JP2000515508A - 分子を精製し濃縮するための方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、タンパク質および核酸などの電荷を有する第１の分子（９）を精製しかつ濃縮するための方法に関し、この方法は、ａ） 第１の分子（９）を含む溶液を準備するステップと、ｂ） 第１の分子（９）に対する親和力を有する第２の分子（４）のコーティングを直接備えた電極（２）に溶液を接触させるステップと、 ｃ） 電界を発生するための手段（１１）に電極（２）を接続して、溶液中で電極（２）に対して向かう第１の分子（９）の動きを起こすステップとを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 分子を精製し濃縮するための方法および装置 この発明は、タンパク質および核酸などの電荷を有する第１の分子を精製し濃 縮するための方法および装置に関する。 核酸などの生物学的に重要な分子は、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）などの分析試験を実行するために、核酸の沈殿、たとえばイオン交換カラムを 用いた適当なマトリクスへの核酸の結合、およびさまざまな遠心法によって濃縮 できる。特定の核酸は、ゲル中で濃縮し分離するか、膜にハイブリッド形成させ るか、または特定のタンパク質と複合化することによって、核酸混合物から選択 できる。タンパク質を精製するのに同様の方法が用いられる。この場合にまた用 いられるのは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの方法および抗体 依存性の精製方法である。抗体依存性の方法では、たとえばラテックスビーズな どの表面に固定化された分子を用いる。公知の方法の欠点は感度および速度が不 十分であることである。さらに、こうした方法は実行するのに高い費用がかかる 。 この発明は、先行技術の欠点を解消する精製および濃縮方法ならびにこれに対 応する装置を提供するという目的に基づく。さらに、特に、所定の程度のホモロ ジーまたは所定の結合親和力を有する、核酸、タンパク質および電荷を有する他 の分子を大容量から濃縮することを可能にすることが意図される。 この目的は請求項１および請求項１３の特徴により達成される。好都合なさら なる発展は請求項２−１２および請求項１４−３５の特徴から明らかとなる。 この発明の方法によれば、この目的は以下のステップ、すなわち ａ） 第１の分子を含む溶液を準備するステップと、 ｂ） 第１の分子に対する親和力を有する第２の分子のコーティングを直接備 えた少なくとも１つの電極に溶液を接触させるステップと、 ｃ） 電界を発生するための手段に電極を接続して、溶液中でコーティングに 対して向かう第１の分子の動きを起こすステップとにより達成される。 電極は好都合には、導電性プラスチックで作られる。これは非導電性プラスチ ック支持ロッド上の層であってもよく、またはこのようなプラスチック支持ロッ ドの一部分、好ましくは末端部分であってもよい。また、プラスチック支持ロッ ドを完全に導電性プラスチックで作り、これに非導電性プラスチックで作られ、 かつたとえば簡単に装着できる取っ手部材を設けてもよい。 電界にさらすにあたり、たとえば核酸分子などの溶液中に存在する第１の分子 が電荷を有しており、そのため電界内を移動できるという効果を利用する。電界 にさらされたことでコーティングに接触するかまたはコーティングの直近に到達 した第１の分子は、その上において第２の分子に結合できる。この場合の適当な 結合は、特に、イオン結合、共有結合、水素結合または立体効果によりもたらさ れる結合である。この結合が発現している間は電界を印加しなくともよい。 この発明による方法は、第１の分子が溶液中に存在する場合だけに用いられる わけではない。第１の分子が、電界内においてその中で移動可能な、たとえばゲ ルまたは肉などのマトリクス中に存在すれば十分である。 この発明の一具体例では、電極がアノードとして作用するよう第１の電圧を電 極に印加することにより電界を発生させ、電極にたとえば核酸分子などの負の電 荷を有する第１の分子を引付けることによって第２の分子への結合が達成される 。別の具体例では、電極がカソードとして作用するよう第１の電圧を電極に印加 することによって電界を発生させ、電極にたとえばタンパク質などの正の電荷を 有する第１の分子を引付けることによって第２の分子への結合が達成される。 特に第１の分子が第２の分子へ結合した後に、以下のステップ、すなわち ｄ₁） 極性を逆転させ、第２の電圧を印加して、電極をカソードとして作用 させ、これによりたとえば核酸などの負の電荷を有する第１の分子を反発させる ようにするステップ、 を実行するのが特に有利であると考えられる。 この代わりに、特に第１の分子が第２の分子へ結合した後に、以下のステップ 、すなわち、 ｄ₂） 極性を逆転させ、第２の電圧を印加して、電極をアノードとして作用 させ、これによりたとえばタンパク質などの正の電荷を有する第１の分子を反発 させるようにするステップ、 を実行してもよい。 ステップｄ₁およびステップｄ₂によりコーティングの封鎖を防ぐことができる 。これは、第２の電圧を適当に選択することにより、電荷を有する種でコーティ ングに結合していないものをコーティングから追い払い、それによってさらなる 第１の分子の接近を向上させることが可能であるためである。さらに、第２の電 圧を適当に増加することにより、電荷を有するある特定の第１の分子をコーティ ングから特定的に取除くことも可能である。また、そのようにして、ある特定の 第１の分子を選択することも可能である。この現象は核酸に対するハイブリッド 形成反応のストリンジェンシィとして知られる。 極性の逆転において考慮しなければならないのは、第２の分子と相互作用する 状態に入った、または第２の分子とハイブリッド形成する第１の分子の移動は制 限されることである。この妨害の程度は、相互作用の性質および数に依存してお り、すなわち、主に、互いに作用する第１および第２の分子のホモロジーの程度 、またはそれらの親和力に依存する。この場合、第２の分子に対して高い親和力 または相補性を有する第１の分子が最も強く制限を受けることになる。 ステップｃの間および／またはステップｃの後に、以下のステップ、すなわち 、 ｅ） 電極または溶液を加熱して、第１の分子が熱により解離し、または熱に より変性して、たとえば一本鎖の核酸など、その成分またはサブユニットになる ようにするステップ、 を実行するのが好都合である。 この具体例により、たとえばコーティングに引付けられる二本鎖の核酸を融解 させることが可能となるため、一本鎖をたとえばコーティング中に設けられた相 補的オリゴヌクレオチドに容易に結合させることができる。また、表面をある特 定の温度に保つことも、特定の第１の結合分子の選択のストリンジェンシィに寄 与する。 特にステップｄ₁またはステップｄ₂の後に、以下のステップ、すなわち、 ｆ） 電極または溶液を冷却して、第１の分子、その成分および／またはサブ ユニットが第２の分子へ結合するようにするステップ、 を実行すると好都合である。 ステップｆはさらに、第１の分子、その成分またはサブユニットのコーティン グへの結合を助ける。 第１の分子の性質によっては、ステップｃからステップｅのうちの１つまたは それ以上のステップを繰返してもよい。 特に、ステップｄ₁またはステップｄ₂の間および／または後に、好ましくは機 械的に溶液を混ぜると好都合である。ステップｄ₁およびステップｄ₂により電極 から追い払われた第１の分子、成分および／またはサブユニットの除去がこのよ うにして助けられる。 第１および第２の電圧の最大値は、電気分解による第１および第２の分子、そ の成分および／またはサブユニットの分解を避けるように有利に選択される。さ らに、第１の分子またはその成分またはサブユニットと第２の分子との間に形成 された結合の破壊を避けるように第２の電圧の最大値を選択することも有益であ ることがわかっている。 濃縮または精製すべき第１の分子の性質に適合させて、第１および／または第 ２の電圧の最大値、極性および逆の極性の持続時間および／または電極の温度を 、溶液のｐＨ、イオン伝導率、第１の分子の濃度および温度などの溶液のパラメ ータの関数として、好ましくは自動的に制御することが可能である。 装置に関しての本発明によれば、核酸およびタンパク質など、溶液中に存在す る電荷を有する第１の分子を濃縮するための装置には、第１の分子に対する親和 力を有する第２の分子のコーティングを直接備えた電極が設けられ、その電極は 電界を発生するための手段に接続され、溶液中で電極に対して向かう第１の分子 の動きを起こすことができるようになる。 これは、コーティングの不利な封鎖を回避し、ある表面上で特定の分子の濃縮 をもたらすことが可能となる、本発明による方法を実行するための装置が利用可 能となることを意味する。電極は簡単に安く製造できるため、使い捨ての物品と して使用することができる。 電極は好ましくは、導電性プラスチック、特にポリカーボネート、ポリカルベ ン、ポリカーボネート共重合体またはホモポリマーに黒鉛などの導電性添加物を 加えたもので作られる。この種の導電性プラスチックは、たとえばＤＥ３５ ４ １ ７２１ Ａ１に開示され、その内容はここに引用により援用される。 電界を発生するための手段は交流電界を発生するための手段であってもよい。 それにより、濃縮または精製すべき第１の分子によって速くかつ特異的にコーテ ィングを占拠することが可能となる。 第１の分子が正の電荷を有するか負の電荷を有するかに応じて、電界を発生す るための手段はアノードまたはカソードとしての電極を含み得る。 電極材料として存在するプラスチックは、選択基準を予め定める第２の分子に よるコーティングの化学を非常に単純にし、そのため低コストとなる（Hitoshi Kohsaka：J．Clin，Lab．Anal，８：４５２−４５５（１９９４））。別の具体 例の特徴によれば、電極に設けられるコーティングは、好ましくは電極にＮＨま たはＳＨ結合を介して結合される少なくとも１つの脂肪族基を有する。この場合 、脂肪族基は２〜２０、好ましくは６〜１０の炭素原子からなる鎖長を有しても よい。タンパク質配列、ペプチド配列またはヌクレオチド配列は好都合に脂肪族 基の自由端に結合される。ヌクレオチド配列は５〜３０のヌクレオチドからなり 得る。さらに、ヌクレオチド配列は、１０〜２０、好ましくは１５のヌクレオチ ドの鎖で形成される第１のオリゴヌクレオチドであると有利である。第２のオリ ゴヌクレオチドを好ましくは糖リン酸エステル結合を介して第１のオリゴヌクレ オチドに結合するのは特に有利であると考えられる。 電極には、電極から電気絶縁体により分離される加熱要素（電熱線）が設けら れていてもよい。絶縁体はガラスまたはセラミック、好ましくは酸化アルミニウ ムまたは窒化アルミニウムで作られていてもよい。加熱要素は白金で作られた抵 抗加熱要素であってもよい。この発明の一具体例において、抵抗加熱要素はまた 、電極と同じであってもよい。これは、適当な回路を用いれば、リード線と比較 して、プラスチック電極の高い電気抵抗を用いて電極表面を加熱できるためであ る。 コーティングから不必要な分子を離して脇へ向け、溶液中の精製および濃縮す べき第１の分子の再配分をもたらすために、溶液を混ぜるための手段を設けるこ とが好都合である。これは、電気的に作動できるスターラーであってもよく、ま たは気体の流れを通過させることであってもよい。 この発明の別の具体例の特徴によれば、電界を発生させるための電気量、なら びに加熱要素および混ぜるための手段を作動させるための電気量は、溶液のｐＨ 、 イオン伝導率、第１の分子の濃度および温度などの溶液のパラメータの関数とし て、好ましくは自動的に制御できる。自動制御のためにコンピュータが好都合に 用いられる。 最後に、本発明による装置を製造するための手段および本発明による方法を実 行するための手段の組合せが請求される。 例１−コーティングの構成およびその下に位置する要素の構成 ガラスまたはセラミック、たとえば酸化アルミニウムで作られる第１の絶縁層 を支持ロッドに付与する。これに、たとえば白金のジグザグの形で作られる加熱 のための導電層を付与する。次に、この導電層を薄い第２の絶縁層で被覆する。 これは１５０μｍの厚みを有していてもよく、ガラスで作ってもよい。この上に 金で作った電極を配置する。これは接着される。 コーティングを電極上に設ける。Ｃ６脂肪族リンカー分子をＳＨ基を介して電 極の表面に結合させる。スペーサ分子たとえば１０個のチミジン残基からなるオ リゴヌクレオチドは各々の場合においてリンカー分子の自由端に結合する。所定 の配列を有する１０ｐｍｏｌの２０−ｍｅｒは各場合において、糖リン酸エステ ル結合を介してその自由端に結合する。コーティングが設けられた電極は通常、 本発明の装置と組合せて用いられる。しかしながら、これはまた、別個の発明と してもよい。 例２−精製 例１に説明した電極を２０ｐｍｏｌの放射性標識オリゴヌクレオチド（２０− ｍｅｒ）および４０ｐｍｏｌのＤＮＡ一本鎖を含んだ１ｍｌの測定溶液に浸す。 オリゴヌクレオチドは、コーティングにおいて結合されているオリゴヌクレオチ ドに対して相補的なものであるが、ＤＮＡ一本鎖はそうではない。以下の結果は 、チェレンコフ計数管により測定されたコーティングの活性に関して得られたも のである。 ０．２Ｖの電圧および０．８ｍＡの電流を電極に印加した結果、極性を数回逆 転させた後、全活性の９％がコーティングに結合した。電極をアノードとして２ 分間、極性を逆転させることなく接続した際には全活性の２％の結合が生じる。 電圧を印加しない場合は、コーティングに結合するのは全活性の０．２％より少 ない。 この発明の具体例を以下の図面により説明する。ここで、 図１は、電極の第１の具体例の概略断面図を示し、 図２は、電極の第２の具体例の概略断面図を示し、 図３は、図１の斜視図を示し、 図４は、電極および対向電極を備えた容器の斜視図を示し、 図５は、電極の第３の具体例の斜視図を示す。 テフロン（Teflon）で作られた支持ロッド１には、導電性プラスチックからな る導電層または電極２が設けられている。溶液（図示せず）に面する電極２の表 面３はオリゴヌクレオチド４で被覆される。第１のリード線５が支持ロッド１に 埋め込まれ、電極２に結合される。他の２本の第２のリード線６（点線で示す） を同様に加熱のために電極２に結合してもよい。 図２に示される具体例では、電気絶縁性中間層７が電極２と支持ロッド１との 間にさらに設けられている。これはテフロンで作られた支持ロッド１上に直接設 けられた加熱層８から電極２を分離する。 図３は、図１において説明した具体例の斜視図を示す。「９」は溶液中に存在 する電荷を有する第１の分子を示す。 図４は、図３による具体例を斜視図で示す。支持ロッド１は、容器１０に収容 される溶液に浸され、この溶液中には第１の分子９が存在する。第１のリード線 ５は交流電圧の電源１１に接続される。溶液に浸された対向電極１３は第３のリ ード線１２を介して同様に交流電圧の電源１１に接続される。 図５は、電極の第３の具体例の斜視図を示す。電極２の表面３は絶縁性プラス チックで作られた支持ロッド１の先端に存在する。埋め込まれた第１のリード線 ５は第１の接続ソケット１４に接続され、第２のリード線６はそれぞれ、第２の 接続ソケット１５に接続される。接続ケーブルのプラグを接続ソケット１４およ び１５に挿入してもよい。 装置は以下の態様で機能する。 溶液から生体分子試料を分離するため、この発明による装置を溶液に浸す。次 に、支持ロッド１上に設けられた電極２と溶液中に浸された対向電極１３とを通 じて電圧を印加する。これにより、電極２に生じる極性に応じて、電極２の方向 へ逆の電荷を有する生体分子の電気泳動による移動が起こる。オリゴヌクレオチ ド４からなるコーティングに到達すると、その生体分子はそこに結合する。 二本鎖ＤＮＡの場合、電極２の分極化を所定の時間の後に中断する。次いで電 極２の加熱を起こす。これにより、オリゴヌクレオチド４に付着したＤＮＡ二本 鎖がその成分に分解される。再び分極化を適用すると一本鎖がオリゴヌクレオチ ド４の方へ戻り、そこで結合する。このようにして、溶液から試料を簡単かつ迅 速に得ることができる。 参照番号リスト １ 支持ロッド ２ 電極 ３ 表面 ４ オリゴヌクレオチド ５ 第１のリード線 ６ 第２のリード線 ７ 中間層 ８ 加熱層 ９ 第１の分子 １０ 容器 １１ 交流電圧の電源 １２ 第３のリード線 １３ 対向電極 １４ 第１の接続ソケット １５ 第２の接続ソケット

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，Ｕ Ｓ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ａ） 第１の分子（９）を含む溶液を準備するステップと、 ｂ） 前記第１の分子（９）に対する親和力を有する第２の分子（４）のコー ティングを直接備えた電極（２）に前記溶液を接触させるステップと、 ｃ） 電界を発生するための手段（１１）に前記電極（２）を接続して、前記 溶液中で前記電極（２）に対して向かう前記第１の分子（９）の動きを起こすス テップとを含む、タンパク質および核酸などの電荷を有する前記第１の分子（９ ）を精製しかつ濃縮するための方法。 ２．前記電界を発生するために、前記電極（２）がアノードとして作用するよう 第１の電圧が前記電極（２）に印加され、前記電極（２）にたとえば核酸分子な どの負の電荷を有する前記第１の分子（９）が引付けられることによって前記第 ２の分子（４）への結合が達成される、請求項１に記載の方法。 ３．前記電界を発生するために、前記電極（２）がカソードとして作用するよう 第１の電圧が前記電極（２）に印加され、前記電極（２）にたとえばタンパク質 などの正の電荷を有する前記第１の分子（９）が引付けられることによって前記 第２の分子（４）への結合が達成される、請求項１に記載の方法。 ４．特に前記第１の分子（９）の前記第２の分子（４）への前記結合の後に、 ｄ₁） 前記電極（２）がカソードとして作用するよう極性を逆転させて第２ の電圧を印加し、前記電極（２）に対してたとえば核酸などの負の電荷を有する 第１の分子（９）が反発するようにするステップが実行される、請求項１または ２に記載の方法。 ５．特に前記第１の分子（９）の前記第２の分子（４）への前記結合の後に、 ｄ₂） 前記電極（２）がアノードとして作用するよう極性を逆転させて第２ の電圧を印加し、前記電極（２）に対してたとえばタンパク質などの正の電荷を 有する第１の分子（９）が反発するようにするステップが実行される、請求項１ または３に記載の方法。 ６．特に、ステップｃの間および／または後に ｅ） 前記電極（２）または前記溶液を加熱して、前記第１の分子（９）が熱 により解離しまたは熱により変性して、たとえば一本鎖の核酸などのような、そ の成分またはサブユニットになるようにするステップが実行される、請求項１か ら５のいずれかに記載の方法。 ７．特にステップｄ₁またはステップｄ₂の後に ｆ） 前記電極（２）または前記溶液を冷却して、前記第１の分子（９）、成 分および／またはサブユニットが前記第２の分子（４）へ結合するようにするス テップが実行される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。 ８．ステップｃ〜ｆのうちの１つまたはそれ以上が繰返される、請求項１から７ のいずれかに記載の方法。 ９．前記溶液が好ましくは機械的に混ぜられる、請求項１から８のいずれかに記 載の方法。 １０．前記第１および第２の電圧の最大値は、電気分解による前記第１の分子（ ９）および第２の分子（４）ならびに前記成分およびサブユニットの分解または 解離を避けるように選択される、請求項２から９のいずれかに記載の方法。 １１．前記第２の電圧の最大値は、前記第１の分子（９）またはその成分または サブユニットと前記第２の分子（４）との間に形成される結合の破壊を避けるよ うに選択される、請求項４から１０のいずれかに記載の方法。 １２．前記第１および／または第２の電圧の最大値、極性および逆の極性の持続 時間および／または前記電極（２）の温度は、前記溶液のｐＨ、イオン導電率、 第１の分子（９）の濃度および温度などの前記溶液のパラメータの関数として、 好ましくは自動的に制御される、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。 １３．溶液中に存在する核酸およびタンパク質などの電荷を有する第１の分子（ ９）を濃縮するための装置であって、前記第１の分子（９）に対する親和力を有 する第２の分子（４）のコーティングを直接備えた電極（２）を備えており、前 記溶液中で前記電極（２）に対して向かう前記第１の分子（９）の動きを起こす ことができるよう前記電極（２）は電界を発生するための手段（１１）に接続さ れる、装置。 １４．容器（１０）が前記第１の分子（９）を含む溶液を収容するのに設けられ る、請求項１３に記載の装置。 １５．前記電界を発生するための手段（１１）は、交流電界を発生するための手 段である、請求項１３または１４に記載の装置。 １６．前記電界を発生するための手段（１１）は、アノードとしての電極（２） を含む、請求項１３から１５のいずれかに記載の装置。 １７．前記電界を発生するための手段（１１）は、カソードとしての電極（２） を含む、請求項１３から１６のいずれかに記載の装置。 １８．電極（２）は金、金／白金合金または白金合金からなる、請求項１３から １７のいずれかに記載の装置。 １９．電極（２）は、ポリカーボネート、ポリカーボネート共重合体またはホモ ポリマーに黒鉛などの導電性添加物を加えたもののような導電性プラスチックか らなる、請求項１３から１７のいずれかに記載の装置。 ２０．前記コーティングは、好ましくは、ＮＨまたはＳＨ結合を介して電極（２ ）に結合される少なくとも１つの脂肪族基を有する、請求項１３から１９のいず れかに記載の装置。 ２１．前記脂肪族基は２〜２０、好ましくは６〜１０の炭素原子からなる鎖長を 有する、請求項２０に記載の装置。 ２２．タンパク質またはペプチド配列が前記脂肪族基の自由端に結合される、請 求項２０または２１に記載の装置。 ２３．ヌクレオチド配列が前記脂肪族基の自由端に結合される、請求項１３から ２２のいずれかに記載の装置。 ２４．前記ヌクレオチド配列は５〜３０のヌクレオチドを含む、請求項２３に記 載の装置。 ２５．前記ヌクレオチド配列は、１０〜２０、好ましくは１５のヌクレオチドの 鎖から形成される第１のオリゴヌクレオチドである、請求項１３から２４のいず れかに記載の装置。 ２６．前記第１のオリゴヌクレオチドは、好ましくは糖リン酸エステル結合を介 して第２のオリゴヌクレオチドに結合される、請求項２５に記載の装置。 ２７．前記電極（２）は支持体（１）上に設けられる、請求項１３から２６のい ずれかに記載の装置。 ２８．前記支持体（１）は電気絶縁性材料、好ましくは電気絶縁性プラスチック からなる、請求項１３から２７のいずれかに記載の装置。 ２９．前記電極（２）には、前記電極（２）から電気絶縁体（６）により分離さ れる加熱要素（８）が設けられる、請求項１３から２８のいずれかに記載の装置 。 ３０．前記電気絶縁体（６）はガラスまたはセラミック、好ましくは酸化アルミ ニウムまたは窒化アルミニウムからなる、請求項２９に記載の装置。 ３１．前記溶液を混ぜるための手段が設けられる、請求項１３から３０のいずれ かに記載の装置。 ３２．前記混ぜるための手段は、電気的に作動できるスターラーである、請求項 ３１に記載の装置。 ３３．前記電界を発生させるための電気量および前記加熱要素および前記混ぜる ための手段を作動させるための電気量は、前記溶液のｐＨ、イオン伝導率、第１ の分子（９）の濃度および温度などの前記溶液のパラメータの関数として、好ま しくは自動的に制御できる、請求項１３から３２のいずれかに記載の装置。 ３４．請求項１３から３３のいずれかに記載の装置を製造するための手段の組合 せ。 ３５．請求項１から１２のいずれかに記載の方法を実行するための手段の組合せ 。