KR100668315B1 - 수소 결합 및 전기장을 이용한 핵산 정제 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표적 핵산과 수소 결합할 수 있는 물질이 코팅되어 있는 전극에 표적 핵산을 포함하는 시료를 접촉시키는 단계; 상기 전극에 양전압을 걸어 상기 표적 핵산을 상기 전극에 이동시켜 전극 상의 물질과 수소 결합시키는 단계; 상기 전극을 세정하는 단계; 및 상기 전극에 음전압을 걸어 상기 수소 결합된 표적 핵산을 용출시키는 단계를 포함하는 수소 결합 및 전기장을 이용한 핵산의 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 수소 결합을 통해 핵산과 단백질간의 선택성이 증가되며, 전기장을 통해 단시간내에 핵산 정제가 가능하며, 결합된 핵산의 효율적인 용출이 가능하다.

Description

수소 결합 및 전기장을 이용한 핵산 정제 방법{Nucleic acids purification method using hydrogen bond and electric field}
도 1은 본 발명의 방법을 이용하여 핵산을 정제하는 일례를 나타내는 모식도이다.
도 2는 각 시료에 따른 550nm에서의 흡광도를 나타낸 것이다.
도 3은 각 시료에 따른 PCR 결과를 Cp 로 나타낸 것이다.
도 4는 각 시료에 대한 단백질 결합 결과를 상대적인 형광 강도로 나타낸 것이다.
본 발명은 수소 결합 및 전기장을 이용한 핵산의 정제 방법에 관한 것이다.
세포로부터 DNA의 분리 방법은 DNA를 결합하는 경향을 갖는 물질을 이용하여 수행되었다. DNA의 분리를 위한 물질의 예는 실리카, 유리섬유, 음이온교환수지, 및 자성 비드이다(Rudi, K. 등, Biotechniqures 22, 506-511 (1997); 및 Deggerdal, A. 등, Biotechniqures 22, 554-557 (1997)). 수작업 단계를 피하고, 작업자 오차를 제거하기 위해, 몇 가지 자동화 기계가 대량 DNA 추출을 위해 개발 되었다.
종래 고상 물질을 이용한 핵산의 정제 방법이 알려져 있었다. 예를 들면, 미국특허 제5,234,809호에는 핵산에 결합하는 고상물질을 이용한 핵산의 정제 방법이 개시되어 있다. 구체적으로, 상기 방법은 출발물질, 카오트로픽 물질 (chaotropic material), 및 핵산 결합 고상물질을 혼합하는 단계, 상기 결합된 핵산을 갖는 상기 고상물질을 액체로부터 분리하는 단계 및 상기 고상물질 핵산 복합체를 세척하는 단계를 포함한다. 그러나, 상기 방법은 시간이 오래 소요되기 때문에 복잡하며, 랩온어칩에 부적합하다. 또한, 상기 방법은 반드시 카오트로픽 물질을 사용하여야 하는 문제점이 있었다. 즉, 상기 카오트로픽 물질을 사용하지 않는 경우에는 고상 물질에 핵산이 결합하지 않는다. 또한, 상기 카오트로픽 물질은 인체 유해한 물질이므로 주의하여 다루어야 하며, PCR 등의 후속 공정에 방해 물질로 작용하므로, 정제과정 중 또는 정제가 완료된 다음 정제된 핵산으로부터 제거하여야 한다.
또한, 미국특허 제6,291,166호에는 고상 매트릭스를 이용한 핵산의 집적(archiving) 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 핵산이 고상 매트릭스에 비가역적으로 결합하기 때문에, 상기 핵산 고상 매트릭스 복합체를 보관한 후 나중에 분석 (delayed analysis)하거나 반복 분석 (repeated analysis)하는 것이 가능하다는 장점이 있다. 그러나, 이 방법에 의하면, 알루미늄과 같은 표면에 양전하를 띠는 물질을 NaOH와 같은 염기성 물질로 친수성화하여야 하고, 핵산은 이렇게 친수성화된 알루미늄에는 비가역적으로 결합하기 때문에 알루미늄으로부터 분리할 수 없게 된다. 따라서, 상기 방법에 의하면, 당업자라면 핵산은 알루미늄에 비가역적으로 결합하는 것이므로, 핵산을 정제하는데 알루미늄을 사용할 수 있을 것으로는 생각하지 않을 것이다. 또한, 상기 결합은 DNA 와 단백질간의 선택성이 떨어진다는 문제점이 있다.
WO97/41219 에는 핵산을 함유하는 혼합물에 전극을 노출하고, 상기 전극에 핵산을 끄는 전압을 가하고, 상기 혼합물로부터 상기 전극을 제거하는 것을 포함하는 전기장을 이용한 핵산의 정제가 기재되어 있다. 그러나, 상기 방법은 핵산을 끌기 위해 전기장을 이용하고 있으나, 핵산 단량체를 전극에 코팅하여 수소 결합을 이용한 기재는 없다.
미국 특허 제6,518,022호에는 전기장을 가하여 표적과 프로브간의 혼성화 효율을 높이는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 상기 방법은 전기장에 의해 혼성화 효율을 높이고 있으나, 핵산 단량체를 전극에 코팅하여 수소 결합을 이용한 기재는 없다.
랩온어칩의 구현을 위해 효율적인 PCR 증폭을 하기 위해서는 세포 용해 후 핵산의 정제 과정이 필요하다. 그러나, 기존의 핵산 정제 과정에서 정전기적 인력에 의한 결합의 경우 핵산과 단백질간의 선택성이 떨어지고, 핵산의 회수율이 낮다는 문제점이 있었다. 따라서, 핵산과 단백질을 선택적으로 결합하고, 핵산의 회수율이 높으며, 빠른 시간 내에 핵산을 효율적으로 정제하는 방법의 필요성이 요구된다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래 기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 수소 결합을 이용하여 핵산과 단백질간의 선택성을 향상시키고, 전기장을 이용하여 단시간내에 핵산을 결합 표면으로 모으고, 결합된 핵산의 용출을 촉진시킬 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 핵산과 단백질간의 선택성이 증가되고, 단시간내에 핵산 정제가 가능한 수소 결합 및 전기장을 이용한 핵산 정제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
표적 핵산과 수소 결합할 수 있는 물질이 코팅되어 있는 전극에 표적 핵산을 포함하는 시료를 접촉시키는 단계;
상기 전극에 양전압을 걸어 상기 표적 핵산을 상기 전극에 이동시켜 전극 상의 물질과 수소 결합시키는 단계;
상기 전극을 세정하는 단계; 및
상기 전극에 음전압을 걸어 상기 수소 결합된 표적 핵산을 용출시키는 단계를 포함하는 수소 결합 및 전기장을 이용한 핵산의 정제 방법에 관한 것이다.
본 발명은 수소 결합 및 전기장을 이용한 핵산의 정제 방법이다. 구체적으로, 수소 결합을 이용하여 핵산과 단백질간의 선택성을 향상시키고, 양전압을 걸어 확산에 의한 이동 속도보다 빠르게 단시간내에 핵산을 결합 표면으로 모으고, 음전압을 걸어 결합된 핵산에 반발력을 가하여 핵산의 용출을 촉진시킴으로써 정제된 핵산의 회수율을 증가시킬 수 있는 것이다.
도 1은 본 발명의 방법을 이용하여 핵산을 정제하는 일례를 나타내는 모식도이다. 정제하고자 하는 표적 핵산과 수소 결합할 수 있는 물질이 코팅되어 있는 전극에 표적 핵산을 포함하는 시료를 접촉시키면, 시료 중의 표적 핵산이 상기 물질과 수소 결합을 형성하게 된다. 일반적으로 수소결합은 2개의 원자 사이에 수소원자가 들어감으로써 생기는 약한 화학결합으로서, 구체적으로 O·N·F 등 전기음성도가 강한 원자 사이에 수소원자가 들어갈 때 생기는 것이며, X－H…Y 와 같이 표시된다. 상기 X－H…Y 결합에서는 X－H가 공유결합이라도 X의 강한 전기음성도에 의하여 수소원자의 전자가 X쪽에 강하게 끌리게 된다. 따라서 H는 거의 노출된 양성자로 되고, 이로 인해 강한 전기음성도를 지닌 Y는 수용체로서 H에 접근하여 결합에너지가 2∼8 kcal/몰인 약한 결합이 생기게 된다. 수소결합은 여러 가지 물질에 중요한 영향을 미치고 있다. 얼음의 경우에는 수소결합에 의하여 생긴 그물 구조로 인해서 상당한 공간이 생긴다. 얼음을 가열할 때 녹는점에서 어느 정도의 융해열이 필요한 것은 이 수소결합을 절단하기 위한 것이며, 물은 수소결합이 어느 정도 절단된 상태이므로 1개의 물분자를 둘러싸는 다른 물분자의 수가 증가하여, 물분자 사이의 틈이 작아진다.
이어서, 상기 전극에 양전압을 걸면 시료 중의 표적 핵산은 정전기적 인력에 의해 양전압이 걸린 전극으로 이동하여 전극 상의 물질과 수소 결합은 증가하게 된다. 핵산은 인산기를 가지고 있어서 중성 pH 에서 음전하를 띠게 된다. 따라서, 표적 핵산과 수소 결합할 수 있는 물질이 코팅되어 있는 전극에 양전압을 걸면 정전기적 인력이 작용하여 시료 중의 표적 핵산은 전기장에 의해 수소 결합할 수 있 는 물질쪽으로 이동을 하게 되는 것이다. 즉, 전기장이 없을 때에는 확산에 의해 표적 핵산이 이동하므로 상기 물질과 표적 핵산이 수소 결합할 기회가 적지만, 전기장을 가할 경우에는 정전기적 인력이 작용하기 때문에 표적 확산의 상기 물질로의 이동은 더욱 빨라져 상기 물질과 표적 핵산의 수소 결합할 기회가 증가하는 것이다.
이어서, 상기 전극을 세정하게 된다. 상기 물질과 상대적으로 강하게 결합하는 물질(예를 들면, 상보적인 핵산)은 그렇지 않은 물질(예를 들면, 단백질)에 비해 적게 해리될 것이다. 따라서, 상대적으로 약하게 결합하거나 결합되지 않은 물질은 예를 들면, PBS 완충액과 같은 세정 완충액을 이용하여 제거될 수 있다. 세정 조건은 분리하고자 하는 핵산과 전극에 코팅된 물질의 결합력에 따라 변할 수 있다.
이어서, 표적 핵산이 결합된 상기 전극에 음전압을 걸면 핵산과 전극 사이의 정전기적 반발력에 의해 표적 핵산은 전극으로부터 용출되게 된다. 이는 표적 핵산이 음전하를 가지며, 전극 또한 음전압이 걸리므로 상호간에 정전기적 반발력이 작용하게 되어 결합되었던 표적 핵산은 상기 전극으로부터 분리하게 되는 것이다. 따라서, 시료 중의 핵산은 수소 결합 및 전기장에 의해 정제되는 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 전극은 금, 백금, 은 등의 금속 전극으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 전극에는 표적 핵산과 수소 결합할 수 있는 물질이 코팅되어 있으며, 상기 물질은 상기 전극에 공유결합을 통해 연결 되어 있으며, 상기 물질은 티올기를 갖는 스페이서, 예를 들면, HS-(CH2)6 를 통해 핵산의 각 단량체인 G, A, T 및 C 에 HS-(CH2)6-G, HS-(CH2) 6-A, HS-(CH2)6-T 또는 HS-(CH2)6-C 와 같은 형태일 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 전극은 실리콘 기판, 실리콘 웨이퍼, 겔, 비드 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 지지체에 부착될 수 있다. 상기 전극은 지지체에 부착되어 있으며, 상기 지지체는 실리콘 기판 또는 실리콘 웨이퍼와 같은 2차원 표면 뿐만 아니라, 겔 또는 비드와 같은 3차원 표면도 가능하다. 3차원 표면은 2차원 표면에 비해 표면적이 넓기 때문에 더욱 많은 핵산을 정제할 수 있다. 상기 지지체는 상기 전극을 지지할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 물질은 DNA 단량체, RNA 단량체, PNA 단량체, 뉴클레오시드, 핵산의 염기 자체, 삼중 가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드(triplex-forming oligonucleotide), 및 올리고뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 물질은 표적 핵산과 상보적인 수소 결합을 형성할 수 있는 것이면 어느 것이라도 가능하다. 상기 전극에 코팅된 물질이 DNA 단량체, RNA 단량체, PNA 단량체, 뉴클레오시드 및 핵산의 염기 자체인 경우에는 단일 가닥의 표적 핵산과 수소 결합이 가능하다. 따라서, 주로 RNA 또는 단일 가닥의 DNA를 특이적으로 정제하게 된다. 이는 두 종류의 서로 상보적인 단일 가닥의 핵산이 상호간에 수소 결합을 형성하여 이중 가닥의 핵산을 형성하기 때문이다.
그러나, 상기 물질이 삼중 가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드(Nucleic Acids Research, 2001, vol 29, No. 23, 4873-4880)인 경우에는, 표적 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥이 모두 가능하다. 즉, 상기 삼중 가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥의 표적 핵산과 수소 결합을 형성할 수 있기 때문에 표적 핵산으로 이중 가닥, 예를 들면, 이중 가닥의 DNA 또는 RNA 가 가능하다. 또한, 상기 삼중 가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산이 단일 가닥이라도 수소 결합을 형성하여 이중 가닥의 핵산을 형성할 수도 있는 것이다. 따라서, 상기 삼중 가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 또는 단일 가닥의 DNA 또는 RNA 와 수소 결합을 형성할 수 있는 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 물질은 상기 표적 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 물질이 핵산 단량체인 경우에 전극상에 상기 핵산 단량체가 무작위적으로 결합되어 있어 특정 서열의 핵산이 아닌 임의의 서열을 갖는 핵산을 단백질로부터 정제하는 경우에는 유리하다. 그러나, 특정 서열의 핵산을 분리하는 경우에는 상기 물질이 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 이는 임의로 전극상에 코팅된 핵산 단량체와 표적 핵산은 부분적으로 수소 결합이 가능하지만, 연속적인 수소 결합은 가능하지 않을 수 있다. 따라서, 핵산 단량체 대신에 표적 핵산과 연속적으로 수소 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드나 폴리뉴클레오티드를 이용하면, 특정 서열의 핵산을 분리할 수 있는 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 전압은 -5 ∼ +5V 인 것이 바람직하다. 전압이 너무 적으면 시료 중의 표적 핵산은 정전기적 인력에 의해 양전압이 걸린 전극으로 이동하는 속도가 너무 느려 시간이 오래 걸리는 문제가 있고, 5V 를 초과하면 용액의 전기분해의 문제가 있기 때문이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예
실시예 1: 흡광도 측정을 통한 핵산의 정제 효과의 확인
본 실시예에서는 4 종류의 DNA 단량체가 코팅되어 있는 기판상의 금 전극을 이용한 핵산의 정제 방법을 이용하여 올리고뉴클레오티드를 정제하였다. 4 종류의 DNA 단량체, 즉, G, A, T 및 C 를 기판상의 금 전극에 코팅하는 과정은 각각 5.0μM의 HS-(CH2)6-G, HS-(CH2)6-A, HS-(CH2) 6-T 및 HS-(CH2)6-C 를 상기 금 전극과 상온에서 2 시간 동안 반응시킴으로써 수행되었다. 표적 핵산으로는 5.0μM의 Cy3 표지된 올리고뉴클레오티드(서열번호 1)를 이용하였다. 다음으로, 바닥에 4 종류의 DNA 단량체가 코팅되어 있는 금 전극이 배치된 원통형의 튜브내에서 상기 표적 핵산을 포함하는 시료를 상기 4 종류의 DNA 단량체가 코팅되어 있는 실리콘 기판상의 금 전극과 접촉시키고, 1V의 양전압을 5분 동안 가하였다. 이어서, 1X PBS 완충액 200㎕로 상기 금 전극을 3회 세정하였다. 이어서, 상기 금 전극상에 용출액을 첨가하고, 1V의 음전압을 5분 동안 가하여 상기 금 전극으로부터 올리고뉴클레오티드를 용출시켰다. 이 때 사용한 용출액은 증류수 200㎕ 이었다. 상기 용출액에 대 하여 550nm에서의 흡광도를 측정하여 정제된 올리고뉴클레오티드의 양을 분석하였다. 각 시료는 하기와 같이 제조하였다: 시료 1은 본 발명의 방법에 따라 DNA 단량체가 코팅된 금 전극에 상기 시료를 첨가하고 전기장을 가한 것이고, 시료 2는 전기장의 효과를 알아보기 위한 것으로서, 전기장을 가하지 않은 것을 제외하고는 시료 1의 제조 방법과 동일하다. 시료 3은 전기장을 가하지 않고, DNA 단량체가 코팅된 금 전극 대신에 아민 유리를 사용한 것을 제외하고는 시료 1의 제조 방법과 동일하며, 이는 수소 결합에 의한 효과를 알아보기 위한 것으로서, 유리 표면에 아민기가 결합되어 있어 올리고뉴클레오티드의 음전하와 정전기적 상호작용에 의해 올리고뉴클레오티드가 유리 표면에 결합하게 되므로, 수소 결합에 의해 DNA 단량체와 올리고뉴클레오티드가 결합하는 본 발명의 방법과는 차이가 있다. 시료 4는 전기장을 가하지 않고, DNA 단량체가 코팅된 금 전극 대신에 실리카 유리를 사용하고, 카오트로픽 염(MinElute PCR 정제 키트에 포함된 PB 완충액을 이용하여 결합시키고 PE 완충액을 이용하여 세정하였다. 용출은 증류수 200㎕를 이용하였다)을 사용한 것을 제외하고는 시료 1의 제조 방법과 동일하다.
도 2는 각 시료에 따른 550nm에서의 흡광도를 나타낸 것이다. 도 2에 보여준 바와 같이, 본 발명의 방법인 DNA 단량체가 코팅된 금 전극에 전기장을 가한 경우(시료 1)가 나머지 3 가지 시료의 경우보다 흡광도가 높으므로 단일가닥 DNA 가 가장 많이 회수된다는 것을 알 수 있다. 즉, 수소 결합 및 전기장에 의해 표적 핵산이 더욱 특이적으로 정제된다는 것을 알 수 있는 것이다.
실시예 2: PCR 증폭에 의한 핵산의 정제 효과의 확인
표적 핵산으로 467nM 의 단일 가닥 B형 간염 바이러스(ssHBV) DNA(서열번호 2) 를 이용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 방법과 동일하게 시료를 제조하였다. 이어서, 정제된 각 DNA 로부터 PCR 을 수행하였다. 사용한 PCR 프라이머는 하기와 같다: 프라이머 A (서열번호 3); 및 프라이머 B (서열번호 4). PCR 증폭은 Taq 중합효소 (Solgent, 한국)를 이용하여 95℃에서 1분 동안 예비변성 후, 50 사이클(95℃에서 5초 동안 변성, 62℃에서 15초 동안 어닐링 및 신장)동안 수행하였다. 증폭된 DNA 를 시판되는 DNA 500 분석 규모의 시약 세트를 이용하여 Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)에서 분석하였다.
도 3은 각 시료에 따른 PCR 결과를 Cp 로 나타낸 것이다. Cp (Crossing point)는 실시간 PCR 반응에서 검출 가능한 형광 신호가 나타나는 사이클 수를 말한다. 즉 초기 DNA 농도가 높을수록 낮은 Cp에서 증폭량이 많아서 형광 신호가 검출가능하고, 초기 DNA 농도가 낮을수록 Cp가 크다. Cp는 또한, DNA 정제와도 관련 있는데, DNA 의 순도가 높을수록 Cp는 낮고, DNA 의 순도가 낮을수록 Cp는 높다. 따라서, Cp가 낮을수록 용액 속의 DNA 는 더욱 정제된 형태라는 것을 알 수 있다.
도 3에 보여준 바와 같이, 본 발명의 방법인 DNA 단량체가 코팅된 금 전극에 전기장을 가한 경우(시료 1)가 나머지 3 가지 시료의 경우보다 Cp가 낮으므로 단일가닥 DNA 가 가장 많이 회수된다는 것을 알 수 있다. 즉, 수소 결합 및 전기장에 의해 표적 핵산이 더욱 특이적으로 정제된다는 것을 알 수 있는 것이다.
실시예 3: 핵산과 단백질간의 선택성에 대한 수소 결합의 효과
표적 핵산과 수소 결합할 수 있는 물질이 표적으로 핵산을 특이적으로 결합 할 수 있는지를 알아보기 위해, 즉, 상기 물질에 대한 핵산과 단백질간의 선택성을 알아보기 위해, 상기 물질에 단백질의 결합 여부를 조사하였다. 본 실험에서, 아민 유리에 1.4μM DNA 를 스팟팅하고, 여기에 100㎍/ml의 IgG-Cy3 를 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 1X PBS 와 0.5% Tween 20의 혼합 용액 500ml을 이용하여 세정하였다. 이어서, 생성되는 형광을 Exon 스캐너인 Genepix 4000B를 이용하여 측정하였다.
도 4는 각 시료에 대한 단백질 결합 결과를 상대적인 형광 강도로 나타낸 것이다. 도 4에서, NH3 + 로 표시된 것은 DNA 를 스팟팅하지 않은 경우이며, DNA 로 표시된 것은 DNA 를 스팟팅한 경우이다. 그 결과, DNA 를 스팟팅하지 않은 경우의 상대적인 형광 강도는 10380±285 이며, DNA 를 스팟팅한 경우의 상대적인 형광 강도는 7084±306으로서, 전자가 후자보다 상대적으로 형광 강도가 높다는 것을 알 수 있다. 즉, DNA 표면이 양전하의 표면인 NH3 + 에 비해 단백질 결합이 상대적으로 약하므로 상대적인 형광 강도가 낮다는 것을 알 수 있다. 이는 NH3 + 는 양전하를 띠고 있어 단백질과의 정전기적 인력이 음전하를 띠는 DNA 보다는 상대적으로 강하기 때문에 나타난 결과로 해석된다. 즉, 표적 핵산과 수소 결합할 수 있는 물질은 표적으로서 단백질에 대한 결합력은 약한 반면, 표적으로서 핵산과는 특이적인 수소 결합이 가능하기 때문에 결합력은 상대적으로 강하므로, 표적으로서 단백질과 핵산간에 선택성이 있다는 것을 알 수 있다. 또한, 상기 물질에는 단백질이 상대 적으로 적게 결합하기 때문에 표적 핵산이 결합될 가능성은 증대되는 것이다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하면, 핵산을 보다 효율적으로 정제할 수 있음을 알 수 있는 것이다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 수소 결합을 통해 핵산과 단백질간의 선택성이 증가되며, 전기장을 통해 단시간내에 핵산 정제가 가능하며, 결합된 핵산의 효율적인 용출이 가능하다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 표적 핵산과 수소 결합할 수 있는 물질이 코팅되어 있는 전극에 표적 핵산을 포함하는 시료를 접촉시키는 단계;
    상기 전극에 양전압을 걸어 상기 표적 핵산을 상기 전극에 이동시켜 전극 상의 물질과 수소 결합시키는 단계;
    상기 전극을 세정하는 단계; 및
    상기 전극에 음전압을 걸어 상기 수소 결합된 표적 핵산을 용출시키는 단계를 포함하는 수소 결합 및 전기장을 이용한 핵산의 정제 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 전극은 금, 백금, 및 은으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 전극은 실리콘 기판, 실리콘 웨이퍼, 겔, 및 비드로 구성된 군으로부터 선택되는 지지체에 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 물질은 DNA 단량체, RNA 단량체, PNA 단량체, 뉴클레오시드, 핵산의 염기 자체, 삼중 가닥을 형성하는 올리고뉴클레오티드(triplex-forming oligonucleotide), 및 올리고뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 물질은 HS-(CH2)6-G, HS-(CH2)6-A, HS-(CH2)6-T 및 HS-(CH2)6-C 로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 표적 핵산은 이중가닥 또는 단일가닥 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 표적 핵산은 RNA 인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 물질은 상기 표적 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 전압은 -5 ∼ +5V 인 것을 특징으로 하는 방법.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03151899A (ja) * 1989-11-09 1991-06-28 Canon Inc 核酸の抽出方法
WO1997041219A1 (en) * 1996-04-26 1997-11-06 Scientific Generics Limited Electrode capture of nucleic acid
KR20010101477A (ko) * 1999-01-18 2001-11-14 하르트비흐 게르하르트 핵산 올리고머 하이브리드를 전기화학적으로 검출하는 방법
US6518022B1 (en) * 1993-11-01 2003-02-11 Nanogen, Inc. Method for enhancing the hybridization efficiency of target nucleic acids using a self-addressable, self-assembling microelectronic device

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5591841A (en) * 1993-01-14 1997-01-07 Ji; Huamin Rapid purification of circular DNA by triplex-mediated affinity capture

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03151899A (ja) * 1989-11-09 1991-06-28 Canon Inc 核酸の抽出方法
US6518022B1 (en) * 1993-11-01 2003-02-11 Nanogen, Inc. Method for enhancing the hybridization efficiency of target nucleic acids using a self-addressable, self-assembling microelectronic device
WO1997041219A1 (en) * 1996-04-26 1997-11-06 Scientific Generics Limited Electrode capture of nucleic acid
KR20010101477A (ko) * 1999-01-18 2001-11-14 하르트비흐 게르하르트 핵산 올리고머 하이브리드를 전기화학적으로 검출하는 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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