EP1377685A2 - Verfahren zum erfassen von makromolekularen biopolymeren mittels einer elektrodenanordnung - Google Patents

Verfahren zum erfassen von makromolekularen biopolymeren mittels einer elektrodenanordnung

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EP1377685A2
EP1377685A2 EP02727216A EP02727216A EP1377685A2 EP 1377685 A2 EP1377685 A2 EP 1377685A2 EP 02727216 A EP02727216 A EP 02727216A EP 02727216 A EP02727216 A EP 02727216A EP 1377685 A2 EP1377685 A2 EP 1377685A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
electrodes
molecules
electrode
detected
dna
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02727216A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Franz Hofmann
Richard Johannes Luyken
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Infineon Technologies AG
Original Assignee
Infineon Technologies AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Infineon Technologies AG filed Critical Infineon Technologies AG
Publication of EP1377685A2 publication Critical patent/EP1377685A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the invention relates to a method for detecting macromolecular biopolymers by means of an electrode arrangement.
  • Fig.la and Fig.lb show such a (bio) sensor as described in [2].
  • the sensor 100 has two electrodes 101, 102 made of gold, which are embedded in an insulator layer 103 made of insulator material. Electrode connections 104, 105 are connected to the electrodes 101, 102, from which the electrical potential applied to the electrode 101, 102 can be tapped.
  • the electrodes 101, 102 are arranged as planar electrodes.
  • DNA probe molecules 106 are immobilized on each electrode 101, 102 (cf. Fig.la). The immobilization takes place according to the so-called gold-sulfur coupling.
  • the analyte to be examined for example an electrolyte 107, is applied to the electrodes 101, 102.
  • DNA strands 108 are contained in the electrolyte 107 with a sequence that is complementary to the sequence of the DNA probe molecules, these DNA strands 108 hybridize with the DNA probe molecules 106 (FIG. 1b).
  • Hybridization of a DNA probe roller 106 and a DNA strand 108 only takes place if the sequences of the respective DNA probe molecule 106 and the corresponding DNA strand 108 are complementary to one another. If this is not the case, no hybridization takes place. Thus, a DNA probe molecule of a given sequence is only able to bind, ie hybridize, a specific one, namely the DNA strand with a complementary sequence.
  • the hybridization changes the capacitance between the electrodes in the sensor described above. This change in capacity is used as a measurement for the detection of DNA molecules.
  • a further procedure for examining the electrolyte with regard to the existence of a DNA strand with a predetermined sequence is known from [7].
  • the DNA strands are labeled with the desired sequence and their existence is determined on the basis of the reflective properties of the labeled molecules.
  • light in the visible wavelength range is radiated onto the electrolyte and the light reflected by the electrolyte, in particular by the DNA strand to be detected, is detected. Due to the reflection behavior, i.e. in particular on the basis of the detected, reflected light rays, it is determined whether or not the DNA strand to be detected with the correspondingly predetermined sequence is contained in the electrolyte.
  • Detection means for detecting the reflected light rays required so that the reflected light rays can be detected at all.
  • affinity chromatography cf. [8]
  • immobilized small molecules in particular ligands of high specificity and affinity
  • ligands of high specificity and affinity to generate peptides and proteins, e.g. Enzymes to bind specifically in the analyte.
  • DNA serves as a template for the formation of a conductive silver wire between two
  • [12] also discloses a method and a device for identifying a biopolymer sequence on solid surfaces.
  • a first biopolymer applied to a solid substrate is brought into contact with a second biopolymer affine to it.
  • An affinity sensor for the detection of specific molecular binding events is also known from [13], which in particular e.g. should be used in DNA microarray tests.
  • the invention is based on the problem of specifying an alternative method for detecting macromolecular biopolymers which is simple in design and has a high detection sensitivity.
  • an electrode arrangement which has a first and a second electrode.
  • Both the first electrode and the second electrode are provided with capture molecules that can bind macromolecular biopolymers.
  • capture molecules can be single type molecules or also first and second type molecules, i.e. Catcher molecules different
  • a first electrical measurement is also carried out on the electrodes.
  • a solution to be examined is brought into contact with the electrode arrangement, wherein the solution can contain the macromolecular biopolymers to be detected.
  • macromolecular biopolymers to be detected contained in the solution to be examined are bound to the capture molecules on the first and second electrodes.
  • the electrode arrangement is also brought into contact with a reagent for increasing the conductivity of macromolecular biopolymers which binds to the macromolecular biopolymers and gives them increased electrical conductivity.
  • a second electrical measurement is then carried out on the electrodes and the macromolecular biopolymers become dependent on that Comparison of the results of the two electrical measurements on the electrodes recorded.
  • the present method is based on the knowledge that generally non-conductive or only weakly conductive macromolecular biopolymers are made electrically conductive by the addition / binding of a reagent which increases the conductivity of the biopolymers, and the macromolecular biopolymers that are now to be detected as conductive, as a “conductivity bridge "are used between two electrodes, this conductivity bridge influencing the flow of the current flowing between the electrodes.
  • the conductivity bridge which can also be understood as a" molecular short circuit "between two electrodes, is in principle formed by only a single molecule can, the present method has a higher detection sensitivity than the known methods, namely a sensitivity of a single molecule of the macromolecular biopolymers to be detected.
  • the resistance or the current flow is preferably determined in the electrical measurements on the electrodes.
  • a single type of molecule can be used as a capture molecule in the process described here, e.g. a double-stranded nucleic acid with a defined nucleic acid sequence.
  • the capture molecules are at least first and second
  • Capture molecules for example at least two oligonucleotides with a different nucleic acid sequence (which therefore have different binding specificities) or two antibodies which can bind different surface areas (epitopes) of a macromolecular biopolymer.
  • detection means both the qualitative and quantitative detection of macromolecular biopolymers in an analyte to be examined. This means that the term "capture” also includes determining the absence of macromolecular biopolymers in the analyte.
  • a reagent for increasing the conductivity of macromolecular biopolymers is understood here to mean a reagent which is able to bind to macromolecular
  • biopolymers preferably specifically, and which has a conductivity for the electric current that is higher than that of the macromolecular biopolymers to be detected.
  • Such a reagent to increase conductivity is preferably a chemically reducible reagent, i.e. a reagent that can donate electrons, thereby lowering the oxidation state of at least one of the atoms of the reagent.
  • the reagent preferably contains metal ions which are not only chemically reducible and can bind to macromolecular biopolymers, but are also easily soluble in solvents suitable for macromolecular biopolymers. Examples of such metal ions are silver, gold, copper or nickel ions or mixtures thereof, which act as cations on negatively charged
  • nucleic acids as the biopolymers to be detected, such cations are bound to the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acids. If proteins are to be recorded, such cations can be bound via the side chains of acidic amino acids such as aspartate or glutanate.
  • reagent for increasing the conductivity are soluble polymers or oligomers which conduct electricity and which are positively charged in the conducting state.
  • suitable substituted polypyrroles for example with 2 to 10 thiophene units, for example 6 thiophene units.
  • Substituents which impart the solubility of these polymers or oligomers in solvents compatible with macromolecular biopolymers, preferably in aqueous media are, for example, sulfonic acid or carboxylic acid groups which are linked to the aromatic backbone via alkylene units.
  • the substitution is preferably carried out via the 3-position of the aromatic ring.
  • the addition to the macromolecular biopolymers to be detected is preferably carried out via electrostatic interactions with charged groups or residues of the biopolymers.
  • the reagent can also be bound to increase the conductivity by interactions with other areas of the nucleic acid, such as the small groove of the nucleic acids.
  • the electrode arrangement is brought into contact with a reducing agent which reduces the reagent (bound to the macromolecular biopolymers) in order to increase the conductivity.
  • a reducing agent which reduces the reagent (bound to the macromolecular biopolymers) in order to increase the conductivity.
  • Known and common organic or inorganic reducing agents such as hydroquinone or hydrogen sulfite can be used for the reduction. If, on the other hand, the above-mentioned conductive polymers or oligomers are used, no chemical reduction of the reagent is necessary to increase the conductivity, since the reagent in its bindable form already conducts the electrical current.
  • Electrode arrangement after immobilization of the macromolecular biopolymers to be detected with the reagent Increase the conductivity of macromolecular biopolymers. Rather, it is also possible to first bring the solution to be examined into contact with the reagent for increasing the conductivity and then to bind the biopolymers to be detected to the electrodes, ie to immobilize them.
  • nucleic acids As macromolecular biopolymers, nucleic acids, oligonucleotides, proteins, peptides or complexes thereof, i.e. For example, complexes of nucleic acids and proteins are recorded.
  • macromolecular biopolymers are understood here to mean nucleic acids such as DNA and RNA molecules or smaller nucleic acid molecules such as oligonucleotides with a length of, for example, approximately 10 to 40 base pairs (bp).
  • the nucleic acids can be double-stranded, but can also have at least single-stranded regions or can be present as single strands overall, for example by preceding thermal denaturation or another type of strand separation for their detection.
  • the sequence of the nucleic acids to be detected can be at least partially or completely predetermined, i.e. be known.
  • Other macromolecular biopolymers that can be detected here are proteins or peptides. These can be made up of the 20 amino acids usually found in proteins, but can also contain naturally occurring amino acids or e.g. be modified by sugar residues (oligosaccharides) or contain post-translational modifications.
  • complexes can also be used here to mean nucleic acids such as DNA and RNA molecules or smaller nucleic acid
  • Nucleic acids and proteins are detected, such as those formed by a DNA (specific) binding protein such as a translation factor with a DNA molecule which has the corresponding recognition sequence. If proteins or peptides are to be detected as macromolecular biopolymers, the capture molecules (located on the electrodes) preferably provide ligands with a binding activity for the proteins to be detected or
  • the proteins or peptides to be detected can bind to the electrodes on which the corresponding ligands are arranged.
  • the capture molecules / ligands are in turn preferably linked to the electrodes by covalent bonds.
  • Low-molecular enzyme agonists or enzyme antagonists pharmaceuticals, sugars or antibodies or any molecule which has the ability to specifically bind proteins or peptides can be considered as ligands for proteins and peptides.
  • nucleic acids or oligonucleotides are detected using the method described here, they can be in both single-stranded and double-stranded form.
  • DNA probe molecules are preferably used as capture molecules for nucleic acids, which is why the nucleic acids then have at least one single-stranded region accessible to hybridization.
  • DNA probe molecules with a sequence which is (completely) complementary to the single-stranded region are preferably used.
  • the DNA probe molecules can be oligonucleotides or also have longer nucleotide sequences as long as they do not form any of the intermolecular structures that hybridize the probe molecule with the one to be detected
  • nucleic acid Prevent nucleic acid.
  • DNA or RNA binding proteins or agents as capture molecules.
  • a problem in the detection of macromolecular biopolymers is the fact that the biopolymers to be detected are usually not identical in any area of their secondary and / or tertiary structure.
  • polypeptides and proteins basically have a different and unique spatial structure at every point / area (surface).
  • Nucleic acids to be detected generally have a different base sequence at their two terms (ie the 3 X terminus and the 5 'terminus).
  • the capture molecules used are at least first and second capture molecules.
  • the first capture molecules are able to (specifically) bind a first region of a biopolymer to be detected, and the second catcher molecules are able to (specifically) bind a second region of a biopolymer to be detected. In this way, the formation of the conductivity bridge described here is ensured.
  • area of a macromolecular biopolymer to be detected is understood in the sense of the invention to mean both an area which, as in the case of proteins, has a special three-dimensional (spatial) structure, or, as in the case of nucleic acids, in principle the same or very much can have a similar three-dimensional structure, have a nucleotide sequence which differs from the other regions, and consequently the capture molecules can be, for example, two antibodies, each of which recognizes a specific epitope of the protein to be detected, or an antibody which has an epitope on the to detecting protein and a peptide that is in the
  • the at least first and second capture molecules are preferably each homogeneously distributed, i.e. in a uniform distribution, applied to the two electrodes. This ensures that the macromolecular biopolymers are bound to the electrodes by means of the capture molecules, regardless of the orientation they have in the solution to be detected.
  • This uniform distribution can e.g. can be achieved by first producing a mixture of the capture molecules and then applying this mixture to the electrodes.
  • the electrode arrangement can be made of a common substrate, e.g. Silicon or gallium arsenide exist, to which a gold layer and a silicon nitride layer have first been applied, and which has subsequently been structured using conventional lithography and etching techniques to produce the electrode arrangement (s).
  • a common substrate e.g. Silicon or gallium arsenide exist
  • gold layer and a silicon nitride layer have first been applied, and which has subsequently been structured using conventional lithography and etching techniques to produce the electrode arrangement (s).
  • the distance between the two electrodes can be made variable, depending on the type of structuring technique used and the type of macromolecules to be detected. In general, the distance between the electrodes is about 5 nanometers (nm) to 100 or several 100 nanometers. Smaller distances in the range from approx. 5 nm to approx. 30 or 40 nm are smaller for the detection
  • the preferred electrode spacing can be estimated from the size of the biopolymer.
  • nucleic acids the 3D structure of which is generally known, can be based on the known helical pitch of ideal A, B and Z DNA (cf. [10]), which e.g. for B-DNA is 0.34 nm per helical turn and base pair, it can be approximately assumed that 10 base pairs (bp) bridge a distance of 3.4 nm and thus the distance between the electrodes is estimated.
  • the catcher molecules can be lengthened or shortened if necessary become.
  • Electrode distance to be determined purely empirically without knowledge of the 3-dimensional dimension of the macromolecular biopolymer to be detected.
  • capture molecules which do not have sufficient conductivity per se, but which are made conductive by modifications.
  • a negatively charged spacer can be used to bind the hormone to the electrodes.
  • a plurality of pairs of electrodes can also be used, each pair having only one capture molecule or at least first and second Capture molecules is provided, which specifically binds one of the biopolymers to be detected.
  • a conventional interdigital electrode for example, can be used as the electrode arrangement for carrying out the method described here.
  • one with several interdigital electrodes i.e. an electrode array, provided biosensor.
  • Another electrode arrangement that can be used is a
  • Electrode arrangement in the form of a trench or a cavity. This is formed, for example, by holding areas such as e.g. there is a gold layer on which the capture molecules that can bind the macromolecular biopolymers are immobilized.
  • a first electrical measurement is carried out on the electrodes in a first method step.
  • the capture molecules can already be attached to the immobilization agent, but do not have to. Any technique known for this purpose can be used to apply the capture molecules. If a multiple determination is to be carried out, this can be done
  • a medium for example an electrolyte, is brought into contact with the electrode arrangement. This takes place in the
  • the macromolecular biopolymers can bind to the capture molecules.
  • the conditions are chosen so that they can bind to their corresponding capture molecule at the same time or one after the other.
  • unbound catcher molecules can be removed from the electrodes on which they are located.
  • the capture molecules are nucleic acid (DNA) strands
  • this is done, for example, enzymatically using an enzyme that selectively degrades single-stranded DNA.
  • the selectivity of the degrading enzyme for single-stranded DNA must be taken into account. If the enzyme selected for the degradation of non-hybridized DNA single strands does not have this selectivity, the hybridized double-stranded DNA to be detected may also be undesirably degraded as well.
  • DNA nucleases for example a nuclease from mung beans, the nuclease P1 or the nuclease S1 can be used to remove the unbound DNA probe molecules from the respective electrode.
  • DNA polymerases which are due to their
  • DNA degradation can be used.
  • the ligands are ligands, they can, if unbound, also be removed enzymatically.
  • the ligands are enzymatically cleavable
  • connection covalently connected to the electrodes for example via an ester compound.
  • a carboxyl ester hydrolase can be used to remove unbound ligand molecules.
  • This enzyme hydrolyzes the ester compound between the electrode and the respective ligand molecule that was not bound by a peptide or protein.
  • ester connections between the electrode and those molecules which have entered into a binding interaction with peptides or proteins remain intact due to the reduced steric accessibility which occurs as a result of the space filling of the bound peptide or protein.
  • Removal of the unbound capture molecules is optional. However, it can have the advantage that the measurement signal obtained e.g. is not influenced by capture molecules which (like oligonucleotides) are also able to bind reagents to increase the conductivity of the macromolecular biopolymers such as reducible metal cations.
  • Catcher molecules are brought into contact with the electrode arrangement with a reagent for increasing the conductivity of macromolecular biopolymers which binds to the macromolecular biopolymers and gives them electrical conductivity. Doing so is also sufficient
  • a second electrical measurement is then carried out on the electrodes.
  • the values determined from the • first and second electrical measurements are then compared with one another. If the measured values of the measured variable used differ in such a way that the difference between the determined values is greater than a predetermined threshold value, it is assumed that macromolecular biopolymers have bound to capture molecules or generally to the electrodes, and thereby the change in the intensity of the signal received at the receiver has been caused.
  • the result is output that the corresponding macromolecular biopolymers that specifically bind a capture molecule have been bound and thus that the corresponding macromolecular biopolymers are contained in the medium were.
  • the method can be designed in such a way that a reference measurement and a measurement for the detection of macromolecular biopolymers is carried out. This happens, for example, in the way that a
  • Reference measurement is only carried out with the medium, and at the same time a measurement with the medium which contains (or not also) the macromolecular biopolymers to be recorded, if, for example, a qualitative proof is desired.
  • Figures la and lb a sketch of two planar electrodes, by means of which the existence of DNA strands to be detected in an electrolyte ( Figure la) or their non-
  • Figure 2 is a sketch of an electrode arrangement, which for
  • Figures 4a to 4e different process states of a method for the detection of proteins according to a further embodiment of the invention.
  • FIG. 2 shows a sectional view of a trench-shaped electron arrangement 200 which can be used for the method disclosed here.
  • Electrode arrangement 200 are applied to an insulating substrate 201, for example a silicon oxide substrate, a gold layer 202 and a silicon nitride 203.
  • an insulating substrate 201 for example a silicon oxide substrate, a gold layer 202 and a silicon nitride 203.
  • trench shape 204 is formed, the
  • Electrode is formed by the opposite side walls 205 and 206.
  • the first electrode 205 is provided with a first electrical connection 207 and the second electrode is provided with a second electrical connection 208.
  • first electrical connection 207 and the second electrode is provided with a second electrical connection 208.
  • Multiple measurement of suitable sensor can have, for example, a plurality of trenches arranged in parallel.
  • FIG. 3a shows a section of an electrode arrangement 300 with an insulating substrate 301, a first layer 302, a silicon nitride layer 303, a first electrode 305 and a second electrode 306, the first electrode 305 and the second electrode 306 being made of gold.
  • the electrode arrangement forms a trench 304.
  • electrodes 305 and 306 can also be made of silicon oxide. These can be coated with a material that is suitable for immobilizing the capture molecules on them.
  • alkoxysilane derivatives can be used, such as
  • a capture molecule to be immobilized reacts with such an activated group, it is immobilized on the surface of the coating on the electrode via the selected material as a kind of covalent linker.
  • DNA probe molecules 307, 308 are applied to the immobilized areas of the electrodes 305, 306 as capture molecules. With the gold electrodes shown here, the immobilization takes place e.g. about the gold-sulfur coupling.
  • First DNA probe molecules 307 are applied to the first electrode 305, the nucleotide sequence of which is complementary to a predetermined first DNA sequence of a nucleic acid to be detected.
  • Second DNA probe molecules 308 are applied to the second electrode 306, the nucleotide sequence of which is complementary to a predetermined second DNA sequence of the nucleic acid to be detected.
  • This embodiment thus represents an example in which first and second capture molecules with different specificity are used.
  • a first electrical measurement is carried out on the electrodes either before or after the immobilization of the DNA probe molecules.
  • the electrode is preferably used
  • Resistance or current flow is determined.
  • a reference value e.g. for the resistance, determined and stored in a memory (not shown).
  • adenine (A), guanine (G), thymine (T), or cytosine (C) can be added to the sequences of Probe molecules hybridize complementary sequences of DNA strands in the usual way, ie by base pairing via hydrogen bonds between A and T or between C and G.
  • 3a also shows an electrolyte 309 which is brought into contact with the electrodes 305, 306 and the DNA probe molecules 307, 308.
  • the electrode arrangement 300 in the event that the electrolyte 309 contains a DNA molecule 310 which has a predetermined first sequence and a predetermined second sequence, each of which is complementary to the sequence of the first DNA probe molecule 307 or of the second DNA molecule 308.
  • the DNA molecule can be single-stranded, as indicated in FIG. 3, or double-stranded.
  • the DNA strand 310 to be detected hybridizes to the first DNA probe molecule 307 via the first predetermined sequence and to the second DNA probe molecule 308 via the second predetermined sequence.
  • the hybridization can take place spontaneously, but also in the case of double-stranded nucleic acid molecules 310, e.g. by thermal denaturation or by induction of a fluid movement perpendicular to the electrodes, as described in [9].
  • the result after hybridization has taken place is the formation of a DNA “bridge” between the electrodes.
  • a biochemical process for example by adding DNA nucleases to the electrolyte 309, hydrolyzes non-hybridized single-stranded DNA probe molecules 307 or 308 (see FIG. 3b). Should capture single-stranded DNA should be dispensed with, however, if this makes it possible for the single strand 310 to be detected to also be dismantled.
  • the selectivity of the degrading enzyme for single-stranded DNA must be taken into account. If the enzyme selected for the degradation of non-hybridized DNA single strands does not have this selectivity, the hybridized double-stranded DNA to be detected may also be degraded undesirably, which would lead to a falsification of the measurement result.
  • one of the following substances can be added to remove the single-stranded DNA probe molecules 306 and 307 on the two electrodes:
  • DNA polymerases that are capable of breaking down single-stranded DNA due to their 5 '- 3' exonuclease activity or their 3 '-> 5' exonuclease activity can also be used for this purpose.
  • the electrode arrangement 300 is brought into contact with a reagent for increasing the conductivity of macromolecular biopolymers which binds to the macromolecular biopolymers and gives them electrical conductivity.
  • This reagent is, for example, silver ions 311 dissolved in an alkaline medium, as described in [9]. The resulting binding of the silver ions 311 to the DNA molecules shown in FIG. 3c takes place through the exchange of the sodium ions bound to the phosphate backbone.
  • the silver ions 311 bound to the DNA molecules are reduced to form the conductivity bridge.
  • small silver nuclei can first be formed on the DNA using a basic hydroquinone solution and then the DNA can be converted into a “wire” completely covered with metallic silver by adding an acidic “developer solution” of hydroquinone and silver ions become.
  • Such a “wire” is shown in FIG. 3d.
  • a second electrical measurement e.g. a second measurement of resistance.
  • the second resistance measurement is used to determine a value for the resistance, which is compared with the reference value.
  • a corresponding output signal is output by the measuring device to the user of the measuring device.
  • FIG. 4 shows a further embodiment of the present method, in which a protein, more precisely a DNA-binding protein such as a transcription factor, for example, is detected as a biopolymer to be detected with the aid of the electrode arrangement 400.
  • the electrode arrangement 400 has an insulating substrate 401, a first layer 402, a silicon nitride layer 403, a first electrode 405 and a second electrode 406.
  • the first electrode 405 and the second electrode 406 are in turn made of gold.
  • the electrode arrangement also forms a trench 304.
  • double-stranded nucleic acid molecules 407 which have a recognition sequence for the DNA-binding protein (FIG. 4 a).
  • the immobilization of the nucleic acid molecules 407 on the two electrodes 405 and 406 takes place via the gold-sulfur coupling.
  • thiol groups are each added to the 3 'termini of nucleic acid 407, which is possible, for example, as described in [9], by enzymatically extending nucleic acid 407 with oligonucleotides that have disulfide groups at the 3' end (cf. Fig. 3).
  • nucleic acid molecule 407 serving as the capture molecule itself via a first and a second oligonucleotide which is attached to the first electrode 405 and to the second electrode 406, i.e. via two further capture molecules to bind to the two electrodes 405 and 406.
  • a first electrical measurement is carried out on the electrodes either before or after immobilization of the DNA probe molecules 407, two of which are not shown in FIG.
  • Electrode connections on the first and second electrodes 405 and 406 and a connected measuring device preferably the resistance or the current flow is determined, and then a reference value, for example for the resistance, is determined in the course of the first electrical measurement and stored in a memory (not shown) is saved.
  • This single strand can be removed in a further biochemical process step, suitable,
  • Single-strand specific nucleases such as nuclease P1, which is mentioned in the exemplary embodiment described with reference to FIG. 3, can be used.
  • nuclease P1 which is mentioned in the exemplary embodiment described with reference to FIG. 3
  • capture molecules 407 to which the protein to be detected 409 is bound remain after this treatment, or, e.g. no such protein was present in the electrolyte 409, no capture molecules 407 (FIG. 4e).
  • Electrode assembly 400 contacted with a reagent to increase the conductivity of macromolecular biopolymers such as silver ions dissolved in an alkaline medium. After binding to the complex of capture molecule 407 and protein 409 to be detected, these are reduced to form a conductivity bridge, as also described above (cf. FIGS. 3d, 3e).
  • a second electrical measurement is carried out, the presence or absence of the protein to be detected being concluded by comparing the measurement value obtained in the process.
  • the method according to this second exemplary embodiment does not only bind proteins such as a DNA Protein can be detected, but also complexes of macromolecular biopolymers such as nucleic acid / protein complexes.

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Abstract

Bei dem Verfahren wird eine Elektrodenanordnung eingesetzt, die eine erste und eine zweite Elektrode aufweist. Bei dem Verfahren wird eine erste elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt. In einem anderen Schritt wird eine zu untersuchende Lösung mit der Elektrodenanordnung in Kontakt gebracht, wobei die Lösung die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthalten kann. In einem weiteren Schritt werden in der zu untersuchenden Lösung enthaltene zu erfassende makromolekulare Biopolymere an den Fängermolekülen auf der ersten und der zweiten Elektrode gebunden und die Elektrodenanordnung wird in Kontakt gebracht mit einem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren, das an die makromolekularen Biopolymere bindet und diesen eine elektrische Leitfähigkeit verleiht. Anschliessend wird eine zweite elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt und die makromolekularen Biopolymere werden abhängig von dem Vergleich der Ergebnisse der zwei elektrischen Messungen an den Elektroden erfasst.

Description

Beschreibung
Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mittels einer Elektrodenanordnung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mittels einer Elektrodenanordnung .
Aus [1] bis [6] sind Verfahren zum Erfassen von DNA-Molekülen bekannt, bei denen zur Erfassung Elektroden bzw. bestimmte Elektrodenanordnungen eingesetzt werden.
Fig.la und Fig.lb zeigen einen solchen (Bio) -Sensor, wie er in [2] beschrieben ist. Der Sensor 100 weist zwei Elektroden 101, 102 aus Gold auf, die in einer Isolatorschicht 103 aus Isolatormaterial eingebettet sind. An die Elektroden 101, 102 sind Elektroden-Anschlüsse 104, 105 angeschlossen, an denen das an der Elektrode 101, 102 anliegende elektrische Potential abgegriffen werden kann. Die Elektroden 101, 102 sind dabei als Planarelektroden angeordnet. Auf jeder Elektrode 101, 102 sind DNA-Sondenmoleküle 106 immobilisiert (vgl. Fig.la). Die Immobilisierung erfolgt gemäß der sogenannten Gold-Schwefel-Kopplung. Auf den Elektroden 101, 102 ist der zu untersuchende Analyt, beispielsweise ein Elektrolyt 107, aufgebracht.
Sind in dem Elektrolyten 107 DNA-Stränge 108 mit einer Sequenz enthalten, die zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle komplementär ist, so hybridisieren diese DNA-Stränge 108 mit den DNA-Sondenmolekülen 106 (Fig.lb) .
Eine Hybridisierung eines DNA-Sondenroleküls 106 und eines DNA-Strangs 108 findet nur dann statt, wenn die Sequenzen des jeweiligen DNA-Sondenmoleküls 106 und des entsprechenden DNA- Strangs 108 zueinander komplementär sind. Ist dies nicht der Fall, so findet keine Hybridisierung statt. Somit ist ein DNA-Sondenmolekül einer vorgegebenen Sequenz jeweils nur in der Lage einen bestimmten, nämlich den DNA-Strang mit jeweils komplementärer Sequenz zu binden, d.h. zu hybridisieren.
Durch die Hybridisierung verändert sich bei dem vorstehend beschriebenen Sensor die Kapazität zwischen den Elektroden. Diese Änderung der Kapazität wird als Messgröße für die Erfassung von DNA-Molekülen herangezogen.
Aus [7] ist eine weitere Vorgehensweise zum Untersuchen des Elektrolyten hinsichtlich der Existenz eines DNA-Strangs mit vorgegebener Sequenz bekannt. Bei dieser Vorgehensweise werden die DNA-Stränge mit der gewünschten Sequenz markiert und deren Existenz wird aufgrund der Reflexionseigenschaften der markierten Moleküle bestimmt. Hierzu wird Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich auf den Elektrolyten gestrahlt und das von dem Elektrolyten, insbesondere von dem nachzuweisenden DNA-Strang, reflektierte Licht wird erfasst. Aufgrund des Reflexionsverhaltens, d.h. insbesondere aufgrund der erfassten, reflektierten Lichtstrahlen wird bestimmt, ob der nachzuweisende DNA-Strang mit der entsprechend vorgegebenen Sequenz in dem Elektrolyten enthalten ist oder nicht.
Diese Vorgehensweise ist sehr aufwendig, da eine sehr genaue Kenntnis über das Reflexionsverhalten des entsprechenden markierten DNA-Strangs erforderlich ist und,weiterhin eine Markierung der DNA-Stränge vor Beginn des Verfahrens notwendig ist. Weiterhin ist eine sehr genaue Justierung des
Erfassungsmittels zum Erfassen der reflektierten Lichtstrahlen erforderlich, damit die reflektierten Lichtstrahlen überhaupt erfasst werden können.
Somit ist diese Vorgehensweise teuer, kompliziert sowie gegen Störeinflüsse sehr empfindlich, wodurch das Messergebnis sehr leicht verfälscht werden kann.
Ferner ist es aus der Affinitätschromatographie (vgl. [8]) bekannt, immobilisierte niedermolekulare Moleküle, insbesondere Liganden hoher Spezifität und Affinität, zu verwenden, um Peptide und Proteine, z.B. Enzyme, im Analyt spezifisch zu binden.
Schließlich ist aus [9] bekannt, DNA als Vorlage (Template) für die Ausbildung eines leitenden Silberdrahts zwischen zwei
Elektroden zu verwenden, indem Silber-Ionen an der DNA angelagert und anschließend zu metallischem Silber reduziert werden. Dieses Verfahren wird auch aus [11] beschrieben.
Ferner ist aus [12] ein Verfahren und eine Vorrichtung uzr Identifikation einer Biopolymersequenz auf Festkörperoberflächen bekannt. Dabei wird ein erstes auf einem Festkörpersubstrat aufgebrachtes Biopolymer mit einem dazu affinen zweiten Biopolymer in Kontakt gebracht.
Aus [13] ist noch ein Affinitätssensor für den Nachweis spezifischer molekularer Bindungsereignisse bekannt, der insbesondere z.B. bei DNA-Mikroarray-Tests Anwendung finden soll.
Die vorstehend aus [1] bis [8] bekannten Nachweisverfahren haben den Nachteil, dass sie relativ große Mengen an nachzuweisenden makromolekularen Biopolymeren benötigen, d.h. dass ihre Nachweisempfindlichkeit relativ gering ist.
Der Erfindung liegt das Problem zugrunde, ein alternatives Verfahren zum Erfassen makromolekularer Biopolymere anzugeben, das einfach konzipiert ist und eine hohe Nachweisempfindlichkeit besitzt.
Das Problem wird durch das Verfahren mit den Merkmalen gemäß dem unabhängigen Patentanspruch gelöst.
Bei einem Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren wird eine Elektrodenanordnung eingesetzt, die eine erste und eine zweite Elektrode aufweist.
Dabei wird sowohl die erste Elektrode als auch die zweite Elektrode mit Fängermolekülen versehen, die makromolekulare Biopolymere binden können. Diese Fängermoleküle können Moleküle einer einzigen Art oder auch Moleküle einer ersten und einer zweiten Art, d.h. Fängermoleküle unterschiedlicher
Art, sein.
Bei dem Verfahren wird ferner eine erste elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt. In einem weiteren Schritt wird eine zu untersuchende Lösung mit der Elektrodenanordnung in Kontakt gebracht, wobei die Lösung die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthalten kann. In einem weiteren Schritt werden in der zu untersuchenden Lösung enthaltene zu erfassende makromolekulare Biopolymere an den Fängermolekülen auf der ersten und der zweiten Elektrode gebunden. Die Elektrodenanordnung wird ferner in Kontakt gebracht mit einem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren, das an die makromolekularen Biopolymere bindet und diesen eine erhöhte elektrische Leitfähigkeit verleiht. Anschließend wird eine zweite elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt und die makromolekularen Biopolymere werden abhängig von dem Vergleich der Ergebnisse der zwei elektrischen Messungen an den Elektroden erfasst.
Anschaulich ausgedrückt beruht das vorliegende Verfahren auf der Erkenntnis, dass im allgemeinen nicht leitfähige oder nur schwach leitfähige makromolekulare Biopolymere durch Anlagerung/Bindung eines Reagenzes, das die Leitfähigkeit der Biopolymere erhöht, elektrisch leitend gemacht werden und die nunmehr leitfähigen nachzuweisenden makromolekularen Biopolymere als eine „Leitfähigkeitsbrücke" zwischen zwei Elektroden eingesetzt werden, wobei diese Leitfähigkeitsbrücke den Stro fluss des zwischen den Elektroden fließenden Stroms beeinflusst. Dadurch, dass die Leitfähigkeitsbrücke, die man auch als einen „molekularen Kurzschluss" zwischen zwei Elektroden verstehen kann, prinzipiell von nur einem einzigen Molekül ausgebildet werden kann, besitzt das vorliegende Verfahren eine höhere Nachweisempfindlichkeit als die bekannten Verfahren, nämlich eine Empfindlichkeit von einem einzigen Moleküls der zu erfassenden makromolekularen Biopolymere.
Aufgrund des vorstehend beschriebenen Prinzips wird bei den elektrischen Messungen an den Elektroden vorzugsweise der Widerstand oder der Stromfluss bestimmt.
Als Fängermolekül kann bei dem hier beschriebenen Verfahren eine einzige Molekülart eingesetzt werden, z.B. eine doppelsträngige Nukleinsäure mit einer definierten Nukleinsäuresequenz . In einer Weiterbildung der Erfindung sind die Fängermoleküle jedoch mindestens erste und zweite
Fängermoleküle, z.B. mindestens zwei Oligonukleotide mit einer sich voneinander unterscheidenden Nukleinsäuresequenz (die daher unterschiedliche Bindungsspezifitäten haben) oder zwei Antikörper, die unterschiedliche Oberflächenbereiche (Epitope) eines makromolekularen Biopolymers binden können. Unter Erfassen wird im Sinne der Erfindung sowohl der qualitative als auch quantitative Nachweis von makromolekularen Biopolymeren in einem zu untersuchenden Analyten verstanden. Dies bedeutet, dass der Begriff "Erfassen" ebenfalls einschließt, die Abwesenheit von makromolekularen Biopolymeren im Analyten festzustellen.
Unter einem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren wird hier ein Reagenz verstanden, das in der Lage ist, an makromolekulare
Biopolymere zu binden, vorzugsweise spezifisch, und das eine Leitfähigkeit für den elektrischen Strom besitzt, die höher ist als die der zu erfassenden makromolekularen Biopolymere.
Ein solches Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit ist vorzugsweise ein im chemischen Sinne reduzierbares Reagenz, d.h. ein Reagenz, das Elektronen abgegeben kann, wodurch sich die Oxidationsstufe zumindest eines der Atome des Reagenzes erniedrigt. In diesem Fall enthält das Reagenz vorzugsweise Metall-Ionen, die nicht nur chemisch reduzierbar sind und an makromolekulare Biopolymere binden können, sondern des weiteren in für makromolekulare Biopolymere geeigneten Lösungsmitteln leicht lösbar sind. Beispiele solcher Metall- Ionen sind Silber-, Gold-, Kupfer- oder Nickel-Ionen oder Mischungen davon, die als Kationen an negativ geladene
Gruppen auf der Oberfläche von makromolekularen Biopolymeren durch elektrostatische Wechselwirkung binden können. Im Falle von Nukleinsäuren als den zu erfassenden Biopolymeren werden solche Kationen an das negativ geladene Phosphat-Rückgrat der Nukleinsäuren gebunden. Sollen Proteine erfasst werden, kann die Bindung solcher Kationen über die Seitenketten von sauren Aminosäuren wie Aspartat oder Gluta at erfolgen.
Eine andere Art des Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit stellen lösliche den elektrischen Strom leitende Polymere oder Oligomere dar, die im leitenden Zustand positiv geladen sind. Beispiele für solche Reagenzien sind geeignet substituierte Polypyrrole, Polythiophene oder Oligothiophene (beispielsweise mit 2 bis 10 Thiophen-Einheiten, zum Beispiel 6 Thiophen-Einheiten) . Substituenten, die die Löslichkeit dieser Polymere oder Oligomere in mit makromolekularen Biopolymeren kompatiblen Lösungsmittel, vorzugsweise in wässrigen Medien, vermitteln, sind beispielsweise Sulfonsäure- oder Carbonsäuregruppen, die über Alkylen- Einheiten an das aromatische Grundgerüst verknüpft sind. Bei Polypyrrolen erfolgt die Substitution vorzugsweise über die 3-Position des aromatischen Rings. Bei diesen Reagenzien erfolgt die Anlagerung an die nachzuweisenden makromolekularen Biopolymere vorzugsweise über elektrostatische Wechselwirkungen mit geladenen Gruppen oder Resten der Biopolymere. Im Fall von Nukleinsäuren als nachzuweisendes Biopolymer ist jedoch auch vorstellbar, dass die Bindung des Reagenzes zur Erhöhung der Leitfähigkeit auch durch Interaktionen mit anderen Bereichen der Nukleinsäure wie z.B. der kleinen Furche der Nukleinsäuren erfolgen kann.
Bei Verwendung eines reduzierbaren Reagenzes wie beispielsweise Silber-Ionen wird bei dem hier beschriebenen Verfahren die Elektrodenanordnung mit einem Reduktionsmittel in Kontakt gebracht, das das (an die makromolekularen Biopolymere gebundene) Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit reduziert. Für die Reduktion können bekannte und gängige organische bzw. anorganische Reduktionsmittel wie Hydrochinon bzw. Hydrogensulfit verwendet werden. Werden dagegen die vorstehend genannten leitenden Polymere oder Oligomere, eingesetzt, ist keine chemische Reduktion des Reagenzes zur Erhöhung der Leitfähigkeit notwendig, da das Reagenz in seiner bindungsfähigen Form bereits den elektrischen Strom leitet .
An dieser Stelle sei angemerkt, dass es bei dem hier offenbarten Verfahren nicht nur möglich ist, die
Elektrodenanordnung nach der Immobilisierung der zu erfassenden makromolekularen Biopolymere mit dem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren in Kontakt zu bringen. Vielmehr ist es auch möglich, die zu untersuchende Lösung zuerst mit dem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit in Kontakt zu bringen und danach die zu erfassenden Biopolymere an die Elektroden zu binden, d.h. zu immobilisieren.
Bei dem Verfahren können als makromolekulare Biopolymere Nukleinsäuren, Oligonukleotide, Proteine, Peptide oder Komplexe davon, d.h. beispielsweise Komplexe aus Nukleinsäuren und Proteinen, erfasst werden.
Genauer gesagt werden unter makromolekularen Biopolymeren hier zum einen Nukleinsäuren wie DNA und RNA-Moleküle oder auch kleinere Nukleinsäuremoleküle wie Oligonukleotide mit einer Länge von beispielweise ca. 10 bis 40 Basenpaaren (bp) verstanden. Die Nukleinsäuren können dabei doppelsträngig sein, jedoch auch zumindest einzelsträngige Bereiche aufweisen oder, zum Beispiel durch vorangehende thermische Denaturierung oder einer anderen Art der Strangtrennung für ihren Nachweis, insgesamt als Einzelstränge vorliegen. Die Sequenz der zu erfassenden Nukleinsäuren kann dabei zumindest teilweise oder auch vollständig vorgegeben, d.h. bekannt sein. Weitere hier erfassbare makromolekulare Biopolymere sind Proteine oder Peptide. Diese können aus den üblicherweise in Proteinen vorkommenden 20 Aminosäuren aufgebaut sein, aber auch natürlich nicht vorkommende Aminosäuren enthalten oder z.B. durch Zuckerreste (Oligosaccharide) modifiziert sein oder post-translationale Modifikationen enthalten. Ferner können auch Komplexe aus
Nukleinsäuren und Proteinen erfasst werden, wie sie zum Beispiel von einem DNA- (spezifisch) bindenden Protein wie einem Translationsfaktor mit einem DNA-Molekül, das die entsprechende Erkennungssequenz besitzt, gebildet werden. Sollen als makromolekulare Biopolymere Proteine oder Peptide erfasst werden, so stellen die (auf den Elektroden befindlichen) Fängermoleküle bevorzugt Liganden mit einer Bindungsaktivität für die zu erfassenden Proteine oder
Peptide dar. Dadurch können die nachzuweisenden Proteine oder Peptide an die Elektroden binden, auf der die entsprechenden Liganden angeordnet sind. Die Fängermoleküle/Liganden sind ihrerseits vorzugsweise durch kovalente Bindungen mit den Elektroden verknüpft.
Als Liganden für Proteine und Peptide kommen niedermolekulare Enzymagonisten oder Enzymantagonisten, Pharmazeutika, Zucker oder Antikörper oder irgendein Molekül in Betracht, das die Fähigkeit besitzt, Proteine oder Peptide spezifisch zu binden.
Wenn Nukleinsäuren oder Oligonukleotide mit dem hier beschriebenen Verfahren erfasst werden, können sie sowohl in einzelsträngiger als auch in doppelsträngiger Form vorliegen.
Vorzugsweise werden als Fängermoleküle für Nukleinsäuren DNA- Sondenmoleküle eingesetzt, weshalb dann die Nukleinsäuren zumindest einen der Hybridisierung zugänglichen einzelsträngigen Bereich aufweisen. Vorzugsweise werden DNA- Sondenmoleküle mit einer zu dem einzelsträngigen Bereich (vollständig) komplementären Sequenz verwendet. Die DNA- Sondenmoleküle können dabei Oligonukleotide sein oder auch längere Nukleotidsequenzen aufweisen, solange diese keine der intermolekularen Strukturen ausbilden, die eine Hybridisierung des Sondenmoleküls mit der zu erfassenden
Nukleinsäure verhindern. Allerdings ist es auch möglich, DNA- oder RNA-bindende Proteine oder Agenzien als Fängermolekül einzusetzen. Ein Problem bei der Erfassung von makromolekularen Biopolymeren stellt die Tatsache dar, dass die nachzuweisenden Biopolymere üblicherweise in keinem Bereich ihrer Sekundär- und/oder Tertiärstruktur identisch sind. So weisen z.B. Polypeptide und Proteine im Prinzip an jeder Stelle/ jedem Bereich (der Oberfläche) eine unterschiedliche und einzigartige räumliche Struktur auf. Nachzuweisende Nukleinsäuren besitzen in der Regel an ihren beiden Termini (d.h. dem 3X- Terminus und dem 5'- Terminus) eine unterschiedliche Basensequenz .
Zur Lösung dieses Problems sind bei einer Ausgestaltung des hier beschriebenen Verfahrens die eingesetzten Fängermoleküle mindestens erste und zweite Fängermoleküle. Dabei sind die ersten Fängermoleküle in der Lage, einen ersten Bereich eines zu erfassenden Biopolymers (spezifisch) zu binden, und die zweiten Fängermoleküle sind in der Lage, einen zweiten Bereich eines zu erfassenden Biopolymers (spezifisch) zu binden. Auf diese Weise wird die Ausbildung der hier beschriebenen Leitfähigkeitsbrücke gewährleistet.
Unter dem Begriff „Bereich eines zu erfassenden makromolekularen Biopolymers" wird im Sinne der Erfindung sowohl ein Bereich verstanden, der, wie im Falle von Proteinen eine spezielle dreidimensionale (räumliche) Struktur aufweist, oder wie im Falle von Nukleinsäuren, die prinzipiell eine gleiche oder sehr ähnliche dreidimensionale Struktur einnehmen können, eine sich von den anderen Bereichen unterscheidende Nukleotidsequenz besitzt. Folglich können die Fängermoleküle z.B. zwei Antikörper sein, die jeweils ein spezielles Epitop des zu erfassenden Proteins erkennen, oder ein Antikörper, der ein Epitop auf dem zu erfassenden Protein erkennt und ein Peptid, das in das
(räumlich entfernte) aktive Zentrum des Proteins bindet, oder zwei Oligonukleotide mit einer bestimmten Sequenz, die jeweils zu der Nukleotidsequenz einer der beiden Termini komplementär ist.
Vorzugsweise sind bei dieser Ausgestaltung des Verfahrens die zumindest ersten und zweiten Fängermoleküle jeweils homogen verteilt, d.h. in einer gleichförmigen Verteilung, auf den beiden Elektroden aufgebracht. Dadurch wird erreicht, dass die makromolekularen Biopolymere unabhängig von der Orientierung, die sie in der zu erfassenden Lösung aufweisen, mittels der Fängermoleküle an die Elektroden gebunden werden. Diese gleichförmige Verteilung kann z.B. dadurch erreicht werden, dass zunächst eine Mischung der Fängermoleküle hergestellt werden und diese Mischung dann auf die Elektroden aufgebracht werden.
Zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens kann prinzipiell jede im Bereich der Biosensorik bekannte Elektrodenanordnung verwendet werden. Beispielsweise kann die Elektrodenanordnung aus einem üblichen Substrat, das z.B. Silizium oder Galliumarsenid aufweist, bestehen, auf das zuerst eine Goldschicht und eine Siliziumnitridschicht aufgebracht worden ist, und das danach mittels konventioneller Lithographie- und Ätztechniken zur Erzeugung der Elektrodenanordnung (en) strukturiert worden ist.
Bei der Strukturierung kann der Abstand zwischen den beiden Elektroden variabel gestaltet werden, je nach Art der verwendeten Strukturierungstechnik und der Art der zu erfassenden Makromoleküle. Im allgemeinen beträgt der Abstand zwischen den Elektroden ca. 5 Nanometer (nm) bis 100 oder mehrere 100 Nanometer. Kleinere Abstände im Bereich von ca. 5 nm bis ca. 30 oder 40 nm sind dabei zum Nachweis kleinerer
(kürzerer) Biopolymere bevorzugt, selbst wenn die Erzeugung solcher Abstände z.B. mittels lithographischer oder Dotierungs-Verfahren zur Zeit technologisch aufwendiger ist als die von Abständen im Bereich von ca. 100 nm bis einige
100 nm.
Ist die dreidimensionale Struktur des nachzuweisenden makromolekularen Biopolymers bekannt, kann der vorzugsweise zu verwendende Elektrodenabstand anhand der Größe des Biopolymers abgeschätzt werden. Beispielsweise kann bei Nukleinsäuren, deren 3D-Struktur im allgemeinen bekannt ist, ausgehend von der bekannten helicalen Ganghöhe von idealer A-,B-, und Z-DNA (vgl. [10]), die z.B. für B-DNA 0,34 nm pro helicale Windung und Basenpaar beträgt, näherungsweise angenommen werden, dass 10 Basenpaare (bp) einen Abstand von 3 , 4 nm überbrücken und somit der Abstand zwischen den Elektroden abgeschätzt werden.
Für die Erfassung einer Nukleinsäure, die eine Länge von 50 bp entsprechend ca. 17 nm aufweist, mit Oligonukleotiden als Fängermolekül, die bei einer Länge von insgesamt je 20 bp eine jeweils komplementäre Sequenz von 15 bp besitzen, sollte der Elektrodenabstand ca. 17 nm + 2-5-0,34 = ca. 21,4 nm betragen. Hierbei sei darauf hingewiesen, dass es nicht erforderlich ist, zur Erfassung eines hier genannten Biopolymers den Elektrodenabstand durch die Strukturierung anzupassen. Es ist vielmehr zum Beispiel auch möglich, die von den zu erfassenden makromolekularen Biopolymere zu überbrückende Distanz und somit den Elektrodenabstand zu verändern, in dem die Länge der Fängermoleküle variiert wird. So können die Fängermoleküle ggf. verlängert oder verkürzt werden. Werden Nukleinsäuren oder Oligonukleotide als
Fängermoleküle verwendet, bietet sich zum Beispiel eine
Verlängerung dieser Fängermoleküle durch zusätzliche
Nukleotide an, da auch sie (diese Fängermoleküle) leitfähige Reagenzien wie Metall-Kationen im wesentlich gleichen Ausmaß wie zu erfassende Biopolymere binden können. Es ist daher möglich, bei dem vorliegenden Verfahren den (optimalen)
Elektrodenabstand rein empirisch ohne Kenntnis der 3- di ensionalen Ausdehnung des nachzuweisenden makromolekularen Biopolymers zu ermitteln.
In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, dass es auch möglich ist, Fängermoleküle zu verwenden, die an sich keine ausreichende Leitfähigkeit besitzen, jedoch durch Modifikationen leitfähig gemacht werden. Beispielweise kann bei einem Hormon als eigentlichem Fängermoleküle ein negativ geladener Spacer zur Bindung des Hormons an die Elektroden benutzt werden.
Mit Hilfe des hier offenbarten Verfahrens ist es selbstverständlich möglich, nicht nur eine einzige Art von Biopolymeren in einer einzelnen Messreihe zu erfassen. Vielmehr können mehrere makromolekulare Biopolymere gleichzeitig oder auch nacheinander erfasst werden. Dazu muss lediglich ein Substrat verwendet werden, das mehrere
Elektrodenanordnungen mit jeweils zwei Elektroden, d.h. einem Elektrodenpaar, aufweist. Auf jedem dieser Elektrodenpaare werden dann jeweils unterschiedliche Fängermoleküle gebunden, von denen jedes (spezifische) Bindungsaffinität für ein bestimmtes zu erfassendes Biopolymer aufweist. Es können auch mehrere Elektrodenpaare eingesetzt werden, wobei jedes Paar nur mit ein Fängermolekül bzw. mindestens ersten und zweiten Fängermoleküle versehen wird, die spezifisch eines der zu erfassenden Biopolymere bindet.
Für die Durchführung des hier beschriebenen Verfahrens kann als Elektrodenanordnung beispielsweise eine konventionelle Interdigitalelektrode verwendet werden. Für eine Paralleloder MehrfachbeStimmung kann folglich ein mit mehreren Interdigitalelektroden, d.h. einem Elektrodenarray, versehener Biosensor eingesetzt werden. Ein weitere einsetzbare Elektrodenanordnung stellt eine
Elektrodenanordnung in Form eines Grabens bzw. einer Kavität dar. Diese wird zum Beispiel dadurch gebildet, dass auf zwei gegenüberliegenden Seitenwände sich Halte-Bereiche wie z.B. eine Goldschicht befinden, auf denen die Fängermoleküle, die die makromolekularen Biopolymere binden können, immobilisiert werden.
Bei dem vorliegenden Verfahren wird in einem ersten Verfahrensschritt eine erste elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt. Dabei können bei dieser ersten Messung die Fängermoleküle schon auf dem Mittel zur Immobilisierung angebracht sein, müssen es aber noch nicht. Zum Aufbringen der Fängermoleküle kann jede für diesen Zweck bekannte Technik verwendet werden. Wenn eine Mehrfachbestimmung durchgeführt werden soll, kann das
Aufbringen der Fängermoleküle z.B. mit Hilfe von Tintenstrahl-Drucktechniken geschehen .
Ein Medium, beispielsweise ein Elektrolyt, wird mit der Elektrodenanordnung in Kontakt gebracht. Dies erfolgt in der
Weise, dass die makromolekularen Biopolymere an die Fängermoleküle binden können. Für den Fall, dass sich in dem Medium mehrere zu erfassende makromolekulare Biopolymere befinden, werden die Bedingungen so gewählt, dass diese jeweils zur gleichen Zeit oder nacheinander an ihre entsprechende Fängermolekül binden können.
Nachdem eine ausreichende Zeitdauer gewartet worden ist, damit die makromolekularen Biopolymere an das entsprechende Fängermolekül bzw. die entsprechenden Fängermoleküle binden konnten, können nicht gebundene Fängermoleküle von den Elektroden, auf den sie sich befinden, entfernt werden.
Für den Fall, dass die Fängermoleküle Nukleinsäure (DNA) - Stränge sind, erfolgt dies beispielsweise enzymatisch mittels eines Enzyms, das selektiv einzelsträngige DNA abba t. Hierbei ist die Selektivität des abbauenden Enzyms für einzelsträngige DNA zu berücksichtigen. Besitzt das für den Abbau nicht-hybridisierter DNA-Einzelstränge ausgewählte Enzym diese Selektivität nicht, so wird möglicherweise auch die zu erfassende, hybridisierte doppeisträngige DNA unerwünschterweise ebenfalls abgebaut.
Insbesondere können zum Entfernen der nicht gebundenen DNA- Sondenmoleküle von der jeweiligen Elektrode DNA Nukleasen, beispielsweise eine Nuklease aus Mung-Bohnen, die Nuklease Pl oder die Nuklease Sl verwendet werden. Gleichfalls können DNA-Polymeräsen, die aufgrund ihrer
5 ' -_► 3' Exonukleaseaktivität oder ihrer
3'-^ 5' Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige
DNA abzubauen, verwendet werden.
Für den Fall, dass die Fängermoleküle niedermolekulare
Liganden sind, lassen sich diese, falls ungebunden, auch enzymatisch entfernen. Hierzu sind die Liganden über eine enzymatisch spaltbare
Verbindung kovalent mit den Elektroden verbunden, beispielsweise über eine Esterverbindung.
In diesem Falle kann beispielsweise eine Carboxylester- Hydrolase (Esterase) eingesetzt werden, um ungebundene Ligandenmoleküle zu entfernen. Dieses Enzym hydrolysiert diejenige Esterverbindung zwischen der Elektrode und dem jeweiligen Ligandenmolekül, das nicht von einem Peptid oder Protein gebunden wurde. Dagegen bleiben die Esterverbindungen zwischen der Elektrode und denjenigen Molekülen, die eine Bindungswechselwirkung mit Peptiden oder Proteinen eingegangen sind, aufgrund der verminderten sterischen Zugänglichkeit, die durch die Raumerfüllung des gebundenen Peptids oder Proteins eintritt, unversehrt.
Das Entfernen der nicht gebundenen Fängermoleküle ist optional. Es kann jedoch den Vorteil besitzen, dass das erhaltene Messsignal z.B. nicht von Fängermolekülen beeinflusst wird, die (wie Oligonukleotide) ebenfalls in der Lage sind, Reagenzien zur Erhöhung der Leitfähigkeit der makromolekularen Biopolymere wie reduzierbare Metall-Kationen zu binden .
Entweder vor oder nach dem Entfernen nicht gebundener
Fängermoleküle wird die Elektrodenanordnung mit einem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren in Kontakt gebracht, das an die makromolekularen Biopolymere bindet und diesen eine elektrische Leitfähigkeit verleiht. Dabei wird ebenfalls für eine ausreichende
Zeitdauer gewartet, damit das Reagenz an die makromolekularen Biopolymere binden kann. Falls das Reagenz noch in einer Form vorliegt, die noch nicht die Leitfähigkeit der makromolekularen Biopolymere in dem gewünschten Maße erhöht (wie dies bei Metall-Kationen wie Ag+ oder Au+ der Fall ist) , kann in einem weiteren Verfahrensschritt diese noch nicht ausreichend leitfähige
Form in einer solche leitfähige Form (z.B. metallisches
Silber oder Gold) umgewandelt werden.
Anschließend wird eine zweite elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt wird. Die ermittelten Werte aus der • ersten und der zweiten elektrischen Messung werden dann miteinander verglichen. Wenn die gemessenen Werte der herangezogene Messgröße sich in einer Weise unterscheiden, dass die Differenz der ermittelten Werte größer ist als ein vorgegebener Schwellenwert, so wird angenommen, dass makromolekulare Biopolymere an Fängermoleküle bzw. allgemein an die Elektroden gebunden haben und dadurch die Veränderung der Intensität des am Empfänger empfangenen Signals verursacht worden ist.
Ist die Differenz zwischen den Werten der ersten und der zweiten elektrischen Messung größer als der vorgegebene Schwellenwert, so wird als Ergebnis ausgegeben, dass die entsprechenden, ein Fängermolekül spezifisch bindenden makromolekularen Biopolymere gebunden worden sind und somit, dass die entsprechenden makromolekularen Biopolymere in dem Medium enthalten waren.
Auf diese Weise sind die makromolekularen Biopolymere erfasst worden.
Das Verfahren kann so ausgestaltet werden, dass gleichzeitig eine Referenzmessung und eine Messung zur Erfassung von makromolekularen Biopolymeren durchgeführt wird. Dies geschieht zum Beispiel in der Weise, dass eine
Referenzmessung nur mit dem Medium durchgeführt wird, und zugleich eine Messung mit der Medium, das die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthält (oder auch nicht) , wenn z.B. ein qualitativer Nachweis gewünscht ist.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Figuren dargestellt und werden im weiteren näher erläutert.
Es zeigen
Figuren la und lb eine Skizze zweier Planarelektroden, mittels derer die Existenz zu erfassender DNA-Stränge in einem Elektrolyt (Figur la) bzw. deren Nicht¬
Existenz (Figur lb) nachgewiesen werden können;
Figur 2 eine Skizze einer Elektrodenanordnung, die zur
Durchführung des Verfahren der Erfindung verwendet werden kann;
Figuren 3a bis 3d unterschiedliche Verfahrenszustände eines
Verfahren zur Erfassung von Nukleinsäuren gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung;
Figuren 4a bis 4e unterschiedliche Verfahrenszustände eines Verfahren zur Erfassung von Proteinen gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Fig.2 zeigt in einer Schnittansicht eine grabenförmige Elektronenanordnung 200, die für das hier offenbarte Verfahren verwendet werden kann. Bei dieser
Elektrodenanordnung 200 sind auf einem isolierenden Substrat 201, z.B. einem Siliziumoxid-Substrat , eine Goldschicht 202 und eine Siliziumnitrid 203 aufgebracht. Durch Strukturierung, z.B. mittels eines gängigen chemischen
Ätz erfahrens, wird die Grabenform 204 gebildet, wobei das
Elektrodenpaar aus der ersten Elektrode und der zweiten
Elektrode durch die gegenüberliegenden Seitenwände 205 und 206 ausgebildet wird. Die erste Elektrode 205 ist mit einem ersten elektrischen Anschluss 207 und die zweite Elektrode ist mit einem zweiten elektrischen Anschluss 208.versehen. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass ein für eine
Mehrfachmessung geeigneter Sensor beispielsweise eine Mehrzahl von parallel angeordneten Gräben aufweisen kann.
Fig.3a zeigt einen Ausschnitt aus einer Elektrodenanordnung 300 mit einem isolierenden Substrat 301, einer ersten Schicht 302, einer Siliziumnitridschicht 303, einer ersten Elektrode 305 und einer zweiten Elektrode 306, wobei die erste Elektrode 305 und die zweite Elektrode 306 aus Gold hergestellt sind. Die Elektrodenanordnung bildet einen Graben 304.
Alternativ können die Elektroden 305 und 306 auch aus Siliziumoxid hergestellt sein. Diese können mit einem Material beschichtet werden, das geeignet ist, die Fängermoleküle darauf zu immobilisieren.
Beispielsweise können bekannte Alkoxysilanderivate verwendet werden wie
• 3-Glycidoxypropylmethyloxysilan,
• 3-Acetoxypropyltrimethoxysilan,
• 3-Aminopropyltriethoxysilan, • 4- (Hydroxybutyramido)propyltriethoxysilan,
• 3-N,N-bis (2-hydroxyethyl) aminopropyltriethoxysilan, oder andere artverwandte Materialen, die imstande sind, mit ihrem einen Ende eine kovalente Bindung mit der Oberfläche des Siliziumoxids einzugehen und mit ihrem anderen Ende dem zu immobilisierenden Sondenmolekül eine chemisch reaktive Gruppe wie einen Epoxy- , Acetoxy-, Amin- oder Hydroxylrest zur Reaktion anzubieten.
Reagiert ein zu immobilisierendes Fängermolekül mit einer solchen aktivierten Gruppe, so wird es über das gewählte Material als eine Art kovalenter Linker auf der Oberfläche der Beschichtung auf der Elektrode immobilisiert.
Auf den immobilisierten Bereichen der Elektroden 305, 306 sind als Fängermoleküle DNA-Sondenmoleküle 307, 308 aufgebracht. Bei den hier gezeigten Goldelektroden erfolgt die Immobilisierung z.B. über die Gold-Schwefel-Kopplung.
Auf der ersten Elektrode 305 sind erste DNA-Sondenmoleküle 307 aufgebracht, wobei deren Nukleotidsequenz komplementär ist zu einer vorgegebenen ersten DNA-Sequenz einer zu erfassenden Nukleinsäure . Auf der zweiten Elektrode 306 sind zweite DNA-Sondenmoleküle 308 aufgebracht, wobei deren Nukleotidsequenz komplementär ist zu einer vorgegebenen zweiten DNA-Sequenz der zu erfassenden Nukleinsäure. Somit stellt diese Ausführungsform ein Beispiel dar, bei der erste und zweite Fängermoleküle mit unterschiedlicher Spezifität eingesetzt werden.
Entweder vor oder nach der Immobilisierung der DNA- Sondenmoleküle wird eine erste elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt. Dabei wird mittels zwei in Fig.3 nicht dargestellter Elektrodenanschlüsse an der ersten und zweiten Elektrode 305, 306 und eines angeschlossenen Messgeräts (ebenfalls nicht dargestellt) vorzugsweise der
Widerstand oder der Stromfluss bestimmt. Im Rahmen der ersten elektrischen Messung wird ein Referenzwert, z.B. für den Widerstand, ermittelt und in einem Speicher (nicht dargestellt) gespeichert.
An die Pyrimidinbasen Adenin (A) , Guanin (G) , Thymin (T) , oder Cytosin (C) , können jeweils zu den Sequenzen der Sondenmoleküle komplementäre Sequenzen von DNA-Strängen in der üblichen Weise, d.h. durch Basenpaarung über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen A und T bzw. zwischen C und G, hybridisieren.
Fig.3a zeigt ferner ein Elektrolyten 309, der mit den Elektroden 305, 306 und den DNA-Sondenmolekülen 307, 308 in Kontakt gebracht wird.
Fig.3b zeigt die Elektrodenanordnung 300 für den Fall, dass in dem Elektrolyt 309 ein DNA-Molekül 310 enthalten ist, das eine vorgegebene ersten Sequenz und eine vorgegebene zweite Sequenz aufweist, die jeweils komplementär zu der Sequenz des ersten DNA-Sondenmoleküls 307 bzw. des zweiten DNA-Moleküls 308 ist. Das DNA-Molekül kann dabei einzelsträngig sein, wie in Fig.3 angedeutet, oder doppeisträngig.
Aufgrund der Sequenzspezifität der Basenpaarung hybridisiert in diesem Fall der zu erfassende DNA-Strang 310 (das zu erfassende DNA-Molekül) an das erste DNA-Sondenmolekül 307 über die erste vorgegebene Sequenz und an das zweite DNA- Sondenmolekül 308 über die zweite vorgegebene Sequenz. Die Hybridisierung kann dabei spontan erfolgen, im Falle von doppelsträngig vorliegenden Nukleinsäuremolekülen 310 aber auch z.B. durch thermische Denaturierung oder durch Induktion einer Fluidbewegung senkrecht zu den Elektroden, wie in [9] beschrieben, bewirkt werden.
Wie aus Fig.3b ersichtlich ist, ist das Resultat nach erfolgter Hybridisierung die Ausbildung einer DNA- „Brücke" zwischen den Elektroden.
In einem optionalen Schritt wird mittels eines biochemischen Verfahrens, beispielsweise mittels Zugabe von DNA-Nukleasen zu dem Elektrolyt 309, ein Hydrolysieren von nicht hybridisierten Einzelstrang-DNA-Sondenmoleküle 307 oder 308 (vgl. Fig.3b) bewirkt. Soll einzelsträngige DNA erfasst werden, sollte allerdings auf diesen Schritt verzichtet werden, wenn dadurch die Möglichkeit besteht, dass der zu erfassende Einzelstrang 310 ebenfalls abgebaut wird.
Bei der Entfernung nicht hybridisierter Fängermoleküle ist die Selektivität des abbauenden Enzyms für einzelsträngige DNA zu berücksichtigen. Besitzt das für den Abbau nicht- hybridisierter DNA-Einzelstränge ausgewählte Enzym diese Selektivität nicht, so wird möglicherweise auch die zu erfassende, hybridisierte doppelsträngige DNA unerwünschterweise abgebaut, was zu einer Verfälschung des Messergebnisses führen würde.
Nach Entfernen der Einzelstrang-DNA-Sondenmoleküle, d.h. der ersten DNA-Sondenmoleküle 307 auf der ersten Elektrode 305 und der zweiten DNA-Sondenmoleküle 308 auf der zweiten Elektrode 102 sind lediglich die mit dem zu erfassenden DNA- Molekül hybridisierten DNA-Stränge 307 und 308 vorhanden (vgl. Fig.3c) .
Beispielsweise kann zum Entfernen der einzelsträngigen DNA- Sondenmoleküle 306 und 307 auf den beiden Elektroden einer der folgenden Stoffe beigegeben werden:
• Nuklease aus Mung-Bohnen, • Nuklease Pl, oder
• Nuklease Sl.
DNA-Polymerasen, die aufgrund ihrer 5 ' - 3' Exonukleaseaktivität oder ihrer 3 ' -> 5 ' Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige DNA abzubauen, können zu diesem Zweck ebenfalls verwendet werden .
Nach oder auch ggf. vor diesem Abbauschritt wird die Elektrodenanordnung 300 in Kontakt gebracht mit einem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren, das an die makromolekularen Biopolymere bindet und diesen eine elektrische Leitfähigkeit verleiht. Dieses Reagenz sind beispielsweise in alkalischem Medium gelöste Silber-Ionen 311, wie in [9] beschrieben. Die in Fig.3c dargestellte resultierende Bindung der Silber-Ionen 311 an die DNA-Moleküle erfolgt durch den Austausch der an das Phosphat-Rückgrat gebundenen Natrium-Ionen.
Zur Ausbildung der Leitfähigkeitsbrücke werden schließlich die an die DNA-Moleküle gebundenen Silber-Ionen 311 reduziert. Dazu können, wie in [9] beschrieben, mittels einer basischen Hydrochinonlösung zuerst kleine Silberkeime an der DNA gebildet werden und anschließend die DNA zu einem vollständig mit metallischen Silber bedeckten „Draht" durch Zugabe einer sauren „Entwicklerlösung" aus Hydrochinon und Silber-Ionen umgewandelt werden. Ein solcher „Draht" ist in Fig.3d gezeigt.
Unter Verwendung der oben genannten, nicht dargestellten Elektrodenanschlüsse und des angeschlossenen Messgeräts (ebenfalls nicht dargestellt) erfolgt gemäß diesem ersten Ausführungsbeispiel dann eine zweite elektrische Messung, z.B. eine zweite Messung des Widerstands. Mittels der zweiten Widerstandsmessung wird ein Wert für den Widerstand ermittelt, der mit dem Referenzwert verglichen wird.
Ist der Differenzwert zwischen diesen Widerstandswerten größer als ein vorgegebener Schwellenwert, so bedeutet dies, dass in dem Elektrolyt 309 ein DNA-Strang enthalten war.
In diesem Fall wird ein entsprechendes Ausgangssignal von dem Messgerät dem Benutzer des Messgeräts ausgegeben.
Fig.4 zeigt eine weitere Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens, bei der mit Hilfe der Elektrodenanordnung 400 ein Protein, genauer gesagt ein DNA bindendes Protein wie beispielsweise ein Transkriptionsfaktor, als nachzuweisendes Biopolymer erfasst wird. Die Elektrodenanordnung 400 weist ein isolierendes Substrat 401, eine erste Schicht 402, eine Siliziumnitridschicht 403, eine erste Elektrode 405 und eine zweite Elektrode 406 auf. Die erste Elektrode 405 und die zweite Elektrode 406 sind wiederum aus Gold hergestellt. Die Elektrodenanordnung bildet ebenfalls eine Graben 304 aus.
Bei dieser Ausführungsform wird nur eine einzige Art von Fängermolekül verwendet, nämlich doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle 407, die eine Erkennungssequenz für das DNA bindende Protein aufweisen (Fig.4a) .
Die Immobilisierung der Nukleinsäuremoleküle 407 an die beiden Elektroden 405 und 406 erfolgt über die Gold-Schwefel- Kopplung. Für diesen Zweck werden Thiolgruppen jeweils an die 3' -Termini der Nukleinsäure 407 angefügt, was beispielsweise, wie in [9] beschrieben, über enzymatische Verlängerung der Nukleinsäure 407 mit Oligonukleotiden, die Disul idgruppen am 3 ' -Ende aufweisen, möglich ist (vgl. Fig.3) .
Alternativ ist es jedoch auch möglich, das als Fängermolekül dienende Nukleinsäuremolekül 407 selbst über ein erstes und ein zweites Oligonukleotid, das an der ersten Elektrode 405 bzw. an der zweiten Elektrode 406 angefügt ist, d.h. über zwei weitere Fängermoleküle, an die beiden Elektroden 405 und 406 zu binden.
Auch bei dieser Ausführungsform wird entweder vor oder nach der Immobilisierung der DNA-Sondenmoleküle 407 eine erste elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt, wobei mittels zwei in Fig.4 nicht dargestellter
Elektrodenanschlüsse an der ersten und zweiten Elektrode 405 und 406 und eines angeschlossenen Messgeräts (ebenfalls nicht dargestellt) vorzugsweise der Widerstand oder der Stromfluss bestimmt wird, und im Rahmen der ersten elektrischen Messung dann ein Referenzwert, z.B. für den Widerstand, ermittelt und in einem Speicher (nicht dargestellt) gespeichert wird. LΠ
behandelt, das selektiv einen einzelnen Strang einer doppelsträngigen DNA-Duplex von seinem 5 x -phosphorylierten Ende her verdaut/abbaut. Im Falle der gespaltenen Fängermoleküle 407, die ein solches phosphoryliertes Ende 410 besitzen, bedeutet dies, dass jeweils dieser Strang abgebaut wird und somit der komplementäre, nicht mehr hybridisierte Einzelstrang des Fängermoleküls 407 zurückbleibt (Fig.4d) .
Dieser Einzelstrang kann in einem weiteren biochemischen Verfahrenschritt entfernt werden, wobei geeignete,
Einzelstrang spezifische Nukleasen wie Nuklease Pl, die in dem anhand Figur 3 beschriebenen Ausführungsbeispiel genannt ist, eingesetzt werden können. Als Ergebnis bleiben nach dieser Behandlung nur Fängermoleküle 407 zurück, an die das zu erfassende Protein 409 gebunden ist, oder, falls z.B. kein solches Protein in dem Elektrolyten 409 vorhanden war, keine Fängermoleküle 407 (Fig.4e).
Anschließend kann, analog zu der im vorstehenden Ausführungsbeispiel beschriebenen Vorgehensweise, die
Elektrodenanordnung 400 in Kontakt gebracht mit einem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren wie in alkalischem Medium gelöste Silber-Ionen. Diese werden nach ihrer Bindung an den Komplex aus Fängermolekül 407 und nachzuweisenden Protein 409 zur Ausbildung einer Leitfähigkeitsbrücke, wie ebenfalls vorstehend beschrieben, reduziert (vgl. Fig.3d,3e).
Abschließend wird unter Verwendung von nicht dargestellten Elektrodenanschlüsse und des angeschlossenen Messgeräts
(ebenfalls nicht dargestellt) eine zweite elektrische Messung durchgeführt, wobei durch den Vergleich des dabei erhaltenen Messwertes auf die Anwesenheit oder Abwesenheit des zu erfassenden Proteins geschlossen wird.
Es wird deutlich, dass mit dem Verfahren gemäß diesem zweiten Ausführungsbeispiel nicht nur Proteine wie ein DNA bindendes Protein erfasst werden kann, sondern ebenfalls Komplexe aus makromolekularen Biopolymeren wie Nukleinsäure/Protein- Komplexe .
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[13] DE 198 60 547
Bezugszeichenliste
100 Sensor
101 Elektrode
102 Elektrode
103 Isolator
104 Elektrodenanschluss
105 Elektrodenanschluss
106 DNA-Sondenmolekül
107 Elektrolyt
108 DNA-Stränge
200 Elektrodenanordnung
201 isolierendes Substrat 202 Goldschicht
203 Siliziumnitridschicht
204 Graben
205 Seitenwand
206 Seitenwand
207 Elektrodenanschluss
208 Elektrodenanschluss
300 Elektrodenanordnung
301 isolierendes Substrat
302 erste Schicht
303 Siliziumnitridschicht
304 Graben
305 Elektrode
306 Elektrode
307 DNA-Sondenmoleküle
308 DNA-Sondenmo1ekü1e
309 Elektrolyt
310 DNA-Molekül
311 Silber-Ionen
400 Elektrodenanordnung 401 isolierendes Substrat
402 erste Schicht
403 Siliziumnitridschicht
404 Graben
405 Elektrode
406 Elektrode
407 Doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül
408 Elektrolyt
409 Proteinmolekül
410 überstehende, freie Enden

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mittels einer Elektrodenanordnung, die aufweist: • eine erste Elektrode, • eine zweite Elektrode, a) bei dem die erste Elektrode mit Fängermolekülen versehen wird, die makromolekulare Biopolymere binden können, b) bei dem die zweite Elektrode mit Fängermolekülen versehen wird, die makromolekulare Biopolymere binden können, c) bei dem eine erste elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt wird, d) bei dem eine zu untersuchende Lösung mit der Elektrodenanordnung in Kontakt gebracht wird, wobei die Lösung die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthalten kann, e) bei dem in der zu untersuchenden Lösung enthaltene zu erfassende makromolekulare Biopolymere an den Fängermolekülen auf der ersten und der zweiten Elektrode gebunden werden, f) bei dem die Elektrodenanordnung in Kontakt gebracht wird mit einem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren, das an die makromolekularen Biopolymere bindet und diesen eine erhöhte elektrische Leitfähigkeit verleiht, g) bei dem anschließend eine zweite elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt wird, h) bei dem abhängig von dem Vergleich der Ergebnisse der zwei elektrischen Messungen an den Elektroden die makromolekularen Biopolymere erfasst werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem das Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren
(chemisch) reduzierbar ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2 , bei das Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit Metall-Ionen enthält .
4. Verfahren nach Anspruch 3 , bei dem die Metall-Ionen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Silber-, Gold-, Kupfer-, Nickel-Ionen und Mischungen davon besteht.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, bei dem nach Schritt f) die Elektrodenanordnung in Kontakt gebracht wird mit einem Reduktionsmittel, das das Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit reduziert.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem als makromolekulare Biopolymere Nukleinsäuren,
Oligonukleotide, Proteine, Peptide oder Komplexe davon verwendet werden.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fängermoleküle in der Lage sind, die makromolekularen Biopolymere spezifisch zu binden.
8. Verfahren nach Anspruch 7 , bei dem die Fängermoleküle mindestens erste und zweite Fängermoleküle sind, und bei dem die ersten Fängermoleküle in der Lage sind, einen ersten Bereich eines zu erfassenden Biopolymers (spezifisch) zu binden, und bei dem die zweiten Fängermoleküle in der Lage sind, einen zweiten Bereich eines zu erfassenden Biopolymers (spezifisch) zu binden .
9. Verfahren nach Anspruch 8 , bei dem die ersten und zweiten Fängermoleküle jeweils homogen verteilt auf den zwei Elektroden aufgebracht sind.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, bei dem als Nukleinsäuren DNA oder RNA-Moleküle erfasst werden .
11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem DNA- oder RNA-Moleküle einer vorgegebener Sequenz erfasst werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die zu erfassenden DNA oder RNA-Moleküle zumindest einen einzelsträngigen Bereich aufweisen.
13. Verfahren nach Anspruch 12 , bei dem als Fängermoleküle DNA-Sondenmoleküle mit einer zu dem einzelsträngigen Bereich komplementären Sequenz verwendet werden .
14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem nicht gebundene DNA-Sondenmoleküle von den Elektroden entfernt werden, indem ein Enzym mit Nukleaseaktivität mit den beiden Elektroden in Kontakt gebracht wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem als Enzym mit Nukleaseaktivität mindestens einer der folgenden Enzyme verwendet wird: a) Nuklease aus Mung-Bohnen b) Nuklease Pl c) Nuklease Sl, oder d) DNA-Polymeräsen, die aufgrund ihrer
5 ' -> 3' Exonukleaseaktivität oder ihrer 3'- 5' Exonukleaseaktivität oder ihrer
Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige DNA abzubauen .
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, bei dem als Fängermoleküle Liganden verwendet werden, die Proteine oder Peptide spezifisch binden können.
17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem nicht gebundene Liganden von den beiden Elektroden entfernt werden, indem ein Material mit den beiden Elektroden in Kontakt gebracht wird, das imstande ist, die chemische Verbindung zwischen den Liganden und den Elektroden zu hydrolysieren .
18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das Material, das mit den Elektroden in Kontakt gebracht wird, ein Enzym ist.
19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das Enzym, das mit den Elektroden in Kontakt gebracht wird, eine Carboxylester-Hydrolase (Esterase) ist.
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