DE10211741B4

DE10211741B4 - Verfahren zum elektrochemischen Detektieren eines Analyten

Info

Publication number: DE10211741B4
Application number: DE10211741A
Authority: DE
Inventors: Jürgen SCHÜLEIN; Christine Kugler; Burcu Meric; Björn GRASSL; Georg Dr. Bauer; Andre Dr. Josten; Hans Dr. Kosak; Jörg Dr. Hassmann
Original assignee: November AG
Current assignee: NOVEMBER AG, 91056 ERLANGEN, DE
Priority date: 2002-03-14
Filing date: 2002-03-14
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2022-03-15
Also published as: DE10211741A1; US20030173232A1

Abstract

Verfahren zum elektrochemischen Detektieren eines Analyten, bei dem eine dafür geeignete Kohlenstoffelektrode verwendet wird, wobei an die Kohlenstoff-Elektrode den Analyten spezifisch bindende Fänger-Moleküle gebunden werden, wobei der Analyt an die Fänger-Moleküle gebunden wird und die Kohlenstoff-Elektrode bei oder nach dem Binden des Analyten an die Fänger-Moleküle mit einem ionischen Detergenz in wässriger Lösung behandelt wird, wobei das Behandeln der Kohlenstoff-Elektrode durch Eintauchen in die Lösung und anschließende Inkubation erfolgt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum elektrochemischen Detektieren eines Analyten, bei dem eine dafür geeignete Kohlenstoffelektrode verwendet wird. Unter einer Kohlenstoff-Elektrode ist hierbei jede Elektrode zu verstehen, welche elementaren Kohlenstoff enthält. Der Analyt ist im Allgemeinen ein Biomolekül, insbesondere eine Nukleinsäure.
Mit elektrochemischen Verfahren können redoxaktive Analyse untersucht und spezifiziert werden. Die Umsetzung der Analyte findet an einer Arbeitselektrode statt. Zur stromlosen Messung der Spannung wird eine Referenzelektrode verwendet. Der über die Arbeitselektrode fließende Strom oder die Spannung, welche zwischen der Arbeits- und der Referenzelektrode abfällt, wird über eine Gegenelektrode gesteuert. Die elektrochemische Detektion von Analyten kann potentiometrisch oder amperometrisch erfolgen. In einem potentiometrischen Messprotokoll wird die über der Arbeits- und Referenzelektrode abfallende Spannung zeitabhängig gemessen. Während dieser Messung kann ein kontrollierter Stromverlauf angelegt werden. Im Falle eines konstanten Stroms wird diese Messung als Konstantstrom-Chronopotentiometrie bezeichnet. Die Untersuchung von an einer Arbeitselektrode adsorbierten oder komplexierten Analyten mittels Konstantstrom-Chronopotentiometrie wird auch als Konstantstrom-Chronopotentiometrische-Stripping-Analyse oder häufig nur als Chronopotentiometrische-Stripping-Analyse (CPSA) bezeichnet. Die Kathodische-Konstantstrom-Potentiometrische-Stripping-Analyse beinhaltet ein Verfahren in dem durch das Anlegen eines positiven Stromes sukzessive Analyte oxidiert werden. Aus diesen spannungsabhängigen Oxidationsreaktionen können Rückschlüsse auf oxidierbare Analyte gezogen werden. Die Anodische-Konstantstrom-Potentiometrische-Strip ping-Analyse beinhaltet ein Verfahren, bei dem ein negativer Strom angelegt wird, um aus dem erhaltenen Spannungsverlauf Rückschlüsse auf reduzierbare Analyte schließen zu können.
In einem amperometrischen Messprotokoll wird die Spannung, welche zwischen der Referenz- und der Arbeitelektrode abfällt, über eine Gegenelektrode nach einem vorgegebenen Protokoll verändert. Gleichzeitig wird der Strom gemessen, welcher über die Arbeitselektrode fließt. Je nach angelegter Spannung können redoxaktive Analyte reduziert oder oxidiert werden. Durch eine Auswertung des Stromverlaufs können Rückschlüsse auf die Analyte gezogen werden. Ein elektrochemisches Messverfahren mit einer stationären Arbeitselektrode, in welchem eine Strom-Spannungskennlinie aufgenommen wird, wird auch als Voltammetrie und die zugehörige grafische Darstellung als Voltammogramm bezeichnet. Für sehr sensitive Messungen von Redoxprozessen wurden spezielle Messprotokolle entwickelt, bei welchen neben den Redoxprozessen stattfindende die Messung beeinflussende kapazitive Prozesse weit gehend unterdrückt werden. Ein sehr effizientes Messprotokoll ist die Differenzielle-Puls-Voltammetrie (DPV).

Aus Wang, J. et al. (1998) Analytica Chimica Acta 375, Seiten 197 bis 203 ist ein elektrochemischer Nachweis von DNA-Hybridisierung bekannt. Dabei wird an einer Kohlenstoffpaste-Elektrode eine Inosin-subsituierte, Guanin-freie DNA-Sonde immobilisiert. Die Bildung von DNA-Hybriden mit der immobilisierten DNA-Sonde wird chronopotentiometrisch durch die Bildung eines Guanin-Oxidationspeaks der hybridisierten DNA detektiert. Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass für jede Detektion die Elektrodenoberfläche erneuert werden muss, d.h. es muss eine erneute Immobilisierung der DNA-Sonde vorgenommen werden. Das führt zu einer mangelhaften Reproduzierbarkeit der damit erzielbaren Ergebnisse. Bei diesem Verfahren erfolgt die Immobilisierung der DNA-Sonde durch un spezifische Bindung an der Elektrode. Die Bindungskapazität der DNA-Sonden geht dadurch nachteiligerweise zum Teil verloren. Ein weiterer Nachteil des Verfahrens besteht darin, dass auf Grund der Empfindlichkeit der Elektrode keine stringenten Hybridisierungsbedingungen gewählt werden können, so dass es zu einem hohen Anteil unspezifischer Hybridisierungen kommt.

Weiterhin ist es aus Ontko, A. C., et al. (1999) Inorg. Chem. Seiten 1842 bis 1846 bekannt, eine so genannte Glassy-Carbon-Elektrode oberflächlich mit einem dünnen Film zu beschichten. Dieser Film enthält Rubidium-Bipyridin-Komplexe als Mediatoren. Diese bewirken eine katalytische Verstärkung des durch die Oxidation von Guanin-Resten in DNA bewirkten Stroms. Nachteilig an derartigen Mediatoren ist, dass sie bei einem elektrochemischen Nachweis einer DNA ein starkes Hintergrundsignal erzeugen. Vor dem Auftragen des Films wird die Elektrode zunächst gründlich poliert. Die Rubidium-Bipyridyn-Komplexe werden dann durch mehrfache Elektropolymerisation aufgetragen. Die Bindung von DNA an die beschichtete Elektrode erfolgt über eine Carbodiimid-Bindung. Dabei werden die auf der Oberfläche vorhandenen Carboxylgruppen aktiviert, um anschließend mit einer Aminogruppe der DNA zu reagieren. Die Aminogruppe ist bevorzugt eine Aminogruppe eines Linkers einer einzelsträngigen DNA. Es gehen jedoch auch die Aminogruppen der Nukleotide Carbodiimid-Bindungen ein. Diese Nukleotide stehen dann für eine spätere Hybridisierung nicht mehr zur Verfügung.

Aus der EP 0 987 333 A2 ist eine Zusammensetzung für einen elektrischen Dickschicht-Leiter zur Verwendung in elektrochemischen Sensoren, insbesondere Biosensoren, bekannt, welche leitende Metallpartikel, Grafit, ein thermoplastisches Polymer und eine oberflächenaktive Substanz enthält. Die Zusammensetzung kann zum Drucken von Arbeitselektroden für elektrochemische Biosensoren verwendet werden.

Aus der WO 01/13103 A1 sind Elektroden, insbesondere Glassy-Carbon-Elektroden, mit einer Oberflächen-Beschichtung aus einer Phenolverbindung bekannt. Die Oberflächen-Beschichtung wird an der Oberfläche der Elektrode oxidiert und enthält zur Verbesserung der Eigenschaften der Elektroden ein oberflächenaktives Agens. Bei der Beschichtung der Elektroden befinden sich diese in einer Lösung, in der dieses oberflächenaktive Agens enthalten ist. Als Detergentien dieser Art werden ionische und nicht-ionische Substanzen vorgeschlagen, wie beispielsweise SDS (Natriumdodecylsulfat).

Aus der WO 02/12550 A1 ist ein amperometrischer Biosensor zur Messung von Cholesterin in vorwiegend nicht-wässrigen Medien bekannt, wobei die Medien ein oberflächenaktives Agens als Emulgator enthalten können.

Die WO 99/22227 A2 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer aus einer Sol-Gel-Grafit-Verbindung bestehenden Elektrode, welche eine oberflächenaktive Substanz enthält. Zweck der oberflächenaktiven Substanz ist es, als Katalysator für die Sol-Gel-Bildung und dispergierendes Agens für die Homogenisierung von Kohlenstoffpartikeln und integrierten Reagenzien zu dienen. Weiterhin verbessert das Detergens die Homogenität, die Oberflächenbeschaffenheit und die Adhäsion zwischen einem Gelfilm und Substraten.

Die US 4 477 579 betrifft eine wässrige Zusammensetzung zur Herstellung einer Beschichtung auf Kohlenstoffelektroden für die Elektrolyse zur Herstellung von Aluminium. Die Zusammensetzung kann ein oberflächenaktives Agens enthalten. Die Beschichtung schützt die Kohlenstoffelektroden vor einem Verfall in einer oxidierenden Umgebung.

Die EP 0 281 368 A2 betrifft ein Trägermaterial auf Perfluorocarbon-Ploymer-Basis, auf dem ein Enzym immobilisiert sein kann. Das Trägermaterial kann mit nicht-ionischen Fluor-Tensiden behandelt werden, um eine unspezifische Bindung zu vermindern.

Aus der EP 0 402 917 A2 ist ein Biosensor bekannt, der Elektroden aus Metall enthält. Die Elektroden befinden sich auf einem Substrat. Substrat und Elektroden können mit einer dünnen Schicht aus einem polymerisierten, grenzflächenaktiven Stoff überzogen sein.

Üblicherweise werden Kohlenstoff-Elektroden vor einer elektrochemischen Detektion vorbehandelt, um die Sensitivität der Elektroden und die Reproduzierbarkeit der Detektion zu erhöhen. Dazu kann die Elektrodenoberfläche mechanisch poliert werden. Das ist jedoch ausgeschlossen, wenn die Elektroden mit einem für die Detektion erforderliche Molekül beschichtet sind. Weiterhin werden die Elektroden üblicherweise elektrochemische konditioniert. Dabei werden an den Elektroden befindliche redoxaktive Substanzen oxidiert, um den späteren elektrochemischen Nachweis nicht zu stören. Gleichzeitig werden die Oberflächen der Elektroden hydrophilisiert, so dass die Elektroden von Flüssigkeit benetzt werden können. Das Verfahren ist aufwändig und nur. schwer zu automatisieren. Nachteilig ist auch, dass an der Elektrode immobilisierte Moleküle, welche mit einer zu analysierenden Substanz reagieren sollen, dabei ebenfalls oxidiert werden können. Beispielsweise werden in einer immobilisierten DNA vorhandene Guanin-Reste oxidiert. Das verschlechtert die Hybridisierungseigenschaften dieser DNA.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum elektrochemischen Detektieren eines Analyten bereitzustellen, bei dem eine dafür geeignete Kohlenstoffelektrode verwendet wird.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 18.

Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zum elektrochemischen Detektieren eines Analyten vorgesehen, bei dem eine dafür geeignete Kohlenstoffelektrode verwendet wird, wobei an die Kohlenstoffelektrode den Analyten spezifisch bindende Fänger-Moleküle gebunden werden, wobei der Analyt an die Fänger-Moleküle gebunden wird und die Kohlenstoff-Elektrode bei oder nach dem Binden des Analyten an die Fänger-Moleküle mit einem ionischen Detergenz in wässriger Lösung behandelt wird, wobei das Behandeln der Kohlenstoff-Elektrode durch Eintauchen in die Lösung und anschließende Inkubation erfolgt. Die Kohlenstoff-Elektrode ist nach dem Behandeln zumindest für ein einmaliges elektrochemisches Detektieren des Analyten geeignet. Die Funktionsfähigkeit der Kohlenstoff-Elektrode wird durch das Behandeln erst hergestellt oder bleibt beim Behandeln erhalten. Um die Funktionsfähigkeit zu erhalten kann die Kohlenstoff-Elektrode so ausgewählt werden, dass sie durch das Detergenz in ihrer Substanz nicht angegriffen wird. Es ist aber auch möglich, die Dauer des Behandelns, die Konzentration und/oder das Detergenz derart zu wählen, dass mit der Kohlenstoff-Elektrode nach dem Behandeln zumindest noch ein einmaliges elektrochemisches Detektieren des Analyten möglich ist. Unter dem Detektieren im Sinne der Erfindung wird auch ein Quantifizieren verstanden.

Überraschenderweise hat es sich gezeigt, dass es durch das erfindungsgemäße Verfahren möglich ist, die Sensitivität der Kohlenstoff-Elektrode und die Reproduzierbarkeit der Detektion auf ein Maß zu erhöhen, wie es bisher nur mit der elektro chemischen Konditionierung bzw. dem Polieren der Kohlenstoff-Elektrode möglich war. Mit den erfindungsgemäß behandelten Kohlenstoff-Elektroden kann bei mehreren unabhängigen Messungen sogar eine geringere Standardabweichung erreicht werden, als mit elektrochemisch konditionierten Kohlenstoff-Elektroden. Bei Kunststoff-Composit-Elektroden, insbesondere Graphit enthaltenden Polycarbonat-Elektroden, wurde außerdem festgestellt, dass es nur durch das Behandeln mit dem ionischen Detergenz, nicht aber durch elektrochemische Konditionierung möglich war, eine für das Detektieren von DNA ausreichende Sensitivität zu erreichen.

Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass an die Kohlenstoff-Elektrode gebundene Moleküle, wie z.B. DNA, funktionell voll erhalten bleiben können und nicht durch eine Oxidation beispielsweise an Bindungsfähigkeit verlieren.

Durch das Behandeln mit dem Detergenz kann eine unspezifische Bindung von die Detektion des Analyten störenden Stoffen vermieden und/oder gelöst werden. Es ist auch möglich das Detektieren in Gegenwart des Detergenz durchzuführen.

In manchen Fällen wurde bisher der Einsatz von Detergenzien bei Kohlenstoff-Elektroden vermieden, weil befürchtet worden ist, dass die Elektroden dadurch für erwünschte Bindungen blockiert werden könnten. Weiterhin wurde bei Wang, J. et al. (1998) Analytical Chimica Acta 375, Seite 197 – 203, Seite 201, linke Spalte berichtet, dass ein Detergenz wie Tween 20 als Blockierungsagens die Reproduzierbarkeit eines Hybridisierungssignals beeinträchtigt. Elektrochemische Nachweisverfahren sind grundsätzlich sehr sensitiv gegenüber zusätzlichen, insbesondere ionischen, Bestandteilen der Lösung, in welcher das Detektieren stattfindet. Es ist z.B. bekannt, dass das ionische Detergenz Natriumdodecylsulfat (SDS) eine Quecksilberelektrode derart blockieren kann, dass damit ein elektrochemisches Detektieren nicht mehr möglich ist. Auf Grund der einem Detergenz innewohnenden Eigenschaft, sowohl an hydrophobe als auch an hydrophile Oberflächen zu binden, könnte ein Detergenz eventuell auch an die Oberfläche einer Kohlenstoff-Elektrode binden und den elektrochemischen Nachweis stören. Es hat sich jedoch gezeigt, dass ein derartiger negativer Einfluss nicht vorhanden ist.

Nach Anspruch 2 ist es vorteilhaft, wenn das Detergenz eine Konzentration von 0,1% bis 20%, insbesondere 1% bis 15%, aufweist. Als günstig hat sich ein Detergenz erwiesen, welches in Wasser eine kritische mizellare Konzentration unter 11 mmol/l, insbesondere unter 5 mmol/l, vorzugsweise unter 3 mmol/l, aufweist. Bevorzugt handelt es sich bei dem Detergenz um Natriumdodecylsulfat (SDS).

Bei einem Ausführungsbeispiel wird die Kohlenstoff-Elektrode mit einem, insbesondere elektrochemisch weit gehend inerten, Stoff beschichtet. Unter einem elektrochemisch inerten Stoff wird hier ein Stoff verstanden, welcher keine elektrochemisch aktiven Gruppen, wie z.B. Mediatoren, enthält, welche in einem für das Detektieren des Analyten relevanten Messbereich ein elektrochemisches Signal erzeugen. Eine Beschichtung mit einem solchen Stoff verursacht im Gegensatz zu einer Beschichtung mit einem elektrochemisch aktive Gruppen enthaltenden Stoff keine Hintergrundsignale, welche das Detektieren eines für den Analyten spezifischen Signals erschweren. Der allgemeine Vorteil einer Beschichtung besteht darin, dass dadurch spezifische chemische Gruppen auf der Oberfläche der Kohlenstoff-Elektrode bereitgestellt werden können, an welche wiederum andere Moleküle gebunden werden können. Bevorzugt handelt es sich bei dem Stoff um ein Silan, insbesondere 3-(Glycidyloxypropyl)-trimethoxysilan.

Besonders vorteilhaft – aber nicht Gegenstand der Erfindung – ist es, wenn die Kohlenstoff-Elektrode nach dem Binden der Fänger-Moleküle bis zum Detektieren in einer das Detergenz enthaltenden Lösung aufbewahrt wird. Dadurch kann mit der Kohlenstoff-Elektrode jederzeit sofort detektiert werden, ohne dass sie direkt vor dem Detektieren einer zusätzlichen Behandlung unterzogen werden muss. Durch ein Aufbewahren der Kohlenstoff-Elektrode in einer das Detergenz enthaltenden Lösung nach dem Detektieren bleibt die Kohlenstoff-Elektrode wiederverwendbar.

Vorzugsweise werden die Fänger-Moleküle gerichtet gebunden, insbesondere an einem ihrer Enden. Durch das endständige Binden kann es erreicht werden, dass ein Fänger-Molekül seine volle Funktionsfähigkeit, insbesondere seine Bindungsfähigkeit, beibehält. So kann z.B. eine endständig gebundene DNA oder ein am Ende des F_c-Anteils gebundener Antikörper seine spezifische Bindungsfähigkeit beibehalten. Die Fänger-Moleküle können kovalent an die Kohlenstoff-Elektrode oder den Stoff gebunden werden. Dadurch kann die Kohlenstoff-Elektrode mit sehr starken Detergenzien behandelt werden, ohne dass sich ein Fänger-Molekül von der Kohlenstoff-Elektrode ablöst.

Vorteilhaft ist es, wenn der Quotient aus der Menge der Fänger-Moleküle, die gerichtet, insbesondere kovalent, an die Kohlenstoff-Elektrode oder den Stoff gebunden werden, und der Menge der Fänger-Moleküle, die anders an die Kohlenstoff-Elektrode oder den Stoff gebunden werden, größer als 1, vorzugsweise größer als 3, ist. Das zu erreichen ist häufig schwierig. Erfolgt beispielsweise die kovalente Bindung über eine Carbodiimid-Bindung, so können kovalente Bindungen nicht nur mit einer dafür vorgesehenen, insbesondere terminalen Aminogruppe zustande kommen, sondern auch über die Aminogruppen der Basen der Nukleinsäure, insbesondere von Guanin. Die unerwünschte kovalente Bindung lässt sich jedoch zurück drän gen, indem die Fänger-Moleküle kovalent in Gegenwart eines Kompetitors, insbesondere eines Proteins oder einer Aminosäure, gebunden werden. Dabei ist der Kompetitor so zu wählen das seine Reaktivität beim Ausbilden einer kovalenten Bindung geringer ist als diejenige der chemischen Gruppe, deren kovalente Bindung gewünscht wird. Gleichzeitig sollte seine Reaktivität aber höher sein als diejenige der chemischen Gruppe, deren kovalente Bindung unerwünscht ist.

Die Fänger-Moleküle können, insbesondere einzelsträngige, Nukleinsäuren, Nukleinsäure-Analoga, Haptene, Peptide, Proteine, Zucker oder Lipide sein. Vorzugsweise ist in den einzelsträngigen Nukleinsäuren jeweils mindestens ein Nukleotid mit einer modifizierten Base, insbesondere Inosin oder 8-Oxoguanin, enthalten, welches beim elektrochemischen Detektieren ein anderes Signal erzeugt als Nukleotide des Analyten. Dadurch kann vermieden werden, dass durch die Fänger-Moleküle Basen bereitgestellt werden, welche beim elektrochemischen Detektieren von Basen einer durch die Fänger-Moleküle gebundenen Nukleinsäure selbst ein elektrochemisches Signal in dem für diese Basen relevanten Meßbereich erzeugen. 8-Oxoguanin bildet bevorzugt mit Adenin eine Basenpaarung aus. Es kann daher anstelle von Thymin in den Nukleinsäuren vorhanden sein. Inosin, welches unter anderem mit Cytosin eine Basenpaarung ausbilden kann, kann anstelle von Guanin in den Nukleinsäuren vorhanden sein. Dadurch bleibt die Bindungsfähigkeit der Nukleinsäuren auch unter oxidierenden Bedingungen erhalten. Das von Inosin erzeugte Oxidationssignal ist deutlich von demjenigen von Guanin zu unterscheiden. Da vorzugsweise Adenin- und/oder Guanin-Reste elektrochemisch detektiert werden, ist es besonders vorteilhaft, wenn die einzelsträngigen Nukleinsäuren keine Guanin- und/oder Adenin-Reste aufweisen.

Die Kohlenstoff-Elektrode kann eine Pencil-, eine Glassy-Carbon-, eine Pyrolytic-Graphit- oder eine Kunststoff-Composit-Elektrode, insbesondere eine Graphit enthaltende Polycarbonat-Elektrode, sein. Bei einer Pencil-Elektrode handelt es sich um eine herkömmliche Bleistiftmine. Die Graphit enthaltende Polycarbonat-Elektrode wird auch als Polycarbonat/Graphit-Elektrode bezeichnet. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn die Kohlenstoff-Elektrode zusätzlich mit einem chaotropen Agens, insbesondere Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid, behandelt wird.

Der Analyt kann ein Biomolekül, insbesondere eine Nukleinsäure, sein. Der Analyt kann eine Markierungssubstanz aufweisen. Dabei kann es sich um ein Enzym handeln, welches sich durch eine enzymatische Reaktion elektrochemisch nachweisen lässt, oder um eine redoxaktive Substanz. Vorteilhaft ist es, wenn der Analyt beim Detektieren an die Kohlenstoff-Elektrode, insbesondere an ein an der Kohlenstoff-Elektrode gebundenes Fänger-Molekül, gebunden ist. Das elektrochemische Detektieren kann z.B. mittels Differenzieller-Puls-Voltammetrie (DPV) oder Chronopotentiometrischer-Stripping-Analyse (CPSA) erfolgen.

Bevorzugt steht die Kohlenstoff-Elektrode beim Detektieren gleichzeitig mit dem Detergenz und mit dem Analyten in Kontakt. Das Detergenz sollte dabei selbst kein Signal im für den Analyten relevanten Messbereich erzeugen. Das Detergenz kann, insbesondere zur Unterdrückung und/oder Lösung unspezifischer Bindungen an der Kohlenstoff-Elektrode, vor, nach oder während der Analyt mit der Kohlenstoff-Elektrode in Kontakt gebracht wird zugesetzt werden. Der Vorteil ist dabei, dass durch das Detergenz für die Bindung des Analyten an das Fänger-Molekül stringente Bedingungen geschaffen werden können, welche eine unspezifische Bindung an die Kohlenstoff-Elektrode nahezu ausschließen. Besonders vorteilhaft ist dies, wenn es sich bei dem Analyten um eine Nukleinsäure handelt, welche mit einem der Fänger-Moleküle hybridisiert.

Vorteilhafterweise wird die Kohlenstoff-Elektrode vor dem Detektieren in einer das Detergenz enthaltenden Lösung aufbewahrt. Dadurch kann die Kohlenstoff-Elektrode jederzeit sofort zum Detektieren verwendet werden. Bei mehrfacher Verwendung der Elektrode wird die Elektrode zwischen den Verwendungen bevorzugt in der das Detergenz enthaltenden Lösung aufbewahrt.

Vorzugsweise wird zum elektrochemischen Nachweis ein Potential-Intervall zur Messung gewählt, in welchem im Wesentlichen nur der Analyt ein Signal verursacht. Insbesondere sollte vermieden werden, dass der Stoff, die Fänger-Moleküle und/oder das Detergenz in dem Potential-Intervall ein elektrochemisches Signal erzeugen.

Nachfolgend wird der Hintergrund der Erfindung näher erläutert. Es zeigen

1 das Verhältnis von aminoterminal gebundener zu undefiniert-gebundener Nukleinsäure,

2 eine mittels DPV bestimmte Menge unspezifisch gebundener Nukleinsäuren an unbeschichtete Pencil-Elektroden,

3 ein DPV-Voltammogramm einer silanisierten und einer nicht silanisierten Elektrode,

4 eine mittels DPV bestimmte Menge von an Elektroden adsorbierter Nukleinsäure nach einer Nachbehandlung mit 10%, 5% und 1% SDS,

5 ein DPV-Voltammogramm von Polyinosin,

6 ein DPV-Voltammogramm der Guanin-Oxidation von mittels Fänger-Molekülen gebundenen komplementären Nukleinsäuren,

7a mit Polycarbonat/Graphit-Elektroden vor und nach einer Behandlung mit 10% SDS aufgenommene Cyclovoltammogramme,

7b eine mit einer Polycarbonat/Graphit-Elektrode nach deren Behandlung mit SDS durchgeführte CPSA einer Heringssperma-DNA-Lösung und

8a, b einen Vergleich von mit Polycarbonat/Graphit- und Pyrolytic-Graphit-Elektroden erzeugten CPSA-Signalen.

Silanisierung von Pencil-Elektroden (Bleistift-Elektroden)
Bleistiftminen (Fa. Pentel, C525-HB/Hi-Polymere, extra strong) einer Länge von 60 mm wurden in etwa 1 cm lange Stücke geschnitten. Die Minenstücke wurden 1 h bei Raumtemperatur (RT) unter leichtem Schütteln in einer Lösung aus 1% (v/v) 3-(Glycidyloxypropyl)-trimethoxysilan (Fa. Fluka), 1% (v/v) entionisiertem Wasser (Fa. Millipore) und 98% (v/v) Ethanol (Fa. Merck) inkubiert. Anschließend wurden die Stücke 30 min bei 80°C getrocknet.
Kopplung von Oligonukleotiden als Fänger-Moleküle an silanisierte Bleistift-Elektroden
Die silanisierten Bleistift-Elektroden wurden in 1 ml einer 150 pmol/ml Oligonukleotid in 0,1 M Na₂CO₃, pH 9,5 enthaltenden Lösung überführt und eine Stunde bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Dabei gehen die freien Aminogruppen der Oligonukleotide mit dem Silan eine kovalente Bindung ein. Zur Abtrennung nicht kovalent gebundener Oligonukleotide wurden die Elektroden eine Stunde in 2 ml 10% SDS bei RT inkubiert. Zur Absättigung noch vorhandener Bindungsstellen wurden die Elektroden eine Stunde bei RT in 1% Rinder-Serum-Albumin (BSA) oder Ethanolamin in Phosphate-gepufferter-Saline (PBS) inkubiert.
Als Oligonukleotide wurden verwendet:
N-T1k-Biotin (Biotin – SEQ ID NO: 1 – Aminolink):
Biotin – 5' gca aca aga cca cca ctt cga aac c 3' – Aminolink
T1k-Biotin (Biotin – SEQ ID NO: 1):
Biotin – 5' gca aca aga cca cca ctt cga aac c 3'
TNF2 (SEQ ID NO: 2 – Aminolink):
5' cct icc cca atc cct tta tt 3' – Aminolink
(i = Inosin)
Bei TNF2 handelt es sich um eine mit einem Aminolink versehene Sequenz aus der c-DNA des humanen Tumor Nekrose Faktor α-Gens.
Optimierung der endständigen Bindung der Oligonukleotide als Fänger-Moleküle an silanisierte Pencil-Elektroden
Pencil-Elektroden wurden wie in Beispiel 1 beschrieben mit Silan beschichtet. Zur Kopplung der Oligonukleotide wurden die silanisierten Elektroden jeweils mit biotinylierten Oligonukleotiden mit (Bio-T1k-N) und ohne (Bio-T1k) endständiger Aminogruppe inkubiert. Die Inkubation erfolgte wie in Beispiel 2 beschrieben mit dem Unterschied, dass sie jeweils in Gegenwart und Abwesenheit von Histidin als Kompetitor in ei nem 100-fachen molaren Überschuss gegenüber den Oligonukleotiden durchgeführt wurde. Nicht kovalent gebundene Nukleinsäuren wurden durch Inkubation für 1 h in 10% SDS bei 42°C entfernt. Zum Nachweis der kovalent gebundener Oligonukleotide wurden die Elektroden zunächst in 1% BSA in PBS inkubiert. Anschließend wurden sie für 30 min bei Raumtemperatur in einer 200 ng/ml Horse-Radish-Peroxidase-(HPR)-Streptavidin-Lösung in PBS, 0,05% Tween 20 inkubiert. Die Elektroden wurden zweimal für 5 min in 6 M Harnstoff, 0,4% SDS, 0,5 × SSC (Standard Saline Citrate) und zweimal in 2 × SSC inkubiert. Darauf wurden die Elektroden in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte überführt und mit 200 μl TMB-Lösung (Fa. Pierce) unter leichten Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 20 min wurde die Farbentwicklung durch Zugabe von 50 μl 1M Schwefelsäure gestoppt. Die Absorption in den Vertiefungen wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 690 nm bestimmt. Die Absorption jeder Konzentration wurden im Dreifachansatz ermittelt.
Oligonukleotide ohne endständige Aminogruppe konnten jeweils nur undefinierte kovalente Bindungen über die in den Basen vorhandenen Aminogruppen eingehen. Dagegen können Oligonukleotide mit endständiger Aminogruppe auch über diese Aminogruppe kovalent binden. Wie aus 1 zu ersehen ist, konnte durch die Anwesenheit des Kompetitors das Verhältnis von Aminoterminal-gebundener zu undefiniert-gebundener Nukleinsäure um einen Faktor größer als 2 gesteigert werden. Das bedeutet, dass der Kompetitor Histidin stärker die undefinierten kovalenten Bindungen als die kovalente Bindung der endständigen Aminogruppe hemmt.
Bestimmung der Menge unspezifisch gebundener Nukleinsäuren an unbeschichteten Pencil-Elektroden
Eine unbeschichtete Pencil-Elektrode wurde an ein Autolab-Gerät (Firma: Eco Chemie, Niederlande) angeschlossen und eine Minute bei 1,4 V in 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 4,6 inkubiert. Anschließend wurde die Elektrode 5 Minuten mit verschiedenen Konzentrationen Polyguanin inkubiert. Folgende Konzentrationen wurden verwendet: 5000 g/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml und 0,1 μg/ml. Adsorbiertes Polyguanin wurde in 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 4,6 mittels DPV in einem Potential-Intervall von 0,6 V – 1,2 V bestimmt. Die DPV wurde mit folgenden Einstellungen durchgeführt: Modulationszeit: 0,05 s; Intervall-Zeit: 0,5 s; Potential-Stufe: 0,00795 V; Modulations-Amplitude: 0,05055 V. Die Oxidation des Guanins erfolgte bei ca. 1,05 V. Polyguanin war bis zu einer Konzentration von 0,1 μg/ml nachweisbar. Das Ergebnis ist in 2 dargestellt.
Untersuchung des Effekts der Silanisierung auf die DPV
Eine Pencil-Elektrode wurde vor und nach der Silanisierung an ein Autolab-Gerät angeschlossen und eine Minute bei 1,4 V in 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 4,6 inkubiert. Anschließend wurde eine DPV in dem Potential-Intervall 0,6 V – 1,2 V mit den in Beispiel 3 beschriebenen Einstellungen durchgeführt. Selbst bei einer Empfindlichkeit kleiner 0,1 nA war in dem Bereich des Oxidationspotentials der Guanine (1 V) kein Signal erkennbar. Die Silanisierung erzeugt somit kein Hintergrund-Signal im Bereich des Oxidationspotentials von Guanin. In 3 zeigt die Kurve a das Ergebnis vor und die Kurve b das Ergebnis nach der Silanisierung.
Elektrochemischer Nachweis der Desorption unspezifisch gebundener Nukleinsäure an Kohlenstoff-Elektroden durch Detergenz
Pencil-Elektroden wurden durch Inkubation für 1 min in 10% SDS vorbehandelt. Zur Adsorption von Nukleinsäure wurden die Elektroden für 1 h in 1 nmol/ml des Oligonukleotids TNF2k mit der Sequenz 5' aat aaa ggg att ggg gca gg 3' (SEQ ID NO: 3) enthaltendem 0,1 M Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,5 bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Entfernung unspezifisch gebundener Nukleinsäure wurden die Elektroden in einer 1%, 5% oder 10% SDS enthaltenden Lösung inkubiert und daraus jeweils nach 0,5 min, 1 min, 5 min, 10 min, 15 min und 20 min entnommen. Die Menge der adsorbiert verbleibenden Nukleinsäure ist mittels DPV anhand der Guanin-Oxidation bestimmt worden. Wie aus 4 ersichtlich ist, konnte durch die Behandlung mit SDS die Menge der adsorbierten Nukleinsäure effektiv verringert werden. Kurve 10 wurde mit der in 10% SDS, Kurve 12 mit der in 5% SDS und Kurve 14 mit der in 1% SDS inkubierten Elektrode ermittelt. Bei der Behandlung mit 10% SDS sank die Menge der adsorbierten Nukleinsäure bereits nach einer Minute unter die Nachweisgrenze.
Elektrochemische Analyse Inosin-haltiger Nukleinsäuren
Zur Bestimmung des Oxidationspotentials von Inosin wurden Pencil-Elektroden für eine Minute in 10% SDS behandelt und für 5 min in 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1250 und 2500 μg/ml Polyinosin in 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 4,6 inkubiert. Die Elektroden wurden in entionisiertem Wasser gespült und mittels DPV im Potentialbreich von 0 – 1,5 V gemessen. Wie aus 5 zu ersehen ist, liegt das Oxidationssignal von Inosin bei 1,3 V und ist damit von dem bei 1,0 V liegenden Oxidationssignal von Guanin deutlich zu unterscheiden.
Abhängigkeit des elektrochemischen Signals von der Nukleinsäurekonzentration
Pencil-Elektroden mit als Fänger-Molekül immobilisierter Nukleinsäure TNF2 wurden eine Minute in 5% SDS vorinkubiert. Die Elektroden wurden in Detergenz-haltigem Hybridisierungs- Puffer (Fa. Roche) mit 0,7 μg/ml, 3 μg/ml, 7 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml und 30 μg/ml der komplementären Nukleinsäure TNF2k (SEQ ID NO: 3) für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurden die Elektroden mittels DPV unter den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen analysiert. Die Bindung der komplementären Nukleinsäure konnte anhand der Guanin-Oxidation nachgewiesen werden. Wie aus 6 zu ersehen ist, nimmt die Signalintensität der Guanin-Oxidation bei 1 V mit steigender Konzentration der komplementären Nukleinsäure zu. Die Kurven 16, 18, 20, 22, 24, 26 und 28 entsprechen jeweils 0,7 μg/ml, 3 μg/ml, 7 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml und 30 μg/ml der komplementären Nukleinsäure TNF2k.
Einfluss der Elektrodenbehandlung auf die Sensitivität und Reproduzierbarkeit der elektrochemischen Nukleinsäuredetektion
Silanisierte Pencil-Elektroden mit als Fänger-Molekül immobilisierter Nukleinsäure TNF2 wurden wie in Experiment 2 beschrieben hergestellt. Abweichend von Experiment 2 wurden die Elektroden vor der Silanisierung elektrochemisch (1 min, 1,2 V in 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 4,6) bzw. durch 1 min. 10% SDS-Behandlung behandelt. Nach der Kopplung der Nukleinsäure TNF2 wurden die Elektroden in einer Lösung von 10 nmol/ml der komplementären Nukleinsäure TNF2k (SEQ ID NO: 3) in Detergenz-haltigem Hybridisierungs-Puffer (Fa. Roche) inkubiert und die gebundene Nukleinsäure TNF2k mittels DPV bestimmt. Jeweils zehn Messungen wurden mit elektrochemisch bzw. mit Detergenz behandelten Elektroden durchgeführt. Die Detergenz-Behandlung führte zu einer Sensitivitätssteigerung von mehr als 10% gegenüber der elektrochemischen Behandlung. Weiterhin war die Reproduzierbarkeit der Messungen mit Detergenz-behandelten Elektroden verbessert. Die Standardabweichung der Messungen Detergenz-behandelter Elektroden war um Faktor 3 geringer als bei einer elektrochemischen Behandlung.
Aktivierung von Polycarbonat/Graphit-Elektroden durch SDS-Behandlung
In 7a zeigt die gestrichelte Linie ein vor und die durchgezogene Linie ein nach einer Behandlung einer Polycarbonat/Graphit-Elektrode aufgenommenes Cyclovoltammogramm. Die Behandlung erfolgte durch eine Inkubation in 10% SDS bei 80°C für 30 min. Das nach der Behandlung aufgenommene Cyclovoltammogramm zeigt durch einen verstärkten kapazitiven Strom, dass eine deutlich größere elektroaktive Oberfläche zur Verfügung steht als ohne die Behandlung.
7b zeigt das Ergebnis einer CPSA von 200 μg/ml Heringssperma-DNA-Lösung in 0,1 M Natriumacetat, pH 4,7. Die CPSA ist mit einer zuvor für 30 min mit 10% SDS bei 80°C behandelten Polycarbonat/Graphit-Elektrode unter den folgenden Bedingungen durchgeführt worden: 30 s Akkumulation, 30 μA konstanter Oxidationsstrom in 1 M Natriumacetat-Puffer, pH 6,0. Wie aus 7 ersichtlich ist, konnte nach der Behandlung ein deutliches Signal der Guanin-Oxidation bei 0,8 V (mit G gekennzeichneter Peak) und der Adenin-Oxidation (mit A gekennzeichneter Peak) bei 1,1 V gemessen werden. Mit einer stattdessen elektrochemisch vorbehandelten Polycarbonat/Graphit-Elektrode war ein Oxidationssignal nicht messbar.
Vergleich der Sensitivität von Polycarbonat/Graphit- und Pyrolytic-Graphit-Elektroden
Eine Konzentrationsreihe von 1, 10 und 100 μg/ml. Heringssperma-DNA wurde mittels CPSA anhand des Guanin-Oxidationssignals analysiert. Als Elektroden wurden eine 60 s bei 1,7 V elektrochemisch behandelte Pyrolic-Graphit-Elektrode und eine mit 10% SDS bei 80°C behandelte Polycarbonat/Graphit-Elektrode verwendet. In den 8a und 8b entsprechen die Kurven 30 und 36 jeweils 1 μg/ml, die Kurven 32 und 38 jeweils 10 μg/ml und die Kurven 34 und 40 jeweils 100 μg/ml Heringssperma-DNA. Die Signalhöhe ist proportional zu der Menge an DNA. Die Empfindlichkeit der mit SDS behandelten Polycarbonat/Graphit-Elektrode ist gegenüber derjenigen der elektrochemisch behandelten Pyrolytic-Graphit-Elektrode erhöht.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum elektrochemischen Detektieren eines Analyten, bei dem eine dafür geeignete Kohlenstoffelektrode verwendet wird, wobei an die Kohlenstoff-Elektrode den Analyten spezifisch bindende Fänger-Moleküle gebunden werden, wobei der Analyt an die Fänger-Moleküle gebunden wird und die Kohlenstoff-Elektrode bei oder nach dem Binden des Analyten an die Fänger-Moleküle mit einem ionischen Detergenz in wässriger Lösung behandelt wird, wobei das Behandeln der Kohlenstoff-Elektrode durch Eintauchen in die Lösung und anschließende Inkubation erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Detergenz eine Konzentration von 0,1% bis 20%, insbesondere 1% bis 15%, aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Detergenz in Wasser eine kritische mizellare Konzentration unter 11 mmol/l, insbesondere unter 5 mmol/l, vorzugsweise unter 3 mmol/l, aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Detergenz Natriumdodecylsulfat ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kohlenstoff-Elektrode mit einem, insbesondere in einem für das Detektieren des Analyten relevanten Meßbereich kein elektrochemisches Signal erzeugenden, Stoff beschichtet wird bevor die Fänger-Moleküle durch Bindung an den Stoff an die Kohlenstoff-Elektrode gebunden werden.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Stoff ein Silan, insbesondere 3-(Glycidyloxypropyl)-trimethoxysilan, ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Fänger-Moleküle kovalent gebunden werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Fänger-Moleküle gerichtet, insbesondere an einem ihrer Enden, gebunden werden.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Fänger-Moleküle kovalent in Gegenwart eines Kompetitors, insbesondere eines Proteins oder einer Aminosäure, gebunden werden, wobei die Reaktivität des Kompetitors beim Ausbilden einer kovalenten Bindung geringer ist als diejenige einer ersten chemischen Gruppe an einem der Fänger-Moleküle, deren kovalente Bindung für die gerichtete Bindung erforderlich ist, und höher ist als diejenige einer zweiten chemischen Gruppe an einem der Fänger-Moleküle, deren kovalente Bindung die gerichtete Bindung verhindert.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Quotient aus der Menge der Fänger-Moleküle, die gerichtet an die Kohlenstoff-Elektrode oder den Stoff gebunden werden, und der Menge der Fänger-Moleküle, die anders an die Kohlenstoff-Elektrode oder den Stoff gebunden werden, größer als 1, vorzugsweise größer als 3, ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Fänger-Moleküle, insbesondere einzelsträngige, Nukleinsäuren, Nukleinsäure-Analoga, Haptene, Peptide, Proteine, Zucker oder Lipide sind.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei in den einzelsträngigen Nukleinsäuren jeweils mindestens ein Nukleotid mit einer modifizierten Base, insbesondere Inosin oder 8-Oxoguanin, enthalten ist, welches beim elektrochemischen Detektieren von Basen von durch die einzelsträngigen Nukleinsäuren gebundenen Nukleinsäuren kein elektrochemisches Signal in dem für diese Basen relevanten Meßbereich erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei die einzelsträngigen Nukleinsäuren keine Guanin- und/oder Adenin-Reste aufweisen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kohlenstoff-Elektrode eine Pencil-, eine Glassy-Carbon-, eine Pyrolytic-Graphit- oder eine Kunststoff-Composit-Elektrode, insbesondere eine Graphit enthaltende Polycarbonat-Elektrode, ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kohlenstoff-Elektrode zusätzlich mit einem chaotropen Agens, insbesondere Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid, behandelt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das elektrochemische Detektieren mittels Differenzieller-Puls-Voltammetrie (DPV) oder Chronopotentiometrischer-Stripping-Analyse (CPSA) erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kohlenstoff-Elektrode beim Detektieren gleichzeitig mit dem Detergenz und mit dem Analyten in Kontakt steht.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zum elektrochemischen Detektieren ein Potential-Intervall zur Messung gewählt wird, in welchem im Wesentlichen nur der Analyt ein Signal verursacht.