DE10340275B3

DE10340275B3 - Verfahren zur Herstellung einer Elektrode

Info

Publication number: DE10340275B3
Application number: DE10340275A
Authority: DE
Inventors: Christine Kugler; Burcu Meric; Ingrid Weigel; Jürgen Dr. Schülein; Jörg Dr. Hassmann
Original assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Current assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2003-08-29
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2023-08-30
Also published as: WO2005029069A1; US20070144902A1; EP1658493A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer zum sensitiven und/oder spezifischen elektrochemischen Detektieren eines Analyten in einer wässrigen ersten Flüssigkeit geeigneten Elektrode, wobei eine Verbund-Elektrode, eine gedruckte Elektrode oder eine Kohlenstoff-Elektrode vor dem Detektieren oberflächlich mit einer hydrophoben zweiten Flüssigkeit in Kontakt gebracht wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer zum sensitiven und/oder spezifischen elektrochemischen Detektieren eines Analyten in einer wässrigen Lösung geeigneten Elektrode sowie eine Verwendung dieser Elektrode.
Mit elektrochemischen Verfahren können redoxaktive Analyte untersucht und spezifiziert werden. Die Umsetzung der Analyte findet an einer Arbeitselektrode statt. Zur stromlosen Messung der Spannung wird eine Referenzelektrode verwendet. Der über die Arbeitselektrode fließende Strom oder die Spannung, welche zwischen der Arbeits- und der Referenzelektrode abfällt, wird über eine Gegenelektrode gesteuert. Die elektrochemische Detektion von Analyten kann potentiometrisch oder amperometrisch erfolgen. In einem potentiometrischen Messprotokoll wird die über der Arbeits- und Referenzelektrode abfallende Spannung zeitabhängig gemessen. Während dieser Messung kann ein kontrollierter Stromverlauf angelegt werden. Im Falle eines konstanten Stroms wird diese Messung als Konstantstrom-Chronopotentiometrie bezeichnet. Die Untersuchung von an einer Arbeitselektrode adsorbierten oder komplexierten Analyten mittels Konstantstrom-Chronopotentiometrie wird auch als Konstantstrom-Chronopotentiometrische-Stripping-Analyse oder häufig nur als Chronopotentiometrische-Stripping-Analyse (CPSA) bezeichnet. Die Kathodische-Konstantstrom-Potentiometrische-Stripping-Analyse beinhaltet ein Verfahren in dem durch das Anlegen eines positiven Stromes sukzessive Analyte oxidiert werden. Aus diesen spannungsabhängigen Oxidationsreaktionen können Rückschlüsse auf oxidierbare Analyte gezogen werden. Die Anodische-Konstantstrom-Potentiometrische-Stripping-Analyse beinhaltet ein Verfahren, bei dem ein negativer Strom angelegt wird, um aus dem erhaltenen Spannungsverlauf Rückschlüsse auf reduzierbare Analyte schließen zu können.
In einem amperometrischen Messprotokoll wird die Spannung, welche zwischen der Referenz- und der Arbeitelektrode abfällt, über eine Gegenelektrode nach einem vorgegebenen Protokoll verändert. Gleichzeitig wird der Strom gemessen, welcher über die Arbeitselektrode fließt. Je nach angelegter Spannung können redoxaktive Analyte reduziert oder oxidiert werden. Durch eine Auswertung des Stromverlaufs können Rückschlüsse auf die Analyte gezogen werden. Ein elektrochemisches Messverfahren mit einer stationären Arbeitselektrode, in welchem eine Strom-Spannungskennlinie aufgenommen wird, wird auch als Voltammetrie und die zugehörige grafische Darstellung als Voltammogramm bezeichnet. Für sehr sensitive Messungen von Redoxprozessen wurden spezielle Messprotokolle entwickelt, bei welchen neben den Redoxprozessen stattfindende die Messung beeinflussende kapazitive Prozesse weit gehend unterdrückt werden. Ein sehr effizientes Messprotokoll ist die Differenzielle-Puls-Voltammetrie (DPV).

Aus der DE 100 22 750 A1 ist ein Verfahren zur Herstellung einer mit Erkennungselementen funktionalisierten Fläche bekannt, bei dem auf einen elektrisch leitfähigen Körper durch Elektrodeposition eine Harzschicht abgeschieden wird, welche einen Stoff mit Erkennungsfunktion enthält. Zur Herstellung des Harzes kann eine ungesättigte organische Verbindung, wie beispielsweise ein natürliches Öl, zu einem harzartigen Stoff umgesetzt werden. Das Harz wird durch Zugabe einer wasserlöslichen Säure wasserlöslich gemacht. Das Harz kann in Wasser suspendiert werden, in welchem Erkennungselemente, wie beispielsweise ein Enzym, gelöst sein können. Das Harz kann auf einer Elektrode, z. B. einer Kohlenstoffelektrode, durch Anlegen eines Potentials an der Elektrode abgeschieden werden.

Aus der EP 0 402 917 A2 ist ein Biosensor bekannt, der Elektroden aus Metall enthält. Die Elektroden befinden sich auf einem Substrat. Substrat und Elektroden können mit einer dün nen Schicht aus einem polymerisierten, grenzflächenaktiven Stoff überzogen sein. Um den polymerisierten, grenzflächenaktiven Stoff auf das Substrat zu übertragen, muss das Substrat hydrophob gemacht werden. Dazu kann beispielsweise Glas als Substrat alkalisch behandelt werden. Dazu kann eine Lösung eines alkylierenden Agens in Hexan verwendet werden. Das Agens kann eine Kohlenstoff kette sein, welche eine Methylalkylhalid-Silan-Gruppe enthält, wie z. B. Dimethyloctadecylchlorsilan.

Aus der WO 01/13103 A1 sind Elektroden mit einer Oberflächenbeschichtung aus einer oxidierten Phenolverbindung bekannt. Die Oberflächenbeschichtung wird durch Oxidation der Phenolverbindung an der Oberfläche der Elektrode erzeugt. Die Oberflächenbeschichtung enthält zur Verbesserung der Eigenschaften der Elektrode ein oberflächenaktives Agens.

Aus Wang, J. et al. (1998) Analytica Chimica Acta, Seiten 197 bis 203 ist ein elektrochemischer Nachweis von DNA-Hybridisierung bekannt. Dabei wird an einer Kohlenstoffpaste-Elektrode eine Inosin-subsituierte, Guanin-freie DNA-Sonde immobilisiert. Zur Herstellung der Kohlenstoffpaste-Elektrode werden Grafit-Pulver und Mineralöl in einem Massenverhältnis von 70:30 gemischt. Dadurch entsteht eine zähe Kohlenstoffpaste, die dann als Elektrode geschaltet wird. Die Bildung von DNA-Hybriden mit der immobilisierten DNA-Sonde wird chronopotentiometrisch durch die Bildung eines Guanin-Oxidationspeaks der hybridisierten DNA detektiert. Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass für jede Detektion die Elektrodenoberfläche erneuert werden muss, d.h. es muss eine erneute Immobilisierung der DNA-Sonde vorgenommen werden. Weiterhin ist die Herstellung dieser Elektroden nur schlecht reproduzierbar, d.h. es ist schwer, identische standardisierte Elektroden herzu stellen. Eine Immobilisierung von Reaktionspartnern durch kovalente Bindung an die Kohlenstoffpaste-Elektrode ist ebenfalls nur schwer zu erreichen. Darüber hinaus ist ein wesentlicher Nachteil der Kohlenstoffpaste-Elektroden, dass diese in vielen, insbesondere Detergenz enthaltenden, Lösungsmitteln und Puffern instabil sind und sich auflösen. Insgesamt führt all das dazu, dass die mit Kohlenstoffpaste-Elektroden erzielbaren Ergebnisse nur mangelhaft reproduzierbar sind.

Üblicherweise werden Kohlenstoff-Elektroden vor einer elektrochemischen Detektion vorbehandelt, um die Sensitivität der Elektroden und die Reproduzierbarkeit der Detektion zu erhöhen. Dazu kann die Elektrodenoberfläche mechanisch poliert werden. Das ist jedoch ausgeschlossen, wenn die Elektroden mit einem für die Detektion erforderlichen Molekül beschichtet sind. Weiterhin werden die Elektroden üblicherweise elektrochemische konditioniert. Dabei werden an den Elektroden befindliche redoxaktive Substanzen oxidiert, um den späteren elektrochemischen Nachweis nicht zu stören. Gleichzeitig werden die Oberflächen der Elektroden gereinigt und hydrophilisiert, so dass die Elektroden von Flüssigkeit benetzt werden können. Das Verfahren ist aufwändig und nur schwer zu automatisieren. Nachteilig ist auch, dass an der Elektrode immobilisierte Moleküle, welche mit einer zu analysierenden Substanz reagieren sollen, dabei ebenfalls oxidiert werden können. Beispielsweise werden in einer immobilisierten DNA vorhandene Guanin-Basen oxidiert. Das verschlechtert die Hybridisierungseigenschaften dieser DNA.

Ein weiteres vor allem bei einer Kohlenstoff-Elektrode auftretendes Problem ist die unspezifische Adsorption von DNA an der Elektrode. Das kann zu einem hohen unspezifischen Signal führen, wenn eine spezifisch an der Elektrode durch Hybridisierung bindende DNA nachgewiesen werden soll. Insbesondere bei einer Detektion von nicht mit einer elektrochemisch nach weisbaren Markierungssubstanz versehener DNA, z. B. durch Oxidation von Guanin-Basen, kann das unspezifische Signal im Verhältnis zum spezifischen Signal zu hoch sein, um eine spezifische und/oder sensitive Detektion zu ermöglichen. Es wird versucht, das Problem der unspezifischen Bindung durch ein Blockieren unspezifischer Adsorptionsstellen an den Elektroden mittels verschiedener, zumeist biologischer, Substanzen zu lösen. Solche Substanzen sind z. B. Proteine, DNA oder RNA. Diese Verfahren sind jedoch, insbesondere bei Kohlenstoff-Elektroden, nicht sehr effektiv.

Für eine sensitive Detektion spezifischer nicht markierter Nukleinsäuren sind die mittels Siebdruck-Elektroden bisher erzeugbaren Signale kaum verwendbar. Die Signale konnten bisher auch durch Polieren oder eine elektrochemische Konditionierung der Siebdruck-Elektrode nicht ausreichend verbessert werden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein alternatives Verfahren zur Herstellung einer Elektrode bereitzustellen, welches die oben genannten Nachteile vermeidet. Insbesondere soll an der Elektrode eine unspezifische Adsorption vermieden und/oder die Sensitivität und/oder Spezifität und/oder Reproduzierbarkeit der mit der Elektrode durchführbaren elektrochemischen Nachweise erhöht werden. Nach dem Verfahren gleich hergestellte Elektroden sollen beim elektrochemischen Detektieren eines Analyten im Wesentlichen einheitliche Ergebnisse liefern. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Verwendung einer erfindungsgemäß hergestellten Elektrode anzugeben.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 17 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 16 und 18 bis 23.

Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Herstellung einer zum sensitiven und/oder spezifischen elektrochemischen Detektieren eines Analyten in einer wässrigen ersten Flüssigkeit geeigneten Elektrode vorgesehen. Dabei wird eine Verbund-Elektrode, eine gedruckte Elektrode oder eine Kohlenstoff-Elektrode vor dem Detektieren oberflächlich mit einer hydrophoben zweiten Flüssigkeit in Kontakt gebracht. Der Kontakt mit der zweiten Flüssigkeit kann dabei sehr kurz sein. Es genügt, die Verbund-Elektrode, gedruckte Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode kurz in die zweite Flüssigkeit zu tauchen und überschüssige zweite Flüssigkeit sofort danach, z.B. durch Abwischen, zu entfernen. Bei der Kohlenstoff-Elektrode handelt es sich um eine Elektrode, welche oberflächlich elementaren Kohlenstoff enthält. Bei einer Verbund-Elektrode handelt es sich um eine Elektrode, bei der leitfähige Partikel, z. B. aus Kohlenstoff oder einem Metall, wie Gold, mittels eines Bindemittels leitfähig miteinander verbunden sind. Eine gedruckte Elektrode kann eine Elektrode sein, bei der ein Elektrodenmaterial in einem siebdruckartigen Verfahren auf einen Träger aufgebracht wird. Statt Farbe wird dabei das Elektrodenmaterial verwendet, das üblicherweise aus einem aushärtenden Bindemittel und leitfähigen Partikeln besteht. Als Elektrodenmaterial kann z.B. die Siebdruck-Elektrodenpaste "Carbon/Graphit Paste C10903D14" der Firma Gwent Electronic Materials Ltd., Pontypool, Großbritannien verwendet werden. Eine solche Elektrode wird als Siebdruck-Elektrode bezeichnet. Eine gedruckte Elektrode kann auch eine Elektrode sein, bei der das Elektrodenmaterial mittels eines anderen Verfahres, wie z.B. einem Tampondruck-Verfahren, auf den Träger aufgebracht wird. Eine Elektrode kann gleichzeitig mehreren der genannten Elektrodenarten angehören. Eine Elektrode kann beispielsweise gleichzeitig eine Verbund-Elektrode, gedruckte Elektrode und Kohlenstoff-Elektrode sein. Unter einer Verbund-Elektrode, gedruckten Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode im Sinne der Erfindung wird keine Elektrode verstanden, die aus einer nicht aushärtenden nur aus Mineralöl und leitfähigen Partikeln bestehenden Paste gebildet ist. Eine solche Paste kann z.B. eine Grafit und/oder Ruß enthaltende Kohlenstoffpaste sein.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Elektroden können direkt zur elektrochemischen Detektion eines Analyten eingesetzt werden. Im Gegensatz zu nicht vorbehandelten, d.h. nicht mit der zweiten Flüssigkeit in Kontakt gebrachten, Verbund-Elektroden, gedruckten Elektroden oder Kohlenstoff-Elektroden sind damit verhältnismäßig einheitliche Ergebnisse zu erzielen. Es hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemäß hergestellten Elektroden eine Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit bei der Detektion eines Analyten aufweisen, wie sie bisher nur mittels der elektrochemischen Konditionierung zu erreichen war. Das ist besonders erstaunlich, weil man annehmen könnte, dass an der Oberfläche der erfindungsgemäß hergestellten Elektrode verbleibende Reste der zweiten Flüssigkeit die Elektrode so blockieren, dass sie für die den Analyten enthaltende erste Flüssigkeit nicht mehr zugänglich ist. Das ist jedoch nicht der Fall. Im Fall von gedruckten Elektroden ermöglicht es das erfindungsgemäße Verfahren, eine Elektrodenoberfläche zu generieren, die einen hochspezifischen Nachweis nicht markierter Nukleinsäuren erlaubt. Insbesondere bei den sehr kostengünstig herzustellenden gedruckten Elektroden bestand bisher das Problem, dass diese wenig geeignet waren, um spezifisch elektrochemisch DNA zu detektieren, die durch spezifische Hybridisierung an den gedruckten Elektroden gebunden war.

Weiterhin ist es beim erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft, dass an der Elektrode gebundene Moleküle, wie z. B. DNA, funktionell erhalten werden können und nicht, wie z.B. bei der elektrochemischen Konditionierung, durch eine Oxidation beispielsweise an Bindungsfähigkeit verlieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Herstellung sehr kostengünstiger Elektroden für die Analytik, insbesondere die Umweltanalytik, und die Diagnostik. Hier bisher eingesetzte Metallelektroden sind teuer. Um wiederverwendet werden zu können, müssen diese Elektroden nach der Detektion eines Analyten häufig regeneriert werden. Der Einsatz kostengünstiger Elektroden, beispielsweise auf Kohlenstoffbasis, wie Pencil-Elektroden und insbesondere gedruckte Elektroden, scheiterte bisher daran, dass diese wenig reproduzierbare Ergebnisse lieferten. Die erfindungsgemäß hergestellten Elektroden können z. B. solche günstig herzustellenden Elektroden sein, die nach einer einmaligen Detektion eines Analyten weggeworfen werden können. Ein aufwändiges Regenerieren entfällt.

Das Problem hoher unspezifischer Adsorption, insbesondere von Biomolekülen, wie DNA, findet überraschenderweise bei den erfindungsgemäß hergestellten Elektroden nur in geringem Ausmaß statt. Dadurch ist es nicht erforderlich, Adsorptionsstellen an den Elektroden mittels Blockierungsreagenzien abzusättigen. Übliche Blockierungsreagenzien sind z.B. Proteine, DNA oder RNA. Sie können ebenfalls elektrochemische, die Detektion störende Signale erzeugen.

Bei der Kohlenstoff-Elektrode kann es sich um eine Pencil-Elektrode, eine Grafit-Elektrode, eine pyrolytische Grafit-Elektrode, eine Highly Orientated Pyrolytic Graphite-Elektrode (HOPG-Elektrode) oder eine Glas-Kohlenstoff-Elektrode handeln. Bei einer Pencil-Elektrode handelt es sich um eine herkömmliche Bleistiftmine. Die Verbund-Elektrode oder gedruckte Elektrode kann Gold-, Platin-, Silber-, Grafit- und/oder Rußpartikel enthalten.

Die zweite Flüssigkeit ist vorzugsweise ein Öl, bevorzugt ein Mineralöl. Mit dieser Flüssigkeit wurden sehr gute Ergebnisse erzielt. Das Inkontaktbringen der Verbund-Elektrode, gedruckten Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode mit der zweiten Flüssigkeit kann durch Eintauchen in die zweite Flüssigkeit oder durch Bestreichen, Besprühen, Überschichten oder Bedrukken mit der zweiten Flüssigkeit erfolgen. Das Bedrucken kann z. B. in einem Tampondruck-Verfahren erfolgen.

Das Inkontaktbringen mit der zweiten Flüssigkeit kann bei 0°C bis 300°C, bevorzugt bei 18°C bis 25°C erfolgen. Die an der Verbund-Elektrode, gedruckten Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode nach dem Inkontaktbringen anhaftende zweite Flüssigkeit wird vorteilhafterweise von der Elektrode entfernt. Das kann durch einfaches Abwischen, Abschleudern, beispielsweise in einer Zentrifuge, Abfließenlassen, Abspülen oder Abblasen mit einem Luft-/Gasstrom erfolgen. Die Verbund-Elektrode, gedruckte Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode kann, insbesondere nach dem Inkontaktbringen mit der zweiten Flüssigkeit, poliert werden. Die Elektrode kann vor und zusätzlich nach dem Inkontaktbringen mit der zweiten Flüssigkeit poliert werden. Dabei kann das Polieren vor dem Inkontaktbringen verhältnismäßig grob erfolgen, z. B. mittels eines Schmirgelpapiers. Nach dem Inkontaktbringen sollte das Polieren mit geringem Materialabtrag, z. B. durch Polieren mittels eines fusselfreien Tuchs, erfolgen. Das Polieren verbessert die Sensitivität der Elektrode und die Reproduzierbarkeit der damit generierten Ergebnisse. Zur weiteren Verbesserung der Eigenschaften der Elektrode kann diese, insbesondere nach dem Inkontaktbringen mit der zweiten Flüssigkeit, elektrisch und/oder chemisch konditioniert werden. Zum chemischen Konditionieren kann die Verbund-Elektrode, gedruckte Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode mit einem Detergenz, bevorzugt einem ionischen Detergenz, insbesondere SDS, in Kontakt gebracht werden. Das Detergenz kann dazu in einer wässrigen Lösung in einer Konzentration von mindestens 0,1% (w/v), bevorzugt mindestens 1,0% (w/v), insbesondere minde stens 5% (w/v), mit der Verbund-Elektrode, gedruckten Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode in Kontakt gebracht werden. Das Inkontaktbringen mit dem Detergenz kann auf die gleiche Weise erfolgen wie das Inkontaktbringen mit der zweiten Flüssigkeit.

Die Verbund-Elektrode, gedruckte Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode kann mit einem Material, insbesondere einem Silan, bevorzugt 3-(Glycidyloxypropyl)-Trimethoxysilan, beschichtet werden. Das Material ist bevorzugt ein Material, welches in einem für das Detektieren des Analyten relevanten Messbereichs kein elektrochemisches Signal erzeugt. Das Beschichten erfolgt bevorzugt nach dem Inkontaktbringen mit der zweiten Flüssigkeit. An die Verbund-Elektrode, gedruckte Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode oder das beschichtende Material können Moleküle, insbesondere den Analyten spezifisch bindende Fänger-Moleküle, gebunden werden. Bei den Fänger-Molekülen kann es sich um Nukleinsäuren, insbesondere jeweils 5 bis 100 Nukleotide, vorzugsweise jeweils 10 bis 40 Nukleotide lange Nukleinsäuren, handeln. Bevorzugt enthalten die Basen der Nukleinsäuren zu weniger als 20%, vorzugsweise zu weniger als 10%, insbesondere zu 0%, Guanin. Stattdessen kann Inosin oder 8-Oxoguanin enthalten sein, welches beim elektrochemischen Detektieren ein anderes Signal erzeugt, als das bevorzugt elektrochemisch nachzuweisende Guanin. Dadurch kann vermieden werden, dass durch das Fänger-Molekül Basen bereitgestellt werden, welche beim elektrochemischen Detektieren von Guanin-Basen einer mit dem Fänger-Molekül hybridisierten Nukleinsäure selbst ein elektrochemisches Signal im relevanten Messbereich erzeugen. Das von Inosin erzeugte Oxidationssignal ist deutlich von demjenigen von Guanin zu unterscheiden.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Elektrode in einem Verfahren zum elektrochemischen Detektieren eines Analyten mit folgenden Schritten:

a) Inkontaktbringen der Elektrode mit einer den Analyten enthaltenden wässrigen ersten Flüssigkeit und
b) Nachweisen des Analyten an der Elektrode durch eine spezifische elektrochemische Reaktion.

Die Elektrode kann zwischen den Schritten lit. a) und lit. b) mit mindestens einer dritten wässrigen Flüssigkeit, insbesondere einem Puffer, gewaschen werden. Dadurch können gegebenenfalls unspezifisch anhaftende Moleküle entfernt werden und die Spezifität des Verfahrens kann erhöht werden. Bevorzugt weist der Analyt keine elektrochemische Markierungssubstanz auf. Bei einer Ausgestaltung der Erfindung wird der Analyt beim Nachweisen an die Elektrode, insbesondere an eines der an der Elektrode gebundenen Fänger-Moleküle, gebunden. Durch eine spezifische Bindung an Fänger-Moleküle kann weiterhin die Spezifität beim Detektieren des Analyten erhöht werden.

Die elektrochemische Reaktion ist bevorzugt eine Redox-Reaktion, die insbesondere mittels eines voltammetrischen Verfahrens, bevorzugt Differenzieller-Puls-Voltammetrie (DPV) oder Chronopotentiometrischer-Stripping-Analyse (CPSA), nachgewiesen wird.

Der Analyt ist vorzugsweise ein Umweltschadstoff oder ein Biomolekül, insbesondere eine Nukleinsäure. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Nukleinsäure anhand der Oxidation ihrer Guanin-Basen nachgewiesen wird. Dazu ist keine spezifische elektrochemische Markierung der Nukleinsäure erforderlich. Die Elektrode kann vor dem Detektieren in der nicht wässrigen zweiten Flüssigkeit aufbewahrt werden. Das ist besonders vorteilhaft, um die Elektrode in den Handel zu brin gen. Die Elektrode kann dann in dieser Flüssigkeit verkauft werden und ist sofort einsatzfähig.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:
1a, b DPV-Signale einer Oxidation der Guanin-Basen von Oligonukleotiden, gebunden an Kohlenstoff-Elektroden, welche mit Mineralöl in Kontakt gebracht oder nicht mit Mineralöl in Kontakt gebracht worden sind,
2a, b DPV-Signale einer Oxidation der Guanin-Basen von Oligonukleotiden, gebunden an Siebdruck-Elektroden, die nicht mit Mineralöl in Kontakt gebracht worden sind,
3a, b DPV-Signale der Oxidation der Guanin-Basen von Oligonukleotiden, gebunden an Siebdruck-Elektroden, die vor der Detektion mit Mineralöl in Kontakt gebracht worden sind und
4a, b Nachweis der elektroaktiven Substanz (N,N-dimethyl-p-phenylendiamin) (DMPPB) mittels DPV an mit Mineralöl in Kontakt gebrachten und nicht mit Mineralöl in Kontakt gebrachten Siebdruck-Elektroden.
Bei den Versuchen, deren Ergebnisse in den 1b, 3a und 3b dargestellt sind, erfolgte das Inkontaktbringen der Elektroden wie folgt:

1. Eintauchen der Elektroden für 1 Minute in Mineralöl und
2. Abwischen des überschüssigen Öls mit einem weichen, fusselfreien Tuch, so dass ein dünner Ölfilm auf der Elektrodenoberfläche verbleibt.

Mit diesen Elektroden und mit den Elektroden, mit denen die in den 1a, 2a und 2b dargestellten Ergebnisse erzeugt worden sind, ist folgende weitere Behandlung durchgeführt worden:

1. Eintauchen für 15 Minuten in je 150 μl 10 % SDS (w/v) in Wasser,
2. Abspülen mit entionisiertem Wasser,
3. Eintauchen für eine Stunde in je 100 μl 1% 3-(Glycidyloxypropyl)-Trimethoxysilan (v/v) in Ethanol,
4. Trocknenlassen für 15 Minuten bei 80°C und
5. Eintauchen für eine Stunde in je 100 μl 0,1 mol/l Na₂CO₃, pH 9,5, 400 pmol/ml Fänger-Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID NO 1 gemäß dem Anliegenden Sequenzprotokoll.

Die Sequenz des Fänger-Oligonukleotids stammt aus dem für humanes TNF-alpha kodierenden Gen. Die darin enthaltene Guanin-Base ist durch eine Inosin-Base ersetzt worden. Am 5'-Ende weist das Fänger-Oligonukleotid eine über einen 7 Kohlenstoff-Atome langen Spacer (C7-Kette) gebundene Amino-Gruppe auf. Über die Amino-Gruppe wird das Fänger-Oligonukleotid beim Eintauchen an die Beschichtung der Elektroden gebunden.
Zur spezifischen Detektion einer nachzuweisenden zu den Fänger-Oligonukleotiden komplementären Ziel-DNA ist wie folgt vorgegangen worden:

1. Eintauchen der Elektroden für 30 Minuten in je 100 μl 1 nmol/ml Ziel-DNA im Hybridisierungspuffer DigEasy (Roche Diagnostics GmbH, Sandhofer Straße 116, 68305 Mannheim, Deutschland),
2. Waschen der Elektroden für 10 Minuten durch deren Eintauchen in je 150 μl 1 × SSC mit 0,1% SDS und
3. DPV in 0,1 M Na-Acetat Puffer, pH 4,6.

Zur Herstellung von 1 × SSC ist 20 × SSC (175,3 g NaCl, 88,2 g Natriumcitrat-2H₂O und 800 ml H₂O, eingestellt mit HCl auf pH 7 und auf einen Liter Gesamtvolumen mit H₂O aufgefüllt) 1:20 mit H₂O verdünnt worden.
Bei den Versuchen zu den in den 1a, 1b, 2a, 2b, 3a und 3b dargestellten Ergebnissen sind die folgenden Oligonukleotide eingesetzt worden:

– komplementäres Oligonukleotid (SEQ ID NO 2),
– Oligonukleotid mit einer Punktmutation, d.h. 1 Base Mismatch, gegenüber dem komplementären Oligonukleotid (SEQ ID NO 3) und
– unspezifisches, d.h. nicht zum Fänger-Oligonukleotid komplementäres, Oligonuleotid (SEQ ID NO 4).

Die in den 1a und 1b dargestellten Ergebnisse wurden mit Pencil-Elektroden erzeugt. 1a zeigt die mit Elektroden ohne Mineralölbehandlung und 1 b die mit Elektroden mit Mineralölbehandlung erhaltenen Ergebnisse. Es zeigt sich, dass ein spezifischer Nachweis eines komplementären Oligonukleotids mit den Mineralöl-behandelten Elektroden, nicht aber mit den nicht mit Mineralöl behandelten Elektroden möglich ist. Das durch das komplementäre Oligonukleotid bei nicht mit Mineralöl in Kontakt gebrachten Elektroden verursachte Signal unterscheidet sich in seiner Intensität nicht von dem durch ein nicht komplementäres Oligonukleotid oder ein Oligonukleotid mit einer Base Mismatch verursachten Signal.
Die in den 2a, 2b, 3a, 3b, 4a und 4b dargestellten Ergebnisse sind mit Siebdruck-Elektroden erzeugt worden. Zur Herstellung der Elektroden ist die Siebdruck-Elektrodenpaste "Carbon/Graphit Paste C10903D14" der Firma Gwent Electronic Materials Ltd., Pontypool, Großbritannien auf einen Träger aufgetragen und trocknen gelassen worden.
2a zeigt das mit dem komplementären Oligonukleotid (SEQ ID NO 2) und 2b das mit dem nicht komplementären Oligonukleotid (SEQ ID NO 4) gewonnene Ergebnis. Es zeigte sich, dass ohne Ölbehandlung weder ein von einem komplementären noch ein von einem nicht komplementären Oligonukleotid erzeugtes Signal nachweisbar ist. Das in 3a dargestellte Ergebnis ist mit dem komplementären Oligonukleotid und das in 3b dargestellte Ergebnis mit dem nicht komplementären Oligonukleotid gewonnenen worden. 3a zeigt im Vergleich zu den 2a, 2b und 3b, dass die Behandlung mit Mineralöl den spezifischen Nachweis eines komplementären Oligonukleotids anhand der Guanin-Oxidation mit Siebdruck-Elektroden erst ermöglicht.
Die in 4a und b dargestellten Versuchsergebnisse sind wie folgt generiert worden:
Für die Messung wurden Träger mit je neun Siebdruck-Elektroden verwendet. Mit diesen Siebdruck-Elektroden wurden simultan unter Verwendung einer Platin-Gegenelektrode und Ag/AgCl-Referenzelektrode DPV-Voltamogramme der Substanz DMPPD aufgenommen. Dazu wurden die Siebdruck-Elektroden in 0,1% HAc/NaAC, pH 4,6, 10^–4mol/l DMPPD getaucht.
4a zeigt die Messung mit Siebdruck-Elektroden, die vor der Messung mit einem fusselfreien Tuch poliert, aber nicht mit Mineralöl in Kontakt gebracht worden sind. Dabei zeigt sich, dass die auf dem Träger vorhandenen neun Siebdruck-Elektroden für die gleiche in identischer Konzentration vorliegende Substanz unterschiedliche Signale erzeugen.
4b zeigt Signale, die mittels Siebdruck-Elektroden generiert worden sind, welche für 5 Minuten in Mineralöl getaucht und anschließend mit einem fusselfreien Tuch poliert worden sind. Die Signale sind wesentlich einheitlicher als die mit Siebdruck-Elektroden ohne Behandlung mit Mineralöl erzeugten Signale. Darüber hinaus ist die Signalstärke bei allen Signalen größer als bei den Signalen, welche mit nicht vorbehandelten Siebdruck-Elektroden erzeugt worden sind.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung einer zum sensitiven und/oder spezifischen elektrochemischen Detektieren eines Analyten in einer wässrigen ersten Flüssigkeit geeigneten Elektrode, wobei die Elektrode eine Verbund-Elektrode, eine gedruckte Elektrode oder eine Kohlenstoff-Elektrode ist, welche vor dem Detektieren oberflächlich mit einer hydrophoben zweiten Flüssigkeit in Kontakt gebracht wird, wobei die Elektrode nicht aus einer nicht aushärtenden nur aus Mineralöl und leitfähigen Partikeln bestehenden Paste gebildet ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kohlenstoff-Elektrode eine Pencil-Elektrode, eine Grafit-Kohlenstoff-Elektrode, eine pyrolytische Grafit-Elektrode, eine Highly Orientated Pyrolytic Graphite-Elektrode (HOPG-Elektrode) oder eine Glas-Kohlenstoff-Elektrode ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbund-Elektrode oder gedruckte Elektrode Gold-, Platin-, Silber-, Grafit- und/oder Rußpartikel enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zweite Flüssigkeit ein Öl, bevorzugt ein Mineralöl, ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbund-Elektrode, gedruckte Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode mit der zweiten Flüssigkeit durch Eintauchen in die zweite Flüssigkeit oder durch Bestreichen, Besprühen, Überschichten oder Bedrucken, insbesondere in einem Tampon-Druckverfahren, mit der zweiten Flüssigkeit in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Inkontaktbringen mit der zweiten Flüssigkeit bei 0 bis 300°C, bevorzugt bei 18 bis 25°C, erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die an der Verbund-Elektrode, gedruckten Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode nach dem Inkontaktbringen anhaftende zweite Flüssigkeit, insbesondere durch Abwischen, Abschleudern, Abfließen lassen, Abspülen oder Abblasen mit einem Luft-/Gasstrom, entfernt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbund-Elektrode, gedruckte Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode, insbesondere nach dem Inkontaktbringen mit der zweiten Flüssigkeit, poliert wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Elektrode vor und nach dem Inkontaktbringen mit der zweiten Flüssigkeit poliert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbund-Elektrode, gedruckte Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode, insbesondere nach dem Inkontaktbringen mit der zweiten Flüssigkeit, elektrisch und/oder chemische konditioniert wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei die Verbund-Elektrode, gedruckte Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode zum chemischen Konditionieren nach dem Inkontaktbringen mit der zweiten Flüssigkeit mit einem Detergenz, bevorzugt einem ionischen Detergenz, insbesondere SDS, in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei das Detergenz in einer wässrigen Lösung in einer Konzentration von mindestens 0,1 Gramm-Volumen%, bevorzugt mindestens 1 Gramm-Volumen%, insbesondere mindestens 5 Gramm-Volumen%, mit der Verbund-Elektrode, gedruckten Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbund-Elektrode, gedruckte Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode nach dem Inkontaktbringen mit der zweiten Flüssigkeit mit einem, insbesondere in einem für das Detektieren des Analyten relevanten Messbereich kein elektrochemisches Signal erzeugenden, Material, insbesondere einem Silan, bevorzugt 3-(Glycidyloxypropyl)-Trimethoxysilan, beschichtet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei an die Verbund-Elektrode, gedruckte Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode Moleküle, insbesondere den Analyten spezifisch bindende Fänger-Moleküle, gebunden werden, oder nach Anspruch 13, wobei an das die Verbund-Elektrode, gedruckte Elektrode oder Kohlenstoff-Elektrode beschichtende Material Moleküle, insbesondere den Analyten spezifisch bindende Fänger-Moleküle, gebunden werden.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei die Fänger-Moleküle, insbesondere jeweils 5 bis 100 Nukleotide lange, vorzugsweise jeweils 10 bis 40 Nukleotide lange, Nukleinsäuren sind.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei die Basen der Nukleinsäuren zu weniger als 20%, vorzugsweise zu weniger als 10%, insbesondere zu 0%, Guanin enthalten.
Verwendung einer nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 hergestellten Elektrode in einem Verfahren zum elektrochemischen Detektieren eines Analyten mit folgenden Schritten: a) Inkontaktbringen der Elektrode mit einer den Analyten enthaltenden wässrigen ersten Flüssigkeit und b) Nachweisen des Analyten an der Elektrode durch eine spezifische elektrochemische Reaktion, wobei die Elektrode zwischen den Schritten lit. a) und lit. b) mit mindestens einer dritten wässrigen Flüssigkeit gewaschen wird.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die dritte wässrige Flüssigkeit ein Puffer ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 oder 18, wobei der Analyt beim Nachweisen an die Elektrode gebunden ist.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Elektrode nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16 herge stellt ist, wobei der Analyt an eines der an der Elektrode gebundenen Fänger-Moleküle gebunden ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei die elektrochemische Reaktion eine Redox-Reaktion ist, die insbesondere mittels eines voltammetrischen Verfahrens, bevorzugt Differenzieller-Puls-Voltammetrie (DPV) oder Chronopotentiometrischer-Stripping-Analyse (CPSA), nachgewiesen wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei der Analyt ein Umweltschadstoff oder ein Biomolekül, insbesondere eine Nukleinsäure, ist.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei die Nukleinsäure anhand der Oxidation ihrer Guanin-Basen nachgewiesen wird.