato), após 16 horas em repouso, mostra que, ao contrário da solução do exemplo 1, a solução é menos difusa (menos branca); um ligeiro depósito se formou na base do balão.

[00203] O potencial zeta das nanopartículas, determinado como descrito no exemplo 1, é apresentado na tabela 1 abaixo. EXEMPLO 3 (não inventivo) Síntese de nanopartículas de Yo.sEuo4sVO, a partir de ortovanadato de sódio, sem contraíons volumosos

[00204] Para a síntese por coprecipitação de sais metálicos, nitratos de ítrio e európio foram usados como fontes de íons Y** e Eu?* Como fonte de íons ortovanadato, VOZ”, é usado ortovanadato de sódio Na3VO:,

[00205] Uma solução aquosa de 10 mL de Na;VO, 0,1 M (solução 1) é preparada na hora. O pH é medido e ajustado, se necessário, para resultar em um valor entre 12,6 e 13.

[00206] Um volume de 10 mL de outra solução de Y(NO3); e de Eu(NO;); com uma concentração de íons (Y** + Eu ** ) de 0,1 M é adicionado em gotas à solução 1 usando um acionador de seringa a uma taxa de 1 mL/min.

[00207] A razão de concentração molar entre Y(NO3); e Eu(NOs;); é selecionada de acordo com a razão desejada entre os íons Y?* e Eu” na nanopartícula; tipicamente, a razão molar Y*":Eu?* é 0,6:0,4.

[00208] Quando a solução de Y(NO3)7/Eu(NO3s); é adicionada, aparece um precipitado leitoso. A síntese continua até que toda a solução de Y(NOs)2/Eu(NO3s); seja adicionada.

[00209] A eventual solução de 20 mL deve agora ser purificada para remover o excesso de contraíons. Para fazer isso, são usadas centrifugações (tipicamente três) a 11.000 g (Sigma 3K10, Bioblock Scientific) por 80 minutos, seguidas em cada caso por redispersão por sonicação (Branson Sonifier 450 operando a 50% com uma potência de 400 W) até a condutividade resultante ser estritamente menor que 100 uS.cm”. Resultados

[00210] Uma comparação da solução resultante com a solução de nanopartículas de acordo com a invenção, obtida no exemplo 1 (para a mesma concentração final de íons vanadato), após 16 horas em repouso, mostra que, ao contrário da solução do exemplo 1, a maioria das nanopartículas se depositou na base do balão; a parte superior da solução é quase transparente, indicando uma ausência de difusão e, portanto, de nanopartículas em solução.

[00211] O potencial zeta das nanopartículas, determinado como descrito no exemplo 1, é apresentado na tabela 1 abaixo.

[00212] O difratograma de raios-X obtido usando um difratômetro Philips X-pert está representado na figura 3.

[00213] Como no exemplo 1, o tamanho médio dos cristalitos que compõem as nanopartículas na direção cristalográfica (200) pode ser estimado pela aplicação da fórmula de Scherrer, e resultar em um valor entre 3 e 40 nm. O tamanho dos cristalitos é menor em geral do que as dimensões das nanopartículas, e pode-se deduzir disso que as nanopartículas sintetizadas de acordo com o exemplo 3 também são policristalinas. FE Ta oito, Exemplos 7 (da invenção) (que não é da invenção) | (que não é da invenção) * medições do potencial zeta feitas após a purificação para resultar em uma condutividade <100 uS.cm” e após diluição em água ácida Milli-Q&.

[00214] TABELA 1: comparação do potencial zeta É de nanopartículas obtidas de acordo com o exemplo 1, de acordo com a invenção (síntese com base em metavanadato de amônio com íons volumosos) e de acordo com os exemplos 2 e 3, que não estão de acordo com a invenção (síntese com base em metavanadato de sódio sem contraíons volumosos, e síntese com base em ortovanadato sem contraíons volumosos).

[00215] A comparação dos potenciais zeta das nanopartículas obtidas de acordo com os exemplos 1 a 3 confirma que as nanopartículas de acordo com a invenção (exemplo 1) exibem uma estabilidade coloidal melhorada com

16>30 mV em comparação com as nanopartículas obtidas sem cátions tetraalquilamônio (exemplos 2 e 3).

[00216] Uma síntese alternativa das nanopartículas YosEuo1aVO, de acordo com a invenção foi realizada de acordo com o mesmo protocolo que na síntese do exemplo 1, com a única diferença sendo que a solução de 10 mL de Y(NO3); e Eu(NO;3); com uma concentração de íons (Y** + Eu?) de 0,1 Mà solução 1 não em gotas, mas de uma só vez.

[00217] No final da síntese, após a purificação, o potencial zeta é de -35 mV a um pH de 7,8. EXEMPLO 4 Acoplamento das nanopartículas com a proteína estreptavidina

[00218] 1. Enxerto de citrato na superfície das nanopartículas

[00219] No resultado da síntese das nanopartículas de acordo com o exemplo 1, a solução de nanopartículas é centrifugada a 17 000 g por 3 minutos, para precipitar quaisquer agregados de nanopartículas, e o sobrenadante é recuperado.

[00220] Aproximadamente 250 uL de partículas de Yo.sEuoaVO4 com uma concentração de íon vanadato de 5 mM são removidos e dispersados em 1 mL de uma solução de água destilada contendo o íon citrato (concentração 0,2 M).

[00221] A solução é então sonicada por 5 minutos e subsequentemente centrifugada a 17000 g por 3 minutos. Esta etapa é repetida 3 vezes.

[00222] No final deste enxerto, as partículas são dispersadas na água destilada, um solvente no qual são estáveis.

[00223] A funcionalização das nanopartículas com citrato pode ser substituída pela funcionalização com PAA (por exemplo, com um grau de polimerização entre 3 e 10.000) empregando um sal de PAA, como por exemplo um sal de sódio ou amônio.

[00224] A Figura 4 mostra esquematicamente as nanopartículas da invenção funcionalizadas com (a) citrato e (b) ácido poliacrílico.

[00225] ii. Acoplamento das nanopartículas com estreptavidina

[00226] As nanopartículas (NPs) enxertadas com os íons citrato são centrifugadas a 16000 g por 1 hora, e o sedimento é então recuperado.

[00227] O acoplamento das nanopartículas, enxertadas em sua superfície com citrato e estreptavidina, é realizado de acordo com o seguinte protocolo:

[00228] 1. Preparar na hora uma solução mista de EDC!Sulfo-NHS ? (concentrações 30 e 30 mg/mL, respectivamente) em tampão MES* (pH 5-6).

[00229] 2. Por sonicação (banho de ultrassom), dispersar o sedimento das NPs em 250 uL da solução preparada na etapa 1. Como as perdas durante as centrifugações são baixas, a concentração de íons vanadato permanece em torno de 5 mM, resultando em uma concentração de nanopartículas de 48 nm.

[00230] (A concentração de vanadato das soluções de nanopartículas foi determinada pela dissolução das partículas em meio ácido, seguida pela determinação colorimétrica da concentração de íons vanadato, como descrito na referência Abdesselem et al, ACS Nano 8, 11126-11137 (2014). À concentração molar das nanopartículas foi determinada a partir da concentração de íons vanadato, como descrito na referência Casanova et al., Appl. Phys. Lett 89, 253103 (2006).)

[00231] 3. Preparar uma solução de estreptavidina (SA) a 100 nm em tampão fosfato pH 7,4 com NaCl a 10 mM. Diluir a solução de estreptavidina para uma concentração determinada pelo número desejado de proteínas enxertadas por nanopartícula (para uma razão de estreptavidina:NPs de 1:1,5:1 e 10:1, selecionar, respectivamente, concentrações de 4,8 nm, 24 nm e 48 nm). Adicionar 250 uL desta solução à solução de nanopartículas.

[00232] 4. Incubar por 2 a 4h em temperatura ambiente.

[00233] 5. Adicionar 1 mL de PBST 4 e agitar em vórtice.

[00234] 6. Realizar a centrifugação a 6 500 g por 30 min e recuperar o sedimento para remover as proteínas não acopladas às NPs. Descartar todo o sobrenadante. Recolocar em dispersão as NPs acopladas às proteínas em 1 mL de PBST e sonicar em um banho de ultrassom. Repetir esta etapa duas vezes.

[00235] 7. Recuperar as NPs acopladas às proteínas em 250 uL de PBS com 1% de BSAÍ.

[00236] 8. Manter a 4ºC para uso imediato ou dividir em alíquotas e manter a -80ºC.

[00237] O acoplamento das nanopartículas com estreptavidina é representado esquematicamente na figura 5.

[00238] Materiais usados para o teste de funcionalização: "Cloridrato de 1 N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDCO) (Sigma, cat % E1769).

*Sal de sódio de 2N-hidroxissulfossuccinimida (Sulfo-NHS) (Sigma, catit 56485).

3 Ácido 3 2- (N-morfolino)etanossulfônico (MES) (10 mM, pH 5-6).

“Solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 (NaCl 10 mM) + Tween 20 a 0,05% (PBST).

5 Albumina sérica bovina (BSA) (Sigma, catft A3059).

6 Solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,4, NaCl mM).

[00239] O número de moléculas de estreptavidina (SA) por nanopartícula (NP), denominado R, caracterizado no final do protocolo de acoplamento, é determinado pelo ensaio da estreptavidina pelo método de BCA, de acordo com o protocolo detalhado acima. Protocolo para caracterização da razão estreptavidina:nanopartículas (SA:NPs) i. Ensaio de SA pelo método de BCA

Princípio

[00240] Em um meio alcalino, as proteínas reduzem o Cu?* a Cu. O sal do ácido bicinconínico (BCA) forma um complexo colorido com íons Cu**. Este complexo pode ser quantificado pela sua absorção a 562 nm. Procedimento

[00241] Kit de ensaio BCA da ThermoFisher (Kit de ensaio de proteína Pierce!"M BCA Cat. Num. 23225)

[00242] * Preparação do reagente de teste Cu*'/BCA de acordo com o protocolo no kit ThermoFisher.

[00243] * Preparação do SA para a curva padrão. Para a curva de calibração, o ensaio é realizado três vezes.

LB | 150 | Lp [q o TABELA 2: Concentração de estreptavidina das soluções padrão

[00244] O procedimento é o seguinte:

[00245] - Pegar uma placa de 96 poços. Colocar 25 uL de cada tubo padrão A I (com uma concentração conhecida de SA) ou de proteínas conjugadas com nanopartículas para ensaio nos poços correspondentes.

[00246] - Adicionar 200 uL do reagente de teste Cu?'/BCA a cada poço. Homogeneizar, tampar e incubar a 37ºC por 30 min.

[00247] - Ler as absorbâncias (A) a 562 nm em função da concentração final, tendo em conta a diluição. Estabelecer a relação de padronização A = f (concentração de SA em ug/mL) por regressão linear.

[00248] A concentração das proteínas conjugadas com nanopartículas para ensaio é deduzida a partir da equação da regressão linear obtida com a curva padrão.

ii. Caracterização da razão SA:NPs

[00249] A concentração mássica de estreptavidina obtida com o ensaio BCA é convertida em concentração molar via a seguinte fórmula: [SA] massa (&/L) [SA] molar (mol / L) = Massa molar (g/mol)

[00250] Para resultar na razão (R) do número de SA:NPs, aplicou-se, finalmente, a seguinte equação: R = [SA] molar = [NPs] molar

[00251] A Tabela 3 abaixo reúne os valores obtidos para as várias razões de concentração da solução de estreptavidina para a solução inicial de nanopartículas. nanopartículas Número de moléculas de estreptavidina determinadas por nanopartícula no final TABELA 3: Caracterização do acoplamento de nanopartículas-estreptavidina para várias razões de concentração da solução de estreptavidina para a solução de nanopartículas.

[00252] Como é evidente a partir dos resultados apresentados na tabela 3, o número de moléculas de estreptavidina por nanopartícula após o acoplamento é da mesma ordem que a razão de concentração nas soluções iniciais e, portanto, indica um acoplamento altamente eficaz.

[00253] As nanopartículas acopladas dessa maneira à estreptavidina podem ser usadas com vantagem em uma técnica de diagnóstico in vitro, acoplando as nanopartículas a um anticorpo biotinilado, como ilustrado esquematicamente na figura 6.

[00254] Alternativamente, também é possível que os anticorpos sejam acoplados diretamente às nanopartículas enxertadas com íons citrato. Nesse caso, o mesmo protocolo acima deve ser usado, com a solução de estreptavidina substituída por uma solução de anticorpo.

EXEMPLO 5 (que não é da invenção) Síntese de nanopartículas de Yo.sEuosVO: a partir de metavanadato de sódio, com adição de íons tetraalquilamônio no final da síntese

[00255] Uma suspensão coloidal de nanopartículas de Yo sEuo1aVO2, é preparada a partir de sais de sódio, de acordo com a síntese do exemplo 2.

[00256] A purificação é realizada por diálise.

[00257] Um equivalente (em relação aos íons vanadato) de hidróxido de tetrametilamônio N(CH;3).OH é adicionado, a suspensão é deixada por 20 minutos e depois é dialisada novamente para remover os contraíons em excesso até que a condutividade resultante seja estritamente menor que 100 uS. em".

[00258] O potencial zeta, determinado como descrito no exemplo 1, no PH da suspensão resultante de 8,9 é -2,20 mV.

[00259] Não é possível obter o mesmo resultado que no método da invenção, usando um método padrão de síntese de nanopartículas e, no final da síntese, adicionando íons volumosos de tetraalquilamônio. Referências 1] "Bioconjugate Techniques", GT Hermanson, Academic Press, 1996; 2] “Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. A Practical Guide to Technology for Quantitative Real-Time Analysis", Segunda Edição, Mason WT, Ed., Academic Press, 1999; 3] Nam et al., Science 301, 1884-1886 (2003); 4] Riwotzki et al., J. Phys. Chem. B 1998, 105, 12709-127; 5] Huignard et al., Chem. Mater. 2000, 12, 1090-1094; 6] Riwotzki et al., Angew. Chem. 2001, 40(3), 573-576; T] Lehmann et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126(45), 14935- 14942; 8] Riwotzki et al., J. Phys.Chem. B.I, IB., 2000, 104, 2824- 2828;

44 / 44 9] Huignard et al., Chem. Mater. 2000, 12, 10920-1094; 10] Giaume et al., Langmuir 2008, 24, 11018—11026; 11] Huignard et al., Chem. Mater. 2002, 14, 2264-2269; 12] Riwotzki et al., J. Phys. Chem. B 1998, 102, 10129-10135; 13] Mialon et al., Acs Nano, 2008 —Publicação ACS, vol. 2, No. 12, 2505-2512; 14] Li et al., J. Phys. Chem. C 2008, 112, 6228-6231; 15] Wu et al, J. Mater. Chem., 2003, 13, 1223-1228; 16] Liang et al., J. Alloys and Compounds 552 (2013) 289-293; 17] Wu et al., J. Phys. Chem. B 2006, 110, 15791-15796; 18] Xu et al., Inorg. Chem. 2010, 49, 6706-6715; 19] Takeshita et al., Journal of Luminescence 128 (2008) 1515-

1522.

Claims (22)

REIVINDICAÇÕES

1. Partícula luminescente, compreendendo uma nanopartícula de fórmula: ArxLnVOs (1-7(POs), (D em que: A é selecionado a partir de ítrio (Y), gadolínio (Gd), lantânio (La) e suas misturas; Ln é selecionado a partir de európio (Eu), disprósio (Dy), samário (Sm), neodímio (Nd), érbio (Er), itérbio (Yb) e suas misturas; 0O<x<l;e 0<y<l; caracterizada pelo fato da nanopartícula ter, na superfície, cátions tetraalquilamônio em uma quantidade tal que a nanopartícula tenha um potencial zeta, 6, menor ou igual a -28 mV em um meio aquoso com pH > 5, mais particularmente com um pH > 5,5, e com condutividade iônica estritamente menor que 100 uS.cm”'.

2. Partícula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os cátions tetraalquilamônio estão associados à nanopartícula por meio de interações eletrostáticas com os íons de superfície negativamente carregados O” da nanopartícula.

3. Partícula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que os cátions tetraalquilamônio são cátions de fórmula NR4*, em que R, idênticos ou diferentes, representa um alquil C1-Cç, mais particularmente alquil C,-C, e muito particularmente grupo alquil C1-C3.

4. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que os cátions tetraalquilamônio são selecionados a partir de tetrametilamônio, tetraetilamônio, tetrapropilamônio, tetrabutilamônio e suas misturas, sendo os cátions tetraalquilamônio mais particularmente os cátions tetrametilamônio.

5. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a nanopartícula tem um potencial zeta 6 menor ou igual a -30 mV em um meio aquoso com pH > 6,5, mais particularmente com pH > 7, e com uma condutividade iônica estritamente menor que 100 uS.em”".

6. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato da nanopartícula ser de fórmula (T') ArxLnVO41-»(POs), . (NR4"), (1) em que: A é selecionado a partir de Y, Gd, La e suas misturas; Ln é selecionado a partir de Eu, Dy, Sm, Nd, Er, Yb e suas misturas; 0<x<l; 0<y<l; R, que são idênticos ou diferentes, representam um grupo alquil Ci-Cç, mais particularmente alquil C;-Ca, especialmente alquil Cr-C3, e muito particularmente um grupo metil; e z representa o número de cátions tetraalquilamônio NR,” localizados na superfície da nanopartícula, z estando mais particularmente entre 100 e 10.000.

7. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que y é 0.

8. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que A representa Y.

9. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que Ln representa Eu.

10. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a9, caracterizada pelo fato de que a nanopartícula é de fórmula Y ..EuxVO, . (NR), (UI), em que x, R e z são como definidos na reivindicação 6, mais particularmente de fórmula Yo.sEuoa(VO4) . (NR4) z (III), em que z é como definido na reivindicação 6.

11. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato da nanopartícula de fórmula (1) ter uma forma elipsoidal alongada, mais particularmente tendo um comprimento do eixo principal, a, entre 20 e 60 nm e um comprimento do eixo menor, b, entre 10 e nm.

12. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o produto do grau de dopagem, x, com íons Ln, mais particularmente com Eu, e o rendimento quântico da emissão pela nanopartícula é maximizado, mais particularmente em que as nanopartículas exibem uma cristalinidade imperfeita.

13. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a nanopartícula é acoplada a pelo menos um agente de direcionamento.

14. Método para preparar partículas luminescentes compreendendo uma nanopartícula de fórmula: ArxLnxVO41 (1-)(PO4s),; (1) em que: A é selecionado a partir de ítrio (Y), gadolínio (Gd), lantânio (La) e suas misturas; Ln é selecionado a partir de európio (Eu), disprósio (Dy), samário (Sm), neodímio (Nd), érbio (Er), itérbio (Yb) e suas misturas; 0O<x<l;e 0<y<l; caracterizado pelo fato de ser por: reação de co-precipitação, em meio aquoso, a partir de precursores dos elementos A e Ln, e na presença de íons ortovanadato (VO2*) e opcionalmente fosfato (PO2*);

a reação sendo realizada na presença de uma quantidade eficaz de cátions tetraalquilamônio, de modo que a nanopartícula tenha um potencial zeta, 6, menor ou igual a -28 mV em um meio aquoso com pH > 5, mais particularmente com pH > 5,5, e com uma condutividade iônica estritamente inferior a 100 uS.cm”.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos as etapas de: (1) fornecer uma solução aquosa, denominada solução (1), compreendendo íons ortovanadato (VO2*?) e, opcionalmente, íons fosfato (PO) e cátions tetraalquilamônio; (11) misturar a solução aquosa (1) com uma solução aquosa, denominada solução (2), compreendendo os precursores dos elementos A e Ln, mais particularmente na forma de sais, especialmente nitratos, em condições propícias à formação por co-precipitação das nanopartículas de fórmula (1); e (111) recuperar as nanopartículas de fórmula (1) com cátions tetraalquilamônio localizados em sua superfície que são formados no final da etapa (11).

16. Método, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que os cátions tetraalquilamônio são selecionados a partir de tetrametilamônio, tetraetilamônio, tetrapropilamônio, tetrabutilamônio e suas misturas, sendo os cátions tetraalquilamônio mais particularmente cátions tetrametilamônio.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de partículas coo definidas em qualquer uma das reivindicações 6 a 12.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que os íons ortovanadato (VOZ?) são gerados in situ por reação de um sal de metavanadato, mais particularmente metavanadato de amônio (NH4VO;3), com uma base, mais particularmente uma base que é uma fonte de cátions tetraalquilamônio, e muito particularmente com um hidróxido de tetraalquilamônio.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais etapas de acoplamento das partículas com um ou mais agentes direcionadores.

20. Suspensão aquosa coloidal, caracterizada pelo fato de compreender partículas como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou obtidas pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 19.

21. Uso de partículas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, ou obtidas pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 19, ou de uma suspensão aquosa coloidal dessas partículas, caracterizado pelo fato de ser como agente de diagnóstico.

22. Kit de diagnóstico, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos partículas como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou como obtidas pelo método definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 19, ou uma suspensão aquosa coloidal dessas partículas.